JPH06331629A

JPH06331629A - 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤およびこれを用いた糖化ヘモグロビンの測定法

Info

Publication number: JPH06331629A
Application number: JP11844493A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Takechi; 昌裕武智
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1993-05-20
Filing date: 1993-05-20
Publication date: 1994-12-02

Abstract

(57)【要約】【構成】アンモニア、もしくは炭素数１〜６の１級ま
たは２級アミンの窒素原子上の少なくとも１つの水素原
子がメチレンホスホン酸基またはその塩で置換されてな
る化合物からなる不安定型糖化ヘモグロビン解離剤であ
る。【効果】検体中のＨｂＡ_lcのうちのＬ−ＨｂＡ_lcが速
やかに除去され、Ｓ−ＨｂＡ_lcのみが精度良く簡便にか
つヘモグロビンを変性させることなく短時間のうちに測
定される。Ｓ−ＨｂＡ_lcは一時的な血糖の上昇もしくは
下降に左右されずに比較的安定して血液中に存在するた
め、この測定値はより信頼度の高い糖尿病の指標となり
得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液中の糖化ヘモグロ
ビン、特にヘモグロビンＡ_lcの測定において用いられる
不安定型糖化ヘモグロビンの解離剤、および、それを用
いた糖化ヘモグロビンの測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖尿病の指標の一つとして、血液中に含
まれる糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ_lc（以下
ＨｂＡ_lcと略記する）が知られ、臨床検査の分野におい
て、その測定が広く行われている。

【０００３】ＨｂＡ_lcは患者の約２ケ月前の血糖値と良
く相関することから、糖尿病病態の重要な指標の一つと
して、その臨床的意義が高まってきている。

【０００４】このＨｂＡ_lcは下記式に示されるように、
ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端に存在するバリンのアミノ基
にグルコースが非酵素的に結合した複合体である。ヘモ
グロビンのアミノ基にグルコースが結合すると、まず、
下記反応式に示すように、シッフ塩基である不安定型Ｈ
ｂＡ_lc（Ｉ）（以下Ｌ−ＨｂＡ_lc略記する）が形成され
る。

【０００５】

【化１】上記式においてβ−Ａ−ＮＨ₂はヘモグロビンＡ_oを示
し、その中のＮＨ₂は該ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端であ
るバリンのアミノ基を示す。

【０００６】このＬ−ＨｂＡ_lc（Ｉ）の生成反応は可逆
反応であり、しかも反応速度が早いため、グルコース濃
度に応じて平衡がＬ−ＨｂＡ_lc（Ｉ）の生成方向（→
方向）、もしくは解離方向（←方向）に傾く。すなわ
ち、血中のグルコース濃度（つまり血糖値）によりその
量が大きく左右される。Ｌ−ＨｂＡ_lc（Ｉ）は、さらに
アマドリ転移を経て、こんどは不可逆的に安定型ヘモグ
ロビンＡ_lc（II）（以下Ｓ−ＨｂＡ_lc略記する）に変化
する。このＳ−ＨｂＡ_lc（II）はＬ−ＨｂＡ_lc（Ｉ）の
ようにグルコース濃度による影響を受けることなく安定
している。

【０００７】ＨｂＡ_lcは、例えば高速液体クロマトグラ
フィーによりヘモグロビンを各ヘモグロビン成分に分離
し、その吸光度を測定することにより定量され得るが、
上記のＳ−ＨｂＡ_lcおよびＬ−ＨｂＡ_lcを、クロマトグ
ラム上で完全に分離して測定することは現在のところ困
難とされている。そのためＨｂＡ_lcの測定値を安定した
値で得ることはできない。なぜなら、Ｌ−ＨｂＡ_lcの量
はグルコース（つまり血糖）量により変化し、該血糖値
は食事や運動により急激かつ大幅に変化するためであ
る。

【０００８】このようにＨｂＡ_lcには、ふつうＬ−Ｈｂ
Ａ_lcとＳ−ＨｂＡ_lcの両成分が含まれるが、上記のよう
な欠点を解消するため、血液検体からＬ−ＨｂＡ_lcを除
去し、Ｓ−ＨｂＡ_lcのみを測定する試みがなされてい
る。例えば、David M.Nathanら、Clin. Chem.,28,512(1
982)には、セミカルバジドおよびアニリンをＬ−ＨｂＡ
_lcの除去剤として用い、ｐＨ５．０で温度３８℃にて３
０分間血液検体を処理することが報告されている。しか
し、このようにＬ−ＨｂＡ_lcの除去反応は比較的高温下
で（３８℃）かつ長時間なされるため、ヘモグロビンの
変性（例えば脱ヘム）を生じる恐れがある。例えば、イ
オン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンを観察
すると、脱ヘムによる退色に起因するピーク強度の低下
や、ＨｂＡ _laとＨｂＡ_lb（ＨｂＡ_la＋b）の溶出位置に
起因するピークの増大が見られる。また、試薬が不安定
なため、使用時ごとの用時調製が必要であり、操作が煩
雑である。

【０００９】特開昭５８−２１００２４号公報には、ジ
ヒドロキシボリル化合物（ホウ酸化合物）がＬ−ＨｂＡ
_lcの除去剤として開示されている。このジヒドロキシボ
リル化合物はグルコースのＯＨ基をエステル化するた
め、グルコースが系内から除去され、その結果、Ｌ−Ｈ
ｂＡ_lcの解離が進行する。しかし、Ｌ−ＨｂＡ_lcを除去
するためには、比較的高濃度のジヒドロキシボリル化合
物が必要である。例えば、該ジヒドロキシボリル化合物
を含む溶離液を用いて、溶血させた血液を含む試料液中
で約０．１〜１．０Ｍ溶血物を溶出させる場合には、同
化合物は該溶離液中に０．０１〜０．１５Ｍの割合で含
有されることが必要である。しかし、このような高濃度
のジヒドロキシボリル化合物が含有されると、溶離液を
イオン交換クロマトグラフィーにかける場合に、使用す
る溶離液のイオン強度が通常の場合とは異なるため、分
離条件が変化し測定が困難になるか、または測定条件の
補正が必要となる。

【００１０】特開昭６３−２９８０６３号公報には、迅
速でかつヘモグロビンの変性のないＬ−ＨｂＡ_lc解離法
として、リン酸縮合体であるポリリン酸を使用すること
が開示されている。また、特開平２−２５９４６７号公
報にはフィチン酸を使用することが開示されている。し
かし、ポリリン酸やフィチン酸は、水溶液として長期間
保存すると加水分解することが知られており、最終的に
はＬ−ＨｂＡ_lc解離効果のない物質に変化するという問
題点がある。例えば、ポリリン酸は加水分解により、Ｌ
−ＨｂＡ_lc解離効果のないモノオルトリン酸に、フィチ
ン酸も加水分解により、Ｌ−ＨｂＡ_lc解離効果のないモ
ノオルトリン酸とイノシトールに変化してしまう。この
保存中の加水分解には温度加速性がある。例えば、０．
１ｗ／ｖのテトラポリリン酸水溶液（ｐＨ６．０）を４
℃で保存する場合、１年余りでもほとんど変化がみられ
ないが、３７℃で保存する場合には、数カ月で５０％以
上のポリリン酸が加水分解し、６０℃で保存する場合に
は、２〜３週間でほとんどのポリリン酸が加水分解し、
Ｌ−ＨｂＡ_lc解離効果をまったく示さなくなる。このた
め、水溶液として長期間保存する場合には、その保存条
件に注意を要するという問題がある。

【００１１】その他のＬ−ＨｂＡ_lcの除去方法として
は、血液検体を希釈してグルコース濃度を下げ、Ｌ−Ｈ
ｂＡ_lcの解離を促進させる方法がある。例えば、Klenk.
D.C.ら、Clin. Chem.,28,2088(1982) には、赤血球を大
過剰の生理食塩水で３７℃、インキュベーションするこ
とでＬ−ＨｂＡ_lcを除去する方法が報告されている。そ
の他にも、赤血球を等張リン酸緩衝液を用いて数時間イ
ンキュベーションする方法や、溶血産物を透析する方法
などが知られているが、これらの方法はいずれも処理に
長時間を必要とするため、臨床検査のための方法として
は適当でない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
欠点を解決すべくなされたものであり、その目的とする
ところは、被検査試料である血液検体中のＳ−ＨｂＡ_lc
のみを、精度良く簡便に、かつヘモグロビンを変性させ
ることなく測定でき、かつ保存安定性の優れたＬ−Ｈｂ
Ａ_lcの解離剤、および、それを用いたＨｂＡ_lcの測定法
を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明のＬ−ＨｂＡ_lc解
離剤は、血液中の糖化ヘモグロビンの測定に用いられ、
該解離剤がアンモニア、または、炭素数１〜６の１級ま
たは２級アミンの窒素原子上の少なくとも１つの水素原
子が、メチレンホスホン酸基（−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）ま
たはその塩で置換されてなる化合物を主成分とし、Ｌ−
ＨｂＡ_lcをヘモグロビンＡ_oとグルコースとに解離しう
るＬ−ＨｂＡ_lc解離剤であることを特徴とする。

【００１４】また、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方
法は、被検査試料である赤血球分散液および／またはヘ
モグロビンを含むその溶血産物を、上記解離剤を含む解
離用緩衝液と接触させることにより、該赤血球分散液お
よび／またはヘモグロビンを含むその溶血産物中に存在
するＬ−ＨｂＡ_lcを、ヘモグロビンＡ_oとグルコースに
解離させる工程、および、該解離後の試料中に存在する
ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを、クロマトグラ
フィー法で各ヘモグロビン成分に分離し、該試料中に存
在するＳ−ＨｂＡ_lcを測定する工程、を包含する。

【００１５】当該解離剤の基本構造は、アンモニア、ま
たは、炭素数１〜６の１級または２級アミンであること
が必要である。該アミンとしては炭素数１〜６の直鎖ア
ルキレンジアミン、ジアミノシクロヘキサン、ジエチレ
ントリアミン、トリエチレンテトラアミン、グリコール
エーテルジアミンなどが好適である。該アミンにはアル
キルモノアミンも含まれるが、上記のジアミンやトリア
ミン、テトラアミンの方がメチレンホスホン酸基または
その塩の置換部位が相対的に多いためより好適である。

【００１６】これら以外にも、上記の分子中の水素原子
が低級アルキル基、水酸基（−ＯＨ）などで置換された
構造のものも、同様の目的のために使用可能である。例
えば、エチレンジアミンの１置換体として、炭素原子に
メチル基が導入された１，２−ジアミノプロパン、プロ
ピレンジアミンの１置換体として、同じく水酸基が導入
された１，３−ジアミノ−２−プロパノールなどがあ
り、これらも当該解離剤の基本構造になりえる。

【００１７】当該解離剤は、これらの基本構造を有する
化合物に含まれる窒素原子上の少なくとも１つの水素原
子が、メチレンホスホン酸基またはその塩で置換されて
なる化合物であることを特徴としているが、これらメチ
レンホスホン酸基で置換された化合物の製造方法として
は、古くから種々の方法が知られている。

【００１８】例えば、Irani.R.R.ら、J.Org.Chem.31.16
03(1966)によって開発された方法が挙げられるが、これ
はアミン、ホルマリンおよび亜リン酸のMannich 反応を
利用したものであり、ホスホン酸誘導体の優れた合成法
の一つとして知られている。また、Motekaitis.R.J.
ら、J.inorg.nucl.Chem.33 3353(1971) の報告する方法
も、当該解離剤の合成法として利用できる。これは、ク
ロロメチレンホスフィン酸（Ｃｌ−ＣＨ₂ＰＯ₂Ｈ）を
用いて、まずアミノ基の水素原子をメチレンホスフィン
酸基（−ＣＨ₂ＰＯ₂Ｈ）で置換し、続いて塩化水銀を
加えて加熱し、メチレンホスフィン酸をメチレンホスホ
ン酸（−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂）に酸化する方法であり、得
られるメチレンホスホン酸置換体の純度も高く、好まし
い。

【００１９】これらの合成法を利用することにより、上
記基本構造中にメチレンホスホン酸基を導入した種々の
置換体が合成でき、これらを本発明の不安定型糖化ヘモ
グロビン解離剤として使用できる。

【００２０】これらの種々の置換体のうち、本発明の当
該解離剤として特に好ましいものとしては、例えば、下
記構造式で示す化合物およびそれらの塩類が挙げられ
る。

【００２１】ニトリロトリメチレンホスホン酸（III ：Nitrilotris-(methylenephosphonic acid ）、
以後NTPOと略す）、エチレンジアミンジメチレンホスホン酸（IV：Ethylenediamine-N,N'-di(methylenephosphonic
）acid、以後EDDPO と略す）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（Ｖ：Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra （methylenep
hosphonic)acid、以後EDTPO と略す）、ヘキサメチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（VI：Hexamethylenediamine-N,N,N',N'-tetra(methyle
nephosphonic)acid ）、ジアミノシクロヘキサンテトラメチレンホスホン酸（VII ：1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetra(met
hylenephosphonic)acid）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（VIII：Diethylenetriamine-N,N,N',N''-N''-penta(me
thylenephosphonic)acid）、トリエチレンテトラミンヘキサメチレンホスホン酸（IX：Triethylenetetramine-N,N,N',N'',N''',N'''-he
xa(methylenephosphonic)acid ）、グリコールエーテルジアミンテトラメチレンホスホン酸（Ｘ：O,O'-Bis-(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,
N',N'-tetra(methylenephosphonic)acid）、ジアミノプロパノールテトラメチレンホスホン酸（XI：1,3-Diamino-2-hydroxypropane-N,N,N',N'- tetr
a(methylenephosphonic)acid）、ジアミノプロパンテトラメチレンホスホン酸（XII ：１，２−Diaminopropane-N,N,N',N'-tetra(met
hylenephosphonic)acid）。

【００２２】また、当該解離剤において、メチレンホス
ホン酸基またはその塩で置換されている水素原子以外の
水素原子が、メチレンホスホン酸基以外の官能基で置換
されている場合、それがＬ−ＨｂＡ_lcの解離作用に対し
特に大きな影響を与えない置換基であれば、そのような
化合物も本発明の解離剤を構成することができる。これ
らの置換基の例としては酢酸基（−ＣＨ₂ＣＯＯＨ）、
水酸基、低級アルキル基などが挙げられる。例えば、メ
チレンホスホン酸基と酢酸基を２個ずつ有する化合物で
ある、エチレンジアミン二酢酸ジメチレンホスホン酸
（XIII：Etylenediamine-N,N'-di(acetic)-N,N'-di(met
hylenephosphonic）acid）が挙げられる。

【００２３】

【化２】

【化３】

【化４】しかし、これらのホスホン酸置換物質のうち、高純度の
ものが入手困難であったり、合成上や精製上の困難さか
ら信頼できる試薬が限られているものもあるが、特にＮ
ＴＰＯ、ＥＤＤＰＯ、ＥＤＴＰＯはキレート試薬として
現に市販されているものもあり、入手もしやすく、当該
解離剤として最も好ましい。

【００２４】当該解離剤は、アンモニア、または、前記
１級または２級アミンの窒素原子上の少なくとも１つの
水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ₂ＰＯ
₃Ｈ₂）またはその塩で置換されてなる化合物である
が、メチレンホスホン酸基が多いほどその解離効果は強
くなる。例えば、エチレンジアミンには２つのアミノ基
が存在するが、このアミノ基のそれぞれ１つずつの水素
原子がメチレンホスホン酸基で置換されたＥＤＤＰＯ
と、すべてのアミノ基の水素原子がメチレンホスホン酸
基で置換されたＥＤＴＰＯでは、後者の方がより強力な
Ｌ−ＨｂＡ_lc解離効果を発現する。

【００２５】また、当該解離剤のメチレンホスホン酸置
換物質は、その塩であっても同等のＬ−ＨｂＡ_lc解離効
果を発現する。塩の種類は特に限定されないが、例えば
アルカリ金属やアルカリ土類金属の塩が用いられ、特に
Ｎａ塩、Ｋ塩などが好適である。

【００２６】また、これらのメチレンホスホン酸置換物
質およびその塩を一種類のみ単独で用いても、あるい
は、二種類以上併用して用いても構わない。

【００２７】これらのメチレンホスホン酸置換物質にお
いて、分子中の炭素数が６よりも大きくなるとＬ−Ｈｂ
Ａ_lc解離効果は少なくなり、あまり適当ではない。

【００２８】本発明では、被検査試料である赤血球分散
液および／またはヘモグロビンを含有するその溶血産物
と、当該解離剤を含む解離用緩衝液とを接触させること
により、Ｌ−ＨｂＡ_lcの解離が達成される。

【００２９】解離用緩衝液は、本発明による糖化ヘモグ
ロビンの測定法のｐＨ範囲を維持するために用いられる
緩衝液に当該解離剤を含有させたものであり、これを被
検査試料と混合することにより、被試料中に含まれるＬ
−ＨｂＡ_lcの解離がなされるものである。該緩衝液の組
成は、ｐＨ４〜７の範囲で緩衝能を有するものであれば
使用でき、特に限定されないが、リン酸緩衝液やクエン
酸緩衝液、フタル酸緩衝液などが好ましい。

【００３０】赤血球分散液としては、全血、洗浄赤血
球、赤血球濃厚液などが該当する。また、ヘモグロビン
を含有するその溶血産物とは、前記赤血球分散液中の赤
血球を何らかの方法で溶血させ、ヘモグロビンを赤血球
膜外に溶出させた処理液を意味する。赤血球分散液は後
述のクロマトグラフィーのカラムに導入される以前に溶
血させる必要がある。

【００３１】当該解離剤は、被検査試料中に含まれる各
ヘモグロビン成分が、クロマトグラフィーのカラム中で
イオン交換により分離され、カラム外に溶出される以前
に、赤血球分散液および／またはヘモグロビンと接触さ
せられることにより、Ｌ−ＨｂＡ_lc解離効果を生ずる。
従って当該解離剤は、被検査試料を適当な濃度に希釈す
るための希釈液、溶血剤を含む溶血用緩衝液、クロマト
グラフィーに用いられる溶離液などに含まれていてもよ
く、このような溶液や溶離液もまた、上記解離用緩衝液
である。

【００３２】例えば、通常、糖化ヘモグロビンの測定に
は全血が用いられるが、全血は赤血球分散液であるた
め、糖化ヘモグロビン測定を行う際、赤血球をまず溶血
させる必要がある。この場合、溶血剤を含む溶血用緩衝
液に当該解離剤を含有させて使用すると、Ｌ−ＨｂＡ_lc
の解離と溶血操作を同時に行うことができるので最も好
ましい。溶血用緩衝液に含まれる溶血剤としては、特に
界面活性剤が好ましく、例えばポリオキシエチレンアル
キルアリールエーテル、高級脂肪族アルコール、スルホ
ネート化合物およびサルフェート化合物のポリオキシエ
チレンエーテル、ソルビット脂肪酸エステルのポリオキ
シエチレン付加体などが例示される。溶血剤の使用量
は、その種類などによっても異なるが、通常、血液１ｍ
ｌあたり１０〜２００ｍｇである。例えば、溶血剤を１
ｗ／ｖ％の割合で含有する溶血用緩衝液を用いる場合は
血液１ｍｌあたり１〜２００ｍｌの割合、溶血剤を０．
０１ｗ／ｖ％の割合で含有する溶血用緩衝液を用いる場
合は血液１ｍｌあたり１００〜５００ｍｌの割合で、そ
れぞれ同緩衝液を添加し、穏やかに攪拌することにより
溶血させることができる。溶血剤が過剰であるとクロマ
トグラフィーによるヘモグロビンの分画が困難となる。

【００３３】その他、解離剤は、例えば被検査試料の赤
血球分散液、その溶血産物、ヘモグロビン溶液に固体の
まま添加されてもよい。この解離剤は速やかに溶解し、
被検査試料中のヘモグロビンは解離用緩衝液と接触す
る。

【００３４】本発明の解離剤を用いたＨｂＡ_lc測定方法
のうち、該解離剤を含有する解離用緩衝液で被検査試料
を処理し、Ｌ−ＨｂＡ_lcを解離させた後、クロマトグラ
フィー法でヘモグロビンの各成分を分離・測定する方法
について説明する。この場合、解離用緩衝液は被検査試
料を適当な濃度に希釈するための希釈液、あるいは溶血
剤を含む溶血用緩衝液などとして使用される。

【００３５】上記解離用緩衝液中に含まれる当該解離剤
の量は、過少であるとＬ−ＨｂＡ_lcの解離効果が得られ
ず、過剰であるとクロマトグラフィー分離時における分
離が困難となる。その含有量は、その種類や測定時の条
件（血液の溶血などの前処理方法、ｐＨ条件や反応温度
など）によっても異なるが、ＥＤＴＰＯやＮＴＰＯの場
合、ふつう、解離用緩衝液中に当該解離剤を約０．０１
〜２．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１〜１．０ｗ／ｖ％
の割合になるように添加する。ＥＤＤＰＯの場合はＥＤ
ＴＰＯに比べてＬ−ＨｂＡ_lc解離効果が少ないので、当
該解離剤を上記の２〜３倍添加するのが好ましい。

【００３６】被検査試料と解離用緩衝液との接触時のｐ
Ｈは、酸性側であるほどＬ−ＨｂＡ _lcの解離速度は上昇
するが、ｐＨが低すぎるとヘモグロビンの変性が生じ
る。さらに、極端にｐＨが高いか低い条件ではクロマト
グラフィーによるヘモグロビンの分離が困難になる。従
って、通常、被検査試料および解離用緩衝液の混合液の
ｐＨは４．６〜７．０、好ましくは５．３〜６．５とな
るように調整される。被検査試料と解離剤との接触時間
は解離剤の種類や濃度、ｐＨ条件や反応温度などにより
異なるが、通常、室温においては１０分以上、好ましく
は１０〜３０分である。この接触時間は、温度を上げる
ことにより短縮することが可能であり、例えば３７℃に
て約３〜７分、５０℃にて約１〜３分間インキュベーシ
ョンすることでＬ−ＨｂＡ_lcを解離することができる。

【００３７】このように処理された被検査試料は、各種
のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換を利用した
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけられ、
ヘモグロビンの各成分が分離・溶出され測定される。

【００３８】次に、解離用緩衝液として当該解離剤が含
有されて成る溶離液を用いて、被検査試料をクロマトグ
ラフィーにかけ、Ｌ−ＨｂＡ_lcを解離させる方法につい
て説明する。

【００３９】溶離液を構成する緩衝液としては、ｐＨ４
〜７．５の範囲で緩衝能を有するもので、クロマトグラ
フィーの分離に影響を及ぼさないものであれば使用で
き、特に限定されないが、リン酸緩衝液やクエン酸緩衝
液、フタル酸緩衝液などが好ましい。

【００４０】この場合、解離用緩衝液である溶離液のｐ
Ｈは、ヘモグロビンを変性させず、かつクロマトグラフ
ィーにより容易にＨｂＡ_lcが分離されて測定され得るよ
うな範囲であればよく、通常、ｐＨ５．０〜７．５の範
囲が選択される。また、本溶離液に含まれる当該解離剤
の含有量は、その種類や測定時の条件（血液の溶血など
の前処理、ｐＨ条件やカラム温度など）によっても異な
るが、ＥＤＴＰＯやＮＴＰＯの場合、一般に溶離液中に
当該解離剤を約０．００１〜１．０ｗ／ｖ％、好ましく
は０．０１〜０．２ｗ／ｖ％の割合になるように添加さ
れる。ＥＤＤＰＯの場合はＥＤＴＰＯに比べてＬ−Ｈｂ
Ａ_lc解離効果が少ないので、当該解離剤を上記の２〜３
倍添加するのが好ましい。

【００４１】この時、被検査試料がクロマトグラフィー
のカラムを通過する間に、含有されるＬ−ＨｂＡ_lcが当
該解離剤と接触することにより解離され、次いで各ヘモ
グロビン成分に分離されて溶出され測定される。

【００４２】また、当該解離剤は、溶血用緩衝液などと
溶離液の両者に含有させることも可能であり、この場合
は特に効果的にＬ−ＨｂＡ_lcの解離がなされる。

【００４３】本発明によるＬ−ＨｂＡ_lcの解離作用は、
ヘモグロビン上の２．３−ＤＰＧポケットの性質に起因
すると考えられる。２，３−ＤＰＧポケットに関して
は、Banesch ら（Biochem.Biophys.Res.Commun.,26,16
2,1967 ）；Chanutinら、（Arch.Biochem.Biophys.,12
1:96,1967 ）などにより詳しく報告されている。この
２，３−ＤＰＧポケットはヘモグロビンのβ鎖のヒスチ
ジン、リジンなどの塩基性アミノ酸残基、および、ヘモ
グロビンのβ鎖Ｎ末端バリンによって形成されており、
カチオン性を帯びていることが知られている。このポケ
ット中にグルコースが入り込んでβ鎖Ｎ末端バリンと結
合し、ＨｂＡ_lcを生成すると考えられている。本発明の
解離剤はアニオン性を有し、かつその分子形状が立体的
に適切であるため、上記２，３−ＤＰＧポケットに対し
て強力な新和性を有する。このため本発明の解離剤は、
ヘモグロビンと可逆的に結合しているグルコースと競合
して、２，３−ＤＰＧポケットに入り込み、これを追い
出してしまうと考えられ、その結果、Ｌ−ＨｂＡ_lcの解
離が促進される。しかし、不可逆的に結合しているグル
コースは追い出すことができない。

【００４４】このようにして本発明の解離剤によるＬ−
ＨｂＡ_lc解離作用によりＬ−ＨｂＡ _lcが被検査試料中か
ら選択的に除去され、Ｓ−ＨｂＡ_lcのみが試料中に残留
する。

【００４５】本発明の解離剤は、低濃度かつ短時間のう
ちに、Ｌ−ＨｂＡ_lcをヘモグロビンＡ_oとグルコースに
解離するので、ヘモグロビンのイオン交換クロマトグラ
フィーによる溶出パターンに悪影響を与えない。そのた
め上記Ｓ−ＨｂＡ_lcは、従来と同様の方法でイオン交換
クロマトグラフィーにより分離され、精度良く測定され
る。

【００４６】また、当該解離剤は、先行文献に開示され
ているポリリン酸やフィチン酸と比べて化学的にもかな
り安定であり、その水溶液である解離用緩衝液も、ポリ
リン酸水溶液やフィチン酸水溶液と比べて保存安定性の
面で優れている。このため、冷所保存など保存上の注意
の必要性も少ない。

【００４７】

【実施例】以下に本発明を実施例につき説明する。

【００４８】測定方法以下の実施例において、ＨｂＡ_lc値測定は、（株）京都
第一科学製のＡｕｔｏ−Ａ_lcＨＡ−8121を用いて溶血モ
ードにより行った。

【００４９】このＡｕｔｏ−Ａ_lcＨＡ−8121はＨＰＬＣ
による糖化ヘモグロビン測定専用装置であり、本装置専
用の陽イオン交換樹脂を充填した分離カラムにより、各
ヘモグロビン成分を４分間で分離して溶出する。溶出用
緩衝液には本装置専用の溶離液（リン酸緩衝液）を使用
した。溶血には本装置専用の溶血用緩衝液（溶血剤を含
有する）を用いた。その他の使用方法の詳細は本測定装
置の取扱い説明書に従った。この装置を用いたヘモグロ
ビンの溶出パターン例を図１に示す。図１において、Ｐ
１およびＰ２はＨｂＡ_lcおよびＨｂＡ_lb（Ｈｂ
Ａ_la＋b）に起因するピーク、ハッチング部のＰ３はＨ
ｂＡ_lc、そしてＰ４はその他のヘモグロビン（Ｈｂ
Ａ_lc）に起因するピークである。Ｐ５は胎児ヘモグロビ
ン（ＨｂＦ）と呼ばれる成分で通常糖化ヘモグロビンに
は含めない。Ｌ−ＨｂＡ_lcは、Ｐ３とＰ５の間に存在す
るピーク中に含まれるが、Ｐ３から完全に分離されてい
ないことがわかる。

【００５０】ここで、ＨｂＡ_lc％は次式で算出され、測
定値は小数点１桁の％値として自動的にプリントアウト
される。

【００５１】

【数１】本実施例においては同一人（健常人）の血液を使用し、
採血後直ちに適量のヘパリンを添加したものを新鮮血液
として用いた。

【００５２】リファレンス値の測定ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌ中に溶血
剤としてポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエー
テル（和光純薬工業（株）から入手）０．１ｇを添加し
て溶血用緩衝液を調製した。この溶血用緩衝液４５０μ
ｌに、採血した直後の新鮮血液３μｌを加えて溶血さ
せ、上記方法により、直ちにＨｂＡ_lc％（Ｌ型およびＳ
型を含む）を測定したところ、５．０％であった。この
値を、Ｌ−ＨｂＡ_lcの全く除去されていない場合、すな
わち１００％Ｌ−ＨｂＡ_lcを含むときのブランク値とし
た。

【００５３】次に、新鮮血液１０ｍｌを遠心分離して得
た赤血球約５ｍｌを８／３２inchセロファンチューブ
（和光純薬工業（株）から入手）に入れ、生理食塩水１
００ｍｌを用いて、３７℃で５時間インキュベーション
した。この赤血球を１．５μｌ採取し、４５０μｌの上
記溶血用緩衝液を加えて溶血させ、直ちに同様の方法で
ＨｂＡ_lc％を測定したところ、４．３％であった。この
値を、Ｌ−ＨｂＡ_lcが完全に除去された場合のＨｂＡ_lc
％、すなわち１００％Ｓ−ＨｂＡ_lc％に相当するとし
た。

【００５４】実施例１５０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌ中に溶血剤としてポリ
オキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル（和光純
薬工業（株）から入手）０．１ｇを加え、これに解離剤
としてＥＤＴＰＯ（（株）同人化学研究所から入手）を
０．２ｇ溶解させた。ｐＨは、１Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液と１Ｎリン酸水溶液を適宜加えて６．０に調整し、
溶血剤を含む解離用緩衝液を得た。この解離用緩衝液４
５０μｌに新鮮血液３μｌを添加して溶血させ、この溶
血産物を室温で約２０分間インキュベーションしてＬ−
ＨｂＡ_lcの解離を行った。このサンプルのＨｂＡ_lc％を
上記測定方法に従って測定したところ、４．３％であっ
た。同様に調製した溶出血産物を、５０℃で２分間イン
キュベーションしたあと、ＨｂＡ_lc％を上記測定方法に
従って測定したところ、４．３％であった。

【００５５】また、分画されたヘモグロビンピークの総
面積は、リファレンス測定時の総面積の９７％であり、
ほとんど変化はなかった。

【００５６】以上より、ＥＤＴＰＯにより、ヘモグロビ
ンを変性させることなく、Ｌ−ＨｂＡ_lcがほとんど完全
に解離されていることがわかる。

【００５７】実施例２実施例１に準じ、５０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌ中に
溶血剤としてポリオキシエチレン(10)オクチルフェニル
エーテル（和光純薬工業（株）から入手）０．１ｇを加
え、解離剤としてＮＴＰＯ（（株）同人化学研究所から
入手）を０．２ｇ溶解させ、実施例１と同様にｐＨを調
整し、解離用緩衝液を得た。この解離緩衝液４５０μｌ
に新鮮血液３μｌを添加し、室温で約２０分間放置して
溶血ならびにＬ−ＨｂＡ_lcの解離を行った。このサンプ
ルのＨｂＡ_lc％を測定したところ、４．４％であった。
同様に調製した溶血産物を５０℃で２分間インキュベー
ションしたあと、ＨｂＡ_lc％を測定したところ、４．３
％であった。

【００５８】また、分画されたヘモグロビンピークの総
面積についても、実施例１と同等の結果が得られた。

【００５９】以上より、ＮＴＰＯについてもＥＤＴＰＯ
と同様のＬ−ＨｂＡ_lc解離能力があることがわかる。

【００６０】実施例３実施例１に準じ、５０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌ中に
溶血剤としてポリオキシエチレン(10)オクチルフェニル
エーテル（和光純薬工業（株）から入手）０．１ｇを加
え、解離剤としてＥＤＤＰＯ（（株）同人化学研究所か
ら入手）を０．５ｇ溶解させ、実施例１と同様にｐＨを
調整し、解離用緩衝液を得た。この解離用緩衝液４５０
μｌに新鮮血液３μｌを添加し、室温で約２０分間放置
して溶血ならびにＬ−ＨｂＡ_lcの解離を行った。このサ
ンプルのＨｂＡ_lc％を測定したところ、４．４％であっ
た。同様に調製した溶血産物を５０℃で２分間インキュ
ベーションしたあと、ＨｂＡ_lc％を測定したところ、
４．４％であった。

【００６１】また、分画されたヘモグロビンピークの総
面積についても、実施例１と同等の結果が得られた。

【００６２】以上より、ＥＤＤＰＯについてもＥＤＴＰ
Ｏと同様のＬ−ＨｂＡ_lc解離能力があることがわかる。

【００６３】実施例４リン酸緩衝液からなるＨｂＡ_lc測定用専用溶離液Ａ液
（積水化学工業株式会社製）にＥＤＴＰＯを０．１ｗ／
ｖ％によるように添加し、解離用緩衝液として解離剤を
含有する溶離液を得た。別に、実施例１と同様の（解離
剤を含有しない）溶血用緩衝液を調製し、これを用い
て、新鮮血液を実施例１と同様に溶血させた。この試料
を速やかに本溶離液を用いてクロマトグラフィーにかけ
てＨｂＡ_lc％を測定したところ、溶出パターンは実施例
１の解離用緩衝液を用いた場合とほぼ同様であり、Ｈｂ
Ａ_lc％は４．４％であった。

【００６４】また、分画されたヘモグロビンピークの総
面積についても、実施例１と同等の結果が得られた。

【００６５】以上より、本発明の解離剤を含有する溶離
液を用いても充分にＬ−ＨｂＡ_lcが除去されることがわ
かる。

【００６６】実施例５実施例１で調製した解離用緩衝液を６０℃のインキュベ
ーターに入れ、２０日間加温した。この解離用緩衝液４
５０μｌに新鮮血液３μｌを添加して溶血させ、この溶
血産物を室温で約２０分間インキュベーションした後、
このサンプルのＨｂＡ_lc％を上記測定方法に従って測定
したところ、４．４％であった。同様に調製した溶血産
物を５０℃で２分間インキュベーションしたあと、Ｈｂ
Ａ_lc％を上記測定方法に従って測定したところ、４．４
％であった。

【００６７】また、分画されたヘモグロビンピークの総
面積についても、実施例１と同等の結果が得られた。

【００６８】以上より、ＥＤＴＰＯは、６０℃で２０日
間放置してもＬ−ＨｂＡ_lc解離能力にはほとんど影響し
ていないことがわかる。

【００６９】比較例１実施例１のＥＤＴＰＯの代わりにセミカルバジド塩酸塩
（和光純薬工業（株）から入手）０．０１Ｍ、アニリン
（和光純薬工業（株）から入手）０．００４Ｍを添加
し、実施例１と同様の方法でｐＨを５．０に調整して、
溶血剤を含む解離用緩衝液を得た。この解離用緩衝液４
５０μｌに新鮮血液３μｌを添加し、３８℃で３０分間
インキュベーションしたあと、ＨｂＡ_lc％を測定したと
ころ、４．５％であった。しかし、分画パターンは、か
なり変化しており、ヘモグロビンピークの総面積は、リ
ファレンスの７０％であった。同様に調製した溶血産物
を５０℃で２分間インキュベーションしたあと、ＨｂＡ
_lc％を測定したところ、４．８％であった。

【００７０】以上より、反応温度を挙げても、反応時間
を短縮できないことがわかる。

【００７１】比較例２実施例１のＥＤＴＰＯの代わりにホウ酸（和光純薬工業
（株）から入手）を１ｗ／ｖ％になるように添加し、実
施例１と同様の方法でｐＨを５．０に調整して、溶血剤
を含む解離用緩衝液を得た。この解離用緩衝液４５０μ
ｌに新鮮血液３μｌを添加して溶血させた。この溶血産
物を６０℃で５分間インキュベーションしたあと、実施
例１と同様にして、ＨｂＡ_lc％を測定したところ、４．
３％であった。しかし、同様にして調製した溶血産物
を、室温で２０分間インキュベーションしたあと、Ｈｂ
Ａ_lc％を測定したところ、４．７％であった。

【００７２】また、ホウ酸濃度を０．１ｗ／ｖ％とした
解離用緩衝液を用いて溶血させ、この溶血産物を６０℃
で５分間インキュベーションしたあと、同様の測定を行
ったところ、ＨｂＡ_lc含量は４．７％になった。このよ
うに、ホウ酸が低濃度である場合や、加温温度が不充分
の場合、Ｌ−ＨｂＡ_lc解離能力が低下することがわか
る。

【００７３】比較例３実施例１のＥＤＴＰＯの代わりにテトラポリリン酸ナト
リウム（太平化学から入手）とフィチン酸２カリウム
（和光純薬工業（株）から入手）を、それぞれ０．１ｗ
／ｖ％になるように添加し、ｐＨを実施例１と同様に
６．０に調整して、溶血剤を含む解離用緩衝液を得た。
これを用いて新鮮血液を実施例１と同様に溶血させ、溶
血産物を室温にて２０分間インキュベーションした。実
施例１と同様にして、ＨｂＡ_lc％を測定したところ、そ
れぞれ４．４％であった。しかし、この溶血用緩衝液を
６０℃で２０日間加温した後、同様に測定したところ、
ＨｂＡ _lc含量はそれぞれ４．９％と５．０％であった。

【００７４】以上より、本溶血用緩衝液中に含まれるポ
リリン酸およびフィチン酸が、６０℃で２０日間加温す
ることにより加水分解し、Ｌ−ＨｂＡ_lc解離効果が失わ
れていることがわかる。

【００７５】

【発明の効果】本発明のＬ−ＨｂＡ_lc解離剤を用いる
と、上記のように検体中のＨｂＡ_lcのうちのＬ−ＨｂＡ
_lcが速やかに除去され、Ｓ−ＨｂＡ_lcのみが精度良く簡
便にかつヘモグロビンを変性させることなく短時間のう
ちに測定される。Ｓ−ＨｂＡ_lcは一時的な血糖の上昇も
しくは下降に左右されずに比較的安定して血液中に存在
するため、この測定値はより信頼度の高い糖尿病の指標
となり得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】血液中のヘモグロビンをイオン交換クロマトグ
ラフィーにより分離して測定したときの溶出パターンを
示すチャートである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アンモニアの水素原子の少なくとも１つ
がメチレンホスホン酸基またはその塩で置換されてなる
化合物からなる不安定型糖化ヘモグロビン解離剤。
【請求項２】炭素数１〜６の１級または２級アミンの
窒素原子上の少なくとも１つの水素原子がメチレンホス
ホン酸基またはその塩で置換されてなる化合物からなる
不安定型糖化ヘモグロビン解離剤。
【請求項３】赤血球分散液および／またはヘモグロビ
ンを含有する溶血産物と、請求項１または２記載の解離
剤を含む解離用緩衝液とを接触させて、不安定型ヘモグ
ロビンＡ_lcをヘモグロビンＡ_oとグルコースに解離させ
る工程、および、該解離後の試料中に存在するヘモグロビンおよび糖化ヘ
モグロビンをクロマトグラフィー法で各ヘモグロビン成
分に分離し、被検査試料中に存在する安定型ヘモグロビ
ンＡ_lcを測定する工程、を包含する糖化ヘモグロビンの測定法。