JPH11504644A - 免疫グロブリンの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は免疫グロブリンＧ製剤の製造方法に関する。該方法では免疫グロブリンを含有する血液画分を約 4.4のｐＨでマイルドペプシンで60〜72時間処理し、Ｓ／Ｄウイルス不活性化法により処理し、薬剤、ペプシン及び分解生成物を除去する。更に、血液画分を最大で約35nmの穿孔を有する有孔フィルターで濾過できる。本発明によると、きわめて純粋で良抗薬性の、ウイルスに関して安全な生成物が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫グロブリンの製造 発明の背景 本発明は免疫グロブリンＧの製造方法に関する。免疫グロブリンＧ生成物は疾 病の処置および予防に用い得る。 ヒトは免疫系により外来病原菌に対して保護され、免疫系の一部は免疫グロブ リンＩｇＧ，ＩｇＭ及びＩｇＡよりなる。免疫系の一部として申し分なく機能す るためには、免疫グロブリンはそれらの天然の形でなくてはならない。即ちＩｇ Ｇの分子量は約 150kDでなくてはならず、言わゆるＦｃ部分は破損されておらず 機能し得るものでなればならない。ＩｇＧは精製過程でその天然形を失なうかも しれず例えばエタノールによって生起される重合、の結果として天然形を失なっ てしまう。変性したＩｇＧ画分は生体内で補体を非常に強く活性化し得るので免 疫グロブリン生成物を注入した患者は致命的なアナフィラキシー反応を受ける。 補体を結合するＩｇＧ画分の能力は抗補体活性として試験管内で測定される。 免疫グロブリンは或る疾病の処置に用いられ、例えば特発性の栓球減少症の処 置に用いられ、並びに遺伝的特性又は一時的特性の何れかとして免疫グロブリン Ｇの欠損している患者（低グロブリン血症又は無ガンマグロブリン血症の患者） を感染から保護するのに用いられる。特異免疫グロブリン例えば破傷風、風疹、 アンチ−Ｄ又は狂犬病に対して抗体を含有する生成物は特定の疾病か らヒトを保護するのに用いる。 肝炎ウイルスは或る免疫グロブリン生成物を介して患者に媒介されることが見 出された。これは全ての感染性ウイルスが製造過程で殺滅されなかったことを意 味する。肝炎は静脈内の免疫グロブリン処置を受けた患者の10〜20％程の多数で 生起すると診断された。 静脈内投与の免疫グロブリンを製造する最も良く知られた方法はpH4 で軽質(m ild)プペチンで処理することである（Vox Sang ７；(1962)157〜 174：フィンラ ンド特許第73,597号；バイオテクノロジー オブ ブラッド プロテイン(Biote chnology of Blood Proteins)，227(1993)261〜 265）。ペプシン処理の目的は 抗補体を除去することであった。他の可能な製造方法は例えばペプシンを又はプ ラスミンの如きタンパク質分解酵素により免疫グロブリンを強度に分画すること である。得られた生成物中のタンパク質分子は高度にフラグメント化（砕片化） されている（タンパク質分子の半分以上）ので抗補体活性はもはや測定できない (Develop．Biol．Standard 44(1979)147 〜 151)。タンパク質分子はまた化学薬 剤により処理でき例えばスルホン化により、還元により及びアルキル化により又 はポリエチレングリコール又はその誘導体と共に沈澱により処理できる(Vox San g 42(1982)62〜73)。 肝炎ウイルスは溶剤／洗浄剤（Ｓ／Ｄ）処理により不活性化させ得る（米国特 許第4,571,505号、第4,613,501 号、第 4,481,189号；Int．Assoc．Biol．Standard(1992)）。 一般に、かなり十分に軽質ペプシンで処理した免疫グロブリンに患者は抗薬力 があるが、この方法により形成した生成物から肝炎が媒介されることが証明され ている(Vox Sang 57(1989)15〜18)。 特に酵素法により分画した又は化学的に処理した生成物の欠点のうちで、生物 学半減期の短縮及び効力不全が挙げられる(Vox Sang 42(1982)62〜73)。 発明の開示 本発明は以下の請求の範囲１により免疫グロブリンを製造する方法を提供する 。本発明の若干の有利な改良は追加の請求の範囲に挙げられている。 抗補体を除去し且つウイルスを不活性化するためには、本法は連続的なペプシ ン処理と、Ｓ／Ｄ処理とを行ない、その後に不活性化に用いた薬剤、ペプシン及 び免疫グロブリンの分解生成物を取出すことからなる。更には、ウイルスを除去 するためには最大穿孔寸法が約35nmより大きくない有孔フィルターを用いて濾過 を行なう。 ペプシンでの処理はわずかなタンパク質分解又は明白な消化を生起するような 処理でありしかも有利には臨床用途に意図した生成物の製造に用いる種類のタン パク質分解又は消化を生起するような処理である。該処理はペプシンが酵素作用 的に活性である条件下で適当な期間 pH3.8〜 4.6で行なう。処理期間は格別に長 く約60〜72 時間でありしかも通常より高い pH4.2〜 4.5で処理を行なうのが最も有利である 。長い処理期間によってウイルスの不活性化が増大されることが見出された。ま た長い処理期間によって分解生成物の量が増大されるものである。然しながら、 これは最終の目的生成物に有害ではない。何故ならば分解生成物は除去されるか らである。 高度に分割した生成物（例えば70％まで）をこの方法により製造できる。溶剤 ／洗浄剤(solvent／detergent)処理においてはウイルスの脂質包膜を分解する溶 剤／洗浄剤の組合せ体を用いる。0.3％のトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート及び １％のポリソルベート（例えばトゥイーン80）、１％のオクトキシノール(例え ばトリトン100)又は 0.2％のナトリウムクロレート(cholate)あるいは２％のト リ（ｎ−ブチル）ホスフェートのみを通常用いる。処理期間は通常４〜６時間で あり、温度は24〜37℃である。 免疫グロブリンをカチオン交換体に結合させるのと同時に薬剤、ペプシン及び 分割生成物を除去するのが最良である。アガロース型のカチオン交換体（例えば ＣＭ−セファロース）を用いるのが最も有利である。 ウイルスの濾過によって、Ｓ／Ｄ処理で不活性化されない様なウイルスを有効 に除去するものであることが見出された。濾過は何らかの任意段階で行ない得る 。薬剤及び分解生成物を除去した後にあるいはペプシンでの温度反応中に行なう のが最も有利である。驚くべきことに は、ペプシン処理は濾過におけるタンパク質の浸透を顕著に高めることが見出さ れた。 ウイルスの除去に用いたフィルター（例えば旭化成のナノフィルター Planova ）中の穿孔の寸法は最大で約35nmであり、最も有利には約15〜20nmである。 前記で提案した方法を組合せると、非包膜ウイルス及び小さな包膜入りウイル スをまた有効の除去するものである。 生成物を最後に安定化し例えば単糖類又は二糖類又は糖アルコールを添加する ことにより安定化するのが最も有利である。 用いる原料は、或る既知の方法により製造されしかも免疫グロブリンＧを含有 する血漿画分であり例えばポリエチレングリコール又はクロマトグラフィーで精 製した画分であり得る。原料は正常な免疫の血漿又は超免疫血漿であるか又は胎 盤から精製した画分であり得る。特に原料はコーン画分IIであることができ、こ れをアニオン交換体で更に精製し且つエタノールから凍結乾燥するのが最も有利 である。或る別の方法により製造された免疫グロブリンＧの粉末又は溶液を用い ることもでき、例えばコーン画分の上清III又は更に処理されていないが90％以 上の電気泳動純度を有するコーン画分IIを用い得る。エタノール含有画分中のエ タノールは例えば免疫グロブリンの溶解前の限外濾過、ゲル濾過又は凍結乾燥に より除去できる。 アニオン交換処理（例えばDEAEセファデックス）はコーン画分を精製する１工 程として用いるのが有利である。 本発明により、ペプシンを含有せずしかも従来の生成物の何れよりも低い抗補 体活性を有する生成物であってきわめて純粋な且つ十分に抗薬性の(tolerated) 静脈内投与生成物が得られる。生成物中のタンパク質の少なくとも95％、有利に は少なくとも98％がＩｇＧであり、ＩｇＧの少なくとも90％がモノマー又はダイ マーである。重合体状ＩｇＧの量は１％以下であり、小さなフラグメントの量は ５％以下である。本発明によると、５mg／ｌ以下、典型的には２〜３mg／ｌのＩ ｇＡ含量の生成物を得ることができる。プレカリクレインアクチベーター含量は 典型的には１IU／ml以下である。更に、生成物のウイルス安全性は従来の生成物 におけるよりも多数の仕方で確保される。 本法は正常な免疫グロブリンと特異免疫グロブリンとの両方の製造に応用でき る。 液剤については、カチオン交換クロマトグラフィー後に若干の溶液が抽出され 、しかもこの溶液は例えばｐＨ調節、濃縮、洗浄及び濾過により処理して液剤と して保存される生成物が製造される。 本発明の方法は例えば次の如く実施される： 免疫グロブリンを溶解して水溶液とする。ｐＨを温和な酸で調節して約 4.4と する。酸は出来るだけ微細な粒子として溶液に添加するのが最も有利である。即 ち免疫 グロブリンに損傷を与えることなくｐＨを迅速に調節する。ペプシンを約１：10 ,000の重量比で添加する。この溶液を大体35℃の温度で約66時間培養反応（イン キュベート）する。該溶液と洗浄剤との混合物を添加し、培養反応を26±２℃の 温度で少なくとも８時間続行する。免疫グロブリンをカチオン交換体に結合させ 、生物学的に相溶性の緩衝剤で溶離する。溶出液のｐＨを約 6.9に調節する。溶 出液を濃縮し、定容量洗浄し且つ同時に３〜15％有利には８〜９％のサッカロー スを含有するように平衡させ、清澄濾過し、分別し且つ凍結乾燥する。得られた 生成物は乾燥生成物であり、これは次いで水を添加して注射溶液とする。 前記の説明により製造した注射液は７個所の病院で15名の患者に投与された。 該生成物は現在使用されている２種類の対照生成物よりも副作用が低いことが見 出された。この試験における関係者は低γグロブリン血症について対照生成物で の処置を早くから受けた患者である。該生成物を用いる結果として感染性ウイル スの媒介は何ら検知されなかった。 液剤として保存される免疫グロブリン溶液は例えば、次の如く製造される： 原物質即ち原料は凍結乾燥前に最も有利にはカチオン交換後に、前記方法から 得られた溶液である。カラムから得られた溶出液のｐＨを調節し、該溶液を限外 濾過により濃縮する。選択した限外フィルターは約 150kDより 小さい分子寸法を有するタンパク質を透過させ得る型式のフィルターであるのが 有利である。該溶液を濃縮して２〜10％（容量／重量）、最も有利には約５〜６ ％のタンパク質含量とする。必要な場合には、濾過剤例えばAl(OH)₃ゲル及び／ 又はケイソウ土を添加し且つ混合する。濾過剤は濾過又は遠心分離により除去す る。該溶液を清澄濾過し、その後に15nmの穿孔寸法を有するフィルターで濾過す る。濾過後に、10％（容量／重量）のサッカロースを該溶液に溶解させ、ｐＨを 点検し必要な場合には調節する。その後に滅菌濾過し、ビン詰めにする。該溶液 を２〜８℃の温度で保持する。液剤として保存される生成物を製造する時は、製 造限定条件を設定し且つ経費を増大させる凍結乾燥工程を行わないで済むことが できる。 実施例１ 原物質のコーン画分IIを次の条件でDEAE−セファデックスアニオン交換体で精 製する：ゲル及び温和なアセテート緩衝剤のｐＨは6.85±0.05であり、温度は６ 〜８℃であり、処理期間は３時間である。原物質の１キロにつき35ｇの乾燥アニ オン交換体を用いる。2.66kgの精製した且つ凍結乾燥したコーン画分II粉末を、 0.2Ｍ NaClを含有する10％サッカロース溶液 35.64ｌに溶解した。該溶液を濾過 により清澄とした。該溶液のｐＨを０℃で 0.2Ｍ HClで 4.4に調節し、240mgの 精製済みのブタのペプシンを添加した。該溶液を濾過により清澄とした。 該溶液を35℃の温度で66時間温置（インキュベート）した。ｐＨを０℃で 0.2Ｍ NaOH で 5.0に調節し、該溶液を滅菌濾過した。 次いで 461ｇのトゥイーン80と 135ｇのトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートを該 溶液に添加し、26℃で１時間混合した。該溶液を蠕動ポンプによりウイルス無含 有の生産領域に運搬し、そこで少なくとも６〜20時間密閉容器中で更に保持した 。この生産領域では、生産にはオートクレーブ装置又は或る別の容量でウイルス を含有しないように精製した装置のみを用いる。該溶液を40ｌのＣＭ−セファロ ース−ＦＦカラムに装填し、50mMのアセテート緩衝剤(pH5.0)で平衡させた。ト ゥイーン80及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート、ペプシン及び免疫グロブリン 分解生成物の一部がカラムを流通する。カラムに付着した免疫グロブリンは、0. 5Ｍ NaCl を含有する15mMの酢酸ナトリウム緩衝剤(pH5.0)で溶離した。該溶液の ｐＨを 0.2Ｍ NaOH で 6.9に調節し、該溶液を限外濾過により約40ｌに濃縮した 。該溶液のタンパク質含量及び塩の組成は、８％（重量／容量）のサッカロース 、0.8％のグリシン及び60mMのNaClを含有する溶液 180ｌで定容量洗浄すること により変化させた。清澄濾過を行ない、しかも15nmの有孔フィルターを用いての 濾過を行なう。滅菌濾過後に、該溶液を凍結乾燥して最後のビンに入れしかも真 空中で密閉するかあるいは液剤として保存される生成物を製造する。 実施例２ 上清のコーン画分III又は非凍結乾燥のコーン画分II溶液を限外濾過し又はゲ ル濾過してエタノールを除去し、DEAEイオン交換体で処理して不純物を除去した 。該溶液を定容量洗浄により、５〜10％（重量／容量）のサッカロースと 0.2％ （重量／容量）のNaClとの溶液に対して平衡化させる。生産は実施例１に記載し た方法により続行した。 実施例３ 実施例１又は２により製造したＣＭ−セファロース溶出液のｐＨを０℃で 0.2 Ｍ NaOH で 5.1に調節した。150kD より小さい全ての分子を透過させる膜フィル ターを用いて限外濾過により該溶液を５〜10％のタンパク質含量となるように濃 縮した。５〜８容量の蒸留水で定容量洗浄を行なった。所望な場合には、濾過剤 としてAl(OH)₃ゲル10〜30ml／ｌ及びケイソウ土濾過剤（例えばフィルターセル ）５〜40ｇ／ｌを添加した。濾過剤は遠心分離によりあるいは有利には清澄濾過 と組合せての濾過により除去した。該溶液は先ずガラス繊維製の予備フィルター で清澄濾過し次いで 220nm及び 100nmの膜フィルターで清澄濾過した。次に15nm の有孔フィルターで濾過した。該溶液に10％（重量／容量）サッカロースを添加 し、その溶解後にｐＨを添加し、必要な場合にはｐＨをNaOH又は HClで 1.5に調 節する。得られた溶液を滅菌濾過し、ビン詰めにする。 参考例 生産規模の回分（４kgの免疫グロブリン）のうち、ペプシン消化前の生産工程 から 300mlの溶液を抽出した。該溶液を２個の部分Ａ及びＢに分割した。部分Ａ には、ペプシン比が１／10,000免疫グロブリン重量であり、ｐＨが 4.4であり、 温度が37℃で処理期間が66時間である条件下でペプシン消化を行った。部分Ｂは 同じ容量で但しペプシンなしで処理した。培養反応後に、両溶液のｐＨを 5.0に 調節した。両方の部分を同じ装置及びフィルターを用いて連続的に濾過した。貫 膜圧を 0.5バールに調整した。部分Ａの濾過においては、濾過溶液を用いて30分 の安定化用濾過を先ず行なった。濾過速度が安定化した時に、濾過を90分間続行 した。溶液Ａについての平均濾過速度（平均タンパク質流速）は、168.4ｇｈ^-1 ｍ^-2であった。用いた装置を溶液Ｂで細心に洗浄し、30分の安定化用濾過及び90 分の濾過を行なった。平均タンパク質流速は58.5ｇｈ^-1ｍ^-2であった。即ち単位 時間当りのペプシンで消化した免疫グロブリンの濾過済みタンパク質量は未消化 の生成物と対比すると３倍であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年９月５日 【補正内容】 請求の範囲 １．血液から単離した免疫グロブリンＧ画分から免疫グロブリンＧ製剤を製造 する方法において、Ｇ画分を pH3.8〜 4.6でペプシンで処理して抗補体を除去し 且つウイルスを不活性化させその後にＧ画分を溶剤／洗浄剤ウイルス不活性化法 で処理してウイルスを不活性化させ、しかる後にウイルス不活性化法で用いた薬 剤、ペプシン及び免疫グロブリン分解生成物を除去し、これらの処理に加えて、 ペプシン処理後の或る段階で、最も有利にはウイルス不活性化に用いた薬剤、ペ プシン及び免疫グロブリン分解生成物の除去後に、35nmより大きくない穿孔例え ば約20nmより大きくない最も有利には約15nmより大きくない穿孔を有する有孔フ ィルターに通してＧ画分を濾過することを特徴とする免疫グロブリンＧ製剤の製 造方法。 ２．ペプシンでの処理は pH4.2〜 4.5で、最も有利にはｐＨ約 4.4で約33〜40 ℃の温度で約60〜72時間マイルドペプシンで処理することからなることを特徴と する、請求の範囲１記載の方法。 ３．ウイルス不活性化に用いた薬剤、ペプシン及び免疫グロブリン分解生成物 はイオン交換体最も有利にはカチオン交換体で処理することにより除去すること を特徴とする、請求の範囲１又は２記載の方法。 ４．免疫グロブリンをカチオン交換体に付着させ、しかも約５のｐＨの緩衝剤 によりカチオン交換体から溶離

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液から単離した免疫グロブリンＧ画分から免疫グロブリンＧ製剤を製造 する方法において、Ｇ画分を pH3.8〜 4.6でペプシンで処理して抗補体を除去し 且つウィルスを不活性化させその後にＧ画分を溶剤／洗浄剤ウイルス不活性化法 で処理してウイルスを不活性化させ、しかる後にウイルス不活性化法で用いた薬 剤、ペプシン及び免疫グロブリン分解生成物を除去し、これらの処理に加えて、 或る段階でしかも有利にはペプシン処理後に、最も有利にはウイルス不活性化に 用いた薬剤、ペプシン及び免疫グロブリン分解生成物の除去後に、35nmより大き くない穿孔例えば約20nmより大きくない最も有利には約15nmより大きくない穿孔 を有する有孔フィルターに通してＧ画分を濾過することを特徴とする免疫グロブ リンＧ製剤の製造方法。 ２．ペプシンでの処理は pH4.2〜 4.5で、最も有利にはｐＨ約 4.4で約33〜40 ℃の温度で約60〜72時間マイルドペプシンで処理することからなることを特徴と する、請求の範囲１記載の方法。 ３．ウイルス不活性化に用いた薬剤、ペプシン及び免疫グロブリン分解生成物 はイオン交換体最も有利にはカチオン交換体で処理することにより除去すること を特徴とする、請求の範囲１又は２記載の方法。 ４．免疫グロブリンをカチオン交換体に付着させ、しかも約５のｐＨの緩衝剤 によりカチオン交換体から溶離 することを特徴とする、請求の範囲３記載の方法。 ５．生成物はまた好ましくは限外濾過により濃縮して２〜10重量／重量％、最 も有利には約５〜６重量／重量％のタンパク質含量とさせ、しかも滅菌濾過する ことを特徴とする、請求の範囲１〜４の何れかに記載の方法。 ６．生成物を濃縮し且つ約 150kDより小さいタンパク質が透過可能なフィルタ ーを有する限外濾過装置で定容量洗浄することを特徴とする、請求の範囲５記載 の方法。 ７．濃縮後に但し滅菌濾過前に最大で約35nmの有孔フィルターを用いて濾過を 行なうことを特徴とする、請求の範囲２及び４又は５の何れかに記載の方法。 ８．生成物をまた凍結乾燥して乾燥保存される生成物とさせるか又は生成物を また加工処理して液剤として保存される生成物とさせることを特徴とする請求の 範囲１〜７の何れかに記載の方法。 ９．生成物をまた加工処理して液剤として保存される生成物とさせ、しかも５ mg／ｌ以下のＩｇＡ含量例えば２〜３mg／ｌのＩｇＡ含量を有することを特徴と する請求の範囲８記載の方法。 10．原料は、アニオン交換体で精製したコーン画分であることを特徴とする請 求の範囲１〜９の何れかに記載の方法。