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JPH0591887A - ジホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法 - Google Patents

ジホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法

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JPH0591887A
JPH0591887A JP3251964A JP25196491A JPH0591887A JP H0591887 A JPH0591887 A JP H0591887A JP 3251964 A JP3251964 A JP 3251964A JP 25196491 A JP25196491 A JP 25196491A JP H0591887 A JPH0591887 A JP H0591887A
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JP
Japan
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extract
dihomo
linolenic acid
extracts
sesame oil
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JP3251964A
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Hiroshi Kawashima
洋 河島
Kengo Akimoto
健吾 秋元
Hideaki Yamada
秀明 山田
Akira Shimizu
昌 清水
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Suntory Ltd
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Suntory Ltd
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Priority to DE69224124T priority patent/DE69224124T2/de
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
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    • C12P7/6445—Glycerides
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  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ジホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する
脂質の新規な製造方法を提供する。 【構成】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不飽和
化活性が低下又は欠失した微生物を培養して、ジホモ−
γ−リノレン酸またはジホモ−γ−リノレン酸を含有す
る脂質を生成せしめ、そしてジホモ−γ−リノレン酸又
はそれを含有する脂質を採取することを特徴とするジホ
モ−γ−リノレン酸又はそれを含有する脂質の製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアラキドン酸（以下、Ａ
ＲＡと称する）生産能を有し、かつΔ５不飽和化活性が
低下又は欠失した微生物を利用した発酵法によるジホモ
−γ−リノレン酸（以下、ＤＧＬＡと称する）またはこ
れを含有する脂質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＧＬＡ（８，１１，１４−エイコサト
リエン酸）は魚油、海藻等の構成脂肪酸のひとつとして
存在することが知られている。しかしながら、その含量
はわずかであるため単離精製品はたいへん高価なものと
なっている。比較的高い生産効率をもつ生産方法として
は、ＤＧＬＡ生産能を有する微生物を使用した発酵法に
よる製造方法（特開昭６３−１４６９６号公報）や、さ
らにその生産性を向上させるために不飽和脂肪酸を培地
に添加したり（特開昭６４−４７３８４号、特開昭６４
−４７３８５号公報）、またゴマ油やクルクミン、各種
植物の抽出物、セサミン、エピセサミン等を培地に添加
する方法（特開平１−２４３９９２号、特開平２−２６
８６９０号、特開平３−７２８９２号、特開平３−４９
６８８号公報）が知られている。
【０００３】また、必須脂肪酸が生体に与える作用に関
しては様々な研究が行われているが、ＤＧＬＡとＡＲＡ
の両者から生ずるエイコサノイドの作用は互いに拮抗す
ることが多いことが知られている。ＤＧＬＡ由来のプロ
スタグランジン１群は血小板凝集抑制作用、血管拡張作
用、気管支拡張作用、抗炎症作用等を有することが知ら
れているが、ＤＧＬＡを油脂の形で食品等として経口摂
取してこれらの作用を発揮するためには、拮抗作用のあ
るＡＲＡが低含量であるＤＧＬＡ含有油脂が最も好まし
い。さらに、ＤＧＬＡ含有油脂からＤＧＬＡを精製する
際にもＡＲＡの含量の低い油脂を用いた方が操作が容易
で好ましい。このようにＡＲＡが低含量であるＤＧＬＡ
含有油脂の開発が強く望まれているが、その製造方法は
これまで知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、安価
な常用の培地のみを用いて簡便に効率よくＤＧＬＡ及び
ＤＧＬＡ含有油脂を製造する方法及びΔ５不飽和化酵素
阻害剤等の添加を併用して、ＡＲＡ含量の低いＤＧＬＡ
含有油脂を製造する方法を提供しようとするものであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の目的
を達成するため種々研究した結果、ＡＲＡを生産する能
力を有し、かつΔ５不飽和化活性が低下または欠失した
微生物を常用の培地で培養するとＡＲＡの前駆体である
ＤＧＬＡを大量に蓄積すること、並びに、この微生物を
Δ５不飽和化反応阻害剤を添加した培地で培養するとさ
らにＡＲＡの割合が下がり、ＤＧＬＡの割合が上昇する
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】従ってこの発明は、ＡＲＡ生産能を有し、
かつΔ５不飽和化活性が低下又は欠失した微生物を培養
して、ＤＧＬＡまたはＤＧＬＡを含有する脂質を生成せ
しめ、そしてＤＧＬＡを採取することを特徴とするＤＧ
ＬＡの製造方法；及びＡＲＡ生産能を有し、かつΔ５不
飽和化活性が低下又は欠失した微生物を培養し、ＤＧＬ
Ａを含有する脂質を採取することを特徴とするＤＧＬＡ
を含有する脂質の製造方法を提供しようとするものであ
る。
【０００７】この発明はさらに、ＡＲＡ生産能を有し、
かつΔ５不飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、Δ
５不飽和化酵素阻害剤を添加した培地で培養するか、あ
るいは該微生物が培養されている培養液にΔ５不飽和化
酵素阻害剤を添加してさらに培養することにより、ＤＧ
ＬＡまたはＤＧＬＡを含有する脂質を生成せしめ、そし
てＤＧＬＡを採取することを特徴とするＤＧＬＡの製造
方法；及びＡＲＡ生産能を有し、かつΔ５不飽和化活性
が低下又は欠失した微生物を、Δ５不飽和化酵素阻害剤
を添加した培地で培養するか、あるいは該微生物が培養
されている培養液にΔ５不飽和化酵素阻害剤を添加して
さらに培養し、ＤＧＬＡを含有する脂質を採取すること
を特徴とするＤＧＬＡを含有する脂質の製造方法を提供
しようとするものである。
【０００８】この発明はさらに、ＡＲＡ生産能を有し、
かつΔ５不飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、ゴ
マ油、落花生油、ゴマ油に対して実質的に非混和性であ
る有機溶媒によりゴマ油から抽出した抽出物、ゴマ種子
の溶剤抽出物、五加皮の抽出物、桐木の抽出物、白果樹
皮の抽出物、ヒハツの抽出物、細辛の抽出物、タラゴン
（Tarragon）の抽出物、イノンド種子（Dill Seed)の抽
出物、パセリ（Parsley)の抽出物、ウコン（Turmeric）
の抽出物、ナツメッグ（Nutmeg）の抽出物を単独でまた
は組み合せて添加した培地で培養するか、あるいは該微
生物が培養されている培養液にゴマ油、落花生油、ゴマ
油に対して実質的に非混和性である有機溶媒によりゴマ
油から抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出物、五加皮
の抽出物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出物、ヒハツの
抽出物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarragon）の抽出
物、イノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パセリ（Pars
ley)の抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出物、ナツメッ
グ（Nutmeg）の抽出物を添加してさらに培養することに
より、ＤＧＬＡまたはＤＧＬＡを含有する脂質を生成せ
しめ、そしてＤＧＬＡを採取することを特徴とするＤＧ
ＬＡの製造方法；及びＡＲＡ生産能を有し、かつΔ５不
飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、ゴマ油、落花
生油、ゴマ油に対して実質的に非混和性である有機溶媒
によりゴマ油から抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出
物、五加皮の抽出物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出
物、ヒハツの抽出物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarrag
on）の抽出物、イノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パ
セリ（Parsley)の抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出
物、ナツメッグ（Nutmeg）の抽出物を単独でまたは組み
合せて添加した培地で培養するか、あるいは該微生物が
培養されている培養液にゴマ油、落花生油、ゴマ油に対
して実質的に非混和性である有機溶媒によりゴマ油から
抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出物、五加皮の抽出
物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出物、ヒハツの抽出
物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarragon）の抽出物、イ
ノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パセリ（Parsley)の
抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出物、ナツメッグ（Nu
tmeg）の抽出物を添加してさらに培養し、、ＤＧＬＡを
含有する脂質を採取することを特徴とするＤＧＬＡを含
有する脂質の製造方法を提供しようとするものである。
【０００９】
【具体的な説明】本発明においては、ＡＲＡ生産能を有
し、かつΔ５不飽和化活性が低下又は欠失した微生物で
あれば、すべて使用できる。ＡＲＡ生産能を有する微生
物としては、例えばモルティエレラ（Mortierella)属、
コニディオボラス（Conidiobolus) 属、フィチウム（Py
thium)属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリ
ューム（Penicillium)属、クラドスポリューム（Clados
porium) 属、ムコール（Mucor)属、フザリューム（Fusa
rium) 属、アスペルギルス（Aspergillus)属、ロードト
ルラ（Rhodotorula)属またはエントモフトフ（Entomoph
thora)属に属する微生物を挙げることができる。モルテ
ィエレラ属では例えば、モルティエレラ・エロンダカ
（Mortierella elongata) 、モルティエレラ・エキシグ
ア（Mortierella exigua) 、モルティエレラ・ヒグロフ
ィラ（Mortierella hygrophila) 、モルティエレラ・ア
ルピナ（Mortierella alpina) 等のモルティエレラ亜属
に属する菌株を挙げることができる。このような微生物
は、ＡＲＡ生産能を有する微生物に突然変異操作を行
い、Δ５不飽和化酵素活性が低下又は欠失した変異株を
誘発させることによって得られる。
【００１０】突然変異操作としては、放射線（Ｘ線、γ
線、中性子線）や紫外線を照射したり、高熱処理を行っ
たり、また微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、
変異源を加えて一定時間インキュベート後、適当に希釈
して寒天培地に植菌し、変異株のコロニーを得るといっ
た操作を行うこともできる。変異源としては、ナイトロ
ジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭ
Ｓ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤や、５−ブロモウラ
シル等の塩基類似体や、マイトマイシンＣ等の抗生物質
や、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤や、プロ
フラビン等の色素類や、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキ
シド等のある種の発癌剤や塩化マンガン、重クロム酸カ
リウム、亜硝酸、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ホ
ルムアルデヒド、ニトロフラン化合物類などを挙げるこ
とができる。また使用する微生物は、生育菌体（菌糸な
ど）でも良いし、胞子でも良い。
【００１１】モルティエレラ属の変異株としては例え
ば、本発明者らが誘導した突然変異株モルティエレラ・
エロンガタＳＡＭ１８６０（微工研菌条第３５８９号）
を使用することができる。本発明に使用される変異株を
培養するためには、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培
養して得られた前培養液を、液体培地又は固形培地に接
種し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグル
コース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マ
ルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マン
ニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも
使用できるが、これらに限られるものではない。
【００１２】窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦
芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティプリカ
ー等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならび
に硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム等の無機窒素源を用いることができる。この他必要に
応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の
無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。
【００１３】これらの培地成分は微生物の成育を害しな
い濃度であれば特に制限しない。実用上一般に、炭素源
は０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％、窒
素源は０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量
％の濃度とするのが良い。又、培養温度は５〜４０℃、
好ましくは２０〜３０℃とし、培地のpHは４〜１０、好
ましくは６〜９として通気攪拌培養、振とう培養、又は
静置培養を行う。培養は通常２〜１０日間行う。
【００１４】固体培地で培養する場合は、固形物重量に
対して５０〜１００重量％の水を加えたふすま、もみが
ら、米ぬか等を用い、５〜４０℃、好ましくは２０〜３
０℃の温度において、３〜１４日間培養を行う。この場
合に必要に応じて培地中に窒素源、無機塩類、微量栄養
源を加えることができる。
【００１５】また、本発明におけるＤＧＬＡの蓄積を促
進するため、ＡＲＡの基質を培地に添加することができ
る。基質としては、テトラデカン、ヘキサデカン、オク
タデカン等の炭化水素、テトラデカン酸、ヘキサデカン
酸、オクタデカン酸等の脂肪酸、又はその塩（例えばナ
トリウム塩またはカリウム塩）、脂肪酸エステル、又は
脂肪酸を構成成分として含む油脂（例えばオリーブ油、
大豆油、綿実油、ヤシ油）等を挙げることができるが、
これらに限られるものではない。
【００１６】さらに本発明は、よりＡＲＡの含量が低い
ＤＧＬＡ含有油脂を生成せしめるため、種々のΔ５不飽
和化酵素阻害剤の存在下で培養することによりＤＧＬＡ
を蓄積せしめることを特徴としている。この場合、Δ５
不飽和化酵素阻害剤として、次の一般式（Ｉ）：
【化３】
【００１７】（式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 、
及びＲ6 はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜３のア
ルキル基、あるいはＲ1 とＲ2 、及び／又はＲ4 とＲ5
は一緒になってメチレン基もしくはエチレン基を表し、
そしてｎ，ｍ，Ｌは０又は１を表す）で表わされるジオ
キサビシクロ〔３．３．０〕オクタン誘導体、ピペロニ
ルブトキサイド、クルクミン、又は次の一般式（II）：
【化４】
【００１８】（式中、Ｒ1 は低級アルキル基を示し、Ｒ
2 は水酸基、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル
基、オキシアルキル基を示す。Ｒ2 が複数ある場合に
は、複数のＲ2 は同一であっても異なっていてもよい。
ｎ０〜５の整数を示す。）で表される化合物等が挙げら
れ、これらは単独で又は適宜組合わせて用いることがで
きる。
【００１９】前記ジオキサビシクロ〔３．３．０〕オク
タン誘導体としては、セサミン、セサミノール、エピセ
サミン、エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４
−メチレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−
４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３メトキシ
−４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシク
ロ〔３．３．０〕オクタン、又は２−（３，４−メチレ
ンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒド
ロキシフェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．
３．０〕オクタン等を挙げることができ、これらを単独
で、又はいずれか２種類以上を組み合せて使用すること
ができる。またこれらの立体異性体あるいはラセミ体も
合わせて使用することができる。
【００２０】Δ５不飽和化酵素阻害剤の一つである前記
ジオキサビシクロ〔３．３．０〕オクタン誘導体を得る
方法として次の手順で行うことができる。まず、前記ジ
オキサビシクロ〔３．３．０〕オクタン誘導体を主成分
とする抽出物を胡麻油から得るには、胡麻油とは実質的
に非混和性であり且つ該誘導体を抽出・溶解することが
できる種々の有機溶剤を用いて抽出・濃縮することで得
られる。
【００２１】このような有機溶剤として、例えばアセト
ン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メタノー
ル、エタノール等を挙げることができる。前記ジオキサ
ビシクロ〔３．３．０〕オクタン誘導体を主成分とする
抽出物を得るには、胡麻油と上記の溶剤のいずれかとを
均一に混合した後、低温において静置し、遠心分離等の
常法に従って相分離を行い、溶剤画分から溶剤を蒸発除
去することにより得られる。
【００２２】さらに具体的には、胡麻油を２〜１０倍、
好ましくは６〜８倍容量のアセトンに溶かし、−８０℃
で一晩放置する。その結果油成分が沈澱となり、濾過に
より得た濾液から有機溶剤を留去して、該誘導体を主成
分とする抽出物が得られる。あるいは、胡麻油を熱メタ
ノール又は熱エタノールで混合した後、室温において静
置し、溶剤画分から溶剤を蒸発除去することにより得ら
れる。
【００２３】さらに具体的には、胡麻油を２〜１０倍、
好ましくは５〜７倍容量の熱メタノール（５０℃以上）
又は熱エタノール（５０℃以上）で激しく混合し抽出す
る。室温に静置あるいは遠心分離等の常法に従って相分
離を行い、溶剤画分から溶剤を留去して、該誘導体を主
成分とする抽出物が得られる。また超臨界ガス抽出も利
用できる。
【００２４】この抽出物より、各々の前記ジオキサビシ
クロ〔３．３．０〕オクタン誘導体を得るためには、抽
出物をカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー、再結晶、蒸留、液々向流分配クロマトグラフ
ィー等の常法に従って処理することにより目的とする化
合物を単離すればよい。さらに具体的には、逆相カラム
（５Ｃ18）、溶離液にメタノール／水（６０：４０）を
使って、上記抽出物を高速液体クロマトグラフィーで分
取し、溶媒を留去した後、得られた結晶をエタノールで
再結晶化することでセサミン、エピセサミン、セサミノ
ール、エピセサミノール等の各前記ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン誘導体が得られる。
【００２５】用いる胡麻油は精製品でもよく、また胡麻
油の製造過程で脱色工程前のいずれの粗製品でもよく更
に、胡麻種子あるいは胡麻粕（脱脂胡麻種子、残油分８
〜１０％）であってもよい。この場合、胡麻種子あるい
は胡麻粕を必要により破砕した後、任意の溶剤、例えば
胡麻油からの抽出について前記した溶剤を用いて常法に
より抽出することができる。抽出残渣を分離した後、抽
出液から蒸発等により溶剤を除去することにより抽出物
が得られる。
【００２６】このように調製された胡麻種子抽出物、胡
麻粕抽出物からはセサミン、セサミノール、エピセサミ
ン、エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４−メ
チレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−
ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３メトキシ
−４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシク
ロ〔３．３．０〕オクタン、又は２−（３，４−メチレ
ンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒド
ロキシフェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．
３．０〕オクタンの前記ジオキサビシクロ〔３．３．
０〕オクタン誘導体が同様の手法で得られる。
【００２７】なお細辛から得られるセサミンも胡麻種
子、胡麻粕及び胡麻油より得られるセサミンと同等の効
果を有する。さらに、胡麻油製造過程の副産物からも前
記ジオキサビシクロ〔３．３．０〕オクタン誘導体を得
ることができる。なお、前記ジオキサビシクロ〔３．
３．０〕オクタン誘導体の精製法及び抽出物を得る方法
は、これに限られるものではない。さらに前記ジオキサ
ビシクロ〔３．３．０〕オクタン誘導体及び該誘導体を
主成分とする抽出物は、胡麻油、胡麻粕、及び胡麻種子
から得たものに限定したわけではなく、該誘導体を含む
天然物をすべて使用できるのは明かであり、例えば五加
皮、桐木、白果樹皮、ヒハツ、細辛等を挙げることがで
きる。
【００２８】また、合成により前記ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン誘導体を得る方法としては、以
下のものが挙げられる。例えば、セサミン、エピセサミ
ンについては、Berozaらの方法〔J.Am.Chem.Soc.78,124
2 (1956)〕で合成することができる他、ピノレシノール
（一般式ＩにおいてＲ1 ＝Ｒ4 ＝Ｈ，Ｒ2 ＝Ｒ5 ＝ＣＨ
3 ，ｎ＝ｍ＝Ｌ＝０）はFreundenbergらの方法〔Chem.B
er.,86,1157 (1953)によって、シリンガレシノール（一
般式ＩにおいてＲ1 ＝Ｒ4 ＝Ｈ，Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ 5 ＝Ｒ
6 ＝ＣＨ3 ，ｎ＝０，ｍ＝Ｌ＝１）はFreundenbergらの
方法〔Chem.Ber.,88，16(1955)によって合成することが
できる。又、前記ジオキサビシクロ〔３．３．０〕オク
タン誘導体は、Δ５不飽和化酵素の特異的な阻害活性を
有している限りその吸収を高めるために例えば、配糖体
等の形で使用することができる。
【００２９】また前記一般式（II）で表される化合物の
具体例としては、アニソール、メトキシフェノール、ジ
メトキシベンゼン、ジエトキシベンゼン、トリメトキシ
ベンゼン、メトキシトルエン、トリ−ブチルヒドロキシ
アニソール（ＢＨＡ）、オイゲノール等が挙げられる。
【００３０】さらにＤＧＬＡの蓄積を高めるために培地
に添加可能なものとして、ゴマ油、落花生油、ゴマ油に
対して実質的に非混和性である有機溶媒によりゴマ油か
ら抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出物、五加皮の抽
出物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出物、ヒハツの抽出
物、細辛の抽出物や香辛性植物、例えばタラゴン（Tarr
agon）、イノンド種子（Dill Seed)、パセリ（Parsle
y)、ウコン（Turmeric）、ナツメッグ（Nutmeg）等から
の抽出物を使用することができる。例えばジクロロメタ
ン、エタノール、メタノール、エチルエーテル等を用い
て調製することができる。
【００３１】添加物の量はおよそ次の通りである。胡麻
油又は落花生油、あるいはこの両者の総添加量は培地に
対して０．００１〜１０重量％、好ましくは０．５〜１
０重量％である。胡麻油の抽出物を添加する場合、その
添加量は培地に対して３×１０-3〜３×１０-1重量％で
ある。また、セサミン、セサミノール、エピセサミン、
エピセサミノール等の前記ジオキサビシクロ〔３．３．
０〕オクタン誘導体を添加する場合その量（これらの２
種類以上を組み合せて使用する場合はその合計量）は、
培地に対して１×１０-3〜１×１０-1重量％である。
【００３２】これらの添加物類は、生産微生物を接種す
る前又はその直後の培地に加えてもよく、あるいは両時
点で加えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、
又は複数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるい
は、連続的に添加することもできる。
【００３３】このようにして培養して、菌体内にＤＧＬ
Ａを大量に含有する脂質が生成蓄積される。液体培地を
使用した場合には、培養菌体から、例えば、次のように
してＤＧＬＡの採取を行う。
【００３４】培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過
等の常用の固液分離手段により培養菌体を得る。菌体は
十分水洗いし、好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、
風乾等によって行うことができる。乾燥菌体は、好まし
くは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機
溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノ
ール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等
を用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交
互抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒
を用いた抽出によって良好な結果を得ることができる。
抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、高
濃度のＤＧＬＡを含有した脂質が得られる。
【００３５】また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて
抽出を行うことができる。メタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。
【００３６】上記のようにして得られた脂質中には、Ｄ
ＧＬＡが脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として含ま
れている。これらの直接分離することもできるが、低級
アルコールとのエステル、例えばジホモ−γ−リノレン
酸メチルとして分離するのが好ましい。このようなエス
テルにすることにより、他の脂質成分から容易に分離す
ることができ、また、培養中に生成する他の脂肪酸、例
えばパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸（これら
も、ＤＧＬＡのエステル化に際してエステル化される）
から容易に分離することができる。例えば、ＤＧＬＡの
メチルエステルを得るには、前記の抽出脂質を無水メタ
ノール−塩酸５〜１０％、ＢＦ3 −メタノール１０〜５
０％等により、室温にて１〜２４時間処理するのが好ま
しい。
【００３７】前記の処理液からジホモ−γ−リノレン酸
メチルエステルを回収するにはヘキサン、エーテル、酢
酸エチル等の有機溶媒で抽出するのが好ましい。次に、
この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し、有機
溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより主として
脂肪酸エステルからなる混合物が得られる。この混合物
中には、目的とするジホモ−γ−リノレン酸メチルエス
テルの他に、パルミチン酸メチルエステル、ステアリン
酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステル等が含ま
れている。これらの脂肪酸メチルエステル混合物からジ
ホモ−γ−リノレン酸メチルエステルを単離するには、
カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接
法、液々向流分配クロマトグラフィー等を単独で、又は
組み合わせて使用することができる。
【００３８】こうして単離されたジホモ−γ−リノレン
酸メチルからＤＧＬＡを得るには、アルカリで加水分解
した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すれ
ばよい。
【００３９】また、ＤＧＬＡをそのメチルエステルを経
ないで採取するには、前記の抽出脂質をアルカリ分解
（例えば５％水酸化ナトリウムにより室温にて２〜３時
間）した後、この分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常
用されている方法により抽出・精製することができる。
【００４０】次に、実施例により、この発明をさらに具
体的に説明する。実施例１． グルコース２％及び酵母エキス１％を含む培
地（pH６．０）１００mlを５００mlエルレンマイヤーフ
ラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina) ＩＦＯ８５６
８（比較例）及び変異株ＳＡＭ１８６０（実施例）を別
々に培地に１白金耳接種し、レシプロシェーカー（１１
０rpm)により２８℃で６日間振盪培養した。培養後、濾
過により菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥し
た。これにより、ＩＦＯ８５６８から１．２８ｇ、ＳＡ
Ｍ１８６０から１．３７ｇの乾燥菌体を得た。
【００４１】これらの菌体より、クロロホルム−メタノ
ール−水の一層系の溶媒を用いるBligh & Dyerの抽出法
によって総脂質を抽出したところ、ＩＦＯ８５６８から
５０５mg、ＳＡＭ１８６０から５３０mgの脂質が得られ
た。これらの脂質を無水メタノール−塩酸（９５：５）
を用いて２０℃にて３時間処理することによってメチル
エステル化し、エーテルで抽出してＩＦＯ８５６８から
４１７mg、ＳＡＭ１８６０から４５４mgの脂肪酸メチル
を得た。得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマト
グラフィーで分析した。表１にその結果を示す。
【００４２】 表 １ ───────────────────────────── 脂肪酸 菌 株 モルティエレラ・ 変異株 アルピナＩＦＯ８５６８ ＳＡＭ１８６０ パルミチン酸 ０．７９ ０．７７ オレイン酸 ０．７６ ０．７４ ＤＧＬＡ ０．２０ １．２７ ＡＲＡ １．４２ ０．４６ 総脂肪酸 ３．９５ ４．３０ 乾燥菌体(g／L) １２．８ １３．７ 数値は培地（Ｌ）当りの生成量（ｇ）
【００４３】表１から明らかなように、変異株ＳＡＭ１
８６０は、ＤＧＬＡをＡＲＡに変換するΔ５不飽和化活
性が親株と比べて著しく低下しており、ＡＲＡの前駆体
であるＤＧＬＡを大量に蓄積することが認められた。な
お、得られた脂肪酸メチルをカラムクロマトグラフィー
によって分離し、ビスホモ−γ−リノレン酸メチル画分
を分取したものについて、ガスクロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー、質量分析、ＮＭＲ分析を行
ったところ、いずれも市販の標準サンプルと一致した。
【００４４】実施例２．グルコース２％及び酵母エキス
１％を含む培地（pH６．０）、グルコース４％及び酵母
エキス１％を含む培地（pH６．０）並びにグルコース８
％及び酵母エキス１％を含む培地（pH６．０）１００ml
を５００mlエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃
で２０分間殺菌した。
【００４５】変異株モルティエレラ・アルピナ(Mortier
ella alpina) ＳＡＭ１８６０を別々に培地に１白金耳接
種し、レシプロシェーカ（１１０rpm)により２８℃また
は２０℃で１０日間振盪培養した。培養後、実施例１と
同様にして得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマ
トグラフィーで分析した。表２にその結果を示す。
【００４６】 表 ２ ──────────────────────────── 培 養 グルコース 乾燥菌体 培地当りの生成量(g／L) 温 度 濃 度 （ｇ／Ｌ） ＤＧＬＡ ＡＲＡ ２ ％ １１．０ １．３３ ０．４９ ２８℃ ４ ％ １５．５ ２．４９ ０．９９ ８ ％ ２０．５ ３．７２ １．２７ ２ ％ １１．８ １．５１ ０．５０ ２０℃ ４ ％ １６．４ ３．２２ １．０２ ８ ％ ２０．０ ４．１０ １．２０ ────────────────────────────
【００４７】表２から明らかなように、グルコースが増
すとＡＲＡの前駆体であるＤＧＬＡが大量に蓄積した。
一方、ＡＲＡの生産はいずれも、ＤＧＬＡの約３０〜４
０％に抑えられていた。また、２８℃及び２０℃いずれ
も良好なＤＧＬＡ生産が認められた。
【００４８】実施例３．グルコース２％、酵母エキス１
％、Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．２％及び種々の炭化水素、
脂肪酸ナトリウム、脂肪酸エステル又は油脂０．５％を
含む培地（pH６．０）２０mlを１００ml容マイヤーに入
れ、１２０℃で２０分間殺菌した。変異株モルティエレ
ラ・アルピナ(Mortierella alpina) ＳＡＭ１８６０１
白金耳を接種し、ロータリーシェーカー（１１０rpm)に
より２８℃で７日間培養した。得られた菌体について、
実施例１と同様にして得られた脂肪酸メチルをガスクロ
マトグラフィーで分析した。表３にその結果を示す。
【００４９】 表 ３ ─────────────────────────────── 添 加 物 乾燥菌体 ＤＧＬＡ ＡＲＡ （ｇ／Ｌ） （ｇ／Ｌ） （ｇ／Ｌ） ヘキサデカン １８．１ １．８９ ０．５５ オクタデカン １８．３ １．８０ ０．５０ オレイン酸ナトリウム １５．５ １．４０ ０．４８ リノール酸ナトリウム １４．８ １．４０ ０．４９ オレイン酸メチル １８．１ １．９９ ０．５６ リノール酸メチル １８．７ ２．１５ ０．６０ オリーブ油 １７．９ １．９２ ０．５９ 綿実油 １８．５ １．９８ ０．５９ ヤシ油 １８．４ １．８８ ０．５８ 無添加 １３．０ １．２５ ０．４０ ───────────────────────────────
【００５０】標準培地に炭化水素、脂肪酸ナトリウム、
脂肪酸エステル又は油脂を添加した場合、ＤＧＬＡの生
成量は無添加区に較べ、１２〜７２％向上した。
【００５１】実施例４．グルコース２％、酵母エキス１
％、大豆油０．１％を含む培地（pH６．０）５ｌを１０
ｌジャーファーメンダに入れ、１２０℃で４０分間殺菌
後、変異株モルティエレラ・アルピナ(Mortierella al
pina) ＳＡＭ１８６０の前培養液２００mlを接種した。
２８℃、通気量０．５v.v.m で７日間通気攪拌培養し、
殺菌した３３％グルコース溶液１５０mlを２, ３, ４お
よび５日目に添加した。
【００５２】得られた湿菌体９６０ｇ（乾燥重量１２６
ｇ）について、実施例１と同様の操作により、総脂質７
４．８ｇ混合脂肪酸メチル７０．２ｇを得た。これをガ
スクロマトグラフィーで分析したところ、ＤＧＬＡ含量
は総脂肪酸の３０％、ＤＧＬＡ生成量は培地１リットル
当たり４．０ｇ、乾燥菌体１ｇ当たり１６５mgであっ
た。
【００５３】実施例５．グルコース４％、酵母エキス１
％を含む培地（pH６．０）１００mlを５００mlエルレン
マイヤーフラスコに入れたもの４本のうち、２本には、
セサミン（２，６−ビス−（３，４−メチレンジオキシ
フェニル）−シス−３，７−ジオキサビジクロ〔３．
３．０〕オクタン）を１５重量％溶解させた大豆油０．
５mlずつをそれぞれ加え、残り２本には大豆油０．５ml
ずつをそれぞれ加え、１２０℃で２０分間殺菌した。
【００５４】モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina) ＩＳ−４（比較例）及び変異株ＳＡＭ１８６０
（実施例）をそれぞれの培地に別々に１白金耳接種し、
レシプロシェーカー（１１０rpm)により２８℃で７日間
振盪培養した。培養２４時間目に、セサミン含有大豆油
を添加した培養には、滅菌した上記セサミン含有大豆油
０．５mlをそれぞれ添加し、大豆油を添加した培地には
滅菌した大豆油０．５mlをそれぞれ添加した。培養後、
実施例１と同様にして得られた脂肪酸メチルエステルを
ガスクロマトグラフィーで分析した。表４にその結果を
示す。
【００５５】 表 ４ ────────────────────────────────── 菌 株 Ｍ．アルピナ 変異株 ＩＦＯ８５６８ ＳＡＭ１８６０ ＩＳ−４ セサミン含有大豆油の添加 無 有 無 有 ＤＧＬＡ対ＡＲＡの比 ０．１５ １．１７ ５．０４ １２．３ 総脂肪酸（ｇ／Ｌ） １１．１ １１．８ １２．０ １１．９ 乾燥菌体（ｇ／Ｌ） ２３．８ ２４．２ ２４．６ ２４．１ ＤＧＬＡ生産量（ｇ／Ｌ） ０．３９ １．８７ ２．４５ ２．９３ ──────────────────────────────────
【００５６】表４から明らかなように、ＩＦＯ８５６８
ではΔ５不飽和化酵素阻害剤であるセサミンを添加して
培養してもＤＧＬＡ対ＡＲＡの比は１．１７までしか上
昇しないが、Δ５不飽和化活性の低下した変異株ＳＡＭ
１８６０をさらにΔ５不飽和化酵素阻害剤セサミン存在
下で培養することによって同比は１２．３にまで上昇す
ることがわかった。また、セサミンの添加は総脂肪酸量
及び乾燥菌体重量には影響を与えないことも確かめられ
た。
【００５７】この結果から、「ビスホモ−γ−リノレン
酸及びこれを含有する脂質の製造方法」と題する特許出
願（特開平１−２４３９９２号）の明細書に記載されて
いるのと同様の効果によって、ＡＲＡの生産が抑制され
てＤＧＬＡの大量生産が起こり、ＤＧＬＡ対ＡＲＡの比
が上昇することは明らかであり、セサミン以外に、ゴマ
油、落花生油、ゴマ油に対して実質的に非混和性である
有機溶剤によりゴマ油から抽出した抽出物、ゴマ種子の
溶剤抽出物、セサミン、セサミノール、エピセサミン、
エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４−メチレ
ンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒド
ロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．
３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３−メトキシ−４
−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン、２−（３，４−メチレンジオ
キシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒドロキシ
フェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．３．
０〕オクタン、タラゴン（Tarragon) の抽出物、イノン
ド種子(Dill Seed) の抽出物、パセリ(Parsley) の抽出
物、ウコン（Turmeric) の抽出物、ナツメグ（Nutmeg)
の抽出物も、ＡＲＡの生産を抑制しＤＧＬＡの大量生産
を起こして、ＤＧＬＡ対ＡＲＡの比が上昇することは明
らかである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年８月５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【化１】 （式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 、及びＲ6 はそ
れぞれ独立に水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、あ
るいはＲ1 とＲ2 、及び／又はＲ4 とＲ5 は一緒になっ
てメチレン基もしくはエチレン基を表し、そしてｎ，
ｍ，Ｌは０又は１を表す）で表わされるジオキサビシク
ロ〔３．３．０〕オクタン誘導体、ピペロニルブトキサ
イド、クルクミン、又は次の一般式（II）：
【化２】 （式中、Ｒ1 は低級アルキル基を示し、Ｒ2 は水酸基、
アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、オキシアル
キル基を示す。Ｒ2 が複数ある場合には、複数のＲ2 は
同一であっても異なっていてもよい。ｎは０〜５の整数
を示す。）で表わされる化合物であることを特徴とする
請求項３又は４記載のジホモ−γ−リノレン酸またはジ
ホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】
【具体的な説明】本発明においては、ＡＲＡ生産能を有
し、かつΔ５不飽和化活性が低下又は欠失した微生物で
あれば、すべて使用できる。ＡＲＡ生産能を有する微生
物としては、例えばモルティエレラ（Mortierella)属、
コニディオボラス（Conidiobolus) 属、フィチウム（Py
thium)属、フィトフトラ（Phytophthora）属、ペニシリ
ューム（Penicillium)属、クラドスポリューム（Clados
porium) 属、ムコール（Mucor)属、フザリューム（Fusa
rium) 属、アスペルギルス（Aspergillus)属、ロードト
ルラ（Rhodotorula)属またはエントモフトラ（Entomoph
thora)属に属する微生物を挙げることができる。モルテ
ィエレラ属では例えば、モルティエレラ・エロンガカ
（Mortierella elongata) 、モルティエレラ・エキシ
グア（Mortierella exigua) 、モルティエレラ・ヒグ
ロフィラ（Mortierella hygrophila)、モルティエレ
ラ・アルピナ（Mortierella alpina) 等のモルティエ
レラ金属る属する菌株を挙げることができる。このよう
な微生物は、ＡＲＡ生産能を有する微生物に突然変異操
作を行い、Δ５不飽和化酵素活性が低下又は欠失した変
異株を誘発させることによって得られる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】モルティエレラ属の変異株としては例え
ば、本発明者らが誘導した突然変異株モルティエレラ・
アルピナＳＡＭ１８６０（微工研菌条第３５８９号）を
使用することができる。本発明に使用される変異株を培
養するためには、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養
して得られた前培養液を、液体培地又は固形培地に接種
し培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコ
ース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マル
トース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニ
トール等の一般的に使用されているものが、いずれも使
用できるが、これらに限られるものではない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】（式中、Ｒ1 は低級アルキル基を示し、Ｒ
2 は水酸基、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル
基、オキシアルキル基を示す。Ｒ2 が複数ある場合に
は、複数のＲ2 は同一であっても異なっていてもよい。
ｎは０〜５の整数を示す。）で表される化合物等が挙げ
られ、これらは単独で又は適宜組合わせて用いることが
できる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】前記ジオキサビシクロ〔３．３．０〕オク
タン誘導体としては、セサミン、セサミノール、エピセ
サミン、エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４
−メチレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−
４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３−メトキ
シ−４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシ
クロ〔３．３．０〕オクタン、又は２−（３，４−メチ
レンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒ
ドロキシフェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン等を挙げることができ、これら
を単独で、又はいずれか２種類以上を組み合せて使用す
ることができる。またこれらの立体異性体あるいはラセ
ミ体も合わせて使用することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】このように調製された胡麻種子抽出物、胡
麻粕抽出物からはセサミン、セサミノール、エピセサミ
ン、エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４−メ
チレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−
ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３−メトキ
シ−４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシ
クロ〔３．３．０〕オクタン、又は２−（３，４−メチ
レンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒ
ドロキシフェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタンの前記ジオキサビシクロ〔３．
３．０〕オクタン誘導体が同様の手法で得られる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】また、合成により前記ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン誘導体を得る方法としては、以
下のものが挙げられる。例えば、セサミン、エピセサミ
ンについては、Berozaらの方法〔J.Am.Chem.Soc.78,124
2 (1956)〕で合成することができる他、ピノレシノール
（一般式ＩにおいてＲ1 ＝Ｒ4 ＝Ｈ，Ｒ2 ＝Ｒ5 ＝ＣＨ
3 ，ｎ＝ｍ＝Ｌ＝０）はFreundenbergらの方法〔Chem.B
er.,86,1157 (1953)〕によって、シリンガレシノール
（一般式ＩにおいてＲ1 ＝Ｒ4 ＝Ｈ，Ｒ2 ＝Ｒ3 ＝Ｒ5
＝Ｒ6 ＝ＣＨ3 ，ｎ＝０，ｍ＝Ｌ＝１）はFreundenberg
らの方法〔Chem.Ber.,88，16(1955)〕によって合成する
ことができる。又、前記ジオキサビシクロ〔３．３．
０〕オクタン誘導体は、Δ５不飽和化酵素の特異的な阻
害活性を有している限りその吸収を高めるために例え
ば、配糖体等の形で使用することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】また前記一般式（II）で表される化合物の
具体例としては、アニソール、メトキシフェノール、ジ
メトキシベンゼン、ジエトキシベンゼン、トリメトキシ
ベンゼン、メトキシトルエン、ｔ−ブチルヒドロキシア
ニソール（ＢＨＡ）、オイゲノール等が挙げられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】次に、実施例により、この発明をさらに具
体的に説明する。実施例１． グルコース２％及び酵母エキス１％を含む培
地（pH６．０）１００mlを５００mlエルレンマイヤーフ
ラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。モルティ
エレラ・アルピナ（Mortierella alpina) ＩＦＯ８５
６８（比較例）及び変異株ＳＡＭ１８６０（実施例）を
別々に培地に１白金耳接種し、レシプロシェーカー（１
１０rpm)により２８℃で６日間振盪培養した。培養後、
濾過により菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥し
た。これにより、ＩＦＯ８５６８から１．２８ｇ、ＳＡ
Ｍ１８６０から１．３７ｇの乾燥菌体を得た。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】表１から明らかなように、変異株ＳＡＭ１
８６０は、ＤＧＬＡをＡＲＡに変換するΔ５不飽和化活
性が親株と比べて著しく低下しており、ＡＲＡの前駆体
であるＤＧＬＡを大量に蓄積することが認められた。な
お、得られた脂肪酸メチルをカラムクロマトグラフィー
によって分離し、ジホモ−γ−リノレン酸メチル画分を
分取したものについて、ガスクロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー、質量分析、ＮＭＲ分析を行っ
たところ、いずれも市販の標準サンプルと一致した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５１】実施例４．グルコース２％、酵母エキス１
％、大豆油０．１％を含む培地（pH６．０）５ｌを１０
ｌジャーファーメンターに入れ、１２０℃で４０分間殺
菌後、変異株モルティエレラ・アルピナ(Mortierella
alpina) ＳＡＭ１８６０の前培養液２００mlを接種し
た。２８℃、通気量０．５v.v.m で７日間通気攪拌培養
し、殺菌した３３％グルコース溶液１５０mlを２, ３,
４および５日目に添加した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５２】得られた湿菌体９６０ｇ（乾燥重量１２６
ｇ）について、実施例１と同様の操作により、総脂質７
４．８ｇ、混合脂肪酸メチル７０．２ｇを得た。これを
ガスクロマトグラフィーで分析したところ、ＤＧＬＡ含
量は総脂肪酸の３０％、ＤＧＬＡ生成量は培地１リット
ル当たり４．０ｇ、乾燥菌体１ｇ当たり１６５mgであっ
た。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５４】モルティエレラ・アルピナ（Mortierella
alpina) ＩＦＯ８５６８（比較例）及び変異株ＳＡＭ１
８６０（実施例）をそれぞれの培地に別々に１白金耳接
種し、レシプロシェーカー（１１０rpm)により２８℃で
７日間振盪培養した。培養２４時間目に、セサミン含有
大豆油を添加した培養には、滅菌した上記セサミン含有
大豆油０．５mlをそれぞれ添加し、大豆油を添加した培
地には滅菌した大豆油０．５mlをそれぞれ添加した。培
養後、実施例１と同様にして得られた脂肪酸メチルエス
テルをガスクロマトグラフィーで分析した。表４にその
結果を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５５】 表 ４ ────────────────────────────────── 菌 株 Ｍ．アルピナ 変異株 ＩＦＯ８５６８ ＳＡＭ１８６０ ────────────────────────────────── セサミン含有大豆油の添加 無 有 無 有 ＤＧＬＡ対ＡＲＡの比 ０．１５ １．１７ ５．０４ １２．３ 総脂肪酸（ｇ／Ｌ） １１．１ １１．８ １２．０ １１．９ 乾燥菌体（ｇ／Ｌ） ２３．８ ２４．２ ２４．６ ２４．１ ＤＧＬＡ生産量（ｇ／Ｌ） ０．３９ １．８７ ２．４５ ２．９３ ──────────────────────────────────
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５７】この結果から、「ビスホモ−γ−リノレン
酸及びこれを含有する脂質の製造方法」と題する特許出
願（特開平１−２４３９９２号）の明細書に記載されて
いるのと同様の効果によって、ＡＲＡの生産が抑制され
てＤＧＬＡの大量生産が起こり、ＤＧＬＡ対ＡＲＡの比
が上昇することは明らかであり、セサミン以外に、ゴマ
油、落花生油、ゴマ油に対して実質的に非混和性である
有機溶剤によりゴマ油から抽出した抽出物、ゴマ種子の
溶剤抽出物、セサミン、セサミノール、エピセサミン、
エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４−メチレ
ンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒド
ロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．
３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３−メトキシ−４
−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
〔３．３．０〕オクタン、２−（３，４−メチレンジオ
キシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒドロキシ
フェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．３．
０〕オクタン、タラゴン（Tarragon) の抽出物、イノン
ド種子(Dill Seed) の抽出物、パセリ(Parsley) の抽出
物、ウコン（Turmeric) の抽出物、ナツメッグ（Nutme
g) の抽出物も、ＡＲＡの生産を抑制しＤＧＬＡの大量
生産を起こして、ＤＧＬＡ対ＡＲＡの比が上昇すること
は明らかである。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１０月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】モリティエレラ属の変異株として例えば、
本発明者ら条寄誘導した突然変異株モルティエレラ・ア
ルピナＳＡＭ１８６０（微工研条寄第３５８９号）を使
用することができる。本発明に使用される変異株を培養
するためには、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養し
て得られた前培養液を、液体培地又は固形培地に接種し
培養する。液体培地の場合に、炭素源としてはグルコー
ス、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルト
ース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニト
ール等の一般的に使用されているものが、いずれも使用
できるが、これらに限られるものではない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】これらの菌体より、クロロホルム−メタノ
ール−水の一層系の溶媒を用いるＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ
の抽出法によって総脂質を抽出したところ、ＩＦＯ８５
６８から５０５mg、ＳＡＭ１８６０から５３０mgの脂質
が得られた。これらの脂質を無水メタノール−塩酸（９
５：５）を用いて５０℃にて３時間処理することによっ
てメチルエステル化し、エーテルで抽出してＩＦＯ８５
６８から４１７mg、ＳＡＭ１８６０から４５４mgの脂肪
酸メチルを得た。得られた脂肪酸メチルエステルをガス
クロマトグラフィーで分析した。表１にその結果を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:66）

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不
    飽和化活性が低下又は欠失した微生物を培養して、ジホ
    モ−γ−リノレン酸またはジホモ−γ−リノレン酸を含
    有する脂質を生成せしめ、そしてジホモ−γ−リノレン
    酸を採取することを特徴とするジホモ−γ−リノレン酸
    の製造方法。
  2. 【請求項２】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不
    飽和化活性が低下又は欠失した微生物を培養し、ジホモ
    −γ−リノレン酸を含有する脂質を採取することを特徴
    とするジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方
    法。
  3. 【請求項３】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不
    飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、Δ５不飽和化
    酵素阻害剤を添加した培地で培養するか、あるいは該微
    生物が培養されている培養液にΔ５不飽和化酵素阻害剤
    を添加してさらに培養することにより、ジホモ−γ−リ
    ノレン酸またはジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質
    を生成せしめ、そしてジホモ−γ−リノレン酸を採取す
    ることを特徴とするジホモ−γ−リノレン酸の製造方
    法。
  4. 【請求項４】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不
    飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、Δ５不飽和化
    酵素阻害剤を添加した培地で培養するか、あるいは該微
    生物が培養されている培養液にΔ５不飽和化酵素阻害剤
    を添加してさらに培養し、ジホモ−γ−リノレン酸を含
    有する脂質を採取することを特徴とするジホモ−γ−リ
    ノレン酸を含有する脂質の製造方法。
  5. 【請求項５】 前記Δ５不飽和化酵素阻害剤が、次の一
    般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 、及びＲ6 はそ
    れぞれ独立に水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、あ
    るいはＲ1 とＲ2 、及び／又はＲ4 とＲ5 は一緒になっ
    てメチレン基もしくはエチレン基を表し、そしてｎ，
    ｍ，Ｌは０又は１を表す）で表わされるジオキサビシク
    ロ〔３．３．０〕オクタン誘導体、ピペロニルブトキサ
    イド、クルクミン、クルクミン、又は次の一般式（I
    I）： 【化２】 （式中、Ｒ1 は低級アルキル基を示し、Ｒ2 は水酸基、
    アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、オキシアル
    キル基を示す。Ｒ2 が複数ある場合には、複数のＲ2 は
    同一であっても異なっていてもよい。ｎは０〜５の整数
    を示す。）で表わされる化合物であることを特徴とする
    請求項３又は４記載のジホモ−γ−リノレン酸またはジ
    ホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方法。
  6. 【請求項６】 前記ジオキサビシクロ〔３．３．０〕オ
    クタン誘導体がセサミン、セサミノール、エピセサミ
    ン、エピセサミノール、セサモリン、２−（３，４−メ
    チレンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−
    ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシクロ
    〔３．３．０〕オクタン、２，６−ビス−（３メトキシ
    −４−ヒドロキシフェニル）−３，７−ジオキサビシク
    ロ〔３．３．０〕オクタン、又は２−（３，４−メチレ
    ンジオキシフェニル）−６−（３−メトキシ−４−ヒド
    ロキシフェノキシ）−３，７−ジオキサビシクロ〔３．
    ３．０〕オクタンであることを特徴とする請求項５記載
    のジホモ−γ−リノレン酸またはジホモ−γ−リノレン
    酸を含有する脂質の製造方法。
  7. 【請求項７】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不
    飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、ゴマ油、落花
    生油、ゴマ油に対して実質的に非混和性である有機溶媒
    によりゴマ油から抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出
    物、五加皮の抽出物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出
    物、ヒハツの抽出物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarrag
    on）の抽出物、イノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パ
    セリ（Parsley)の抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出
    物、ナツメッグ（Nutmeg）の抽出物を単独でまたは組み
    合せて添加した培地で培養するか、あるいは該微生物が
    培養されている培養液にゴマ油、落花生油、ゴマ油に対
    して実質的に非混和性である有機溶媒によりゴマ油から
    抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出物、五加皮の抽出
    物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出物、ヒハツの抽出
    物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarragon）の抽出物、イ
    ノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パセリ（Parsley)の
    抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出物、ナツメッグ（Nu
    tmeg）の抽出物を添加してさらに培養することにより、
    ジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質またはジホモ−
    γ−リノレン酸を生成せしめ、そしてジホモ−γ−リノ
    レン酸を採取することを特徴とするジホモ−γ−リノレ
    ン酸の製造方法。
  8. 【請求項８】 アラキドン酸生産能を有し、かつΔ５不
    飽和化活性が低下又は欠失した微生物を、ゴマ油、落花
    生油、ゴマ油に対して実質的に非混和性である有機溶媒
    によりゴマ油から抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出
    物、五加皮の抽出物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出
    物、ヒハツの抽出物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarrag
    on）の抽出物、イノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パ
    セリ（Parsley)の抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出
    物、ナツメッグ（Nutmeg）の抽出物を単独でまたは組み
    合せて添加した培地で培養するか、あるいは該微生物が
    培養されている培養液にゴマ油、落花生油、ゴマ油に対
    して実質的に非混和性である有機溶媒によりゴマ油から
    抽出した抽出物、ゴマ種子の溶剤抽出物、五加皮の抽出
    物、桐木の抽出物、白果樹皮の抽出物、ヒハツの抽出
    物、細辛の抽出物、タラゴン（Tarragon）の抽出物、イ
    ノンド種子（Dill Seed)の抽出物、パセリ（Parsley)の
    抽出物、ウコン（Turmeric）の抽出物、ナツメッグ（Nu
    tmeg）の抽出物を添加してさらに培養し、ジホモ−γ−
    リノレン酸を含有する脂質を採取することを特徴とする
    ジホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方法。
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