JPH06279500A - ＨＢｃ融合蛋白粒子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原（ＨＢ
ｃ抗原）遺伝子の３’末端側に外来遺伝子を連結した組
換え遺伝子を宿主細胞に導入して得る融合蛋白質、なら
びにその製造方法、利用方法。該融合蛋白質を抗原とし
て用いて得るポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体、これらを用いる抗休検出方法、抗原検出方法、外
来遺伝子はＣ型肝炎ウイルス遺伝子であるものを含む。 【効果】 上記融合蛋白質は、抗体産生能が高く、抗体
検出試薬、抗原検出試薬として有力であり、ＨＢｃ抗
体、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗体の同時アッセイを可能と
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（以
下「ＨＢＶ」と略記する）コア抗原（以下「ＨＢｃ抗
原」と略記する）遺伝子の３′末端側に種々の外来遺伝
子を連結した組換え遺伝子を宿主細胞に導入して得る融
合蛋白質の発明、および抗原蛋白質を製造する方法の発
明、ならびにかかる融合蛋白質の利用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＢｃ抗原蛋白質はＨＢＶのＣ遺伝子に
コードされる１８３ないし１８５アミノ酸残基からなる
ボリペブチドである。そのＣ末端側はアルギニン、プロ
リンおよびセリンに富み、ＳＰＲＲＲＲＳの繰り返し配
列を有している。コア蛋白質には２種類のＨＢｃ抗原
（ＨＢｃＡｇ／α、ＨＢｃＡｇ／β）と２種類のＨＢｅ
抗原（ＨＢｅＡｇ／ａ、ＨＢｅＡｇ／ｂ）が各々一つず
つ存在する。コア粒子はＨＢｃ抗原蛋白質が約３００個
集合して構築されたもので、Ｃ末端部が粒子の深部でＨ
ＢＶ−ＤＮＡと結合し、ＨＢｃ抗原基は表面に露出し、
ＨＢｅ抗原基は粒子表面下に存在していると考えられて
いる。

【０００３】他方、Ｃ型肝炎ウィルス（以下「ＨＣＶ」
と略記する）ゲノムは約９０００塩基からなる１本の長
いオープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）を持ち、５′
側からコア（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ）、非構造蛋白質
１（ＮＳ１），同２（ＮＳ２）同３（ＮＳ３）、同４
（ＮＳ４）、同５（ＮＳ５）をコードしていると推定さ
れる。このうち非構造蛋白質１はもう一つのエンベロー
プ蛋白質の一部であることも考えられ、Ｅ２／ＮＳ１と
も表記される。

【発明が解決しようとする課題】

【０００４】遺伝子組換えで得られるＨＢｃ抗原蛋白質
が粒子を形成し易いという知見から、ＨＢｃ遺伝子の
５′末端側、中央部または３′末端側のいずれかの位置
に外来遺伝子を連結させ、大腸菌などを宿主として発現
して、ＨＢｃ抗原との融合蛋白質を粒子状態で得る試み
が既になされており、発現された融合蛋白質は粒子を形
成し、しかも目的の外来蛋白質が粒子表面に露出したも
のを得ることが可能であった。

【０００５】しかし、これら従来の実験結果では、外来
蛋白質として親水性の高いペプタイドがもちいられ、し
かもアミノ酸残基として約１００残基以下の、比較的小
さいものの挿入が成功しているにすぎなかった。

【０００６】したがって、ＨＢｃ抗原蛋白質の粒子形成
能を利用しながら、一層大きな外来蛋白質や疎水性の高
い蛋白質をも得られることができる方法の開発が期待さ
れていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＢｃ遺
伝子の特性を利用しながら有用な融合蛋白質を発現させ
る方法について研究を重ねた。その結果、１００残基以
上のアミノ酸をコードする外来遺伝子や、疎水性の高い
ポリペプチドをコードする外来遺伝子をＨＢｃ遺伝子に
結合させることによって、有用な融合蛋白質が得られる
ことを見出し、これを得る方法を完成させた。さらに、
本発明者らは、得られた抗原粒子が表面に外来蛋白質の
抗原性を担っていることを見出し、したがって、これら
の融合蛋白質が免疫原として、また抗体、抗原測定試薬
の材料として有用であることを見出した。

【０００８】すなわち、本発明はＢ型肝炎ウィルスＣ遺
伝子の３′末端側コドン１４９の下流に外来遺伝子を連
結した組換遺伝子を宿主細胞に導入して得ることを特徴
とする融合蛋白質の発明であり、外来遺伝子がＣ型肝炎
ウィルス遺伝子である融合蛋白質、これらの融合蛋白質
を抗原として用いて得るポリクローナル抗体またはモノ
クローナル抗体、これらの融合蛋白質を抗原または抗体
として用いる抗体検出方法または抗原検出方法の発明で
あり、またこれらを製造する方法の発明である。

【０００９】本発明について、さらに詳記すれば次のと
おりである。本発明者らは、ＨＢｃ遺伝子のＣ末端部分
を削り、１４９残基のペプタイドをコードする配列をベ
クターに組み込み、その下流に続けてＨＣＶコア部分の
エピトーブを担うことが知られている２７アミノ酸、９
１アミノ酸または１８０アミノ酸をコードする遺伝子を
単独又は２個から７個のタンデムで挿入した発現ベクタ
ー、およびＨＣＶのエンベロープ部分１９２アミノ酸、
１１５アミノ酸、Ｅ２／ＮＳ１部分の３５１アミノ酸を
コードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築した。
得られた各発現ベクターを大腸菌に導入した結果、目
的とする融合蛋白質が発現され、しかもそれらが粒子状
態で産生されていることが確認された。また、粒子を形
成しない大腸菌発現蛋白質と比較して、精製が簡便であ
ることが確認された。

【００１０】粒子形成の確認は以下の如く行った。すな
わち、密度勾配遠心法によって分画された、天然ＨＢｃ
抗原蛋白質粒子と同様の密度を有するフラクションにお
いて、ＨＢｃ抗原と外来蛋白質抗原の両方の抗原性が検
出されることをそれぞれの抗原に対するモノクローナル
抗体を用いて確認した。また、モノクローナル抗体を反
応させたサンプルを遠心分離し、得られた沈澱を電子顕
微鏡で観察することにより粒子の疑集像を確認した。

【００１１】

【作用】得られた融合蛋白質粒子は、外側に外来蛋白質
を露出していた。このことから、免疫原として用いた場
合、抗体産生能が高く、また抗体検出試薬、抗原検出試
薬の原料としても有用であることが見出された。

【００１２】特に、実施例に示すようにＨＢｃとＨＣＶ
コアとの融合蛋白質はＨＢｃ、ＨＣＶコアの双方に対す
る抗原性を同時に持つため、これを原料として抗体検出
系を組むことにより、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶコア抗体の同
時アッセイが可能となる。このため輸血用血液のスクリ
ーニング等に極めて有用であるものと期待される。ま
た、ＨＢｃとＨＣＶエンベロープとの融合蛋白質はワク
チン原料としても有力である。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００１４】（実施例１） ＨＢｃ／ＨＣＶコア遺伝子を挿入したベクターの構築 （１）ＨＢｃ発現ベクターの作製 ＨＢＶコア遺伝子としてｐＮＤＲ２６０（ａｄｒ）のＣ
遺伝子断片を用い、５′側にＮｃｏＩ部位、を３′側に
ＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマーを用いてｎｔ１９
０１〜２３４７をＰＣＲ増幅した。得られたＤＮＡ断片
をＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ処理した後、発現ベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のマルチクロー
ニング部位のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、Ｈ
ＢｃのＮ末より１４９番目までのアミノ酸とＥｃｏＲＩ
部位より下流のマルチクローニングサイト部位の２４ア
ミノ酸を発現するベクターｐＹＡ２０７を得た（図
１）。 （２）ＨＣＶ遺伝子の場合 ＨＣＶ遺伝子は患者血清よりクローニングしたＨＣ−Ｊ
４株（ｔｙｐｅＩＩ；特開平２−１５３４０１）または
ＨＣ−Ｊ６株（ｔｙｐｅＩＩＩ；特開平３−１９６１７
５）のＤＮＡを用いた。ｔａｃ−ｐｒｏｍｏｔｏｒ−Ｈ
Ｂｃ（１９０１−２３４７）−ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
−Ｘｂａｌ−ｓａｌＩ−ＰｓｔＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
（ｐＹＡ２０７）のマルチクローニングサイトにフレー
ムが合うようにＨＣＶ遺伝子を挿入した。最初に５′側
にＰｓｔＩ部位を持つプライマー：：５´−ＡＡＣＣＴ
ＧＣＡＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣ−
３′と３′側にストップコドンとＨｉｎｄＩＩＩ部位を
持つプライマー：５´−ＡＡＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＣＣ
ＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡ−３´でＨＣＶコア
の領域の１８０アミノ酸に相当する遺伝子をＰＣＲ増幅
した。得られたｃＤＮＡをＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処
理した後、マルチクローニングサイトのＰｓｔＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＨＢｃ（１４９アミノ酸）と
ＨＣＶコア（１８０アミノ酸）の融合蛋白質を発現する
ベクターｐＹＡ２８５を得た。 （３）各種のＨＣＶ遺伝子を挿入した発現用ベクターの
構築 上記（２）で用いたＨＣＶ−ｃＤＮＡを用い、５′側に
ＳａｌＩ部位を持つプライマー：：５´−ＡＡＣＧＴＣ
ＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣ−３
´と３′側にＸｈｏＩ−ｐｓｔＩ部位を持つプライマ
ー：５´−ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡ
ＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧ−３´でＨＣＶのコアの
領域の１８０アミノ酸に相当する遺伝子をＰＣＲ増幅し
た。得られたｃＤＮＡをＳａｌＩ、ＰｓｔＩ処理した
後、ｐＹＡ２８５のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し、
ＨＢｃ（１４９アミノ酸）＋ＨＣＶコア（１８０アミノ
酸）×２を発現するベクターｐＹＡ２８７を得た。さら
にＨＣＶコア（１８０アミノ酸）を連結するために、Ｐ
ＣＲ増幅しＳａｌＩ、ＰｓｔＩ処理したＨＣＶのＤＮＡ
断片をｐＹＡ２８７のＸｈｏＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入し
た。この際、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩの接続部分のアミノ酸
配列はＶａｌ−Ｇｌｕとなり、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩで切
断されないため、該遺伝子を何個でも挿入することが可
能である（図２）。動揺にして、ＨＣＶコア（１８０ア
ミノ酸相当）遺伝子を３個（ｐＹＡ８８）、５個（ｐＹ
Ａ２９０）、７個（ｐＹＡ２９１）連結した発現ベクタ
ーを得た。また、同様にしてＰＣＲ法にてＨＣＶコア領
域の一部、Ｎ末より３９〜７５番目（ＣＰ９）および１
〜９１番目のアミノ酸に相当する遣伝子を増幅し、ｐＹ
Ａ２０７のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩに挿入し、発現
ベクターｐＹＡ２１０、ｐＹＡ２０９をそれぞれ得た。
制限酵素はＢｏｅｈｌｉｎｇｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
（ドイツ）、ＮＥＢ社（ＵＳＡ）、宝酒造社のものを、
ＤＮＡリガーゼ、フォスファターゼは宝酒造社のものを
用いた。

【００１５】（実施例２） 大腸菌によるＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白質の発現と精
製 （１）融合蛋白質の発現 実施例１で得られた各プラズミドを大腸菌ＭＣ１０６１
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、ＵＳＡ）に導入し、１夜培
養した、その１００分の１量を新しい培養液（ＮＢ培
地、栄研化学社）に移して２〜３時間培養し、ＩＰＴＧ
（Ｎｏｖａ社）を１ｍＭ相当加えてさらに４〜１６時間
培養した後、集菌した。得られた菌体を緩衝液Ａ（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｏｌ ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．５％ＮＰ４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１μ Ａ
ｐｒｏｔｔｎｉｎ）に懸濁し、超音波処埋した後、１
０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を以下の
精製に供した。 （２）精製 上記（１）で得た上清に硫安をくわえ、２０％〜３５％
硫安分画沈澱を緩衝液Ａに溶解した後、透祈した。Ｎａ
Ｃｌを最終濃度０．５Ｍになるように加え、４℃で２０
分間攪拌後１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
た。得られた上清に最終濃度１０％になるように５０％
ポリエチレングリコール＃６０００（ナカライテスク社
製）溶液を加え、４℃で２０分間攪拌後１０，０００ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離した。上清を捨て、沈澱を緩衝
液Ａに溶解してサンプル（精製蛋白質）とした。

【００１６】（実施例３）ＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白
質について抗原性および粒子形成能をいずれも確認し
た。実施例２−（２）で得た精製蛋白質の抗原性を検出
した。

【００１７】

【表１】

【００１８】表３に示すように、各発現蛋白質のサイズ
が導入したＨＣＶコア遺伝子の塩基数に従って予想され
る通りのものとなっていることが確認された。

【００１９】実施例２−（２）で得られたサンプルをＣ
ｓｃｌ密度勾配遠心分離法にて分画し密度測定を行い、
図４に示すように１．２９ｇ／ｍｌ付近のフラクション
にＨＢｃ、ＨＣＶエンベロープの両方の抗原が存在する
ことを確認し、天然のＨＢｃ抗原とほぼと同じ密度をも
っていることを確認した。

【００２０】電子顕微鏡により図５に示すとおり直径約
３０ｎｍの粒子が抗体を介して疑集している状態が観察
された。

【００２１】（実施例４）ＨＢｃ／ＨＣＶエンベロー
プ、ＨＢｃ／ＨＣＶ（Ｅ２／ＮＳ１）遺伝子を連結した
発現ベクターの構築と発現を行い、融合蛋白質の発現と
精製を行った。

【００２２】

【発明の効果】本発明の融合蛋白質は、免疫原として用
いた場合、抗体産生能が高く、抗体検出試薬、抗原検出
試薬として有力であり、ＨＢｃ抗体、ＨＣＶコア抗体の
同時アッセイを可能とする。また、ＨＣＶワクチン原料
としても有力に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白質の発現ベクター
の模式図。

【図２】ＨＣＶコア１８０アミノ酸をコードする遺伝子
をタンデムで挿入する方法。

【図３】ＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白質のウェスタンブ
ロット法による分析結果。

【図４】ＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白質の密度勾配遠心
分離法による実験結果を示す。図中、●は密度、○、△
はそれぞれモノクローナル抗体Ｎｏ．３１２０、Ｎｏ．
９３５５のサンドイッチＥＩＭにおける吸光度。

【図５】ＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白質の電子顕微鏡写
真。

【図６】ＨＢｃ／ＨＣＶエンベロープ、ＨＢｃ／ＨＣＶ
（Ｅ２／ＮＳ１）の各融合蛋白質のウェスタンブロット
法による分析結果。

【手続補正書】

【提出日】平成６年１月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】ＨＢｃ／ＨＣＶコア融合蛋白質の電子顕微鏡観
察図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/62 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｂ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/51

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｂ型肝炎ウィルスＣ遣伝子の３′末端側コ
   ドン１４９の下流に外来遺伝子を連結した組換遺伝子を
   宿主細胞に導入して得ることを特徴とする融合蛋白質。
2. 【請求項２】外来遺伝子がＣ型肝炎ウィルス遺伝子であ
   る請求項第１項記載の融合蛋白質。
3. 【請求項３】請求項第１項または第２項記載の融合蛋白
   質を抗原として用いて得るポリクローナル抗体またはモ
   ノクローナル抗体。
4. 【請求項４】Ｂ型肝炎ウィルスＣ遺伝子の３′末端側コ
   ドン１４９の下流に外来遺伝子を連結した組換遺伝子を
   宿主細胞に導入して融合蛋白質を得ることを特徴とする
   抗原蛋白質製造方法。
5. 【請求項５】外来遺伝子がＣ型肝炎ウィルス遺伝子であ
   る請求項第４項記載の抗原蛋白質製造方法。
6. 【請求項６】請求項第１項または第２項記載の融合蛋白
   質を抗原として用いる抗体検出方法または抗原検出方
   法。
7. 【請求項７】請求項第３項記載の抗体を用いる抗原検出
   方法または抗体検出方法。