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JPH0627741B2 - 免疫検定装置及び方法 - Google Patents

免疫検定装置及び方法

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Publication number
JPH0627741B2
JPH0627741B2 JP58502780A JP50278083A JPH0627741B2 JP H0627741 B2 JPH0627741 B2 JP H0627741B2 JP 58502780 A JP58502780 A JP 58502780A JP 50278083 A JP50278083 A JP 50278083A JP H0627741 B2 JPH0627741 B2 JP H0627741B2
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JP
Japan
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fiber
component
radiation
fluorescence
complex
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JP58502780A
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JPS59501873A (ja
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ブロツク・マイロン・ジエイ
ハ−シユフエルド・ト−マス・ビ−
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of JPS59501873A publication Critical patent/JPS59501873A/ja
Publication of JPH0627741B2 publication Critical patent/JPH0627741B2/ja
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は免疫検定に関し、より詳細にはよりエネルギー
の高い励起放射で励起されたときに螢光放射を出すこと
のできる螢光標識が抗原−抗体あるいは同様な免疫化学
的複合体の成分として入つているような免疫検定に関す
る。
一種類またはそれ以上の試薬と試料のアリコツトを種々
反応させて抗原−抗体あるいは同様な上記複合体を形成
し、その際にこれを所定量の複合体の滴定量について試
料を分析するために観測する免疫検定は周知である。こ
のような検定の典型的なものとして特定の抗体がそれに
特有な抗原の量を測定する（あるいはその逆の場合）た
めに用いられる検定がある。しかしながらこの手法は抗
原とともにハプテン（ホルモン、アルカロイド、ステロ
イド等を含む）を、また完全な抗体とともに抗体断片
（すなわちFab）を計量するように拡張されてきてお
り、この広い意味で本発明も理解すべきである。
高感度の免疫検定は複合体の標識成分が試薬に加えら
れ、標識を加えた非複合体の試薬が複合体の試薬から分
離され、それから複合体（あるいは非複合体の試薬）は
標識を観測することにより計量されるトレーサーの手法
を用いている。免疫検定の試薬の標識成分には放射性同
位体と螢光性マーカーとの両方が用いられており、標識
はそれぞれガンマ線カウンターまたは螢光光度計で観測
される。しかしながら本発明は螢光による検定だけを意
図している。
非複合体である標識の部分を複合体から分離することは
複合体の成分の所定の１つをその成分の複合体形成時の
反応度を低下させないようにして固相体（試験管の内
壁、ガラスまたは重合体のビーズ等のような）に固定さ
せることにより通常なされている。例えば免疫グロブリ
ンＧ(IgG)のような抗体はカルボキシル末端によりガラ
ス等の固相体に、３−アミノプロピル−トリメトキシシ
ラン等のシリル化合物によつて結合され、それによつて
抗体の抗原の反応性アミノ末端を遊離にさせる。固定し
た成分を含んで形成された複合体はそれから、管からの
流体のアスピレーシヨンまたはデカンテーシヨン、ある
いは粒子状ベツドで流体を溶離させることにより溶液中
に残つている非反応性成分から物理的に分離されよう。
拮抗的免疫検定において、試薬は複合体の固定した成分
（この場合抗体）に対する基地の量の標識のあるほたい
補体（抗原等）からなる。試薬は定量化されるべき標識
のない補体を含む一定量の試料と混合される。標識のあ
る補体も標識のない補体もその相対的濃度に比例して複
合体の固定した成分に結合する。設定した時間だけ接続
させると流体の試料と試薬とが分離される。固相体に固
定された複合体はそれから標識の螢光を励起させるよう
に選択された波長の放射で照射され、螢光が測定され
る。固定した複合体の螢光の強度は分析される標識のな
い補体の濃度に反比例する。
あるいは計量すべき部分にある量の類似体の物質（すな
わち免疫的に同様に反応する物質）を固定しこの試料を
既知の量の標識のある補体と反応させることにより分析
を行なつてもよい。標識のある補体は試料中の未知の量
の部分と固定した類似体との両方との複合体となる。ま
た固定した複合体の螢光の強度は定量化されている（自
由な）部分の濃度に反比例する。
固定した成分に対する多価の補体に関しいわゆる「サン
ドイツチ」免疫検定を行なつてもよく、このとき加えら
れた補体はさらに固定した成分の標識された類似体と反
応する。かくして二価の抗原は固定した抗体と結合し、
それから標識された螢光性の抗体と反応して抗体−抗原
−標識された抗体のサンドイツチを形成し、それからこ
れが未反応の標識された抗体から分離されよう。このよ
うにして形成された固定した複合体の螢光の強度は定量
化される部分の濃度に正比例する。
これらの分析のいずれにおいても、固定した複合体及び
未反応の標識のある成分の物理的分離が必要となり、典
型的な従来技術の方法ではこれをアスピレーシヨン、デ
カンテーシヨン、溶離あるいは他の固相体と流体との分
離法によつて行なつている。未反応の標識のある成分の
定量化を可能にするほかにこのような分離のステツプは
またバツクグラウント螢光の量を減少させるものであ
り、生物学的試料（例えば血清ビリルビン、トリプトフ
アン、種々の薬剤等）があると思われる物質の固有の螢
光の点における重要な考察事項となる。
実験室のプロトコルにおいて追加の（分離の）ステツプ
を必要とすることのほかに、このような手法は反応の終
点を決定するものであり、それゆえ反応のダイナミツク
スを研究するのには有利でない。
分離による免疫検定に共通する固相体に固定した複合体
から実際に流体を除去することのほかに、分離は本来固
相体のすぐ近くまで螢光の測定を限定することによつて
なされよう。かくして固相体の表面の分子的大きさの範
囲内だけで螢光が生ずれば、このような距離以内にあ
る、またそれゆえ固定した成分との複合体をなした発螢
光団だけが励起されよう。試料と他の材料との間の境界
面において試料の螢光を発生させこれを観測する方法が
ハーシフエルド(Hirschfeld)によつて開発されている
（米国特許第3,604,927号）。この方法において試料を
プリズムの面に接触させ、試料に接触する面で内面全反
射が生ずるようにしてプリズムに励起放射が照射され
る。かくして試料は比較的短い距離だけ試料内に透過す
る微弱波を照射され、その電場の振幅が境界面からの距
離とともに、典型的には１０００Å以下で表面の値のｅ
−１まで指数関数的に減少し、正確な有効透過深度は波
長、屈折率の不斉合、臨界角に対する光線の行路に依存
する。このようにして試料の薄い表面層が検査されよ
う。この薄片から大きな角度で境界面に放出される螢光
を観測すると螢光信号からの励起放射が有効に濾光され
る。
この手法はクロニツク及びリトル(Kronick and Little)
による螢光免疫分析に特に適用されているが（米国特許
第3,939,350号）、これは複合体の成分をプリズム（あ
るいはプリズムに光学的に接触するスライド）に固定し
微弱波によつて励起される発螢光団の螢光を観測するこ
とを教示している。これらが抗原−抗体の複合体の固定
した成分に集中し結合している発螢光団である程度によ
りこの方法は試料または試薬のバツクグラウンド螢光に
対する所望の信号を増加させることになる。このアプロ
ーチの利点は、固相と液相とが測定前に分離されそれゆ
え終点（分離が影響を受けた時に対応する）が観測され
る分離法に対して、螢光の強度が本来時間の関数として
観測されるということである。不利な点としては、この
手法は数百Åより薄くない層を分離するにすぎず、それ
によつて試料の固有の螢光を全面的に低下させることも
なく、また結合していない試薬から結合したものを完全
に分離することもない。かくして前述の手法に比して、
大きな固有の螢光があり非常に低い滴定量のものを計量
すべきときに不利になる。
さらにクロニツク及びリトルの方法及び装置は従来技術
による螢光検定のコーテイング壁試験管に共通して、螢
光面のランバート放射を観測するものである。このよう
な光源を有効に利用するには大きな光学流量（すなわち
大きな立体角−開口の積）を有する光学系が必要にな
る。このような光学系はより小さい光学流量を有する光
学系より本来大型で、複雑かつ高価になる。例えばこの
ような拡張された拡散源に対する放射検出器の流量整合
は一般的に大きな集光光学系と組合せて用いられる大き
な領域の（それゆえより高価で騒音を発生する）検出器
を必要とする。放出された放射の有効利用に替るものは
光学系の感度の損失になる。
拡張された螢光源の光学出力の整合の弱さによつて生ず
る光学系の感度の損失を補償するために、より強力な励
起源と、励起放射を試料に反復的に反射させることによ
つて多数回再使用することに頼つてもよい。これはまた
照射されるべき領域の大きさと、この領域に励起源の流
量整合を行なう必要性によつて悪化する。このような整
合を行なわないと、非常に強い（また通常複雑で高価
な）光源が必要になる。かくしてクロニツク及びリトル
の好ましい実施例（米国特許第3,939,350号）ではヘリ
ウム−カドミウム−レーザーを備え、比較的濃度の高い
試料の分析にだけ十分な感度を有している。
他には標識成分に（一般的にすでに）高い効率の発螢光
団をより多く包含せしめることである。これは通常補体
について識別化した成分の特性及び強度を低下させ、ま
た螢光の効果を減少させることになり、これが実際に限
界になる。
発明の目的 従つて従来技術による全反射螢光より薄い層を観測する
ことによつて液相と固相を分離せずに螢光の測定が行な
われ、それによつて本来の未反応試薬の螢光の除外を改
良する螢光免疫検定の方法及び装置を提供することが本
発明の目的である。
本発明の他の目的は螢光放射がオプトエレクトロニクス
式の検出装置により容易に流量整合される免疫検定の方
法及び装置を提供することである。
低い出力の励起源がかなりの量の反応した試料及び試薬
に最大の有効流量利用度で有効に光学的に結合されるよ
うな螢光免疫検定の方法及び装置を提供することが本発
明の他の目的である。
発明の簡単な説明 流体相に微弱な波を発生させるために低い屈折率の液相
と固相との間の境界面における内面全反射を用い、この
波によつて励起された螢光が固相媒体における全反射に
よつて「暗部円錐」内で（すなわち臨界角より大きい角
度で）観測される免疫検定の方法及び装置について本発
明の前記及び他の目的が見られる。固相体は境界面で多
数回の内面全反射をさせるように配置され照射される。
好ましい実施例において固相体は免疫化学反応で形成さ
れる複合体の成分が固定される光フアイバーの形であ
る。複合体の他の成分に発螢光団が付加される。螢光で
識別される成分は拮抗的分析あるいはサンドウイツチ分
析のいずれがなされるかによつて固定した成分に対する
補体かその類似体になろう。拮抗的分析の場合識別され
る成分は制御された濃度で固定した成分に予め包含せし
めるのが好ましい。フアイバー（と分析の付加された成
分）は流体相の試料に浸される。流体相で螢光を励起さ
せるために微弱波が用いられ、固相体に通り抜ける螢光
（臨界角より大きい角度の方向に固相体内で伝わる）が
検出される。
観測される量は境界面からの距離の関数としての微弱波
の急速な減衰だけでなく、通り抜けの効率が距離ととも
に同様に急速に減少することによつても制限され、より
離れた発螢光団がより強度が小さく励起され、それゆえ
螢光が少ないだけでなく、その放射がフアイバー内に結
合する効率も小さくなる。その結果検出される層の有効
深度は全反射螢光だけで観測される領域に比してずつと
減少し、結合効率によりこの領域が効果的に減少する。
固相体における多数回の内面全反射により照射ビームが
微弱波を反復的に励起させることができ、それによつて
小さい励起源を試料の量により効率的に結合できる。こ
れによりまた抽出量と、かくして検出される試料の量が
増加し、この量はさらに表面（試料が通過する際に反応
により付着する）を通る試料の拡散循環により増大す
る。かくして拡散により実際の試料の層の厚さがバツク
グラウンドに寄与する全てとなる薄い表面層よりずつと
大きくなる。
フアイバー内に通り抜けて戻る放射は全て全反射角内に
あり、かくしてフアイバー内に捕捉される。螢光から利
用できる出力は螢光材料内のフアイバーの長さが増加す
るとともに増加するが、光学系の光学流量（フアイバー
の開口数〔受容角〕と開口〔断面〕によつて決定され
る）は一定のままである。フアイバーの全面積から出る
螢光信号全体は、拡散による試料の量の増加分だけ乗ぜ
られて、フアイバー内の屈折の臨界角によつて決定され
る制限された角度でフアイバーから出る、実際のフアイ
バーの断面積となる、非常に明るい点で用いられる。こ
のような信号は小さな検出器に適合した高い効率及び流
量で容易に集められる。
表面近くの放出における干渉角効果により通り抜けが放
出の空間分布においてよくなるので信号がさらに増大す
る。逆反射によるフアイバーの二重通過によつて励起及
び集光の効率の両方を倍加する機会ができるので、全反
射の周知の放射場増大（ハーシフエルド、米国特許第3,
604,927号）もこれに寄与する。
本発明の他の目的は一部は明白であり、一部は以下に明
らかになろう。従つて本発明は以下の詳細な説明におい
て例示される構造、要素の組合せ、部分の配置をもつ装
置、いくつかのステツプと、このステツプの１つまたは
それ以上と他のステツプの各々との関係を包含するもの
であり、請求の範囲に示される技術範囲のものである。
図面の簡単な説明 本発明の特徴及び目的をより完全に理解するために添付
の図面と併せて以下の詳細な説明を参照すべきであり、
ここで 第１図は本発明の主旨を具体化し免疫検定装置の例の概
略図であり、 第２図は本発明を実施した場合に関連する典型的な免疫
化学反応及び放射エネルギーの工程を示す、第１図の装
置の一部分を様式化した図である。
図において同じ指示番号は同じ部分を示す。
詳細な説明 周知のように、与えられた屈折率n1の媒体を通つて伝わ
る電磁放射の波面がその媒体と屈折率n2の他の媒体との
境界面に達すると、波面はスネルの法則 n1 sin i＝n2 sin r (1) に従つて屈折し、ここでｉ及びｒはそれぞれ波面が境界
面を通過する前及び後に境界面への法線が波面への法線
に対してなす角度である。n1がn2より大きければ９０°
より小さいあるｉの値に関してsinrが１になるであろ
う。この臨界角より大きい入射角の値では境界面で正規
の屈折がもはや生ぜず、その代りに波面が第一の媒体へ
反射して戻る。内面全反射として知られるこの現象は周
知であり、例えば光フアイバー導光管の原理であつて、
これは多数回の内面全反射を維持するようにした形状の
壁部が設けられている。
臨界角に等しいかこれより大きい入射角の値について
も、最も単純な場合に低い屈折率の媒体内への正味のエ
ネルギーの伝達がないけれども、実際に屈折が生ずる。
むしろ境界面の各点で境界面を通る周期的なエネルギー
の流れがあり、低い屈折率の媒体内に移送されるエネル
ギーが逆に移送されるエネルギーに等しくなつている。
低い屈折率の媒体に生ずる波は入射波と同じ波長のいわ
ゆる微弱波であり、入射波面の射影速度に合致した速度
で境界面に平行に伝わり、また境界面で最大になり境界
面からの距離とともに指数関数的に減衰して波長に比べ
て大きな距離ではほぼ０になる振幅を有する。
内面全反射の最も単純な場合は非吸収性、非放出性の低
い屈折率の媒体によるものである。この場合微弱波によ
つて低い屈折率の媒体にエネルギーが失なわれたり、こ
れから生じたりすることはなく、一方の媒体から他方の
媒体に伝わるエネルギーは逆に移送されるエネルギーと
正確に均等になつている。従つて境界面における反射が
実際に全てである。しかしながら低い屈折率の媒体が吸
収性であれば、エネルギーの幾分かが微弱波から取出さ
れ、それゆえ高い方の屈折率の媒体に戻らないであろ
う。境界面における反射はもはや実際に全てではない。
減衰全反射(ATR)として知られるこの現象は低い屈折率
の媒体をなす試料による吸収の程度を決定するために反
射ビームにおけるエネルギーを測定したフア−レンフオ
ート(Fahrenfort)により１９５９年に最初に吸収分光学
に適用された。吸収成分が螢光性であれば、微弱波は螢
光の発生に用いられよう。全反射螢光(TRF)として知ら
れるこの現象はハーシフエルドの米国特許第3,604,927
号の主題事項である。ＡＴＲとＴＲＦの両方とも表面効
果の研究に広く用いられており、境界面から波長の部分
の距離での微弱波の限られた振幅により観測される試料
の厚さの範囲が効率よく決定される。
この現象を詳細に考察するとまた境界面のすぐ近くで低
い方の屈折率の媒体から出る波が一部臨界角より大きい
角度で高い方の屈折率の媒体内に反射することが示され
る。この現象は通り抜け(tunnelling)として知られてお
り、この放射はまた媒体が適当な形状であれば内面全反
射により高い屈折率の媒体内で伝わるであろう。
本発明は励起放射と螢光放射との両方が多数回の内面反
射を行なう螢光のＴＲＦと通り抜けとの両方によるもの
である。
第１図を参照すると本発明の好ましい実施例の主要部分
が特に概略図で見られよう。全体的に指示番号１０で一
部だけが示される光フアイバーが全体的に１２で示され
る流体の試料に没入されている。フアイバー１０はその
縦方向に多数回の内面全反射によりフアイバーの軸の回
りにほぼ回転対称な設定された立体角内でフアイバーの
端部に入る光学放射を伝えるようにした細長くほぼ円筒
形の光学的な透明体である。フアイバー光学の技術でよ
く知られているように、フアイバーに入つてその内で伝
わる放射についてフアイバーの軸に関して最大の受容角
Ｂはフアイバーと周囲の媒体の屈折率によつて設定され
る。最初に屈折率n0の媒体を通つて伝わり、屈折率n2の
材質で囲まれた屈折率n1のフアイバー上に入射する放射
について最大の受容角は次式 N.A.＝n0sinB（▲ｎ2 1▼−▲ｎ2 2▼）1/2 (2) で与えられ、ここでN.A.はフアイバーのいわゆる開口数
である。限定的なものでない例として、フアイバー１０
流体１２の屈折率（典型的には1.33近くの屈折率を有す
る水溶液または1.35に近い屈折率を有する血清試料）よ
り大きい屈折率を有するように選択され、またさらに流
体に比較的不溶性で反応性がないように選択された、ガ
ラス、水晶、ポリオレフイン、ナイロン等のいくつかの
光学的に透明な材質のいずれでもよい。フアイバーの直
径は２００ミクロンが良好であるが、他の大きさのもの
も用いられよう。多くの分析で長さ２５mmのフアイバー
で十分であると思われるが、しかしながらフアイバーの
長さは行なわれる分析に適合され得ることが分かるであ
ろう。
以下に詳細に説明されるように、フアイバー１０は抗原
−抗体複合体のような免疫化学的複合体の成分（ここで
用いる「抗原−抗体複合体」は完全な抗体及び抗原の複
合体だけでなくそのいずれかまたは両方の免疫反応性断
片を有する複合体をも含む）を付着させるための手段を
含む表面コーテイングが施されている。
流体１２は以下により詳細に説明するように試料または
試薬を含む。
フアイバー１０はフアイバーの端部１４以外の全部を流
体に当てて端部１４の研磨した端面１６が流体またはホ
ルダーに光学的に妨げられないようにするためいくつか
の機械的手段（図示せず）のいずれかにより流体１２内
で支持されるのが好ましい。かくして流体１２は端の開
いた直立形の容器と、取外し可能なキヤツプに通されて
固着されたフアイバー１０の端部１４に包囲されよう。
これで流体１２は完全に包囲され、フアイバー１０は容
器の壁部を通り抜ける。流体１２の容器もフアイバー１
０のホルダーも本発明の重要な要素ではないので、明瞭
にするためにそれらを図面から省略している。フアイバ
ー１０は端部１４を除いてフアイバーが容器の壁部また
は支持手段に接触しないように流体内に支持されてい
る。端部１４はフアイバー内のエネルギーを支持手段ま
たは容器による撹乱を分離させるための合せ材（図示せ
ず）のような手段が設けられることは光フアイバーの当
業者に理解されよう。
研磨した端面１６は平面状でフアイバー１０の軸に垂直
に配設されるのが好ましい。また端面１６と反対側のフ
アイバーの端面１７をフアイバーの軸に垂直な平面に研
磨しさらにミラー・コーテイング１８（または分離した
ミラー）を施してフアイバーに捕捉された放射がフアイ
バーを二重に通過するようにすることも任意になされ
る。
フアイバー１０は螢光光度計１９とともに使用すること
を意図している。螢光光度計１９は光源２０、ダイクロ
イツク・ミラー２２、対物レンズ２４、光検出器２６、
参照光検出器２８、比率増幅器３０及びデイスプレー３
２からなる。
光源２０は試薬の付加成分に螢光を励起させるため問題
となる分析において標識として用いられる発螢光団をも
とに選択された適当な周波数の光学放射を与える。光源
２０はこの放射を、螢光を最大にするように選択された
狭い波長帯にだけわたつて与えるのが好ましい。それゆ
え光学２０は典型的には好ましいタングステン−ハロゲ
ン・ランプ及び関連する電源供給部に加えて帯域フイル
ターを含むものである。あるいは光源２０は水銀ラン
プ、フラツシユ・ランプまたはレーザー等の他の光源を
備えてもよい。光源２０は、当業者に理解されるよう
に、対物レンズ２４がフアイバーの開口数に対応する角
度より大きい入射角で光線が端面に入射しないように光
源の開口をフアイバー１０の端面１６に結像できるよう
にして適当な傾度のビームで対物レンズを照射するため
の適当なビーム成形の開口及び光学系を含む。
光源２０と対物レンズ２４との間にダイクロイツク・ビ
ーム・スプリツター２２が置かれている。好ましい実施
例においてビーム・スプリツター２２は問題の螢光の最
大吸収周波数と最大螢光放出周波数との間にあるように
選択されたカツトオフ周波数を有するローパス干渉フイ
ルターである。かくしてビーム・スプリツター２２は光
源２０からの高周波数（短波長）螢光励起放射を反射さ
せ、発螢光団の最大の螢光に対応する低周波数の放射を
透過させる。ここで前者の放射を第１の分光エネルギー
分布を有する放射と称し、後者の放射を第２の分光エネ
ルギー分布を有する放射と称する。
対物レンズ２４は光源のビーム成形開口の像でちようど
端面を満たすようにフアイバー１０の端面１６に光源２
０を結像させるように選択され、光線の最大入射角度が
フアイバーの開口数に対応する角度より小さくなるよう
に選択される。対物レンズ２４はまた端面１６から出る
ほぼ全部の放射をフアイバーの開口数にわたつて集光し
端面を光検出器２６において結像させるように選択され
る。
光検出器２６はビーム・スプリツター２２を通じて対物
レンズ２４により光検出器の方へ投射されたフアイバー
１０の端面１６の像を受けるように配設される。光検出
器２６は発螢光団のピーク螢光領域において最大の感度
を有するように選択された光電増倍管（周知のように検
出器の視野を端面１６に制限するための適当な光学系及
び電源供給部が設けられている）を含むのが好ましい。
光検出器２６はさらに帯域フイルターを設けた光源２０
に対応するブロツキング・フイルターを設けるのが好ま
しい。
参照光検出器２８はフオトダイオードであるのが好まし
く、ダイクロイツク・ビーム・スプリツター２２を通過
する光源２０からの放射を遮るように配設されている。
参照光検出器２８はダイクロイツク・ビーム・スプリツ
ター２２に透過させる光源２０のスペクトル領域におけ
るピーク感度に関して選択され、その光源に対する視野
を制限するための適当な視野絞り及び光学系を含む。
比率増幅器３０は参照光検出器の出力に対する光検出器
の出力の比率に比例する信号を発生するように光検出器
２６及び参照光検出器２８の出力に結合した、一対の入
力信号の比率に比例した出力を与えるいくつかの周知の
電子回路手段のいずれかである。例えば比率増幅器３０
は光検出器２６からの出力を増幅し参照光検出器３０か
らの出力に反比例するゲインを有する可変ゲイン増幅器
でもよい。
比率増幅器３０の出力はデイスプレー３２に結合してそ
の入力となる。デイスプレー３２は電気的入力に比例す
る可視的信号を与えるいくつかの装置のいずれかであ
り、例えば計測器、デイジタル・デイスプレー、ストリ
ツプ・チヤート記録計等でもよい。
第２図を参照すると、フアイバー１０の縦方向の断面と
近接する流体１２とを高度に様式化した図が示されてい
る。
フアイバー１０の表面には多数の結合部位３４が設けら
れ、その多くの抗体−抗原複合体の成分３６が結合して
いる。（ここで用いている「抗体−抗原複合体の成分」
という語句はこのような複合体の免疫反応性の成分につ
いて言うものであり、完全な抗原とともにハプテンを、
また完全な抗体とともに抗原反応性の抗体断片〔Fab〕
を含む。）結合部位３４は複合体の補完的部分に関し複
合体部分の反応性（例えば親和力、指向性）にそれほど
影響を与えずに複合体成分３６を固定するように選択さ
れている。好ましい実施例においてフアイバー１０はガ
ラスまたは水晶からなり、結合部位３４は３−アミノプ
ロピルトリメトキシシラーネ等のシリル化合物の反応性
基であり、複合体成分３６は免疫グロブリンＧ(IgG)等
の抗体である。前記のようにこの特定の固相体の結合に
関して結合部位３４及び複合体成分３６は抗体のカルボ
キシル末端によつて結合し、それによつて抗体の抗原反
応性アミノ末端を遊離にする。フアイバー１０のガラス
面を形成し、これにシリル化合物を付加し、シリル結合
により抗体をガラスに共有結合させる方法はウイートー
ル（Weetall,米国特許第3,652,761号）によつて開示さ
れているが、ここにはカルボキシル、アミノ、及び他の
抗体または抗原（またはそれらの部分）の反応性グルー
プが種々の無機材質に共有結合するような方法及び他の
シリル化合物についての開示もなされている。抗原また
は抗体を重合体に固定するための広範な技術も存在する
ことが分るはずであり、また抗原または抗体の結合部位
３４は重合体のフアイバーにも設けられることが当業者
に理解されよう。かくして例えばフアイバー１０がナイ
ロン（ポリアミド）からなるものであれば、結合は適当
な基で分子鎖の炭素または窒素のいずれかに結合した水
素を置換した形になろう。
結合部位３４はまた周知のように抗体−抗原の結合過程
の立体障害を最少にするのに十分なフアイバー１０と複
合体成分３６との間隔ができるようにするためのスペー
サー・グループを備えてもよい。例えばペプチド結合に
よりフアイバー１０に結合しそれぞれ蛋白質成分３６の
カルボキシルまたはアミノ末端に共有結合するための遊
離のアミノ基及び自由なカルボキシル基を与える1,6ジ
アミノヘキサンまたは６アミノヘキサン酸の場合のよう
に結合部位３４はポリエチレン鎖を含むこともある。こ
れらの結合材質のいずれも末端の間の６−炭素鎖を与え
るもので、それによりフアイバー１０から錯体部分３６
を対応する距離だけ離す。同様に適当な結合及びスペー
サーの材質は免疫検定と親和力クロマトグラフイの両方
の技術において周知である。
好ましい実施例において、フアイバー１０は指示番号３
６Ａで示されるような空席の結合箇所を有する複合体成
分３６がある。但しこの部分は所望であれば拮抗的免疫
検定のために一部において標識のある補体が付加される
ことが理解されよう。かくしてある実施例において複合
体成分３６は抗体であり、標識のある抗原またはハプテ
ンを予め包含させることもなされよう。
流体１２はとりわけ計量すべき特定の抗体−抗原複合体
の成分３８と（最初にフアイバー１０に複合体成分３６
がなければ）既知の滴定量の標識成分４０とを含む緩衝
水溶液であるのが好ましい。これまで説明した好ましい
実施例において成分３８と標識成分４０は同様な抗原ま
たはハプテンである。最適の免疫反応では、流体はpH６
−９の範囲に、好ましくはpH７−８の範囲に緩衝され
る。このためにホウ酸塩、炭酸塩等の種々の緩衝剤が用
いられよう。
標識成分２０の各々は所定の量の発螢光団４２を備え、
それによつて標識となる。標識に関係する特定の螢光化
合物はフルオレセイン、テトラメチルローダミン、希土
類キレート化合物等である。螢光標識を蛋白質に連結さ
せる方法は周知であり、市販の螢光化合物の多くは蛋白
質との連結のための基を有する。
前述のフアイバー１０及び流体１２が接触すると、流体
中の成分３８と標識成分４０とがフアイバーに結合した
成分３６と反応する。成分３８と４０とが同様に成分３
６と反応する程度まで指示番号３６Ｂ及び３６Ｃで示さ
れるそれぞれの濃度に比例して上記成分との免疫性複合
体を形成するであろう。
第２図にはまたある瞬間の全反射した波面における光学
的エネルギーの行程４４が示されている。この行程の近
くにおける発螢光団４２は微弱波中であり従つて波面の
波長が適当であれば螢光を発するであろう。図示のよう
に複合体成分３６との複合体をなした標識成分（３６Ｃ
のように）の発螢光団は微弱波内にあり従つて螢光を発
する。フアイバーに十分近い非複合体の標識成分４０
（指示番号４０Ａのような）も微弱波で励起されるが、
フアイバーからさらに遠いものは励起されない。
螢光成分によつて放出される放射はどの方向でもよい
が、螢光複合体３６Ｃの多くについて放出された放射の
幾分かが光線４６で示されるように通り抜けて戻る。螢
光粒子から分るように、粒子の回りの全立体角の約２％
だけが復帰ビームに集められる。しかしながらフアイバ
ー−流体境界面の近くの螢光放出による角度干渉のため
にこれは典型的には１０％以上の螢光放射を示す。通り
抜けがフアイバー内の光線路において臨界角またはそれ
以上の角度で生ずると（角度干渉は臨界角よりわずかに
大きい行路で生ずる）、光線４６はフアイバーに沿つて
全反射して倍加し、フアイバーに沿つてその端部の方へ
伝わる。かくしてフアイバー内に通り抜ける螢光放射の
１部分は端面１６（第１図）から出てくる。端面１７に
ミラーが設けられていれば、フアイバー内に通り抜ける
放射の全部（吸収と反射の損失は少ない）が端面１６か
ら出てゆく。フアイバーの開口数はフアイバー内での内
面全反射となるようなフアイバーの端面外の最大の立体
角を用いて定義され、また対物レンズ２４はこの角度の
光を集光するように選択されているので、フアイバーに
付着された成分３６との複合体となる標識成分からフア
イバー内に通り抜ける螢光放射の半分またはそれ以上
（フアイバー内の損失は少ない）が対物レンズ２４に集
光されよう。
特にフアイバー１０の形状はＡＴＲの平板またはプリズ
ムの形状と異なつて他の光学的部分に対してフアイバー
の流量整合を行なうのに特に適合しているのが分るはず
であろう。フアイバーの円筒形状によりフアイバー内で
伝わる放射が固定された回転対称の立体角内で伝わり小
さな円形開口を通つてフアイバー内に入りフアイバーか
ら外へ出るように制限される。放射のパターンの大きさ
及び対称性は従来の光学系に対して容易に流量整合され
る。これに対しプリズムまたは平板は内部に伝わるエネ
ルギーが少なくとも一次元的に広がることを可能にし、
少なくとも一次元的に大きな空間範囲と大きな発散とを
有するけれども流量整合の困難な放射パターンとなる。
ＡＴＲの平板またはプリズムと比較した場合のフアイバ
ー１０の形状の他の利点は拡散過程における集光器とし
てのフアイバーの効率にある。この点に関し抗体−抗原
複合体の形成は結合していない成分の拡散によることが
分るはずである。与えられた平均拡散厚さ（すなわち所
定の時間の拡散によつて排除される資料の層の与えられ
た厚さ）について、小さな径の円筒面（フアイバー）に
よつて、同じ面積の平面（平板またはプリズム）による
場合より多量の資料が排除される。かくしてフアイバー
は平板またはプリズムよりも急速に与えられた滴定量の
複合体の結合していない成分を固定した成分に集める。
操作時に発螢光団４２において螢光を励起させるように
選択された波長の放射が、フアイバーの開口数によつて
決定される円錐角内のフアイバー１０の端面を照射する
ように、ダイクロイツク・ビーム・スプリツター２２及
び対物レンズ２４を通じて、光源２０によつて供給され
る。その後にこの放射は臨界角またはそれより大きい角
度でフアイバー内に伝わり、フアイバーの縦方向に内面
全反射してフアイバーに近接する流体１２中に微弱波を
発生させて倍加する。フアイバーに付加された成分３６
に対する標識のある成分４０と標識のない成分３８との
拮抗的結合で標識のない成分に対する標識のある成分の
相対的濃度に比例した螢光標識のある複合体３６Ｃが生
ずる。微弱波により標識のある複合体３６Ｃの螢光が励
起される。螢光放出の一部はフアイバー内に通り抜け、
このうちの半分またはそれ以上がフアイバーの端面１６
から出て、ここで対物レンズ２４によつて集光され光検
出器２６に向かつて投射される。螢光が励起放射より長
い波長（低い周波数）で生ずるので、ローパス・ダイク
ロイツク・ビーム・スプリツター２２によりこの放射が
光検出器に透過されるようになり、光検出器の方は螢光
の強度に比例した電気的信号を発生させる。ダイクロイ
ツク・ビーム・スプリツター２２はまた光源２０からの
放射の幾分かが参照光検出器２８を照射できるように
し、参照光検出器２８は光源の強度に比例した電気的信
号を発生させる。これらの２つの電気的信号は比率増幅
器３０によつて比率化されて光源強度の変化を補正した
螢光強度に比例する電気的出力信号を発生させ、これが
デイスプレー３２で表示される。
本発明の主旨から逸脱せずにその方法及び装置に対して
種々の変化を与えることができることが分るであろう。
例えばすでに示したように拮抗的検定用キツトには、固
定した部分との複合体となる標識成分を予め入れておい
てもよい。本発明の装置は拮抗的検定にもサンドイツチ
検定にも適合できるのは明らかである。またフアイバー
に固着される複合体部分は抗体である必要はなく、代り
に抗体の活性断片(Fab)であつても、ありは抗原または
ハプテンでもよい。またフアイバー１０に抗原−抗体複
合体の標識成分を設けずに、使用者が検定をできるよう
に単に結合部位３４のコーテイングを施すだけでもよ
い。さらに同じフアイバーで多数回の検定を行なつて、
個々の検定では異なる螢光特性の螢光材料を用いるよう
にしてもよい。さらに前述したように、フアイバー１０
は端面１６と反対側の反射端面１７を設けて励起ビーム
が多数回通過し通り抜ける螢光放射全部集光させるよう
にしてもよい。
螢光光度計１８において励起と螢光の放射を分離するた
めにビーム・スプリツターよりむしろ焦点距離あるいは
コヒーレント光源及び空間濾光を用いてもよいことは当
業者には明らかであろう。かくしてレーザー照射を用い
れば、励起放射はフアイバーの受容角よりずつと緩やか
に傾斜し、フアイバーに通り抜ける螢光放射は受容角ま
での発散でフアイバーの端面から出るであろう。
さらに光源２０は多放射帯のあるものでもよく、複数の
光検出器２６を設けて、各々が同時に異なるスペクトル
帯域を観測するようにしてもよい。
流体１０の好ましい例は緩衝水溶液であるが、適当な他
の流体で置換えてもよいことが理解されよう。かくして
流体１０は何らかの生体流体、環境上の標本流体等でも
よい。またこの方法及び装置は本来ダイナミツクな過程
の観測に特に適しているけれども、その場での観測のた
めにフアイバーを試料流体から取外すことができること
が理解されよう。
本発明の主旨から逸脱せずに前記の方法及び装置にこれ
らの、また他の何らかの変化を行なうことができるの
で、前記の説明に含まれ、あるいは添付の図面に示され
ている全ての事項は例示的であつて制限的でないという
意味において解すべきものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブロツク・マイロン・ジエイ アメリカ合衆国ニユ−ハンプシヤ−州 03073ノ−ス・サレム・ノ−ス・メイン・ ストリ−ト334 (72)発明者 ハ−シユフエルド・ト−マス・ビ− アメリカ合衆国カリフオルニア州94550リ バ−モア・バンク−バ−・ウエイ1262 (56)参考文献 特開 昭58−501481（ＪＰ，Ａ) 特表 昭56−501297（ＪＰ，Ａ) 米国特許4050895（ＵＳ，Ａ) 米国特許3939350（ＵＳ，Ａ)

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】免疫化学的複合体の第１の成分と第２の成
    分との反応によって形成される免疫化学的複合体（該第
    ２の成分は蛍光標識を含む）にもとづく蛍光免疫検定の
    ための装置であって： 上記蛍光標識の蛍光を励起できる第１の分光エネルギー
    分布を有する放射を発生できる放射源； 第１の分光エネルギー分布を有する放射と、上記蛍光標
    識からの蛍光に対応する第２の分光エネルギー分布を有
    する放射とを透過する光ファイバーであって、第１の成
    分が上記免疫化学的複合体を形成する反応性に実質的な
    影響を与えないようにして、複数の第１の成分が該ファ
    イバーの側壁に付着している光ファイバー； 第１の分光エネルギー分布を有する放射を上記放射源か
    ら上記光ファイバーの一端へ放射する手段であって、該
    励起放射が上記ファイバーの開口数によって決定される
    より小さな立体角にわたって少なくとも一端に供給され
    てそれによって上記励起放射が上記ファイバーの側壁に
    関してほぼ臨界角以上の行路に沿って上記ファイバー内
    で伝わるようにする手段； 上記ファイバーに付着された上記複合体における上記標
    識の励起から生じ上記ファイバー内で伝わって戻り、該
    光ファイバーの上記一端から出てくる蛍光放射を同様に
    制限された立体角にわたって集光する手段；および 上記光ファイバー内で伝わって戻り、該光ファイバーの
    上記一端から出てくる、第２の分光エネルギー分布を有
    する放射を検出する手段 の組み合わせからなる装置。
  2. 【請求項２】上記付着のための手段が、複数の第１の成
    分と反応性であるコーティングからなる特許請求の範囲
    第１項の装置。
  3. 【請求項３】複数の第１の成分が該光ファイバーの側壁
    の少なくとも１部分に上記付着のための手段によって付
    着している特許請求の範囲第１または２項の装置。
  4. 【請求項４】第１の成分の少なくとも１部分が、あらか
    じめ決められた量の、蛍光標識を含む該成分と複合体を
    形成している特許請求の範囲第３項の装置。
  5. 【請求項５】上記第１の成分が抗体である特許請求の範
    囲第３項の装置。
  6. 【請求項６】上記第１の成分が抗原反応性抗体断片であ
    る特許請求の範囲第３項の装置。
  7. 【請求項７】上記第１の成分が抗原である特許請求の範
    囲第３項の装置。
  8. 【請求項８】上記第１の成分がハプテンである特許請求
    の範囲第３項の装置。
  9. 【請求項９】免疫化学的複合体の１つの成分（該成分が
    蛍光標識を含む）にもとづく免疫検定法であって： 検定するべき試料中に、上記標識の蛍光を励起できる励
    起放射および上記標識の蛍光放射を透過させる光ファイ
    バーを没入させ、該ファイバーには、その表面に上記免
    疫化学的複合体の選択された成分を付着させておいて上
    記試料との免疫化学的複合体を形成させ； 上記光ファイバーの少なくとも一端を、上記励起放射で
    照射して、該光ファイバーに付着した上記免疫化学的複
    合体中の蛍光標識の蛍光を励起するようにし、該励起放
    射が上記ファイバーの開口数によって決定されるより小
    さな立体角にわたって少なくとも上記一端に供給され
    て、それによって上記励起放射が上記ファイバーの側壁
    に関してほぼ臨界角以上の行路に沿って上記ファイバー
    内で伝わるようにし、 上記ファイバーに付着された上記複合体における上記標
    識の励起から生じ上記ファイバー内で伝わって戻り、該
    ファイバーの上記一端から出てくる蛍光放射を、同様に
    制限された立体角にわたって集光し；そして 上記ファイバーから出てくる上記蛍光放射の強度を測定
    する ことからなる方法。
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US406324 1995-03-17

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