JPH0636748B2 - 微生物による炭素源の発酵によって多糖類を製造する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物による炭素源の発酵によって多糖類を
製造する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、向
上した過適性を示す多糖類の水溶液又はゲルの取得を
可能にする発酵方法並びにこの多糖類を石油の促進的回
収に使用する方法に関する。

〔従来の技術とその問題点〕

キサントモナス属若しくはアルスロバクター属の細菌、
スクレロチウム属に属する菌類又はこの部類の他の微生
物の作用の下で炭素源を発酵させることによって得られ
る多糖類、即ちバイオポリマーは、その増稠性及び増粘
性の故に多くの工業的用途が見出されている。

特に、キサンタンゴム型のヘテロ多糖類は、石油の二次
及び三次回収方法において有益な用途が見出された。こ
の用途においては、部分的に枯渇した埋蔵所から石油を
置換するため、約３００〜３０００ppmの濃度に希釈さ
れた水溶液が使用される。キサンタンゴムは、事実、低
濃度での高い粘度、塩分及び塩の性状に対する大きな不
感受性並びに機械的束縛に対する大きな安定性によって
特徴づけられる。しかしながら、発酵液から又はこの発
酵液より沈殿回収された粉末の希釈により工業的な量で
製造された溶液は、それが注入された岩石組織の細孔を
迅速に目詰りさせ、これによって望ましくない圧力の増
大を招きかつ石油のそれ以上の回収を迅速に制止させる
という重大な欠点を示す。この目詰りの原因は、一方で
は、発酵に由来する細胞の残骸や生きていない細菌のた
めであり、他方では、特に溶液が発酵液から沈殿させた
バイオポリマーで製造された場合には、確実な数の半透
明の凝集体又はミクロゲルの存在のためであることがわ
かる。

また、発酵培地の組成、特に使用する窒素源に左右され
るキサンタンゴムの水溶液の流動学的挙動に著しい差異
が観察され得ることが認められた。米国特許第３，００
０，７９０号、同３，０２０，２０６号、同３，３２
８，２６２号及び同３，４９５，７１９号に記載のよう
に、蒸留所の可溶物の使用は発酵培地中に多量の不溶物
をもたらすことが知られている。この問題点を防止する
ため、他の知られた方法によって、最終発酵培地に少量
の無機窒素源及び（又は）有機窒素源が使用される。例
えば、米国特許第３，３９１，０６０号及び同３，４３
３，７０８号、仏国特許第２，４１４，５５５号を参照
されたい。

これにより過適性は改善されるけれども、これらの培
地は生産性及び（又は）過適性の観点から完全に満足
できるものとならない。使用できる各種の有機窒素源が
これらの特許にあげられているが、既知の化合物のうち
のある種の化合物の選択が特別の効果を生じるとは思わ
れない。さらに、無機窒素の使用は培地を汚染しやすく
し、また培地が完全に殺菌されていない場合には工業的
製造では二次的な発酵を生じさせる可能性がある。

さらに、石油の促進的回収の分野で使用できる多糖類の
製造のために変性された発酵培地が米国特許第４，１１
９，５４６号、同４，２９６，２０３号、同４，３７
７，６３７号、ヨーロッパ特許第００６６９６１号にお
いて提案された。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、良好な粘度及び過適性を有する水性ゾルを
導くキサンタンゴム型の多糖類を高い生産性でもって製
造する方法を提供することを目的とする。さらに、本発
明の特別の目的は、部分的に枯渇した埋蔵所からの石油
の置換に使用するのに適した、キサントモナス属（Xant
homonas）により生じる多糖類を含有する発酵液を得る
ことである。

〔課題を解決するための手段〕

したがって、本発明は、１０〜１２０ｇ／の炭素源並
びに窒素源を含有する水性栄養培地を微生物により発酵
させることによって多糖類を製造するにあたり、前記窒
素源がカゼイン塩を他の有機及び（又は）無機窒素源と
の混合物状で含むことを特徴とする多糖類の製造方法に
係る。

カゼイン塩は、カゼインナトリウム、カゼインカリウ
ム、カゼインアンモニウム、カゼインカルシウムのよう
なカゼイン塩のうちから選ぶことができる。

カゼイン塩は、カゼインの中和又は発酵培地中で得るこ
とができる。カゼイン塩は、発酵培地１当りの元素状
窒素のｇ当量数で表わして、0.007〜0.5ｇ／、好まし
くは0.014〜0.35ｇ／の濃度で有利に使用される。

発酵培地は、カゼイン塩の他に、他の有機及び（又は）
無機窒素源を含有する。有機窒素源のうちでは、ペプト
ン、ゼラチン、酵母抽出物、とうもろこしの可溶性抽出
物、大豆粉があげられる。

無機窒素源のうちでは、硝酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、炭素モノ又はジアンモニウム、硫酸モノ又はジ
アンモニウム、りん酸モノ又はジアンモニウム及び硝酸
アルカリがあげられる。

カゼイン又はその誘導体の補充として、好ましくは有機
窒素源があげられる。特に、とうもろこしの可溶性抽出
物（ＣＳＬ）を使用するのが好ましい。なぜならば、そ
れは有機窒素源のうちで最良の収率を得させるものであ
るからである。生産性を高めるため、有機窒素源に要す
れば少量の無機窒素源を追加することができる。

窒素の全量は、発酵培地１当りの元素状窒素のｇ当量
数で表わして、有利には0.2〜0.6ｇ／、好ましくは0.
3〜0.4ｇ／である。

炭素源は糖であってよい。好ましくは、グルコース、サ
ッカロース、フラクトース、マルトース、ラクトース、
ガラクトースが１０ｇ〜４０ｇ／の好適濃度で使用さ
れる。

グルコース及びサッカロースが特に好ましい。

炭素源及び窒素源の他に、発酵培地は、それ自体知られ
た状態で、微量の元素及び必須生長要素を含有する。

しかして、発酵培地は、例えば、硫酸マグネシウム、酢
酸マグネシウム、塩化マグネシウム又は硝酸マグネシウ
ムによりもたらされるマグネシウムイオンを含有でき
る。元素状マグネシウムの濃度は好ましくは0.001〜0.0
5ｇ／である。

また、発酵培地は、りん源を含有することができる。こ
れは出発時から使用でき又は有利には、例えば、りん酸
カリウム、ナトリウム又はアンモニウムによるpH調節時
に導入することができる。元素状りんの濃度は、好まし
くは0.05〜1.3ｇ／である。pHは有利には６〜7.5の間
に保持される。

また、発酵時には消泡剤を導入することができる。

発酵用の微生物は、炭化水素を発酵させる細菌、例えば
「BERGEY′ S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOG
Y」（８版−１９７４年 Ｎ．ウイリアムズ、ウイルキ
ンズ社発行、バルチモア市）に記載の細菌、例えば、キ
サントモナス・ベコニアエ（Xanthomonas begoniae）、
キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campes
tris）、キサントモナス・カロタエ（Xanthomonas caro
tae）、キサントモナス・ヘデラエ（Xanthomonas heder
ae）、キサントモナス・インカナエ（Xanthomonas inca
nae）、キサントモナス・マルバセアリューム（Xanthom
onas malvacearum）、キサントモナス・パパベリ・コー
ラ（Xanthomonas papaveri cola）、キサントモナス・
ファセオリ（Xanthomonas phaseoli）、キサントモナス
・ピシ（Xanthomonas pisi）、キサントモナス・バスキ
ュロリューム（Xanthomonas vasculorum）、キサントモ
ナス・ベシカトリア（Xanthomonas vesicatoria）、キ
サントモナス・ビチアンス（Xanthomonas vitians）、
キサントモナス・ペラルゴニイ（Xanthomonas pelargon
ii）；アルスロバクター属（Arthrobacter）の細菌、特
に、アルスロバクター・スタビリス（Arthrobacter sta
bilis）、アルスロバクター・ビスコサス（Arthrobacte
r viscosus）；エルウイニア属（Erwinia）；アゾトバ
クター属（Azotobacter）、特にアゾトバクター・イン
デイカス（Azotobacter indicus）；アグロバクテリウ
ム属（Agrobacterium）、特にアグロバクテリウム・ラ
ジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロ
バクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogene
s）、アルゴバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobac
terium tumefaciens）のうちから選ばれる。また、スク
レロチウム属（Sclerotium）に属する菌類も使用するこ
とができる。

これらの微生物のうちでも、キサントモナス・カンペス
トリス（Xanthomonas campestris）を使用するのが好ま
しい。

微生物は、発酵培地にそれ自体知られた態様で、例えば
２０の実験室用発酵器において得られた中間培養物
（これ自体は例えば１の三角フラスコで実施された接
種物より得られたものである）により導入される。

当業者に知られた接種物、即ち中間培養物の製造は、例
えば仏国特許第２，４１４，５５５号に記載されてい
る。

次いで、発酵が本発明の方法によって一又は二以上の発
育及び生産段階で数日間行われる。発育用培地及び生産
用培地は同一の組成又は異なる組成を有していてよい。
発酵が終った後、液は約1.5〜５０ｇ／の濃度の多糖
類、細菌の残骸、炭素又は窒素源不純物、残留たん白質
及び無機イオンを含有する。発酵が完了した後であって
かつ多糖類の単離を行う前に（多糖類を粉末として得よ
うとする場合）、好ましくは発酵液の加熱が６０〜１２
０℃、好ましくは８０〜１１０℃の温度で１〜６０分間
実施される。重合体、即ち多糖類はそのままで使用する
ことができ、或るいは発酵液から当業者に知られた任意
の方法、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノ
ール、ブタノールのような低級アルコールによる沈殿に
より、又は例えば塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
ナトリウム若しくはりん酸ナトリウムのような無機塩に
よる沈殿によって回収することができる。

沈殿した多糖類は分離され、洗浄され、次いで乾燥さ
れ、粉砕される。このようにして直ちに使用できる粉末
が得られる。

本発明の範囲では多糖類は発酵液中のものを直接的に又
は粉末から出発して使用することができるが、粉末を懸
濁させて得られるゲルは一般に発酵液よりも過するの
が困難である。もちろん、所望ならば、発酵液（要すれ
ば熱処理前に）又は沈殿した粉末にバイオサイド又は発
酵を添加することができる。さらに、ある場合には、任
意の周知の手段によって実施することができる発酵液の
濃縮を行うのが有益である。

本発明方法によれば、高い粘度と良好な過適性を有す
るキサンタンゴムを高い生産性でもって得ることができ
る。

本発明方法による発酵液全体及び多糖類粉末は、キサン
タンゴムの知られた用途の全てに、特に良好な過適性
を要求する用途、具体的には石油の促進的回収に使用す
ることができる。

〔実施例〕

本発明を下記の実施例により詳述するが、これらは本発
明を限定するものではない。

例１ 試験管中のゲロース上に維持したキサントモナス・カン
ペストリス（Xanthomonas campestris）ＡＴＣＣ１３９
５１の培養物から１００ｍのＭＹ−サッカロース培地
（酵母抽出物３ｇ、麦芽抽出物３ｇ、バクトペプトン５
ｇ、サッカロース１０ｇ、飲料水１とするに要する
量）に播種する。一定の攪拌下２８℃でのインキュベー
ション時間は２４時間である。

この培養物の１００ｍにより下記の組成 サッカロース ２１ｇ／ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ 0.25ｇ／ カゼインナトリウム ０〜２ｇ／ とうもろこしの可溶性抽出物 8.5〜0.5ｇ／ 菜種油 0.5ｍ／ 水 １とするに十分な量 を有する無菌生産用培地１５に接種する。

接種前のpHは7.2である。発酵は２８℃の温度で攪拌し
かつ曝気しながら行うとともに、その間pHはか性ソーダ
の添加により7.2に調節する。発酵は、もはや微量の糖
が存在しなくなったときに停止する。

次いで、発酵液の熱処理を行い、それからイソプロパノ
ールを添加することにより多糖類を沈殿させ、洗浄し、
乾燥し、粉砕する。

窒素源の正確な組成及び発酵の結果を下記の表に示す。

得られた粉末から出発し、0.075ｇ／のＣａＣｌ_２を
含有する水溶液を希釈用に使用することにより、０．１
重量％濃度の希釈溶液を調製する。次いで、溶液の粘度
及び過適性を測定する。

粘度は、ブルックフィールド粘度計（モデルＬＶＴ、装
置ＵＬ、６rpm、２５℃）によって測定する。

過適性は、溶液を細孔直径１２μの多孔質膜に0.06バ
ールの一定圧力の下に通すことによって評価する。３０
分間で過された容積を測定する。

カゼインナトリウムを使用しない培地がそれほど粘稠で
なくかつ目詰まりさせるゾルを与えることが認められ
る。

例２ 発酵培地は下記の組成を有する。

サッカロース ２７ｇ／ カゼイン塩 １ｇ／ とうもろこしの可溶性抽出物 ２ｇ／ ＫＮＯ_３ １ｇ／ 菜種油 １ｇ／ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ 0.25ｇ／ 水 １とするに十分な量 全窒素は0.35ｇ当量／の元素状窒素である。発酵時間
は６２時間であり、最終粘度は５，４００cpsである。
サッカロースに対する収率は67.6％である。

発酵液の粘度を0.4ｇ／の多糖類の溶液について測定
する。その粘度は6.3mPa.sであり、またこの液から回収
された粉末で作った溶液の粘度は6.9mPa.sである（ブル
ックフィールド、ＬＶＴ、装置ＵＬ、３０rpm、２５
℃）。

過適性を ＮａＣｌ 70.5ｇ／ ＣａＣｌ_２ 17.5ｇ／ よりなる塩水中の0.04％の溶液について、３μの細孔直
径を有する膜上で１０ミリバールの圧力の下で測定す
る。発酵液では１５０分間に１，９７８ｍが過さ
れ、また粉末では１５０分間に４９５ｍが過され
た。

例３ 発酵培地は下記の組成を有する。

グルコース・１Ｈ_２Ｏ ２０ｇ／ でんぷん ２ｇ／ とうもろこしの可溶性抽出物 0.5ｇ／ カゼインナトリウム 1.25 又は 2.5ｇ／ Ｋ_２ＨＰＯ_４ 7.3ｇ／ ＭｇＳＯ_４ 0.25ｇ／ 菜種油 2.5ｍ／ 水 １とするに十分な量 ゾルの粘度は、７５ppmのＣａＣｌ_２を含む塩水中の
０．１％溶液について、３rpmで回転するブルックフィ
ールド粘度計ＬＶＴより例１におけるように測定する。

過適性は、0.075ｇ／のＣａＣｌ_２を含む塩水中の
0.1重量％溶液について、１２μの細孔直径を有する膜
上で１０分間測定する。

例４ 発酵用培地は下記の組成を有する。

カゼインナトリウム ０〜0.5ｇ／ ＮＨ_４ＮＯ_３ 1.2ｇ／ Ｋ_２ＨＰＯ_４ 7.3ｇ／ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ 0.25ｇ／ 菜種油 2.5ｍ／ グルコース・１Ｈ_２Ｏ ２０ｇ／ でんぷん ２ｇ／ 水 １とするに十分な量 抽出し、乾燥した後の多糖類粉末の粘度を、蒸留水中0.
1重量％の多糖類を含有する溶液についてブルックフィ
ールド粘度計（ＬＶＴ、装置ＵＬ、３rpm、２５℃）に
より測定する。

多糖類粉末の過適性は、次の組成 ＮａＣｌ １６０ｇ／ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ 16.5ｇ／ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ 7.5ｇ／ の塩水中0.04重量％の多糖類溶液について測定する。

この溶液を３μの細孔直径を持つ多孔質フィルターに0.
06バールの一定圧の下で通す。３０分間に過された容
積を測定する。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１０〜１２０ｇ／の炭素源並びに窒素源
   を含有する水性栄養培地を微生物により発酵させること
   によって多糖類を製造するにあたり、前記窒素源がカゼ
   イン塩を他の有機及び（又は）無機窒素源との混合物状
   で含むことを特徴とする良好な粘度と過適性を有する
   水溶液製造用の多糖類の製造方法。
2. 【請求項２】他の有機窒素源がとうもろこしの可溶性抽
   出物、ペプトン、大豆粉、酵母抽出物及びゼラチンのう
   ちから選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】他の窒素源が無機アンモニウム塩及び硝酸
   アルカリのうちから選ばれることを特徴とする請求項１
   記載の方法。
4. 【請求項４】カゼイン塩の量が、発酵培地１当りの元
   素状窒素のｇ当量数で表わして、0.007〜0.5ｇ／、好
   ましくは0.014〜0.35ｇ／であることを特徴とする請
   求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】窒素の全量が、発酵培地１当りの元素状
   窒素のｇ当量数で表わして、0.2〜0.6ｇ／、好ましく
   は0.3〜0.4ｇ／であることを特徴とする請求項１〜４
   のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】炭素源が糖であることを特徴とする請求項
   １〜５のいずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】微生物がキサントモナス属（Xanthomona
   s）に属することを特徴とする請求項１〜６のいずれか
   に記載の方法。
8. 【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の方法によ
   って得られる多糖類の発酵液及び粉末。
9. 【請求項９】請求項１〜７のいずれかに記載の方法によ
   って得られた多糖類を石油の促進的回収に使用する方
   法。