JPH06269499A - 細胞分離方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 目的細胞を、効率よく、純度も高く分離で
き、かつ分離目的細胞の機能低下のない細胞分離方法と
装置を提供する。 【構成】 目的細胞を認識する抗体にヌクレオチドを結
合させ、細胞混合液と接触処理し、次いで前記のヌクレ
オチドと相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを固定
化し水不溶性担体と接触させて、目的細胞を分離する方
法とその装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、体液又は血液などの細
胞混合液中より、目的細胞を選択的に分離する方法及び
装置に関する。造血器悪性腫瘍及び各種固形癌に対する
大量化学療法により失われた造血機能回復のために本人
の末梢血幹細胞移植を行なう療法が進歩しつつある。末
梢血中の幹細胞は有核細胞の０．０１％にすぎないが、
本発明の分離方法及び装置を用いることにより効率良く
幹細胞の分離・濃縮が可能となり、これを患者に返還す
ることにより造血機能の回復を計ることができる。又、
血液中のヘルパーＴ細胞やサプレッサーＴ細胞を除去す
ることにより、臓器移植後の急性拒絶反応の防止、各種
免疫疾患及びＡＩＤＳ治療にも応用できるものである。

【０００２】

【従来の技術】現在用いられている細胞分離方法には、
遠心分離法、所望の細胞以外の細胞を死滅させる方法、
蛍光抗体標識細胞分離法、水不溶性担体に目的細胞に親
和性を有するリガンドを固定化し、これに目的細胞を直
接或は間接的に結合させる方法、免疫吸着カラムによる
分離及び免疫磁気ビ−ズによる分離法等がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】遠心分離法は細胞の大
きさ及び比重の違いによって分離する方法であり、白血
球、赤血球及び血小板の様に物理的性質に大きな相違が
ある場合には可能であるが、白血球の亜集団の分離（例
えばＴ、Ｂ細胞の分離）などの物理的な差が小さい場合
には使用できない。

【０００４】目的の細胞以外の細胞を死滅させる方法は
種々の方法が検討され開発されたが、この方法を使用す
るのは移植に先立ち自家骨髄中に存在する癌細胞を死滅
させるために薬剤やモノクロ−ナル抗体を用いる程度で
ある。この場合の薬剤は一般的に、４−ヒドロパ−オキ
シシクロホスファミドが使用されるが、正常な骨髄細胞
まで損傷を受けることが明らかになってきた。又、癌細
胞やＴ細胞に反応する抗体が所望細胞以外の細胞を死滅
させるために用いられてきたが、この場合においても、
これらの抗体はそのもの単独では細胞を死滅させること
ができないために他の薬剤（補体やトキシン）と組合わ
せて使用する必要がある。しかし抗体と癌細胞の反応性
は変化しやすいため、完全に癌細胞を死滅させることが
できない場合が多い。更に、抗体と一緒に用いなければ
ならない補体やトキシンは正常細胞にたいしても副作用
を有するため、所望の細胞を損傷する。

【０００５】蛍光抗体標識細胞分離法（以後ＦＡＣＳと
略記する）とは、最初に細胞混合液を目的細胞の膜抗原
を認識する蛍光ラベルしたモノクロ−ナル抗体とインキ
ュベ−トした後、処理した細胞にレ−ザ−光を照射する
ことにより抗体が結合した細胞のみが蛍光を発すること
を利用し、蛍光抗体が結合した細胞を分離する方法であ
る。ＦＡＣＳ法は、実験室的レベルの研究のために少量
の細胞を分離するのには効果的な方法であるが、一千万
個／時間の細胞処理速度が限界であるため、診断や治療
に要する大量の細胞を分離するためには時間的に不適当
である。例えば、ＦＡＣＳ装置を用いて有核細胞を１〜
２千万個含有する１５〜２０ｍｌの血液を処理するため
に数時間が必要であり、一般的に移植に必要とされる１
０〜２０億個の幹細胞を分離するためには数週間が必要
である。又、ＦＡＣＳ装置は非常に高価であり、装置を
使用するのに高度な熟練した技術が必要であると同時
に、メインテナンスに費用がかかる等の欠点を有する。

【０００６】ＰＣＴ 公開Ｎｏ．ＷＯ ８７／０４６２
８に二種類の細胞分離法が記載されている。第一番目の
方法は、目的細胞の膜表面の抗原に対するモノクロ−ナ
ル抗体を直接分離装置表面に固定化して用いる方法であ
る。細胞分離は、担体又は装置に固定化されたモノクロ
−ナル抗体に対して、抗原陽性細胞が直接結合すること
で行なわれる。第二番目の方法は、最初、細胞混合液を
目的細胞の膜抗原に対して結合するモノクロ−ナル抗体
とインキュベ−トし、それから、細胞表面上の抗体に結
合する抗イムノグロブリン抗体のようなリガンドを固定
化した細胞分離装置で処理される。これらの方法の範ち
ゅうに入る、所謂“パニング”法では、抗体を固定化し
たプラスチック皿上で分離される。この方法の手順を記
すと、細胞混合液は最初、抗体を固定化したプラスチッ
ク皿上に注がれ、抗体と目的細胞膜の抗原とを結合させ
るためにインキュベ−トされる。インキュベ−トした
後、プラスチック皿を洗浄して、結合していない細胞を
除去して、分離する。このようにパニング法は非常に簡
単であるが、幾つかの致命的な欠点を持っている。抗体
と抗原の結合が弱いため、効率の良い細胞と抗体の結合
を生じせしめるために細胞をプラスチック皿上で長時間
インキュベ−トする必要があり、このため、目的以外の
細胞の非特異的な接着が生じ、純度が低下する。更に、
抗体と細胞の結合が弱いために、多くの抗体が細胞と結
合せずに残存し、多量の細胞を結合させるために、大量
の抗体をプラスチック皿に固定化する必要が生じ、非常
に高価な装置となる。加うるに、赤血球の非特異的な吸
着を防止するために、この方法では、細胞混合液から赤
血球を除去して用いなければならない等の欠点を有す
る。

【０００７】免疫磁気ビ−ズ法は最初、細胞混合液を抗
体を結合した磁気ビ−ズとインキュベ−トすることによ
り、目的細胞を磁気ビ−ズでラベルする。ラベルした
後、磁気装置を用いてラベルされていない細胞から、ラ
ベルした細胞を分離する。この技術は患者の骨髄液から
癌細胞を除去して臨床に用いるために応用されている。
ビ−ズと目的細胞を効率よく結合させるために長時間の
インキュベ−トが必要であり、そのため、目的以外の細
胞の非特異的な吸着が生じ、目的細胞の純度低下を招く
と同時に、小さな磁気ビ−ズに吸着した目的細胞を回収
することが非常に困難である。これらの欠点のために治
療に用いることができない。

【０００８】免疫吸着カラム法は、目的細胞の膜抗原に
対する抗体等のリガンドをビ−ズ表面に固定化し、これ
をカラムに充填して細胞分離を行なうものである。この
場合もパニング法や磁気ビ−ズ法と同様に細胞膜抗原と
抗体との結合力が弱いため、細胞をビ−ズ表面の抗体に
結合させるにはインキュベ−ションが必要となり、この
ため目的以外の細胞の非特異的な吸着が生じ、得られる
目的細胞の純度が低下する。更に、抗原−抗体の結合力
が弱いため、多量の抗体の固定が必要となり、カラム自
身が非常に高価となるため、大量の細胞分離が必要な治
療分野への適用が困難である。

【０００９】ＰＣＴ 公開Ｎｏ．ＷＯ ９１／１６１１
６には、ビオチン化抗体（目的細胞膜抗原に対する抗
体）を細胞混合液中に加え、インキュベ−トすることに
より、細胞−抗体−ビオチン結合を生じさせた後、ポ−
ラスアクリルアミドゲルにアビジンを固定化したビ−ズ
を充填したカラムを通過させ、ビオチン−アビジンの強
力な結合力を利用して、目的細胞をカラム内に吸着させ
て分離する方法が開示されている。この方法は、ビオチ
ン−アビジンの結合力の強さを利用したものであり、前
記の種々の方法に比較すると処理速度及び純度の点で改
良されていて、臨床応用が可能なレベルである。しかし
この方法においても幾つかの欠点が存在する。そのうち
の一つは、ビオチン−アビジンの結合力が非常に強いた
め、一度細胞分離に用いて、ビ−ズに固定化したアビジ
ンの全てがビオチンと結合するとこの結合を切ってカラ
ムを再生することが困難である。即ち、カラムを並列に
並べて、一方のカラムが飽和すると他方のカラムに切替
え、その間に飽和したカラムの再生を行なうといった切
替え方式を採用することができず、カラムの大容量化、
プライミング容量の増加を招く。更に、ポリアクリルア
ミドビ−ズにアビジンが直結しているため、アビジンが
有効に作用せず細胞−抗体−ビオチンの吸着速度及び吸
着効率が低下する等の欠点を有する。

【００１０】本発明は、上記のような欠点を改良し、目
的細胞を効率よく、高速で分離でき、かつ純度も高く、
分離した細胞の機能低下を招くことのない細胞分離方法
及び装置を提供するものである。更に、本発明の特徴
は、再生可能な分離方法及び装置を提供することにもあ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、目的細胞を認
識する抗体にヌクレオチドを結合させ、細胞混合液と混
合処理し、次いで、前記のヌクレオチドに対し相補的塩
基配列を有するヌクレオチドを固定化した水不溶性担体
を充填したカラムを通して細胞を水不溶性担体に吸着さ
せて、目的細胞を分離することを特徴とする細胞分離方
法及び装置で構成される。

【００１２】上記の目的細胞とは、哺乳動物を形成する
全ての細胞を意味するが、特に、内皮細胞、癌細胞、ラ
ンゲルハンス島細胞、マクロファ−ジ、単球、Ｂリンパ
球、Ｔリンパ球及び造血系の細胞、更には、妊婦の血液
中の胎児細胞等のヒト細胞等があげられる。このうちＢ
及びＴリンパ球は多くの亜集団に更に分類されるが、特
に、Ｔリンパ球において、ＣＤ４⁺ 細胞、ＣＤ８⁺ 細
胞、ＣＤ１９⁺ 細胞、インタ−ロイキンＩＬ２Ｒ⁺ 細
胞、トランスフェリンリセプタ−ＴｒＲ⁺ 細胞等の亜集
団を分離することは自己免疫疾患、ＡＩＤＳ及び移植後
の急性拒絶反応防止等に利用でき意義深い。更に、造血
系の悪性腫瘍、癌治療等の際に有用な自己骨髄移植のた
めに、ＣＤ３４⁺ を発現している造血系の幹細胞の分離
は現在最も注目を集めている分野である。

【００１３】これらの細胞を認識する抗体には、モノク
ロ−ナル抗体、ポリクロ−ナル抗体があり、この何れを
用いてもよいが、モノクロ−ナル抗体を用いることが好
ましい。モノクロ−ナル抗体を作製する方法は、通常マ
ウスリンパ球とマウスのミエロ−マ細胞との融合細胞
（ハイブリド−マ）を用いるが、ラット−ラット、ラッ
ト−マウス、ヒト−ヒト型ハイブリド−マを用いてもよ
く、更に、遺伝子操作を利用したヒト型モノクロ−ナル
産生細胞や大腸菌や酵母等に抗体を産生する遺伝子を組
込んで作製する方法等種々の方法があるが、この何れの
方法を用いてもよい。更に、今後開発されるであろう抗
体作製技術を利用してもよい。

【００１４】ここで用いられるヌクレオチド及び相補的
ヌクレオチドとは、一般に各々のヌクレオチドを構成す
る塩基が、アデニン（以下Ａと略記する）−チミン（以
下Ｔと略記する）、グアニン（以下Ｇと略記する）−シ
トシン（以下Ｃと略記する）の対で特異的相互作用する
ことが知られている。従って、あるヌクレオチドに対す
る相補的ヌクレオチドの組合わせにおいて、Ａ−Ｔ及び
Ｇ−Ｃの組合わせが少なくとも３対以上、好ましくは５
対以上のヌクレオチドの組合わせが好ましい。更に好ま
しくは、次式Ａ及びＢにおいてＴｍで表わされるヌクレ
オチドと相補的ヌクレオチドの５０％解離温度が２０℃
以上、好ましくは２５℃であることが好ましい。

【００１５】 Ａ：塩基数が１８以下のオリゴヌクレオチドの場合 Ｔｍ＝（Ａ＋Ｔ）×２℃＋（Ｇ＋Ｃ）×４℃ Ｂ：塩基数が１８以上のオリゴヌクレオチドの場合 Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ₁₀［Ｎａ⁺ ］）＋
０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ） 上式中 Ａ ： オリゴヌクレオチド内のＡの数 Ｃ ： オリゴヌクレオチド内のＣの数 Ｇ ： オリゴヌクレオチド内のＧの数 Ｔ ： オリゴヌクレオチド内のＴの数 ％Ｇ： オリゴヌクレオチド内のＧの％ Ｎ ： オリゴヌクレオチドの長さ ［Ｎａ⁺ ］：溶液中のＮａ⁺ 濃度

【００１６】用いられるヌクレオチドは、天然に存在す
るものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。
更に核酸中の塩基数は、５以上、好ましくは８以上、更
に好ましくは１０以上である。上記のようなヌクレオチ
ドと相補的ヌクレオチドを用いて抗体−ヌクレオチド及
び水不溶性担体−相補的ヌクレオチドの関係を利用する
ことが本発明の特徴とするところである。

【００１７】ヌクレオチドと抗体との結合は、文献に記
載されているあらゆる方法を用いることができる。その
一例を以下に示す。カルボジイミド化合物を用いてヌク
レオチド中のアミノ基と抗体中のカルボキシル基を縮合
させる方法、抗体の糖鎖中のグルコ−ス環等を解裂し、
アルデヒド基を導入した後、ヌクレオチド中のアミノ基
とシッフ塩基を形成させ、還元して結合させる方法、逆
に、ヌクレオチドのリボ−ス環を酸化解裂し、アルデヒ
ド基を導入し、抗体中のアミノ基とシッフ塩基を形成さ
せた後、還元して結合する方法、ヌクレオチドを直接ブ
ロモ化し、次いでヘキサメチレンジアミン等の脂肪族ジ
アミンを導入し、その末端アミノ基と抗体のカルボキシ
ル基を縮合させる方法、ヌクレオチド中のシトシン部分
を水銀化し、これをハロゲン化した後ジアミンと反応さ
せ、その末端アミノ基と抗体のカルボキシル基とを縮合
させる方法、ヌクレオチド中のグアニン塩基にグリオキ
ザ−ルのようなジカルボニル試薬を作用させ、アルデヒ
ド基を導入し、このアルデヒド基と抗体のアミノ基とで
シッフ塩基を形成させ、次いで還元することにより結合
させる方法、抗体にＮ−ブロモアセチルサクシイミドを
反応させて、ブロモアセチル基を導入し、チオ−ル化し
たヌクレオチドと反応させて結合する方法等の結合方法
がありこれらの何れを用いてもよい。

【００１８】更に、両末端がアミノ基、カルボキシル
基、ジグリシジル基又はアルデヒド基である分子量２０
０〜１００００、好ましくは５００〜５０００のポリエ
チレングリコ−ルを用いて、上記の何れかの反応を応用
し、その各々の両末端に、抗体とヌクレオチドを結合す
る方法もある。この結合方式は、ポリエチレングリコ−
ル鎖が柔軟であることから抗体が目的細胞に、細胞−抗
体−ヌクレオチドが水不溶性担体に固定化された相補的
ヌクレオチドに結合しやすくなるのでより好ましい。

【００１９】水不溶性担体に用いられる素材は、素材自
身又は溶出物に毒性がない限り、合成、天然を問わず水
不溶性又は水不溶化された高分子化合物全てが使用でき
る。又、これらの形状はビ−ズ、繊維、中空糸等、何れ
でもよい。このうちビズ状で使用する素材として好適な
ものとしては、ポリアクリルアミドゲル、ポリアクリル
酸エステル誘導体ゲル、ポリビニルアルコ−ルゲル、ポ
リスチレン及びその誘導体ゲル、セルロ−スゲル、アガ
ロ−スゲル、キトサンゲル、キチンゲル及びその他の市
販ビ−ズ状高分子がある。これらのうち、非特異的な吸
着を防止する意味から、親水性のゲルであるポリアクリ
ルアミドゲル、ポリビニルアルコ−ルゲル及びセルロ−
スゲルが好ましい。ビズ状担体の粒径は、分離しようと
する目的細胞の大きさによって変わるが、５〜４０００
μｍであり、目的細胞の大きさが１〜５μｍの場合の粒
径は５〜５００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍであ
り、目的細胞の大きさが５〜５０μｍの場合は、３０〜
４０００μｍ、好ましくは５０〜２０００μｍである。
又、ビ−ズは多孔性であることが好ましく、その孔径は
分子量５０００ｋＤの分子が侵入可能な孔径である。更
に、ビ−ズ全体に占める細孔容量は、１０〜９０％、好
ましくは２０〜８０％である。

【００２０】繊維状担体の素材としては、ポリエステ
ル、ポリアミド、ポリエチレン、セルロ−ス、ポリプロ
ピレン、レ−ヨン、ポリスチレン、ポリビニルアセタ−
ル等があげられる。このうち、改質の容易さ、強度保持
の点からポリエステル、セルロ−ス、レ−ヨン、ポリエ
チレンが好ましい。繊維形状は織物、綿状、不織布等、
何れでもよいが、取扱いの容易さ、吸着効率の点から不
織布が好ましい。又、維径は、１〜２００μｍ、好まし
くは、２〜１００μｍ、更に好ましくは３〜５０μｍで
ある。これらの繊維は、多孔性であってもよく、孔径は
ビ−ズ状担体の場合と同様の孔径範囲であることが好ま
しい。

【００２１】上記の水不溶性担体への相補的なヌクレオ
チドの固定化は、通常、担体にもとから存在するか、或
は化学的改質や電子線照射等の改質により導入した水酸
基、カルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、アルデ
ヒド基、ハロアセチル基又はチオ−ル基等の官能基を利
用して固定化を行なう。これらの改質方法は、文献に記
載されているあらゆる方法を用いることが可能である
が、化学的改質の例としては、セルロ−スやレ−ヨンを
過沃素酸塩で酸化することによりグルコ−−ス環を開裂
し、アルデヒド基を導入する方法、更にこのアルデヒド
を利用してアミノ基を一分子内に少なくとも２個以上有
する化合物と、或は、アミノ基とカルボキシル基両方を
有する化合物とシッフ塩基を形成させ、次いで還元する
ことによりアミノ基やカルボキシル基を導入する方法、
ポリアクリルアミドゲルを部分加水分解してカルボキシ
ル基を導入する方法、このようにアミノ基又はカルボキ
シル基を導入した後、ジグリシジル化合物を反応してグ
リシジル基を末端に導入する方法、アミノ基にブロモア
セチルブロミドを反応させて、アセチルブロミド基を導
入する方法、セルロ−スの水酸基にシアノブロミドを反
応させて活性基を導入する方法、水酸基にエピクロロヒ
ドリンを反応させてグリシジル基を導入する方法、更
に、グリシジル基に一分子内にアミノ基とチオ−ル基を
有する化合物を反応させて末端にチオ−ル基を導入する
方法等があげられる。

【００２２】上記のような方法で担体に各種の官能基を
導入することが可能であるが、これらの官能基にたいし
て、両末端にアミノ基、カルボキシル基、グリシジル
基、ブロモアセチル基又はアルデヒド基を有するポリエ
チレングリコ−ルを反応させて、柔軟なポリエチレング
リコ−ル鎖を介して片末端の官能基と抗体に結合したヌ
クレオチドに対し相補的な配列を有するヌクレオチドを
結合させること方法もある。この方法は、担体に直接相
補的なヌクレオチドを結合させるより、ポリエチレング
リコ−ル鎖が柔軟であるため、細胞−抗体−ヌクレオチ
ド結合物を捕捉しやすく、又ポリエチレングリコ−ル鎖
が親水性であるため、その排除体積効果により、目的以
外の細胞や蛋白質の非特異的な吸着等を防止する効果が
あり好ましい。この場合のポリエチレングリコ−ルの分
子量は、２００〜１００００であり、好ましくは５００
〜５０００である。

【００２３】又、担体に官能基を導入する方法として、
上記の化学的処理のほかに電子線やガンマ−線を照射し
て導入する方法も可能である。例えば、ポリエステルは
化学改質すると主鎖のエステル結合が加水分解を受けや
すいため、大きな強度低下を起こしやすい。又、ポリエ
チレンやポリプロピレンのようなポリオレフィン系のポ
リマ−は化学改質が困難である。これらの改質に関して
は、勿論、ポリマ−製造工程において、上記のような官
能基を有するビニルモノマ−を共重合させても良いが、
下記に示すような電子線照射による改質が便利である。

【００２４】電子線照射による官能基導入法としては、
アクリル酸又はアクリル酸単位を少なくとも１０モル
％、好ましくは２０モル％以上含有するアクリル酸含有
ポリオレフィン系ポリマ−と一分子中に少なくとも２個
以上のビニル基又はアリル基を有する架橋性モノマ−と
の混合溶液を担体の塗布し、溶剤を蒸発させた後、電子
線を１〜５０Ｍｒａｄ、好ましくは２〜２０Ｍｒａｄ照
射することによりカルボキシル基が導入できる。同様に
して、分子量１００〜１０００００、好ましくは５００
〜１００００のポリエチレンイミンを用いてアミノ基の
導入、グリシジルアクリレ−ト、グリシジルメタクリレ
−ト又はこれらの化合物単位を上記の割合で含有するオ
レフィン系ポリマ−を用いてグリシジル基の導入が可能
である。この場合の架橋性モノマ−としては、メチレン
ビスアクリルアミド、トリメチロ−ルプロパンジアクリ
レ−ト、トリアリルイソシアヌレ−ト、トリメチロ−ル
プロパントリアクリレ−ト、テトラメチロ−ルメタンテ
トラアクリレ−ト等のビニル基又はアリル基を一分子中
に複数個有する化合物のほかに、ポリエチレングリコ−
ルジアクリレ−トがあげられる。このうち、ポリエチレ
ングリコ−ルジアクリレ−トを用いて、種々の官能基を
導入した場合が、官能基を有する化合物の導入率が高
く、更にポリエチレン鎖も導入でき親水性化されること
により上記のように目的以外の細胞や蛋白質等の非特異
的吸着が抑制されるので好ましい。この場合のポリエチ
レングリコ−ル鎖の分子量は１００〜５０００、好まし
くは２００〜２０００である。

【００２５】上記のような方法で、ビ−ズ状担体又は繊
維状担体に固定化された相補的ヌクレオチド量は、担体
１ｍｌ当たり１〜２０００μｇ、好ましくは１５〜１０
００μｇである。通常、ヌクレオチドを固定化した担体
は、ポリカ−ボネ−ト、ポリメチルメタクリレ−ト、ポ
リアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリ塩化
ビニ−ル等のプラスチック製の上端と下端に流入・流出
口を有する筒状、円盤状、円錐状のカラムに充填され
る。但し、カラム形態はこれに限定されるものではな
い。又、繊維状、好ましくは不織布のカラムへの充填密
度は、０．６ｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．４ｇ／ｍｌ
以下である。

【００２６】以下実施例で本発明を具体的に説明する。 〈実施例１〉 ａ．バフィ−コ−ト細胞の分離 骨髄液を２４０ｇで１５分間遠心分離し、血漿を除去し
た後、残存するバフィ−コ−ト細胞を上記の条件で遠心
分離して赤血球を除去する。バフィ−コ−ト細胞を２８
０ｇで１０分間リン酸緩衝液（以後ＰＢＳと略記する）
を用いて遠心分離することにより洗浄する。洗浄後細胞
を牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）を１％含
有するＰＢＳ中に、１×１０⁸ 個になるように再分散さ
せる。

【００２７】ｂ．ヌクレオチド結合抗ＣＤ３４抗体の合
成 ヌクレオチドへのチオ−ル基の導入 ヌクレオチド自動合成機により合成したＡの繰返しが１
０単位から成るヌクレオチド（以下ヌクレオチド１と略
記する）４００μｇ及び過沃素酸ソ−ダ２０μｇを水に
溶解し、０．２Ｍ−酢酸ソ−ダ水溶液でｐＨ４．５に調
整し、全量を４５０μｌに調整した。暗所で、振とうし
ながら２時間反応した。反応後、反応混合液は０．３Ｍ
−ホウ酸カリウムによりｐＨ９．０〜９．３に調整した
Ｇ ５０カラムにより分別し、１，２ｍｌの留分として
集めた。この留分に２−アミノエタンチオ−ル２０μｇ
を加え、シッフ塩基を形成させた後、ＮａＢＨ₄ を添加
し還元した。この混合液は、１ｍＭの１−メルカプトエ
タノ−ルを含む０．４Ｍ酢酸ソ−ダで処理したＧ ５０
カラムを通して、未反応成分を除去した。凍結乾燥し
て、末端にチオ−ル基を有するヌレレオチド１を得た。

【００２８】抗ＣＤ３４抗体（ＩｇＧ３４と略記する）
のブロモアセチル化 ＩｇＧ３４の２０ｍｇを０．３Ｍ−ホウ酸バッファ−
ｐＨ９．９に溶解し、１ｍｌとした。この溶液に、Ｎ−
ヒドロキシルサクシイミドのブロモ酢酸エステル１０ｍ
ｇをジメチルホルムアミド１ｍｌに溶解した溶液を６０
μｌ添加し、室温で２時間反応させた後、リン酸塩バッ
ファ−で透析して精製した。

【００２９】ＩｇＧ３４−ヌクレオチド１結合体の合成 ブロモアセチル化ＩｇＧ３４の１．６ｍｇを０．３Ｍ−
ホウ酸バッファ−に溶解し、１ｍｌとした。これにチオ
−ル基を末端に導入したヌクレオチド１の３ｍｇ／ｍｌ
水溶液１ｍｌを加え、窒素雰囲気下で、室温、２時間反
応を行なった。その後、メルカプトエタノ−ル０．０１
モルを添加し、室温で更に２時間反応させて、残存する
ブロモ基を除去した。その後、該反応液はプロテインＡ
カラムを通して、吸着せしめ、未結合ヌクレオチド１は
１．０Ｎ−ＮａＣｌを通して溶出させ、次いで、結合Ｉ
ｇＧ３４と未結合ＩｇＧは１．０Ｎ−イソチオシアナ−
トを用いて溶出させた。その溶出液はｐＨ７．０の０．
１Ｍ−ＰＢＳバッファ−で透析し、イソチオシアナ−ト
及び未結合のヌクレオチドを除去した。その後、結合Ｉ
ｇＧ３４は５０％硫酸アンモニウムにより析出させ、濾
過して回収した。

【００３０】Ｃ．ＩｇＧ３４結合体とバフィ−コ−ト細
胞とのインキュベ−ション 上記バフィ−コ−ト細胞の懸濁液にヌクレオチド１結合
ＩｇＧ３４が１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加
し、４℃で１０分間インキュベ−トする。その混合液
は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で、２８０ｇ、１０分間遠
心分離を２回行ない洗浄する。その後、細胞は、５％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ中に、１×１０⁸ 白血球／ｍｌになるよう
に再懸濁する。

【００３１】Ｄ．ポリアクリルアミドゲルのカルボキシ
ル化 １７ｇの乾燥バイオゲル（５０〜６０メッシュ（湿潤
時）、粒状）（ＢＩＯＲＡＤ カタログＮｏ．１５０，
１６３０，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｆ）に１．５ｌの
０．５Ｍ ＮａＨＣＯ₃/０．５Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 水溶液
を添加し、ＮａＯＨでｐＨを１０．５に調整し、ビ−ズ
を壊さない速度でゆっくりと撹拌しながら２０〜３０分
間反応する。その後、６０℃で２時間反応を継続する。
反応終了後氷冷して反応液の温度を室温まで下げる。ビ
−ズを荒い目のガラスフィルタ−で濾過し、蒸留水で数
回洗浄し、更にＰＢＳで数回洗浄する。カルボキシル化
ゲルはＰＢＳ中４℃で貯蔵する。

【００３２】Ｅ．ヌクレオチド結合カルボキシル化バイ
オゲル ヌクレオチド自動合成機により合成したＴの繰返しが１
０単位からなるヌクレオチド（以下ヌクレオチド２と略
記する）を２−アミノエタンチオ−ルのかわりに１，６
−ヘキサメチレンジアミンを用いた以外は実施例１−
ｂ．と同様に反応させて、末端にアミノ基を有するヌク
レオチド２を得た。

【００３３】ヌクレオチド結合カルボキシル化バイオゲ
ル ＰＢＳ中に保存したカルボキシル化バイオゲルを目の荒
いガラスフィルタ−で濾別することによりＰＢＳを除去
する。その後、ゲルを蒸留水中に３０分間浸漬する。蒸
留水で置換したゲルをゲル１ｍｌに対し、蒸留水１０ｍ
ｌの割合で、再分散する。１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カ−ボジイミドをゲル１ｍｌに対
して２０ｍｇづつ添加する。塩酸を滴下して素早くｐＨ
を５．５に調整する。その後、撹拌しながら５分間反応
させ、次いで、末端にアミノ基を有するヌクレオチド２
を１０ｍｇ／ｍｌの割合で蒸留水に溶解した溶液を用
い、カルボキシル化バイオゲル１ｍｌに対し、ヌクレオ
チド２を１ｍｇの割合で添加する。更に、撹拌しながら
１．５時間反応させ、次いで、２Ｍ／ｌのグリシン溶液
を溶液中のグリシン濃度が０．２Ｍになるように添加
し、更に撹拌を１時間継続する。反応終了後、ゲルを濾
別し、ＰＢＳでよく洗浄後、０．１％−ナトリウムアジ
ド添加ＰＢＳ中の保存する。 Ｆ．目的細胞の分離 カラムの作製 出口キャップに８０ミクロンのフィルタ−を有する内径
３ｃｍの医療用グレ−ドポリ塩化ビニ−ル製カラムに上
記のヌクレオチド結合バイオゲルをＰＢＳ中で４ｃｍの
高さになるように充填する。気泡を除去した後、ゲルを
５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄し、平衡化する。同様の
カラムを用いて、カルボキシル化バイオゲルを１ｃｍの
高さに同様の方法で充填したプレカラムを作製し、その
出口とヌクレオチド結合バイオゲル充填カラムの入口を
チュ−ブで接続する。

【００３４】目的細胞の分離 上記のように調整した骨髄細胞にヌクレオチド１結合Ｉ
ｇＧ３４を加えてインキュベトした懸濁液を細胞数が５
×１０⁹ になるように、プレカラムに層を形成するよう
に静かに加える。次いでペリスタ−ポンプを用い、３．
５ｍｌ／ｍｉｎ．カラムに懸濁液を流す。プレカラムを
５ｍｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄し、次いでカラ
ムを１５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し結合していない細胞を
留去する。結合している細胞は、ＰＢＳのフロ−を停止
した後、カラム中のゲルが動く程度に手動で軽く振動さ
せてビ−ズより脱離させる。その後、ＰＢＳを再び流し
て、脱離した細胞の回収を行なう。蛍光標識フロ−サイ
トメトリ−（以後ＦＡＣＳと略記する）により測定した
ＣＤ３４陽性細胞の回収率、トリパンブル−の取り込み
によって測定した細胞のバイアビリティ−及びＣＤ３４
陽性細胞の純度を後記の表１に示した。

【００３５】〈実施例２〉ＩｇＧ３４結合ヌクレオチド
にヌクレオチド自動合成機により合成したＧの繰返しが
１０単位からなるヌクレオチド（以下ヌクレオチド３と
略記する）を使用し、ヌクレオチド結合カルボキシル化
バイオゲルとして、Ｔの繰返しが１０単位からなるヌク
レオチド（以下ヌクレオチド４と略記する）を用いた以
外は全て実施例１と同様にして、ＣＤ３４陽性細胞の分
離を実施した。ＦＡＣＳにより測定したＣＤ３４陽性細
胞の回収率、トリパンブル−の取り込みによって測定し
た細胞のバイアビリティ−及びＣＤ３４陽性細胞の純度
を表１に示した。

【００３６】〈実施例３〉繊維径１０μｍのポリエチレ
ンテレフタレ−ト（以後ＰＥＴと略記する）不織布（目
付け５０ｇ／ｍ² ）を１５×１５ｃｍに裁断し、分子量
４５０のポリエチレングリコ−ルジアクリレ−ト１．０
ｇ及び分子量４０００のポリアクリル酸１．０ｇをメタ
ノ−ル２００ｍｌに溶解した溶液に裁断した不織布１２
枚を浸漬し、風乾後、５Ｍｒａｄの電子線を表裏に各一
回照射した。照射後、イオン交換水２００ｍｌで超音波
洗浄１５分間を３回、同様にメタノ−ル洗浄を３回行な
った。電位差滴定により測定した導入されたカルボキシ
ル基濃度は０．２３８ｍｅｑ／ｇであった。このカルボ
キシル基導入ＰＥＴを担体として用いたほかは実施例１
と同様にしてＣＤ３４陽性細胞の分離を行なった。尚、
ヌクレオチド２結合ＰＥＴ不織布のカラムへの充填密度
は０．３５ｇ／ｃｍ³ とした。ＦＡＣＳにより測定した
ＣＤ３４陽性細胞の回収率、トリパンブル−の取り込み
によって測定した細胞のバイアビリティ−及びＣＤ３４
陽性細胞の純度を表１に示した。

【００３７】〈比較例１〉実施例１のＩｇＧ３４−ヌク
レオチド１結合体のかわりに、ビオチン−ＩｇＧ３４結
合体を用いバフィ−コ−ト細胞とインキュベ−トし、ヌ
クレオシド２結合カルボキシル化バイオゲルのかわりに
アビジン結合カルボキシル化バイオゲルを用いたほかは
実施例１と同様にして、ＣＤ３４陽性細胞の分離を実施
した。ビオチン−ＩｇＧ３４結合体は Ｑｕａｎｔｕｍ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（Ｗａｔｅｒｂｅａｃｈ
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）を使用し、アビジン結
合カルボキシル化バイオゲルの作製は、実施例１のＥ．
核酸結合カルボキシル化バイオゲル作製条件のうちヌク
レオチド２のかわりにアビジンを用いた他は同様に実施
した。ＦＡＣＳにより測定したＣＤ３４陽性細胞の回収
率、トリパンブル−の取り込みによって測定した細胞の
バイアビリティ−及びＣＤ３４陽性細胞の純度を表１に
示した。

【表１】

【００３８】

【発明の効果】以上のように、本発明の分離方法は、比
較例１に比較し、ＣＤ３４陽性細胞回収率、バイアビリ
ティ−及び純度とも優れていることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横田 英之 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 目的細胞を認識する抗体にヌクレオチド
   を結合させ、細胞混合液と混合処理し、次いで、前記の
   ヌクレオチドに対し相補的塩基配列を有するヌクレオチ
   ドを固定化した水不溶性担体を充填したカラムを通して
   細胞を水不溶性担体に吸着させて、目的細胞を分離する
   ことを特徴とする細胞分離方法。
2. 【請求項２】 目的細胞を認識する抗体にヌクレオチド
   を結合さす要素、該ヌクレオチド結合抗体と目的細胞を
   含有する液と接触するための要素、および前記のヌクレ
   オチドと相補的な塩基配列を有するヌクレオチドを水不
   溶性担体に固定化したものを充填した要素を少なくとも
   有する細胞分離装置。