CN109705231B - 一种能凝聚石油的微生物胞外多糖 - Google Patents

Abstract

本发明属于石油污染治理领域，具体涉及一种能凝聚石油的微生物胞外多糖。该胞外多糖，重均分子量为26469g/mol，由L‑阿拉伯糖和D‑甘露糖两种单糖按照摩尔比为1.19:5.33组成。本发明的胞外多糖具有石油凝聚的功能，该多糖可将石油凝聚成球状，凝聚降解效率高，应用前景好，为进一步探究石油凝聚降解产品奠定基础。

Description

一种能凝聚石油的微生物胞外多糖

技术领域

本发明属于石油污染治理领域，具体涉及一种能凝聚石油的微生物胞外多糖。

背景技术

随着石油污染问题的加剧，对于石油降解的研究越来越受到人们的关注。尤其水体发生石油污染，包括石油泄漏、油港码头船舶及进入海洋或其他水体中的陆地石油等，因石油密度较小，可漂浮水体表面，随水体流动而快速扩展，造成污染面积的迅速扩大。目前文献报道较多的微生物治理环境石油污染主要集中在利用微生物降解石油，针对海洋漂浮油膜的污染快速扩散问题，利用微生物代谢物对污染油膜进行生物凝聚回收处理则没有报道，本发明不仅解决石油污染问题，还将为污染石油回收再利用提供一种新方法。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种能凝聚石油的微生物胞外多糖。

本发明采用如下技术方案：

一种能凝聚石油的胞外多糖，重均分子量为26469g/mol，由L-阿拉伯糖和D-甘露糖两种单糖按照摩尔比为1.19:5.33组成。

进一步的，所述的D-甘露糖分子量为180.16。

进一步的，所述的L-阿拉伯糖分子量为150.13。

本发明同时请求保护上述微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用。其具体方法为：制备含有膨胀玉米芯(粒度过60目筛)50wt％和含量200mg/g胞外多糖的树脂缓释颗粒，该缓释颗粒可漂浮于水面，利用该缓释颗粒凝聚石油。其中，一种方法是：将树脂缓释颗粒装入细条布袋中，用于圈拦漂浮油膜，漂浮石油将沿着细条布袋凝聚成颗粒，可直接将聚集的颗粒划拨分离出来；另一种方法是：直接将缓释树脂颗粒撒播至油膜中间，油膜会聚集成大小不一的颗粒状，可将凝聚的油膜颗粒及树脂缓释颗粒同时回收。

本发明的胞外多糖具有石油凝聚的功能，该多糖可将石油凝聚成球状，凝聚降解效率高，应用前景好，为进一步探究石油凝聚降解产品奠定基础。

附图说明

图1胞外多糖粗提物经DEAE-52阴离子交换柱层析洗脱图；

图2高效液相色谱法对组分EPS1、EPS2的纯度检测；

图3 EPS1、EPS2分别经Sephadex G150凝胶层析柱分离后的洗脱图；

图4高效液相色谱法对组分EPS1-1(6)的纯度检测；

图5组分EPS1-1(6)单糖组成的TLC检测结果，其中1：D-葡萄糖；2：L-鼠李糖；3：D-甘露糖；4：D-半乳糖；5：D-木糖；6：L-阿拉伯糖；7：待测样品，待测样品的Rf值与单组分标样D-葡萄糖，L-阿拉伯糖和D-甘露糖相近；

图6糖标准品的HPLC图；其中a：D-葡萄糖；b：L-阿拉伯糖；c：D-甘露糖；

图7组分EPS1-1(6)的HPLC图；其中b：L-阿拉伯糖；c：D-甘露糖分别与糖标准品L-阿拉伯糖和D-甘露糖的保留时间一致，组分EPS1-1(6)的单糖组成为L-阿拉伯糖和D-甘露糖，二者摩尔比为1.19:5.33。

图8 EPS1、EPS2对石油的凝聚情况，其中A为去离子水对照，石油漂浮水面形成油膜；B为EPS1，具有石油凝聚功能，C为EPS2，不具有石油凝聚功能；

图9 EPS1-1、EPS2-1对石油的凝聚情况，其中A为去离子水对照，石油漂浮水面形成油膜；B为EPS1-1，具有石油凝聚功能；C为EPS2-1，不具有石油凝聚功能；

图10组分EPS1-1(6)对石油的凝聚情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1

本实施例采用菌株CS07提取胞外多糖，所述的菌株CS07拉丁文学名为Marinobacter maritimus.分类命名：近海海杆菌。所述的菌株CS07采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，富集分离所得。所述的菌株CS07已提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月6日；

保藏编号：CGMCC No.12739；

所述的菌株CS07的形态及理化特征为：菌株CS07在固体LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株CS07的菌落形态，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色。菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm

本实施例具体包括以下步骤：

(1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL。

(2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，用封口膜密封三角瓶口，放置于4℃冰箱中，静置过夜。将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液。

(3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％，封口膜密封瓶口，放置于4℃冰箱，静置24h。醇沉24h后三角瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀。

(4)向溶液中加入0.1％的蛋白酶K(w/v)，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。

(5)将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖。

(5.1)DEAE-52纤维素离子交换层析

①DEAE-52纤维素的预处理：取DEAE-52纤维素2.5g，加入到40mL 0.5mol/LHCl中，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡30min。加入60mL去离子水，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡10min。倒出上层液体，加入60mL去离子水，搅拌静置后弃上清，重复上述步骤1-2次，然后倾入有100目尼龙滤布的漏斗中。用去离子水充分洗涤，直到流出液pH>4。然后加入40mL 0.5mol/L NaOH浸泡30min后，倾倒上清，用去离子水充分洗涤，直到流出液pH≤3。之后加入100mL0.01mol/L Na₂HPO₄浸泡并搅拌，倾去上层液体，重复上述操作，直到溶液pH＝8。

②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的DEAE-52纤维素边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后DEAE-52纤维素必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用0.3mol/L NaCl平衡2-3个柱体积即可上样。

③上样：加样前，需将柱内DEAE-52纤维素上面多余的液体放出，直到柱内液面与纤维素表面相齐为止。样品上样前需过0.45μm滤膜，上样量为4mL，上样后打开下口开始洗脱。

④洗脱：洗脱剂为去离子水、0.3mol/L NaCl、0.6mol/L NaCl、0.9mol/L NaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min，每5mL收集一管，洗脱效果最好。

⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分用截留分子量为3500Da的透析袋透析脱盐，第一次隔3h换一次去离子水，之后每隔6h换一次去离子水，重复3～4次。

如图1所示，胞外多糖粗提物经过DEAE-52阴离子交换柱层析分离后，由去离子水、0.3mol/L NaCl洗脱分别得到2个组分，命名为EPS1和EPS2。EPS1、EPS2的高效液相色谱图如图2所示。组分EPS1和EPS2未达到对称的单一峰，且EPS2两峰之间未达到较好分离，说明EPS1、EPS2经离子交换层析后并未达到预期的纯度，因此，对这两种胞外多糖还需进行进一步的分离纯化。

(5.2)凝胶渗透层析

①Sephadex G150的预处理：取Sephadex G150凝胶粉8g加入到400mL去离子水中，沸水浴4h，冷却至室温，用去离子水洗涤几次去除杂质，超声脱气。

②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的凝胶边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后凝胶必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用NH₄HCO₃平衡2-3个柱体积即可上样。

③上样：加样前，需将柱内凝胶上面多余的液体放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐为止。取(5.1)分离得到的活性组分过0.45μm滤膜后，上样，上样量为2mL，上样后打开下口开始洗脱。

④洗脱：流动相为0.2mol/L NH₄HCO₃，流速0.2mL/min，每3mL收集一管。

⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分旋转蒸发出NH₄HCO₃并浓缩冻干。如图3所示，EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS1-1。EPS2经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS2-1。

组分峰EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析分离后得到组分EPS1-1(6)，采用高效凝胶渗透色谱法对其进行纯度检测，EPS1-1(6)的高效液相色谱图如图4所示，可看出EPS1-1(6)峰型单一且较对称，无杂峰出现，纯度较高。

实施例2

对实施例1得到胞外多糖进行组分分析，将EPS1-1(6)置于螺旋样品瓶中，加入1ml2mol/L的三氟乙酸，旋紧瓶口，110℃水解10h。将水解后的样品在60℃真空旋转浓缩后，再以500ul无菌水溶解，备用。采用薄层色谱(TLC)法和高效液相色谱(HPLC)法分析其组分：

1、薄层色谱法

①点样：取10ul样品点样于10×20CM微晶纤维素板下端约1.5cm处，以5mg/L的果糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖为标准样品，标准样品点样量为2.5ul。

②展层：将点样的微晶纤维素板置于展层缸中，以乙酸乙酯：吡啶：冰醋酸：水＝8:5:1:1.5(V/V)为展层剂，上行法展开。

③显色：显色剂以1.66g邻苯二甲酸、100ml饱和正丁醇、0.9ml苯胺配制而成，于层析板上方10cm处喷雾，110℃加热5min显色。

薄层色谱结果：

多糖经三氟乙酸水解后，薄层层析分析结果见图5。由图5计算得出各个样品的R_f值见表1。图5与表1结果表明，待测样品的R_f值与D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D甘露糖比较接近，说明组成多糖的单糖可能含有这3种单糖。

表1样品的R_f值

2、高效液相色谱法

标准品前处理：将单糖标准品配制成5mg/mL的溶液，过0.22μm水系微孔滤膜，备用。

样品前处理：取水解后样品适量，过0.22μm水系微孔滤膜，按设定色谱条件，记录其色谱图，色谱条件如下：

色谱柱：Purospher STAR NH₂(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1mL/min；流动相：乙腈：水(75：25V/V)；进样量：20μL；漂移管温度：40℃；载气：氮气；柱温：室温；采集时间：40min；检测器：蒸发光检测器(ELSD)。

由图6、7和表2、3结果表明，多糖的单糖可能含有D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D甘露糖这三种单糖，采用高效液相色谱法验证结果表明，初步推测多糖的单糖由L-阿拉伯糖和D-甘露糖组成，摩尔比为1.19:5.33，HPLC色谱图如图6、7所示。

表2标准品及样品的HPLC保留时间

3、单糖组成摩尔比计算：

采用公式m＝f×A计算单糖组成摩尔比。

其中，m为样品质量，f为效应因子，A为峰面积。

由表3及上述公式计算得出，L-阿拉伯糖和D-甘露糖的摩尔比为1.19:5.33。

表3标准品及样品的峰面积

实施例3

采用高效凝胶渗透色谱法测定EPS1-1(6)的重均分子量，高效凝胶渗透色谱法测定条件如下：

色谱柱：Waters Ultrahydrogel^TM 500(7.8×300mm，5μm)；流速：1mL/min；流动相：屈臣氏蒸馏水；柱温：室温；进样量：70μL；采集时间：60min；检测器：激光检测器(LS)、示差光检测器(RI)。

结果显示，EPS1-1(6)的重均分子量(Mw)为26496g/mol。

表4 EPS1-1(6)的绝对分子量测定结果

实施例4

胞外多糖对石油的凝聚作用

取实施例1步骤(4)制备的胞外多糖粗提物EPS1-1、EPS2-1、EPS1-1(6)同时设定去离子水为对照，分别向上述含有胞外多糖粗提物的试管中加入30μL石油，观察石油的凝聚情况。

图8是EPS1、EPS2对石油的凝聚情况，其中A去离子水石油成膜，无凝聚现象；B、EPS1使石油凝聚成球；C、EPS2石油成膜，凝聚现象不明显；

图9是EPS1-1、EPS2-1对石油凝聚情况，其中A去离子水石油成膜，无凝聚现象；B、EPS1对石油的凝聚效果；C、EPS2对石油无凝聚效果。

如图10所示，组分EPS1-1(6)对石油的凝聚效果最好。因此，由L-阿拉伯糖和D-甘露糖两种单糖按照摩尔比为1.19:5.33组成的胞外多糖对石油有凝聚效果的活性组分。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种能凝聚石油的微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用，其特征在于，胞外多糖重均分子量为26469g/mol，由L-阿拉伯糖和D-甘露糖两种单糖按照摩尔比为1.19:5.33组成。

2.根据权利要求1所述的一种能凝聚石油的微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用，其特征在于，所述的D-甘露糖分子量为180.16。

3.根据权利要求1所述的一种能凝聚石油的微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用，其特征在于，所述的L-阿拉伯糖分子量为150.13。

4.根据权利要求1所述的一种能凝聚石油的微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用，其特征在于，制备含有膨胀玉米芯50wt％和含量200mg/g胞外多糖的树脂缓释颗粒，该树脂缓释颗粒可漂浮于水面，利用该树脂缓释颗粒凝聚石油。

5.根据权利要求4所述的一种能凝聚石油的微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用，其特征在于，将树脂缓释颗粒装入细条布袋中，用于圈拦漂浮油膜，漂浮石油将沿着细条布袋凝聚成颗粒，可直接将聚集的石油颗粒划拨分离出来。

6.根据权利要求4所述的一种能凝聚石油的微生物胞外多糖对漂浮石油凝聚的应用，其特征在于，将树脂缓释颗粒撒播至油膜中间，油膜会聚集成颗粒状，将凝聚的油膜颗粒及树脂缓释颗粒同时回收。

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