JPS59501873A - 免疫検定装置及び方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 免疫検定装置及び方法 発明の背景 本発明は免疫検定に関し、より詳細にはよりエネルギーの高い励起放射で励起さ れたときに螢光放射を出すことのできる螢光標識が抗原−抗体あるいは同様な複 合体。

の成分としで入っているような免疫検定に関する。

一種類またはそれ以上の試薬と試料のアリコツトを種板するために観測する免疫 検定は周知である。このような検定の典型的なものとして特定の抗体がそれに特 有な抗原の量を測定する（あるいはその逆の場合）ために用いられる検定がある 。しかしながらこの手法は抗原ととモニハフテン（ホルモン、アルカロイド、ス テロイド等を営む）を、また完全な抗体とともに抗体部分（すなわちＦａｂ）を 計量するように拡張されてきて８つ、この広標識を加えた非複合体の試薬が複合 体の試薬から分離され、それから複合体（あるいは非複合体の試薬）は標識を観 測することにより計量されるトレーサーの手法を用いている。免疫検定の試薬の 標識成分には放射性同位体と螢光性マーカーとの両方が用いられて２つ、標識は それぞれガンマ線カウンターまたは螢光光度計で観測される。しかしながら本発 明は螢光による検定だけを意図している。

非複合体である標識の部分を複合体から分離することは複合体の成分の所定の１ つをその成分の複合体形成時の反応度を低下させないようにして固相体（試験管 の内壁、ガラスまたは重合体のビーズ等のような）に固定させることにより通常 なされている。例えば免疫グロブリフ　Ｇ　ＣＩｆＧＩのような抗体はカルボキ シル末端によりガラス等の固相体に、３−アミノプロピル−トリメトキシシラン 等のシリル化合物によって結合され、それによって抗体の抗原の反応性アミン末 端を遊離にさせる。固定した成分を含んで形成された複合体はそれから、管から の流体のアスピレーションまたはデカンテーション、あるいは粒子状ベッドで流 体を溶離させることにより溶液中に残っている非反応性成分から物理的に分離さ れよう。

拮抗的免疫検定において、試薬は複合体の固定した成分（この場合抗体）に対す る既知の量の標識のある補体（抗原等）からなる。試薬は定量化されるべき標識 のない補体を含む一定の量の試料と混合される。標識のある補体も標識のない補 体もその相対的濃度に比例して複合体の固定した成分に結合する。設定した時間 だけ接続させると流体の試料と試薬とが分離される。、固相体に固定された複合 体はそれから標識の螢光を励起させるように選択された波長の放射で照射され、 螢光が測定される。

固定した複合体の螢光の強度は分析される標識のない補体の濃度に反比例する。

あるいは計量すべき部分にある量の類似体の物質（すなわち免疫的に同様に反応 する物質）を固定しこの試料を既知の量の標識のある補体と反応させることによ り分析を行なってもよい。標識のある補体は試料中の未知の量の部分と固定した 類似体との両方との複合体となる。

また固定した複合体の螢光の強度は定量化されている（自由な）部分の濃度に反 比例する。

固定した成分に対する多価の補体に関しいわゆる「サンドイッチ」免疫検定を行 なってもよく、このとき加えられた補体はさらに固定した成分の標識きれた類似 体と反応する。かくして二価の抗原は固定した抗体と結合し、それから標識され た螢光性の抗体と反応して抗体−抗原−標識された抗体のサンドイッチを形成し 、それからこれが未反応の標識された抗体から分離されよう。このようにして形 成された固定した複合体の螢光の強度は定量化される部分の濃度に正比例する。

これらの分析のいずれに３いても、固定した複合体及び未反応の標識のある成分 の物理的分離が必要となり、典型的な従来技術の方法ではこれをアスピレー／ヨ ン、デカンテーション、溶離あるいは他の固相体と流体との分離法によって行な っている。未反応の標識のある成分の定量化を可能にするほかにこのような分離 のステップはまたバックグラウンド螢光の量を減少させるものであり、生物学的 試料（例えば血清ビリルビン、ト−リプトフアン、種々の薬剤等）かあると思わ れる物質の固有の螢光の点における重要な考察事項となる。

実験室のプロトコルにおいて追加の（分離の）ステップを必要とすることのほか に、このような手法は反応の終点を決定するものであり、それゆえ反応のダイナ ミックスを研究するのには有利でない。

分離による免疫検定に共通する固相体に固定した複合体から実際に流体を除去す ることのほかに、分離は本来固相体のすぐ近くまで螢光の測定を限定することに よってなされよう。かくして固抄体の表面の分子的大きさの範囲内だけで螢光が 生ずれば、このような距離以内にある、またそれゆえ固定した成分との複合体を なした発螢光団だけが励起されよう。試料と他の材料との間の境界面において試 料の螢光を発生させこれを観測する方法がバーンフェルト責Ｈｉｒｓｃｈｆｅ’ ｌｄ）によって開発されている（米国特許第３，６０４，９２７号）。この方法 において試料をプリズムの面に接触させ、試料に接触する面で内面全反射が生ず るようにしてプリズムに励起放射が照射される。かくして試料は比較的短い距離 だけ試料内に透過する微弱波を照射され、その電場の振幅が境界面からの距離と ともに、典型的には１００ＯＡ以下で表面の領のｅ−１１で指数関数的に減少し 、正確な有効透過深度は波長、屈折率の不斉合、臨界角に対する光線の行路に依 存する。このようにして試料の薄い表面層が検査されよう。

この薄片から大きな角度で境界面に放出される螢光を観測すると螢光信号からの 励起放射が有効に濾光される。

この手法はクロニック及びリトル（Ｋｒｏｎｉｃｋ　ａｎｄＬｉｔｔｌｅ　）に よる螢光免疫分析に特に適用されているが（米国特許第３，９３９，３５０号） 、これは複合体の成分をプリズム（あるいはプリズムに光学的に接触するスライ ド）に固定し微弱波によって励起される発螢光団の螢光を観測することを教示し ている。これらが抗原−抗体の複合体の固定した成分に集中し結合している発螢 光団である程度によりこの方法は試料または試薬のバックグラウンド螢光に対す る所望の信号を増加させることになる。このアプローチの利点は、固相と液相と が測定前に分離されそれゆえ終点（分離が影響を受けた時に対応する）が板側さ れる分離法に対して、螢光の強度が本来時間の関数として観測されるということ である。不利な点としては、この手法は数百Ａより薄くない層を分離するにすぎ ず、それによって試料の固有の螢光を全面的に低下させることもなく、また結合 していない試薬から結合したものを完全に分離することもない。かくして前述の 手法に比して、大きな固有の螢光があり非常に低い滴定量のものを計量すべきと きに不利になる。

さらにクロニック及び１１　）ルの方法及び装置は従来技術による螢光検定のコ ーティング壁試験管に共通して、螢光面のランバート放射を観ｆｆ１ｌｆするも のである。このような光源を有効に利用するには大きな光学流量（すなわち大き な立体角−開口の積）を有する光学系が必要になる。このような光学系はより小 さい光学流量を有する光学系より本来大型で、複雑かつ高価になる。例えばこの ような拡張された拡散源に対する放射検出器の流量整合は一般的に大きな集光光 学系と組合せて用いられる大きな領域の（それゆえより高価で騒音を発生する） 検出器を必要とする。放出された放射の有効利用に替るものは光学系の感度の損 失になる。

拡張された螢光源の光学出力の整合の弱さによって生ずる光学系の感度の損失を 補償するために、より強力な励起源と、励起放射を試料に反復的に反射させるこ とによって多数回再使用することに頼ってもよい。これはまた照射されるべき領 域の大きさと、この領域に励起源の流量整合を行なう必要性によって悪化する。

このような整合を行なわないと、非常に強い（また通常複雑で高価な）光源が必 要になる。かくしてクロニック及びリトルの好ましい実施例（米国特許第３．？ 　３９，３５０号）ではヘリウム−カドミウム・レーザーを備え、比較的濃度の 高い試料の分析にだけ十分な感度を有している。

他には標識成分に（一般的にすでに）高い効率の発螢光団をより多く包含せしめ ることである。これは通常補体について識別化した成分の特性及び強度を低下さ せ、また螢光の効果を減少させることになり、これが実際に限界になる。

発明の目的 従って従来技術による全反射螢光より薄い層を観測することによって液相と固相 を分離せずに螢光の測定が行なわれ、それによって本来の未反応試薬の螢光の除 外を改良する螢光免疫検定の方法及び装置を提供することが不発明の目的である 。

本発明の他の目的は螢光放射がオプトエレクトロニクス式の検出装置により容易 に流量整合される免疫検定の方法及び装置を提供することである。

、低い出力の励起源がかなりの量の反応した試料及び試薬に最大の有効流量利用 度で有効に光学的に結合されるような螢光免疫検定の方法及び装置を提供するこ とが本発明の他の目的である。

日の　単な＠日 流体相に微弱な波を発生きせるために低い屈折率の液相と固相との間の境界面に ８ける内面全反射を用い、この彼によって励起された螢光が固相媒体における全 反射によって「暗部円錐」内で（すなわち臨界角より大きい角度で）桟測される 免疫検定の方法及び装置について本発明の前記及び他の目的が見られる。固相体 は境界面で多数回の内面全反射をさせるように配置され照射される。

好、ましい実施例に８いて固相体は免役化学反応で形成される複合体の成分が固 定される光ファイバーの形である。

複合体の他の成分に発螢光団が付加される。螢光で識別される咬分は拮抗的分析 あるいはサンドウィッチ分析のいずれがなされるかによって固定した成分に対す る補体かその類似体になろう。拮抗的分析の場合識別される成分は制御された濃 度で固定した成分に予め包含せしめるのが好ましい。ファイバー（と分析の付加 された成分）は流体相の試料に浸される。流体相で螢光を励起させるために微弱 波が用いられ、固相体に通り抜ける螢光（臨界角より大きい角度の方向に同相体 内で伝わる）が検出される。

観測される量は境界面、からの距離の関数としての微弱波の急速な減衰だけでな く、通り抜けの効率が距離とともに同様に急速に減少することによっても制限さ れ、より離れた発螢光団がより強度が小さく励起され、それゆえ螢光が少ないだ けでなく、その放射がファイバー内に結合する効率も小さくなる。その結果検出 される層の有効深度は全反射螢光だけで観測される領域に比してずつと減少し、 結合効率によりこの領域が効果的に減少する。

固相体における多数回の内面全反射により照射ビームが微弱波を反復的に励起さ せることができ、それによって小さい励起源を一試料の量により効率的に結合で きる。

これによりまた抽出量と、かくして検出される試料の量が増加し、この量はさら に表面（試料が通過する際に反応により付着する）を通る試料の拡散循環により 増大する。かくして拡散により実際の試料の層の厚さがバックグラウンドに寄与 する全てとなる薄い表面層よりずっと大きくなる。

ファイバー内に通り抜けて戻る放射は全て全反射角内にあり、かくしてファイバ ー内に捕捉される。螢光から利用できる出力は螢光材料内のファイバーの長さが 増加するとともに増加するが、光学系の光学流量（ファイバーの開口数〔受容角 〕と開口〔断面〕によって決定される）は一定の１まである。ファイバーの全面 積から出る螢光信号全体は、拡散による試料の量の増加分だけ乗ぜられて、ファ イバー内の屈折の臨界角によって決定される制限された角度でファイバーから出 る、実際のファイバーの断面積となる、非常に明るい点で用いられる。このよう な信号は小さな検出器に適合した高い効率及び流量で容易に集められる。

表面近くの放出に２ける干渉角効果により通り抜けが放出の空間分布においてよ くなるので信号がさらに増大する。逆反射によるファイバーの二重通過によって 励起及び集光の効率の両方を倍加する機会ができるので、全反射の周知の放射場 増大（バージフェルト、米国特許第３．６０４，９２７号）もこれに寄与する。

本発明の他の目的は一部は明白であり、一部は以下に明らかになろう。従って本 発明は以下の詳細ガ説明において例示きれる構造、要素の組合せ、部分の配置を もつ、装置、いくつかのステップと、このステップの１つまたはそれ以上と他の ステップの各々との関係を包含するものであり、請求の範囲に示される技術範囲 のものである。

図面の簡単な説明 本発明の特徴及び目的をより完全に理解するために添付の図面と併せて以下の詳 細な説明を参照すべきであり、Ｏ 第１図は本発明の主旨を具体化し免疫検定装置の例の概略図であり、 第２図は本発明を実施した場合に関連する典型的な免疫化学反応及び放射エネル ギーの行程を示す、第１図の装置の一部分を様式化した図である。

図において同じ指示番号は同じ部分を示す。

」１乱至基」Ｌ 周知のように、与えられた屈折率ｎ１の媒体を通って伝わる電磁放射の波面がそ の媒体と屈折率ｎ２の他の媒体との境界面に達すると、波面はスネルの法則ｎ、 　ｓｉｎ　ｉ　＝ｎ２ｎｉｎ　ｒ　（１）に従って屈折し、ここでｉ及びｒはそ れぞれ波面が境界面を通過する前及び後に境界面への法線が波面への法線に対し てなす角度である。ｎ、がｎ２より大きければ９０゜工り小さいあるｉの値に関 して５ｉｎｒが１になるであろう。この臨界角より大きい入射角の仮では境界面 で正規つ屈折がもはや生ぜず、その代りに波面が第一の媒体へ反射して戻る。内 面全反射として知られるこの現象は周知であり、例えば光フアイバー導光管の原 理であって、これは多数回の内面全反射を維持するようにした形状の゛壁部が設 けられている。

臨界角に等しいかこれより大きい入射角の＠についても、最も単純な場合に低い 屈折率の媒体内への正味のエネルギーの伝達がないけれども、実際に屈折が生ず る。

１ むしろ境界面の各点で境界面を通る周期的なエネルギーの流れがあり、低い屈折 率の媒体内に移送されるエネルギーが逆に移送されるエネルギーに等しくなって いる。

低い屈折率の媒体に生ずる波は入射波と同じ演技のいわゆる微弱波であり、入射 波面の射影速度に合致した速度で境界面に平行に伝わり、また境界面で最大にな り境界面からの距離とともに指数関数的に減衰して波長に比べて犬、きな距離で はほぼＯになる振幅を有する。

内面全反射の最も単純な場合は非吸収性、非放出性の低い屈折率の媒体によるも のである。この場合微弱波によって低い屈折率の媒体にエネルギーが失なわれた り、これから生じたりすることはなく、−万の媒体から他方の媒体に伝わるエネ ルギーは逆に移送されるエネルギーと正確に均等になっている。従って境界面に ２ける反射が実際に全てである。し刀・しながら低い屈折率の媒体が吸収性であ れば、エイ・ルギーの幾分かが微弱波から取出され、それゆえ高い方の屈折率の 媒体に戻らないであろう。境界面に２ける反射はもはや実際に全てではない。

減衰全反射ＣＡＴＲＩとして知られるこの現象は低い屈折反射ビームに２けるエ ネルギーを測定したファーレンツオートＣＦａｈｒｅｎｆｏｒｔ）により１９５ ９年に最初に吸収分光学に適用された。吸収成分が螢光性で゛あｌ″Ｌば、微弱 波は螢光の発生に用いられよう。全反射螢光（ＴＲＦ）として知られるこの現象 はバー／フェルトの米国特許第１２ ３．６０４，９２７号の主題事項である。ＡＴＲとＴＲＦの両方とも表面効果の 研究に広く用いられており、境界面から波長の部分の距離での微弱波の限られた 振幅により観測される試料の厚さが効果的に限定される。

この現象を詳細に考察するとまた境界面のすぐ近くで低い方の屈折率の媒体から 出る波が一部臨界角より大きい角度で高い方の屈折率の媒体内に反射することが 示される。この現象は通り抜け（ｔｕｎｎｅ　／　ｌ　ｉｎｇ）　として知られ ており、この放射はまた媒体が適当な形状であれば内面全反射により高い屈折率 の媒体内で伝わるであろう。

本発明は励起放射と螢光放射との両方が多数回の内面反射を行なう螢光のＴＲＦ と通り抜けとの両方によるものである。

第１図を参照すると本発明の好ましい実施例の主要部分が特に概略図で見られよ う。全体的に指示番号１０で一部だけが示される光ファイバーが全体的に１２で 示される流体の試料に没入されている。ファイバー１０はその縦方向に多数回の 内面全反射によりファイバーの軸の回りにほぼ回転対称な設定された立体角内で ファイバーの端部に入る光学放射を伝えるようにした細長くほぼ円筒形の光学的 な゛透明体である。ファイバー光学の技術でよく元られでいるように、ファイバ ーに入ってその内で伝わる放射についてファイバーの軸に関して最大の受容角Ｂ はファイバーと周囲の媒体の屈折率によって設定される。最初に屈折率ル。の媒 体を通って伝わり、屈折率ｎ２１３　］］１ＡｂＪ５９−５０４８７３（５ンの 材質で囲まれた屈折率ｎ１のファイバー上に入射する放射について最大の受容角 は次式 ％式％（２） で与えられ、ここで＃、Ａ、はファイバーのいわゆる開口数である。限定的なも のでない例として、ファイバー１０は流体１２の屈折率（典型的には１．３３近 くの屈折率を有する水溶液または１．３５に近い屈折率を有する血清試料）より 大きい屈折率を有するように選択され、またさらに流体に比較的不溶性で反応性 がないように選択された、ガラス、水晶、ポリオレフィン、ナイロン等のいくつ かの光学的に透明な材質のいずれでもよい。ファイバーの直径は２００ミクロン が良好であるが、他の大きさのものも用いられよう。多くの分析で長さ２５龍の ファイバーで十分であると思われるが、しかしながらファイバー〇長きは行なわ れる分析に適合され得ることが分るであろう。

以下に詳細に説明されるように、ファイバー１０は選定された抗原−抗体複合体 の部分（ここで用いる「抗原−抗体複合体」は完全な抗体及び抗原の複合体だけ でなくそのいずれかまたけ両方の免疫反応性部分を有する複合体をも営む）を付 着させるだめの手段を含む表面コーティングが施されている。

流体１２は以下により詳細に説明するように試料ｌたは試薬を含む。

ファイバー１０はファイバーの端部１４以外の全部を４ 流体に当てて端部１４の研磨した端面１６が流体またはホルダーに光学的に妨げ られないようにするためいくつかの機械的手段（図示せず）のいずれかにより流 体１２内で支持されるのが好ましい。かくして流体１２は端の開いた直立形の容 器と、取外し可能なキャップに通されて固着されたファイバー１０の端部１４に 包囲されよう。

これで流体１２は完全に包囲され、ファイバー１０は容器の壁部を通り抜ける。

流体１２の容器もファイバー　・１０のホルダーも本発明の重要な要素ではない ので、明瞭にするためにそれらを図面から省略している。ファイバー１０は端部 １４を除いてファイバーが容器の壁部または支持手段に接触しないように流体内 に支持されている。端部１４はファイバー内のエネルギーを支持手段または容器 による撹乱を分離させるための合せ材（図示せず）のような手段が設けられるこ とは光ファイバーの当業者に理解されよう。

研磨した端面１６は平面状でファイバー１０の帖に垂直に配設されるのが好まし い。また端面１６と反対側のファイバーの端面１７をファイバーの軸に垂直な平 面に研磨しさらにミラー・コーティング１８（まだめ分離したミラー）を施して ファイバーに捕捉された放射がファイバーを二重に通過するようにすることも任 意になされる。

ファイバー１０に螢光光度計１９とともに使用することを意図している。螢光光 度計１９は光源２０、ダイク５ ０イツク・ミラー２２、対物レンズ２４、光検出器２６、参照光検出器２８、比 率増幅器３０及びディスプレー３２からなる。

光源２０は試薬の付加成分に螢光を励起させるため問題となる分析において標識 として用いられる発螢光団をもとに選択された適当な周波数の光学放射を与える 。光源２０はこの放射を、螢光を最大にするように選択された狭い波長帯にだけ わたって与えるのが好ましい。それゆえ光学２０は典型的には好ましいタングス テン−ハロゲン・ランプ及び関連する電源供給部に加えて帯域フィルターを含む ものである。あるいは光源２ｏは水銀ランプ、フラッシュ・ランプまたはレーザ ー等の他の光源を備えてもよい。光源２０は、当業者に理解されるように、対物 レンズ２４がファイバーの開口数に対応する角度より大きい入射角で光線が端面 に入射しないように光源の開口をファイバー１０の端面１６に結像できるように して適当な傾度のビームで対物レンズを照射するための適当なビーム成形の開口 及び光学系を含む。

光源２０と対物レンズ２４との間にグイクロイック・ビーム・スプリッター２２ が置かれている。好捷しい実施例に２いてビーム・スプリッター２２は問題の螢 光の最大吸収周波数と最大螢光放出周波数との間にあるように選択されたカット オフ周波数を有するローパス干渉フィルターである。；：Ｖ）くシでご一部・ス プリッター２２殊光源２０ｐらの高周波数（短波長）螢光励起放射を反射ｌ６ させ、発螢光団の最大の螢光に対応する低周波数の放射を透過させる。

対物レンズ２４は光源のビーム成形開口の像でちょうど端面を満たすようにファ イバー１０の端面１６に光源２０を結像させるように選択され、光線の最大入射 角度がファイバーの開口数に対応する角度より小さくなるように選択される。対 物レンズ２４はまだ端面１６から出るほぼ全部の放射をファイバーの開口数にわ たって集光し端面を光検出器２６に８いて結像させるように選択される。

光検出器２６はビーム・スプリッター２２を通じて対物レンズ２４により光検出 器の方へ投射されたファイバー１０の端面１６の像を受けるように配設される。

光検出器２６は発螢光団のピーク螢光領域に３いて最大の感度を有するように選 択された光電増倍管（周知のように検出器の視野を端面１６に制限するための適 当な光学系及び電源供給部が設けられている）全含むのが好ましい。

光検出器２６はさらに帯域フィルターを設けた光源２０に対応するブロッキング ・フィルターを設けるのが好ましい。

参照光検出器２８はフォトダイオードであるのが好まシく、ダイクロイック・ビ ーム・スプリッター２２を通過する光源２０からの放射を遮るように配設されて いる。

参照光検出器２８はダイクロイック・ビーム・スプリッター２２に透過させる光 源２０のス被りトル領域におけるピーク感度に関して選択され、その光源に対す る視野を制限するだめの適当な視野絞り及び光学系を含む。

比率増１福器３０は参照光検出器の出力に対する光検出器の出力の比率に比例す る信号を発生するように光検出器２６及び参照光検出器２８の出力に結合した、 一対の入力信号の比率に比例した出力を与えるいくつかの周知の電子回路手段の いずれかである。例えば比率増幅器３０は光検出器２６からの出力を増福し参照 光検出器３０からの出力に反比例するゲインを有する可変ゲイン増幅器でもよい 。

比率増幅器３０の出力はディスプレー３２に結合してその入力となる。ディスプ レー３２は電気的入力に比例する可視的信号を与えるいくつかの装置のいずれか であり、例えば計測器、ディジタル・ディスプレー、ストリップ・チャート記録 計等でもよい。

第２図を参照すると、ファイバー１０の縦方向の断面と近接する流体１２とを高 度に様式化した図が示されている。

ファイバー１０の表面には多数の結合箇所３４が設けられ、その多くの抗体−抗 原複合体の部分３６が結合している。（ここで用いている「抗体−抗原複合体の 部分」という語句はこのような複合体の免疫反応性の部分について言うものであ り、完全な抗原とともにハプテンを、また完全な抗体とともに抗原反応性の抗体 部分〔Ｆαｂ〕を含む。Ｌ結合箇所３４は複合体の補助的部分に関し複８ 合体部分の反応性（例えば親和力、指向性）にそれほど影響を与えずに複合体部 分３６を固定するように選択されている。好ましい実施例においてファイバー１ ０はガラスまたは水晶からなり、結合箇所３４は３−アミノプロビルトリメトキ ンシラーネ等のシリル化合物の反応性基であり、複合体部分３６は免疫グロブリ ンＧ　（１？Ｇ）等の抗体である。前記のようにこの特定の固相体の結合に関し て結合箇所３４及び複合体部分３６は抗体のカルボキシル末端によって結合し、 それによって抗体の抗原反応性アミン末端を遊離にする。ファイバー１０のガラ ス面を形成し、これにシリル化合物を付加し、シリル結合により抗体をガラスに 共有結合させる方法はライ−トール（Ｗｅｅｔａｌｌ、米国特許第３，６５２， ７６１号）によって開示されているが、ここにはカルボキシル、アミン、及び他 の抗体または抗原（またはそれらの部分）の反応性グループが種々の無機材質に 共有結合するような方法及び他のシリル化合物についての開示もなされている。

抗原または抗体を重合体に固定するだめの広範な技術も存在することが分るはず であり、また抗原または抗体の結合箇所３４は重合体のファイバーにも設置すら れることが当業者に理解されよう。かくして例えばフ−０どイバー１０がナイロ ン（ポリアミド）からなるものでオ）れば、結合は適当な基で分子鎖の炭素また は窒素のいずれかに結合した水素を置換した形になろう。

結合箇所３４はまた周知のように抗体−抗原の結合過９ 程の立体障害を最少にするのに十分なファイバー１０と複合体部分３６との間隔 ができるようにするだめのスに一す−・グループを備えてもよい。例えばペプチ ド結合によりファイバー１０に結合しそれぞれ蛋白質部分３６のカルボキシルま たとアミン末端に共有結合するための遊離のアミン基及び自由なカルボキシル基 を与える１、６ジアミノヘキサンまたは６アミノヘキサン酸の場合のように結合 箇所３４はポリエチレン鎖を含むこともある。

これらの結合材質のいずれも末端の間の６−炭素鎖を与えるもので、それにより ファイバー１０から錯体部分３６を対応する距離だけ離す。同様に適当な結合及 びス４−サーの材質は免疫検定と親和力クロマトグラフィの両方の技術において 周知である。

好ましい実施例において、ファイバー１０は指示番号３６Ａで示されるような空 席の結合箇所を有する複合体部分３６がある。但しこの部分は所望でおれば拮抗 的免疫検定のために一部において標識のある補体が付加されることが理解されよ う。かくしである実施例において複合体部分３６は抗体であり、標識のある抗原 またはハプテンを予め包含させることもなされよう。

流体１２はとりわけ計量すべき特定の抗体−抗原複合体の成分３８と（最初顛フ ァイバー１０に複合体部分３６がなければ）既知の滴定量の標識成分４０とを含 む緩衝水溶液であるのが好ましい。これ寸で説明した好ましい実施例において成 分３８と標識成分４０は同様な抗ｐＨ６−９の範囲に、好ましくはｐＨ７−８の 範囲に緩衝される。このためにホウ酸塩、炭酸塩等の種々の緩衝剤が用いられよ う。

標識成分２０の各々は所定の量の発螢光団４２を備え、それによって標識となる 。標識に関係する特定の螢光化合物はフルオレセイン、テトラメチルローダミン 、希土類キレート化合物等である。螢光標識を蛋白質に連結さ質との連結のだめ の基を有する。

前述のファイバー１０及び流体１２が接触すると、流体中の成分３８と標識成分 ４ｏとがファイバーに結合した部分３６と反応する。成分３８と４０とが同様に 部分３６と反応する程度まで指示番号３６Ｂ及び３６Ｃで示されるそれぞれの濃 度に比例して上記部分との免疫性複合体を形成するであろう。

第２図には１だある瞬間の全反射した波面における光学的エネルギーの行程４４ が示されている。この行程の近くに８ける発螢光団４２は微弱波中にあり従って 波面の波長が適当であれば螢光を発するであろう。図示のように複合体部分３６ との複合体をなした標識成分（３６Ｃのように）の発螢光団は微弱波向にあり従 って螢光を発する。ファイバーに十分近い非複合体の標識成分４゜（指示番号４ ０Ａのような）も微弱波で励起されるが、螢光成分によって放出される放射はど の方向でもよいが、螢光複合体３６Ｃの多くについて放出された放射の幾分かが 光線４６で示されるように通り抜けて戻る。螢光粒子から分るように、粒子の回 りの全立体角の約２％だけが復帰ビームに集められる。しかしながらファイバー −流体境界面の近くの螢光放出による角度干渉のためにこれは典型的には１０チ 以上の螢光放射を示す。通り抜けがファイバー内の光線路において臨界角または それ以上の角度で生ずると（角度干渉は臨界角よりわずかに大きい行路で生ずる ）、光線４６はファイバーに沿って全反射して倍加し、ファイバーに沿ってその 端部の方へ伝わる。かくしてファイバー内に通り抜ける螢光放射の部分は端面１ ６（第１図）を出てゆく。端面１７にミラーが設けられていれば、ファイバー内 に通り抜ける放射の全部（吸収と反射の損失は少ない）が端面１６から出てゆく 。ファイバーの開口数はファイバー内での内面全反射となるようなファイバーの 端面外の最大の立体角を用いて定義され、また対物レンズ２４はこの角度の光を 集光するように選択されているので、ファイバーに付着された部分３６との複合 体となる標識成分からファイバー内に通り抜ける螢光放射の半分またはそれ以上 （ファイバー内の損失は少ない）が対物レンズ２４に集光されユリ。

巷にファイバー１０の形状はＡＴＲの平板またはプリズムの形状と異なって他の 光学的部分に対してファイバ２ −の流量整合を行なうのに特に適合しているのが分るはずであろう。ファイバー の円筒形状によりファイバー内で伝わる放射が固定された回転対称の立体角内で 伝わり小さな円形開口を通ってファイバー内に入りファイバーから外へ出るよう に制限される。放射のパターンの大きさ及び対称性は従来の光学系に対して容易 に流量整合される。これに対しプリズムまたは平板は内部に伝わるエネルギーが 少なくとも一次元的に広がることを可能にし少なくとも一次元的に大きな空間範 囲と大きな発散とをＡＴＲの平板ｌたはプリズムと比較した場合のファイバー１ ０の形状の他の利点は拡散過程における集光器と１□、７）７アイ２．−０効イ 、ある。ン。点、関。抗体−抗原複合体の形成は結合していない成分の拡散によ ることが分るはずである。与えられた平均拡散厚さくすなわち所定の時間の拡散 によって排除される試料の層の与えられた厚さ）について、小さな径の円筒面（ ファイバー）によって、同じ面積の平面（ＸＶ−板またはプリズム）による場合 より多量の試料が排除される。かくしてファイバーは平板またはプリズムよりも 急速に与えられた滴定量の複合体の結合していない成分を固定した成分に集める 。

操作時に発螢光団４２において螢光を励起させるように選択された波長の放射が 、ファイバーの開口数によって決定される円錐角内のファイバー１０の端面を照 射するように、グイクロイック・ビーム・スプリッター２２３ 及び対物レンズ２４を通じて、光源２０によって供給される。その後にこの放射 は臨界角またはそれより大きい角度でファイバー内に伝わり、ファイバーの縦方 向に内面全反射しファイバーに近接する流体１２中に微弱波を発生させて倍加す る。ファイバーに付加された部分３６に対する標識のある成分４０と標識のない 成分３８との拮抗的結合で標識のない成分に対する標識のある成分の相対的濃度 に比例した螢光標識のある複合体３６Ｃが生ずる。微弱波により標識のある複合 体３６Ｃの螢光が励起される。螢光放出の一部はファイバー内に通り抜け、と、 のうちの半分またはそれ以上がファイバーの端面１６から出て、ここで対物レン ズ２４によって集光され光検出器２６に向かって投射される。螢光が励起放射よ り長い波長（低い周波数）で生ずるので、ローパス・グイクロイック・ビーム・ スプリッター２２によりこの放射が光検出器に透過されるようになり、光検出器 の方は螢光の強度に比例した電気的信号を発生させる。グイクロイック・ビーム ・スプリッター２２に１だ光源２０刀）らの放射の幾分かが参照光検出器２８を 照射できるようにし、参照光検出器２８は光源の強度に比例した電気的信号を発 生させる。これらの２つの電気的信号は比率増幅器３０によって比率化されて光 源強度の変化を補正した螢光強度に比例する電気的出力旧号を発生させ、これが ディスプレー３２で表示される。

本発明の主旨から逸脱せずにその方法及び装置に対し２４ て種々の変化金与えることができることが分るであろう。

例えばすでに示したように拮抗的検定用キットには、固定した部分との複合体と なる標識成分を予め入れておいてもよい。本発明の装置は拮抗的分析にもサンド イッチ−に固着される複合体部分は抗体である必要はなく、代りに抗体の活性部 分ＣＦａｂ）であっても、あるいは抗原またはハプテンでもよい。またファイバ ー１０に抗原−抗体複合体の標識成分を設けずに、使用者が分析をできるように 単に結合箇所３４のコーティングを施すだけでもよい。ざらに同じファイバーで 多数回の分析を行なって、個々の分析では異なる螢光特性の螢光材料を用いるよ うにしてもよい。さらに前述したよりに、ファイバー１０は端面１６と反対側の 反射端面１７を設けて励起ビームが多数回通過し通り抜ける螢光放射全部集光さ せるようにしてもよい。

螢光光度計１８において励起と螢光の放射を分離するためにビーム・スプリッタ ーよりむしろ焦点分離あるいはコヒーレント光源及び空間濾光を用いてもよいこ とは当業者には明らかであろう。かくしてレーザー照射を用いれば、励起放射は ファイバーの受容角よりずっと緩やかに傾斜し、ファイバーに通り抜ける螢光放 射は受容角１での発散でファイバーの端面から出るであろう。

さらに光源２０は多放射帯のあるものでもよく、複数の光検出器２６を設けて、 各々が同時に異なるスペクトル帯域を観測するようにしてもよい。

流体１０の好ましい例は緩衝水溶液であるが、適当な他の流体で置換えてもよい ことが理解されよう。かくして流体１０は何らかの生体流体、環境上の標本流体 等でもよい。またこの方法及び装置は本来ダイナミックな過程の観測に特に適し ているけれども、観測のためにファイバーを試料流体から取外すことができるこ とが理解されよう。

本発明の主旨から逸脱せずに前記の方法及び装置にこれらの、１だ他の何らかの 変化を行なうことができるので、前記の説明に含まれ、あるいは添付の図面に示 されている全ての事項は例示的であって制限的でないという意味において解すべ きものである。

第１回 第２図 １、事件の表示 ５．補正命令の日付　昭和５７年タ月２２日（発送日）６、補正の対象 ７、補正の内容 了り＋６う島ソ、）肴ｊ’７ｉ　Ｉす／ｌλノの喜廂に着９力））にノｊシニ１ −亀　７Ｃ，、、。

１俵Ｊ　５９−５０１８７３　（９） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原−抗体複合体の成分が蛍光標識を含む免疫検定を行なう際に使用する装 置において、該装置が上記標識の螢光を励起享せることかできる放射と上記標識 からの螢光放射とを透過させる光ファイバーと、所望の抗原−抗体複合体の複数 の選択された部分を、上記抗原−抗体複合体を形成するため上記選択された部分 の反応性にほぼ影響を与えないようにして、上記ファイバーの側壁に付着させる だめの手段 と全組合せてなることを特徴とする上記装置。 ２、上記ファイバーの端部に入射するファイバー内の放射を反射させるだめの上 記端部における反射手段をさらに含むことを特徴とする請求の範囲１に記載の装 置。 ３、上記付着させるための手段が上記複数の選択された部分に反応するコーティ ングからなることを特徴とする請求の範囲１−！たは２に記載の装置。 ４、上記付着きせるための手段により上記ファイバーの側壁の少なくとも一部に 付着された上記複数の選択された部分を含むことを特徴とする請求の範囲１また は２に記載の装置。 ５、上記部分の少なくとも一部が螢光標識を有する所定の量の上記成分との複合 体となることを特徴とする請求の範囲４に記載の装置。 ６、上記選択された部分が抗体であることを特徴とする請求の範囲４に記載の装 置。 ７ ７、上記選択された部分が抗原反応性の抗体断片であることを特徴とする請求の 範囲４に記載の装置。 ８、上記選択された部分が抗原であることを特徴とする請求の範囲４に記載の装 置。 ９、上記選択された部分がハプテンであることを特徴とする請求の範囲４に記載 の装置。 幻、螢光標識を含む抗原−抗体複合体の成分を用いる免疫検定のための方法にお いて、 上記標識の螢光を励起させることができる励起放射及び上記標識からの螢光放射 を透過させる光ファイバーを分析すべき試料に没入させ、上記ファイバーには上 記抗原−抗体複合体の選択された部分をその表面に付着させて上記試料との複合 体を形成させ、 上記ファイバーに付着された上記複合体において上記標識の螢光を励起させるよ うに上記ファイバーの少なくとも一端を上記励起放射で照射し、上記励起放射が 上記ファイバーの開口数によって決定されるより小さな立体角にわたって少なく とも一端に供！８されてそれによって上記励起放射が上記ファイバーの側壁に関 してほぼ臨界角以上の行路に旧って上記ファイバー内で伝わるようにし、 上記ファイバーに付着された上記複合体における上記標識の励起から生じ上記フ ァイバー内端部がら出てゆく螢光放射を同様に制限された立体角にわたって集光 し、上記ファイバーから出てゆく上記螢光放射の強度を測２８ ことからなる改良を施した上記方法。 浄書（内容に変更なし）