JPH05503284A - 準安定結合の修飾速度を上昇する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

準安定結合の修飾速度を上昇する方法 発明の分野 本発明は概してペプチド結合の切断または形成速度を上昇させる方法に関する。 さらに詳しくは、本発明はタンパク質またはペプチド分子内の特異的準安定ペプ チド結合の、そのような分子と速度上昇抗体との接触による切断または形成の速 度を上昇させる方法に関する。 いくつかの参考文献が本出願の括弧内のアラビア数字で引用されている。これら の参考文献の全ての引用は明細書の最後、請求の範囲のすぐ直前に見られる。参 考文献はより十分に、本発明自身のある局面同様、本発明に関する技術の状況を 記述している。 発明の背景 タンパク質中のあるペプチド配列は準安定であることが知られている。これらの 配列は“センシトーブとして引用されるか、脱アミド化、異性化、ラセミ化およ びある場合にはペプチド結合の切断のような自発的な化学反応が可能である。そ れ自体それらはそのような感受性部位で起きる化学反応の速度上昇抗体の標的部 位である。 ある合成ペプチド配列は特に自発的反応が可能である（１）。アスパラギン、ア スパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸は感受性の配列と頻繁に会合するアミ ノ酸残基である、そしてこれらの特定の側鎖に隣接するアミノ酸残基はペプチド 内のこれらの部位の特定の感受性を決定できることが提案されている（２）。完 全なタンパク質のこれらの部位周辺の構造的性質はまた自発的な化学的修飾に対 するこれらの部位の安定性に影響を及ぼすことができることも観察されている（ ３）。 さらに具体的には、ジペプチド配列、ＡＳＮ−ＰＲＯｌＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＰ −ＰＲＯｌＡＳＰ−ＧＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−ＸまたはＧ ＬＵ−Ｘを含むポリペプチドは、他のジペプチドよりもさらに速い速度で加水分 解をうけることが知られている。この不安定性は、２個のアミノ酸の間のペプチ ド結合に対する側鎖アミドまたは酸の分子内攻撃の結果生じる環状構造の形成に よる。しかしこれらの準安定結合は天然（変性していない）タンパク質中ではよ り安定であることが報告されている（２）。 アシル転移反応（４）、向シグマ性再編成（５）、分子内環状化（６）、および ペプチド結合加水分解（７）を触媒する抗体が既に産出されている。そのような 抗体は特に基質か補助する触媒をおこなう、即ち反応性求核原子を含む基質また は形態変化する分子内の触媒の反応を触媒するのに適していることが推測されて いる。 ペプチドに対して生した抗体は同一の配列が完全なタンパク質中に存在している とそこに結合することができる。例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のアミノ酸１ からｌ５を含むペプチドに対して生じた抗体は天然の腫瘍壊死因子に結合し、そ うすることにより細胞表面受容体との相互作用を阻害することができる（８）。 同様に、ＨＩＶのｇｐ１２０コートタンパク質のアミノ酸を含むペプチドに対す る抗体は完全なウィルスと交差反応し、ウィルスとその細胞受容体、ＣＤ４との 相互作用を阻害する（９）。別の例では、ニワトリ卵リゾチームのアミノ酸６７ から８３を含むペプチドに対する単クローン抗体は完全タンパク質と交差反応す ることができ、エピトープ内の配列か本質的に類似している他の鳥類のりゾチー ムを認識することかできた（１０）。 触媒抗体を調製する方法が記述され、目的の抗原または基質への非触媒および触 媒抗体の結合方法が記述される一方、これまでに自発的な加水分解を起こすこと か知られているある準安定ペプチド結合の切断または形成の速度を上昇させる技 術は与えられていない。 発明の目的 本発明の第一の目的は、タンパク質またはペプチド分子内の準安定ペプチド結合 の切断または形成の速度を上昇させる方法を提供することである。 さらに本発明の目的は、準安定ペプチド結合を含むペプチドまたはタンパク質分 子を発明にしたがった合理的な計画方法により調製された速度上昇抗体に接触さ せることにより、準安定ペプチド結合、例えばＡＳＮ−ＰＲＯｌＡＳＮ−ＧＬＹ 、ＡＳＰ−ＰＲＯ，ＡＳＰ−ＧＬＹ、Ｘかいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−Ｘ 、ＧＬＵ−Ｘの切断または形成速度を上昇させる方法を提供すること本発明のも う一つのおよび関連する目的は、タンパク質またはペプチド分子の特異的なペプ チド結合の加水分解速度を、そのような分子とこれらの結合の天然の傾向を、ペ プチド結合中のアスパラギン酸またはグルタミン酸のアミドまたは酸の官能基ま たはアスパラギンまたはグルタミン側鎖の分子内攻撃による環状中間体構造を形 成するように促進する速度上昇抗体と接触させることにより、上昇させる方法を 提供することである。 発明の要約 発明のこれらおよび他の目的は速度を上昇させる抗体を引き出す抗原で達成され 、前記抗原は準安定結合をもつハブテンを含む。 本発明の一つの態様は、準安定結合部位で目的の基質の反応速度を上昇させるこ とかできる抗体を引き出す抗原であり、前記抗原は前記準安定結合部位またはそ の近傍で目的の基質をまねるハブテンを含む。 本発明のさらなる態様は、目的の基質中の準安定結合の修飾速度を上昇させる抗 体である。前記抗体は、修飾される特異的準安定結合を選択すること：前記準安 定結合部位またはその近傍で前記基質をまねるハブテンを含む抗原を選択するこ と、前記抗原に抗体産生能のある細胞をさらし、それにより抗体産生細胞を産出 すること：前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それによりそれ ぞれが単クローン抗体を産生ずる複数のハイブリドーマ細胞を産出すること；お よび修飾される準安定結合部位またはその近傍でエピトープに結合する単クロー ン抗体を同定し、前記準安定結合の修飾速度を上昇させるために、前記複数の単 クローン抗体をスクリーニングすることの各段階を含む過程により調製される。 本発明のさらなる態様は、目的のタンパク質またはペプチド分子基質中で切断ま たは形成される特異的準安定結合を選択すること；前記準安定結合部位またはそ の近傍で前記基質をまねるハブテンを含む抗原を選択すること、抗体を産生でき る細胞を前記抗原にさらし、それにより抗体産生細胞を産出すること：前記抗体 産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それぞれが単クローン抗体を産生ず る複数のハイブリドーマ細胞を産出すること：および前記準安定結合の修飾速度 を上昇させるように修飾された準安定結合部位またはその近傍でエピトープに結 合する単クローン抗体を同定するために複数の単クローン抗体をスクリーニング することの各段階からなる、目的の準安定結合の切断または形成速度を上昇する 抗体を調製する方法である。 またさらに、本発明の態様は、前記特異的準安定結合部位またはその近傍でエピ トープで前記基質に結合し、反応速度を上昇させるために、前記抗体にとって十 分な条件下で、前記基質を抗体と接触させることを含む、目的のタンパク質また はペプチド分子基質内の特異的準安定結合の修飾速度を上昇させる方法である。 さらにもう一つの本発明の態様は、前記特異的準安定結合部位またはその近傍の エピトープで前記基質に結合し、それにより前記反応速度を上昇させるために前 記抗体にとって十分な条件下で、前記基質を効果的な量の抗体と接触させること を含む、目的のタンパク質またはペプチド分子基質内の特異的準安定結合の修飾 速度を上昇させる方法である。前記抗体は、修飾される特異的準安定結合を選択 すること；前記準安定結合部位またはその近傍で前記基質をまねるハブテンを含 む抗原を選択すること；抗体産生能のある細胞を前記抗原にさらし、それにより 抗体産生細胞を産出すること；前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成さ せ、それによりそれぞれが単クローン抗体を産生ずる複数のハイブリドーマ細胞 を産出すること；および修飾される準安定結合部位またはその近傍でエピトープ に結合する単クローン抗体を同定するために前記複数の単クローン抗体をスクリ ーニングすることという方法により生産される。 本発明、ならびに他の目的、その特性および利点は、以下の詳細な説明からより 明らかに、そして完全に理解されるであろう。 発明の詳細な説明 ＸおよびＹかいずれかのアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ、ＡＳＰ−Ｘ、ＧＬＮ−Ｘ、 ＧＬＵ−ＸＳＬＹＳ−ＸおよびＨＩ　５−Ｙ−Ｘからなるグループから準安定結 合が選択される抗原を本発明は具体化している。 特に、本発明は前記準安定結合部位またはその近傍でアミノ酸配列と免疫学的に 交差反応するハブテンを含む抗原を具体化している。 さらに本発明は特に前記ハブテンが少なくとも２個のアミノ酸の配列からなる抗 原を具体化する。 またさらに本発明は、特にＸおよびＹかいずれかのアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ、 ＡＳＰ−Ｘ、ＧＬＮ−Ｘ、ＧＬＵ−Ｘ、ＬＹＳ−ＸおよびＨＩＳ−Ｙ−Ｘからな るグループから前記準安定結合が選択され、前記準安定結合の同一性か技術的に 既知の条件下で目的の基質を修飾し、そのような修飾で得られる産物を解析する ことにより決定されるような前記抗原により引き出される抗体を具体化する。 用語の定義 最も広義には、「抗原Ｊという用語は抗体の形成を誘導する分子として定義され る。この中で用−いられるＦ抗原Ｊという用語は木質的に免疫原性分子、発明に したがったハブテンまたは適当な共役部分によりキャリアー分子と連結した発明 にしたがったハブテンを含む免疫原を意味する。キャリアー分子は例えば、キー ホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）　、千ログロブリン、ニワトリ免疫 グロブリン、オブアルブミン、ウノ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔ−ヘルパーペ プチド等を含む。ここで用いられる「共役部分」は技術的によく知られた生物工 学的架橋剤（例えば、イリノイ州ロックフォードのピース社から購入できる）を 指し、例えばトラウド試薬、ジサクシニルスベリン酸等を含む。 ［抗体）という用語は免疫グロブリン全体および抗原結合部位を含むその断片を 含む。 「速度上昇抗体」という用語は、準安定結合ペプチドを含むタンパク質またはペ プチド分子上のエピトープを認識、結合し、それにより化学量論的に、または触 媒的に（これらの用語は以下で定義される）反応速度を上昇させる本発明にかか る抗体を指す。 「準安定ペプチド結合」という用語は、形成または切断の自発的反応を起こす性 質をもつ全ての結合を含む。 「自発的反応」という用語はペプチド結合で通常観察されるよりも速い速度で進 むペプチド配列内の特定の位置での反応を指す。特に、ＡＳＮ−ＰＲＯｌＡＳＮ −’ＧＬＹ、ＡＳＰ−ＰＲＯ１ＡＳＰ−ＧＬＹ、Ｘがいずれかのアミノ酸である ＧＬＮ−ＸまたはＧＬＵ−Ｘは環状中間体の形成により仲介される自発的なペプ チド結合加水分解を起こすことが知られている。 ここで用いられている「ジペプチド類似体」という用語は、２個のアミノ酸の間 の通常のアミド結合（即ち、−Ｃｏ−ＮＨ−）が上に定義した原子の配列で置換 されている構造を指す。付加的アミノ酸残基はポリペプチドを形成するためにジ ペプチド類似体の周辺に取り込まれる。ジペプチド類似体周辺の部分は、天然に 生じるＣ＝Ｏ基がＮＨ，０１ＳＳＣＨｔ　、ＣＦ２　、またはＣ２Ｓで置換され る、および／または天然に生じるＮＨ基が０、Ｓ、ＣＨ，、ｃｐｓ　、Ｃ＝Ｏま たはＣ２Ｓで置換されるような変化ができるペプチド結合を含む。例えば、この 部分はアミド結合のＣ＝０およびＮＨ基が置換されているレトロペプチドである 。 ここで用いられている「ハブテン」という用語はエピトープとして作用できる分 子として定義される。ハブテンは目的の準安定結合を含むペプチドまたはタンパ ク質の領域と同一である、またはそれをまねる少なくとも２個のアミノ酸の配列 を含む。ハブテンはまた、前に定義されたジペプチド類似体のような類似体を含 む。 ここで用いられる「天然に生じるアミノ酸Ｊという用語は、タンパク質に見いだ されるあるいは見いだされない２０個の必須α−アミノ酸および他のα−アミノ 酸を含む。これらのアミノ酸はアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラ ギン酸、システィン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソ ロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリ ン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、４−ヒドロキシプロリン 、５−ヒドロキシリジン、ε−Ｎ−メチルリジン、３−メチルヒスチジン、コー ル酸およびβ−シアノアラニンを含む。アミノ酸はアミノ基、カルボニル基、水 素原子および「側鎖」と記述される特徴的な基を結合する炭素原子からなる。こ こで用いられる「前記側鎖類似体」という用語は、ｌまたはそれ以上の部分の天 然に生じる側鎖が本質的に天然に生じる部分に相当するｌまたはそれ以上の異な る部分により置換されている天然に生じるアミノ酸の側鎖として定義される。ヒ ドロキシ基を含むそれらのａｍはグルコシル化、リン酸化、スルホニル化または ヒドロキシ保護基による保護がなされる。側鎖のどのとドロ牛シ基も技術的によ く知られた任意の数の適当なヒドロキシ保護基により保護される。これらは例え ば第３級ブチルエーテル基を含む。 ［目的の部位またはその近傍での］抗体の結合は目的の準安定結合への抗体の直 接的な結合、目的の準安定結合に近接するペプチド配列への結合、または目的の 準安定結合へ直接的な、および目的の準安定結合の一方または両方にあるアミノ 酸配列への結合を意味する。 ［触媒」抗体は、他の全ての条件（例えば、温度、反応物／基質濃度等）が同一 であるときに、化学反応速度を変化させることができ、反応では消費されず、触 媒抗体１モルあたり多モルの反応物／基質を変換できる抗体である。メカニズム の観点から、これは平衡位置をシフトすることなしに化学反応速度を変えること により反応物／基質に結合し、反応物／基質の産物への変換を加速し、産物を放 出する。前記の定義は理想的な触媒の特性である。しかし実際には、最高の触媒 でさえ反応系の汚染により、または反応過程中の化学的あるいは物理的破壊の結 果として被毒化、または不活化する。技術的によく知られた理由により、触媒の 真の操作は、反応系の成分により、または反応環境条件により不ａＡＦａにされ る。 抗体が反応完了後エピトープから離れる場合、準安定ペプチド結合に作用する速 度上昇抗体は触媒抗体として記述される。 「化学量論的」抗体は化学量論的に化学反応速度を上昇させる抗体である、即ち 、反応速度を上昇させるが、触媒抗体とは異なり、反応の間に化学量論的に消費 される。反応完了後抗体がエピトープに結合したまま、または反応により変化し 、そのためさらに反応を促進することかできない場合、準安定ペプチド結合に作 用する速度上昇抗体は化学量論的抗体として記述される。 速度上昇抗体の標的としてのタンパク質またはペプチド分子およびその準安定結 合の同定準安定結合は発明の方法にとって好ましい修飾部位である。例えば、以 下のアミノ酸の組み合わせ、ＡＳＮ−ＧＬＹ、ＡＳＮ−ＰＲＯ，ＡＳＰ−ＧＬＹ 、ＡＳＰ−ＰＲＯ，Ｘかいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−Ｘ、またはＧＬＵ− Ｘを含む配列は変性タンパク質または小ペプチド中では準安定で、自発的な加水 分解をうけることか知られている。天然のタンパク質に存在している場合、これ らの結合はより安定であるか、準安定結合部位またはそこに近接した部位でのエ ピトープへの抗体の結合は結合を不安定化し、切断の速度上昇か得られる。 目的のタンパク質またはペプチド分子内の準安定結合の同一性と位置は技術的に 利用可能な各種の方法により知られ、また確立されている（ＩＩ、１２）。その ような情報は各種の形態で、各種の水準の正確さで得られ、タンパク質またはペ プチド分子の３次元構造、そのコンピューターモデルまたは予想構造、あるいは 親水性プロフィールを含む。 適当な準安定結合を同定する経験的方法は、目的のタンパク質またはペプチド分 子を修飾を起こさせるのに十分な時間、技術的に認識できる修飾条件にさらすこ とを含む。例えば、各種温度でのＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）巾（２ ４−１６）での、各種温度同様、ヒドロキシルアミン（１７）または希釈酸（１ ８，１９）でのタンパク質のインキュベーションのような他の方法を用いて自己 溶解を誘導することを当業者は正しく認識するであろう。 その後、修飾された両分は同定され、修飾が起きた準安定結合が同定される。 発明の方法にしたがって有利に修飾されたタンパク質。 またペプチド分子は免疫グロブリン（加水分解）、腫瘍壊死因子（加水分解）お よびヒト免疫不全ウィルス（加水分解）を含む。 速度上昇抗体の調製 修飾された準安定結合が上述の方法により同定されると、抗原が抗体を引き出す 免疫学的方法に使用するために得られる、または合成される。抗原は望ましくは 目的の準安定結合または目的の準安定結合類似体を含む小ペプチドまたはその類 似体である。その後抗原は、試験管内、または生体内技術のいずれかを用いて目 的の速度上昇性をもつ抗体を引き出すために免疫原として使用され広くは、その 方法は抗体産生能をもつ細胞を免疫原にさらし、それにより抗体産生細胞を産出 すること；抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それによりそれぞれ が単クローン抗体を産生ずる複数のハイブリドーマ細胞を産出すること：および 目的の化学反応を触媒する単クローン抗体を同定するために複数の単クローン抗 体をスクリーニングすることからなる。そのように同定された単クローン抗体は 目的の化学反応を触媒するのに十分な量を得るために、再び生体内または試験管 内の技術のいずれかにより複製される。 本発明の好ましい免疫原は、基質補助機構による触媒過程に関与できる準安定結 合またはアミノ酸側鎖をもつペプチドを含む。これらにはＹおよびＸがいずれか のアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ　；　ＡＳＰ−Ｘ　、ＧＬＮ−Ｘ　；ＧＬＵ−Ｘ　 ；　ＬＹＳ−Ｘ　：およびＨＩ　５−Ｙ−Ｘからなる配列が含まれる。発明のこ れらの経験的加水分解断片解析技術により見いだされた池の免疫原もまた使用さ れる。触媒される特異的反応の反応経路に補足的なポケットを組み合わせた抗体 をつくることにより分子内触媒反応をペプチドまたはタンパク質基質におこなわ せるように誘導された環状類似体を含む免疫原もまた使用される。 目的の活性および特異性を用いた抗体の検出はそれらが引き出された際のハイブ リドーマのスクリーニングにより達成される。例えば、スクリーニングは高速液 体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または分光光度計による方法（ＥＬＴＳＡ） により達成される。単クローン抗体は、ここで参考文献に取り入れられている、 １９８０年４月１日に発行された米国特許第４，１９６，２６５号のＫｏｐｒｏ ｗｓｋｉ等により記載された技術を改良した方法により、生体内で引き出される 。その過程の詳細は技術的に知られている。特異的抗原に関する一連の単クロー ン抗体は適当な条件下で調製される。これにはまず適当な抗原でＢＡＬＢ／Ｃマ ウスを免疫することが含まれる。抗原はペプチドまたは他のキャリアー分子に結 合する本発明にかかるハブテンが含まれる。 抗体産生リンパ細胞はその後免疫されたマウスの膵臓から取り出され、ハイブリ ドーマ細胞をつくるためにＳ　Ｐ　２１０細胞のようなミエローマ細胞と雑種形 成される。これらのハイブリドーマ細胞はその後マイクロタイタープレートのウ ェルに植えられる。ハイブリドーマ細胞により生産される一連の単クローン抗体 は適当な条件下で目的の反応を触媒する単クローン抗体を同定するために、適当 な条件下でスクリーニングされる。代わりに、培地は免疫原に結合する抗体につ いて試験され、これらの抗体を産生ずるハイブリドーマはその後組織培養に広げ られるか、または生体内で生育される。スクリーニングは、反応物の標準液をマ イクロタイターウェルから回収された培地のアリコツトで処理し、通常の機器法 で目的産物の測定をおこなうことにより簡便に達成される。 この測定は例えば、分光光度計による方法または気体−液体または高速液体クロ マトグラフィーにより簡単に行なわれる。目的産物または反応物の標準試料と比 較することにより、反応速度か定量される。このように、単クローン抗体を産生 ずるハイブリドーマ細胞を含むウェルが同定される。選択されたハイブリドーマ 細胞はその後コロニーを得るために培養される。 これらのコロニーはさらに試験管内または生体内の系で広げられる。後者の場合 、同系のＢＡＬＢ／Ｃマウスのようなマウスが選択されたハイブリドーマ細胞を 腹腔内に接種され、通常は２から３週間以内に腫瘍がつくられる。これらの腫瘍 は、目的の単クローン抗体を含む腹水の生産を伴う。単クローン抗体はその後限 外濾過、超遠心、透析および免疫アフィニティークロマトグラフィーのような通 常の方法により腹水から単独に回収される。 発明の免疫原から引き出される抗体は、目的の準安定結合の修飾を触媒するため だけにデザインされているという意味で「部位特異的」である。同様に、これら の抗体はその末端にある構造配位をもつ部分の末端から結合を形成することを触 媒するためだけにデザインされている。本発明にしたがい合理的にデザインされ た免疫原は、２またはそれ以上の切断産物を産出し、正しい構造配位をもつそれ らの切断産物が結び付けられる結合の形成を触媒するために、タンパク質または ペプチド分子の特異的部位で結合を切断することができる部位特異的抗体を引き 出すために用いられる。 発明はさらに以下の例に記述される。 ！ 例Ｉ ヒト免疫不全ウィルスＩ壓（ＨＩＶ−１）糖タンパク質１２０（ＧＰ　１２０） を用いたタンパク質中の準安定ペプチド結合を決定する方法 ＧＰ　１２０は技術的によく知られた方法で均一に精製される。精製されたＧＰ 　１２０は終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるように１０ｍＭ　ＣａＣＬを含む５０ｍ ＭＴｒｉｓ　−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ９，０）に溶解され、その後５５°Ｃで４８ 時間熱処理される。反応液は断片化のパターンを決定するために５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）により解析される。 ゲルはタンパク質のバンドを目に見えるようにするためにクーマシーブリリアン トブルーＲ−２５０で染色される。分子量標準との比較に基づいて、ｇｐ＋２０ バンドよりも速く移動するバンドは準安定結合の切断を示す。熱自己溶解により 生産される個々の断片はＨＰＬＣにより均一になるまで精製され、それらの同一 性は酸加水分解後のアミノ酸分析およびシーフェンシングにより確定される。こ れら全てのデータとｇｐ１２０の既知のアミノ酸配列との比較により断片および それにより準安定切断部位の明白な同定がなされる。 この方法は容易に他のペプチド、タンパク質、糖タンパク質、およびペプチドグ リカンに利用される。当業者は他の方法が各種の温度でのＥＤＴＡ　（エチレン ジアミン四酢酸）　（１４−１６）、各種温度同様、ヒドロキシルアミン（１７ ）または希釈酸（１８，１９）中でのタンパク質のインキュベーションのような 自己溶解を誘導するために用いられることを正しく認識できる。 例■ 準安定ペプチド結合切断のための類似体の合成発明のさらなる態様では、配位的 に不自然なペプチド類似体を含む免疫原により引き出される抗体は正常なペプチ ドの加水分解を促進する。そのような免疫原は例えば、ある環状または非環状の ペプチド類似体から調製される。 本発明のこの態様は、これらの準安定結合が他のペプチド結合よりもさらに速い 速度でうける自発的反応の中間体である環状構造類似体を利用する。これらの中 間体は、ＡＳＮ−ＰＲＯｌＡＳＮ−ＧＬＹｌＡＳＰ−ＰＲＯｌＡＳＰ−ＧＬＹ、 Ｘがいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−Ｘ、またはＧＬＵ−Ｘのような２個のア ミノ酸の間の準安定結合上の側鎖アミドまたは酸の分子内攻撃の結果得られる。 類似体は自発的な加水分解の間に準安定ペプチド配位の形態をまねる。 免疫原として調製されたそのような類似体により誘導される抗体は結合し、目的 の準安定ペプチド結合の配位に変化を誘導することにより特定の準安定ペプチド 結合の切断を促進する。図により、好ましいペプチドの合成は以下に記述される 。 Ａ、環状ジフルオロケトンハブテンの合成環状ジフルオロケトンハブテンは、準 安定ペプチド結合であるＡＳＮ−ＧＬＹおよびＡＳＰ−ＧＬＹが他のジペプチド 結合よりもかなり速い速度でうける自発的切断を仲介する化学構造の配位的類似 体としてデザインされる。 前記ハブテンを取り込む免疫原は、ＡＳＮ−ＧＬＹおよびＡＳＰ−ＧＬＹ結合の み、または完全な配列の部分としての結合で切断を誘導できる抗体の形成を引き 出すようにデザインされる。これらの立体異性のペプチドへの取り込みは既知の ペプチド合成により進む。 これらのハブテンスキームｌにしたがって合成される： スキーム１ ［６］ スキーム１−続き スキームｌ−続き

【１３】 合成の方法論は本質的には出願番号ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１９５１　（１９８ ９年５月４日出願）の例７に記述されている方法に、環状類似体をつくるべくさ らに修飾を加えたものにしたかっている。 化合物４−フェニルベンゾイルクロリド（１）はアスパラギン酸のモノメチルエ ステル〔２〕で濃縮され、４−フェニルベンゾイルで保護された類似体〔３〕が 得られる。ラクトンの環状化〔４〕は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミド’（ＥＤＣ）を用いたアブロティツクな条件下で達成さ れる。不飽和ジフルオロケト酸〔５〕の無水物を用いた濃縮（Ｊ、　Ｆ。 Ｎｖｒｍａｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｕｌｌ、　Ｓｏｃ、　Ｃｈｉｍ、　Ｆｉ、 、　（１９７４）　２０７２（２５ｂ）　）はジペプチドシントン〔６〕を与え る（２５）。液体アンモニア中でのトリメチルアルミニウムを用いた′　〔６〕 の処理は保護されたアスパラギンシントン〔７〕を与える。アルデヒドへのオゾ ン分解および酸類似体

〔９〕へのジョーンズ酸化は円滑に進む。ナトリウムアマ ルガムを用いた４−フェニルベンゾイル基の脱保護化（２４）は、リンカ一部分 で誘導化されて必要なペプチド配列を与えるか（１１）、または、当業者に知ら れている方法（２６）により必要なペプチド配列に取り込まれるようなＡＳＮ− ＧＬＹ環状ジフルオロケトンジペプチドシントンを提供する。保護されたジペプ チドシントン〔６〕の炭酸カリウムによる処理はアスパラギン酸−〇ＬＹシント ン〔８〕を与える。同様のオゾン分解の後にジョ−ンズ酸化を行うことにより、 当業者に知られている方法論（２６）により選択された配列に取り込まれるか、 または直接的にキャリアータンパク質に付着するためのリンカ一部分（１１）（ ２４）で誘導化されるＡＳＰ−ＧＬＹ環状ジフルオロケトンジペプチドソントン 〔１０〕を与える。 Ｂ、ハブテンを含む環状リンの合成 （以下に示される）スキーム２によりつくられるハブテンを含むリン、または前 記ハブテンを取り込んだ免疫原は、ＹかＧＬＹまたはＰＲＯであるＡＳＮ−Ｙお よびＡＳＰ−Ｙのみて、あるいは完全な配列の部分としてこれらで切断を誘導で きる抗体を引き出すようにデザインされる。立体異性を含むこれらのリンのペプ チドへの取り込みは既知のペプチド合成により進む。 発明のこの態様は、他のジペプチド結合よりもさらに速い速度て、ＹかＧＬＹま たはＰＲＯである準安定ペプチド結合ＡＳＮ−ＹおよびＡＳＰ−Ｙかうける自発 的加水分解を仲介する化学構造類似体を含むリンを利用する。 説明として、ペプチド類似体を含む好ましいリンの合成はスキーム２に記述され る。 ハブテンを含む環状リンの合成方法は本質的に文献の方法論にしたがう：しかじ 、生産される類似体は先例のない化合物である。環状リン立体異性のペプチドへ の取り込みは既知のペプチド合成により進む。 スキーム　２ ［１４］

【１５】 ｒ１６］ スキーム２−続き ［１６１

【１７］ ［１８］ ［１９１ 既知のスルホキシド（２２）（１４）は、α−アセトキシスルフィド〔１５〕を 与えるために無水酢酸存在下での加熱によるブメラー再配置に供される。温和な 塩基処理は、フェニルスルフィニル陰イオンの除去に付随して選択的にアセトキ シ基を切断してアルデヒドを与える（１６〕　：ジョーンズ酸化の後にジアゾメ タンを用いてエステル化をすれば、エステル〔Ｉ７〕が得られる。単一のメトキ シホスフィニル基の選択的モノ脱保護の後に塩化チオニル処理を行うと、ジメチ ル鋼リチウムを用いた反応でホスホン酸塩を与える塩化ホスフィノイルを与える 〔１８〕。分子内クライゼン型環状化は〔１９〕を得るためにメタノール中ナト リウムメトキシドにさらすことにより達成される。塩基加水分解の後に塩化チオ ニル処理をすれば、目的のジペプチド類似体〔２１〕を得るために適当に保護さ れたアミノ酸誘導体と共役する塩化ホスホニル〔２０〕を与える。 スキーム３にしたがったハブテンを含む非環状リン（２３）は上記のＡおよびＢ のハブテンよりも広い交差反応性を提供する。本発明のこの態様は準安定ペプチ ド結合、ＡＳＮ−ＰＲＯｌＡＳＮ−ＧＬ、Ｙ、ＡＳＰ−ＰＲＯ，ＡＳＰ−ＧＬＹ ＳＸかいずれかのアミノ酸であるＧＬＮ−ＸまたはＧＬＵ−Ｘか他のジペプチド 結合よりもさらに速い速度でうける自発的加水分解の中間体である化学的構造の 類似体を含む非環状リンを利用する。 免疫原として調製された類似体を含むそのようなリンにより誘導される抗体は結 合し、目的の準安定ペプチド結合の配位に変化を誘導することにより、特定の準 安定ペプチド結合の加水分解を促進する。実例として、ペプチド類似体を含む好 ましいリンの合成がスキーム３に記述される。 スキーム　３ 【２３１ ［Ｚ４］ す釘 既知のβ−ラクタム誘導体（２２〕　（Ｒ＝Ｍｅ）は文献（２３）に記述されて いるものに類似の方法で〔２３〕で与えられる保護アミノ酸誘導体と共役して〔 ２３〕を与える。次に、β−ラクタム環のアルコール分解は保護されたジペプチ ド誘導体〔２４〕を与える。リンエステルの選択的切断はチオフェルレート陰イ オン処理により達成される。塩化チオニルでの反応に続いて適当に保護されたア ミノ酸との共役によって得られた酸の塩素化はトリペプチド類似体〔２５〕を与 える。 例■ 免疫原ペプチドを用いたＨＩＶｇｐ１２０コートタンパク質に対する触媒抗体の 生体内での誘導Ａ、免疫原の調製 目的の準安定ペプチド結合が例Ｉに記述されたように選択されると、速度上昇抗 体を誘導するための最適なハブテンを決定することが必要である。最適な速度上 昇抗体は、目的の準安定結合部位またはその近傍に位置するエピトープと免疫学 的に交差反応するハブテンにより誘導される。最大の速度上昇を与える抗体を誘 導するハブテンは経験的に決定されねばならない。目的の準安定ペプチド結合部 位またはその近傍の異なる部位を認識する抗体は、いずれが速度を上昇させ、そ れらのうちのいずれか最高に速度を上昇させるかを決定するためにスクリーニン グされる。 例■に記述された方法により同定される準安定ペプチド結合を含む、またはそこ に隣接する一連のオクタペプチド配列が合成される。配列はＨＩＶｇｐ１２０に 見いだされるアミノ酸配列に相同または同一であるか、あるいは例■にしたかっ た、目的の準安定ペプチド結合のジペプチドまたはトリペプチド類似体を含む。 そのような類似体は目的の準安定ペプチド結合をその部位または、例Ｉの方法に より同定され、７個のアミノ酸までのいずれかの側に隣接した部位で定義する天 然に生じるアミノ酸を置換する。それゆえ、目的の準安定結合または目的の準安 定ペプチド結合の合成ペプチド類似体を含む入れ子状のオクタペプチドが生成さ れる。同一の２個のアミノ酸の間に位置する準安定結合を含むが、それぞれ異な るオクタペプチドのペプチドのＮ−末端から異なる距離に生じるこの入れ子状の オクタペプチドが生成される。 それゆえ、一連のオクタペプチドは目的の準安定ペプチド結合、または異なる位 置に存在する類似体として目に見えるようになる。この一連のオクタペプチドに より誘導される相当の抗体は、天然のｇｐ１２０タンパク質中に存在する目的の 準安定ペプチド結合から異なる距離で結合する一団の抗体を表す。 目的の準安定ペプチド結合（またはその類似体）を含むハブテンの性質をより理 解するために、例としてのみ示される、標的タンパク質内に準安定結合を含む次 の１２個のアミノ酸配列・ＶＤＲＡＳＮＰＫＡＳＴＲを考える。 以下のオクタペプチドは免疫原として用いるために構築される： ＮＨ，−Ｖ　Ｄ　ＲＡ　Ｓ　Ｎ−Ｘ−Ｐ　Ｋ−Ｃ００ＨＮＨ，−Ｄ　ＲＡ　′５ Ｎ−Ｘ−Ｐ　Ｋ　Ａ−Ｃ００ＨＮＨ，−ＲＡ　Ｓ　Ｎ−Ｘ−Ｐ　Ｋ　Ａ　Ｓ−Ｃ ００ＨＮＨ，−Ａ　Ｓ　Ｎ−Ｘ−Ｐ　Ｋ　Ａ　Ｓ　Ｔ−Ｃｏｏｌ（ＮＨ２−Ｓ　 Ｎ−Ｘ−Ｐ　Ｘ　Ａ　Ｓ　Ｔ　Ｒ−Ｃ０ＯＨここでＮＸＰはジペプチド立体異性 または天然に生じるアミノ酸準安定ジペプチドである。それゆえ、天然のタンパ ク質配列中の一連のエピトープで結合する相当の一群の抗体を誘導するための一 群のハブテンを調製できることは高く評価されるべきである。この一群の抗体は その後、いずれか好ましい速度上昇抗体であるかを決定するためにスクリーニン グされる。 それぞれのペプチドハブテンは架橋剤ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒトロキ シサクシンイミドエステルを用いて、末端のシスティン残基を介してキーホール リンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役される。 Ｂ、単クローン抗体の調製 ＢＡＬＢ／Ｃマウスか、完全フロイント補助剤で乳状化されたＫＬＨ−ペプチド 結合（免疫原）で免疫される。 血液試料はそれぞれのマウスから得られ、血清か遠心により分離され、４°Ｃで 保存される。このようにして得られた血清は標準のＥＬＩＳＡ法により、元々の ペプチド免疫原に対する結合活性でスクリーニングされる。上述のように免疫さ れ、免疫原に対する反応性でアッセイされた抗体産生マウスは犠牲にされ、その 膵臓が取り出され、ハイブリドーマ細胞が融合のパートナ−として５Ｐ２７０ミ エローマ細胞を用いて調製される。 プラスチック製マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ３９１５　Ｐｒｏｂｉ ｎｄ、　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ　ＣＡＳ、　ＵＳ Ａ　）のウェルはＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（０，１Ｍ、ｐＨ９，６）緩衝液に溶解し た５μｇ／ｍｌペプチド５０μしてコートされる。 プレートは最初に３０分間３７℃で、さらに室温で一晩インキユベートされる。 ツイーン（Ｔｗｅｅｎ　）を含むリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅ ｅｎ　Ｏ、１％　ｐＨ７，４）で３回洗浄後、連続的希釈をしたＰＢＳ−ＢＳＡ 　１％　ｐＨ７，４に溶解した単クローン抗体５０μｌかペプチドをコートした 二重のウェルに添加され、３７°Ｃで２時間インキュベートされる。プレートは 再びＰＢＡ　−Ｔｗｅｅｎ　Ｏ，１％で３回洗浄され、ウェルはその後１：５０ ０に希釈されたアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｓｉｇ ｍａ、　ＭＯ，ＵＳＡ）で処理される。インキュベーションは３７℃で１時間行 われる。 Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ　０　、　１％での十分な洗浄後、ＩｍＭのＭ　ｇ　 Ｃ１２およびＺ　ｎ　ＣＩ　！を含む０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １０，４）に溶解されたアルカリホスファターゼ基質（シグマ１０４−１０５の ２錠／１０ｍ１）１５０μＬとインキュベートされる。酵素反応は３７°Ｃて２ ４時間続けられ、５０μＬのＮａｚ　Ｃｏｘ（１，５Ｍ）の添加により止められ る。 ４０５ｎｍでの吸収がタイターチックマルチスキャンＥＬＩＳＡリーダー（Ｆｌ ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）て読まれる。 力価発現は（１：１００希釈の保存された正常マウス血清を含む）負の対照の３ 倍の大きさの吸収を与える最大希釈による光学密度の上昇により決定される。 このスクリーニングアッセイで正の反応を与えるハイブリドーマは次の研究のた めに選択される。ＩｇＧはペイカーポンドＡＢｘ　ＨＰＬＣカラムを用いたＨＰ ＬＣにより腹水から精製される。 Ｄ、ＨＩＶ　ｇｐ　Ｉ　２０コートタンパク質に特異的な触媒抗体によるペプチ ド切断の触媒 準安定結合（２，７μＭ）を含む、またはそこに隣接するオクタペプチド基質（ ２，７μＭ）は上に概略を示した方法により生産された触媒抗体とインキュベー トされ、反応は混合液の逆相ＨＰＬＣ分析によりモニターされる。反応は触媒抗 体による高ｋ　ｅ　ａ　＋のための最適ｐＨを決定するために各種のｐＨで行わ れる。３Ｈ無水酢酸（４］　ＯＣｉ　／ｍｍｏｌ　；アマ−ジャム）を用いた遊 離のオクタペプチドまたは上述のリンカー−ペプチド共役体のアセチル化により 調製されたトリチウム標識オクタペプチド基質を用いて反応が行われる。ＨＰＬ Ｃがその後トリチウム標識切断産物の生産を追跡するために用いられる。 オクタペプチド基質の切断に最高のｋ　ｅ　ａ　ｌ値を示す抗体はウィルス複製 の阻害能を試験される。 ウィルス複製アッセイは、培養が２００μＬを含むマイクロチューブウェルに広 げられることを除いて、文献（２０）に記述された方法に本質的にしたがって行 われる。 それぞれ２５μＬの段階濃度の精製単クローン抗体は２５μＬの５０ＴＣＩＤ” 　ＨＴＬＶ　ＩＩＩＢと共に５％ＣＯ□中で、３７℃で１時間予めインキュベー トされる。ブレインキュベーションに続き、Ｈ９細胞（加熱処理により不活化し た２０％ＦＣＳを添加した１５０μＬＲＰＭＩ−０４０中にｔｘｉｏ’細胞）が ウェルに添加され、最終的に抗体濃度は０．１Ｍｇ／ｍｌからＩＯμｇ／ｍｌの 範囲となる。マイクロタイタープレートは５％ＣＯ２中で３７°Ｃ１４日間イン キュベートされる。細胞は３．７．１０日に新鮮な培地と無細胞上清１００μＬ を交換することにより培養され、この間は抗体の添加は行われない。無細胞上清 （１００μＬ）はＲＴＡ（ＤｕＰｏｎ　ｔ＋　ＮＥＫ−０４０）によりｐ２４抗 原が分析される。ｐ２４の量は感染の程度およびウィルスの複製に関連するので 、対照の抗体で処理されたウィルスと比較しｐ２４か顕著な減少を示した触媒抗 体処理を行ったウェルは触媒抗体によるｇｐ１２０の切断による阻害を示す。 Ｃ８１６６融合アッセイは文献（２１）に記述される。単クローン抗体は２時間 アッセイで試験される。慢性的にＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｂを感染されたＨ９細 胞（ＩＸ１０４）は９６穴プレートで、１５０μＬ培地中各種濃度の抗体と予め インキュベートされる。全てのアッセイは３連で行われる。５％ＣＯｍ中３７℃ １時間のインキュヘーション後、ａＸ１０’　Ｃ８１６６細胞（ＨＴＬ、Ｖ−■ で形質転換した羨帯リンパ細胞）５０μｍかウェルに添加される。最終的なウェ ル中の抗体濃度は３１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌである。２５μｇ／ｍｌの ０ＣＴ４Ａ　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　）を用いたブレインキュ ベーションか対照として用いられる。５％ＣＯ□中、３７°Ｃ１２時間プレート をインキュベートした後、多核体（リンパ細胞の直径の３倍以上に細胞質か膨ら んでいる）かカウントされる。計測中の偏りを防ぐために、試料はコードされる 。 それぞれの単クローン抗体の抗ウィルス活性はＨＩＶ−１複製および細胞融合ア ッセイで試験される。結果は単クローン抗体によるウィルス感染の投与量依存性 の阻害を示す。 準安定結合を含むペプチドによる免疫により引き出された触媒単クローン抗体は 、リンパ細胞のＣＤ４受容体への結合に含まれるウィルスコートタンパク質の重 要な領域の破壊を引き起こすことにより、ＨＩＶウィルスによる感染を阻害でき る。触媒単クローン抗体は、タンパク分解酵素の作用に類似の様式て選択された 配列のペプチド結合を切断する。オクタペプチドまたはｇ１１１２０の抗体触媒 加水分解の機構は金属イオンを含んでいてもいなくてもよいが、いずれの場合も 、抗体の活性部位に核体を含むか、抗体結合部位により活性化された水の核的付 加のいずれかを含む。 例■ ヒトＩｇＥを切断しアレルギー反応を阻害する単クローン抗体の生産、スクリー ニングおよび単離の方法論背景 アレルギー反応開始におけるＩｇＥの役割は６０年以上多くの研究の主題であっ た。これらの研究はアレルギー反応の経路について詳細な理解を導き出してきた 。アレルギー反応開始の第一の事象はアレルゲン（抗原）のＩｇＥへの結合であ る。これによりＩｇＥの幹細胞および好塩基球細胞の表面への架橋ができ、Ｉｇ Ｅは標的細胞上に存在するＦｃ受容体へＦｃ領域を介して結合する。 この架橋の結果、身体の他の組織への効果を介してアレルギー反応の心身に有害 な効果を最終的には導き出すヒスタミン、５ＲＳ−Ａおよびだの血管に作用する アミンの放出が誘発される。 ＩｇＥ分子は機能的にはその結合活性により定義される２つの部分に分けられる 。このことは、分子か２断片を生成するパパインタンパク分解に供せられたとき に示される。このタンパク分解の結果、アレルギー反応を導き出す能力に関して 、ＩｇＥは不活性化される。事実、Ｆｃ受容体のＦｃ断片への阻害を介した阻害 剤となる。 抗アレルギー単クローン抗体を産生ずるために、特異的にＩｇＥを切断し、他の 心身に有害な効果なしにこれを不活性化することかできる触媒抗体が調製される 。これを達成するため、単クローン抗体は目的の配列内に含まれる環状ジペプチ ド類似体 ＮＥ（２Ｔ−Ｚ− Ａ＝ＣＨ２または　ＮＨ ２＝Ｎ　または　ＣＨ を用いて引き出される。そのように引き出された触媒単クローン抗体は以下に示 される位置で天然のＩｇＥペプチド配列を切断する ＣＡＤＳＮ　Ｉ　ＰＲＧＶＳＡＹＬＳＲＰＳＰＦＤＬＦＩＲＫＳＰＴＩＴＣ？ 存在し、この切断によりＴｇＥ分子の活性か破壊され、アレルギー反応の生成を 阻害する。 この領域に対する触媒抗体をつくるため、（Ｘ）が上に示された環状ジペプチド 類似体を表すペプチドハブテンＡＤＳ　（Ｘ）ＲＧＶが標準の固相または液相法 により合成される。完成したペプチドは十分に保護がはずされ、固相合成か用い られた場合、トリフルオロ酢酸を用いて、固体支持体から切断される。ペプチド のＮ末端アミノ基はマウスを免疫するためのキャリアータンパク質に付着ペプチ ドハブテンはポリアミド−キーセルブール複合樹脂を用いた固相法により合成さ れる。側鎖の保護基は以下のものである：　Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル（チロシン、 アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン）；Ｎ−４−メトキシ−２ ，３，６−１リメチルベンゼンスルホニル（アルギニン）。Ｎ−官能基の一時的 な保護は、ピペリジン／ＤＭＦ　：　２０／８０を用いて１０分で除去されるフ ルオレニルメトキシカルボニルによる。共役反応はＦＭＯＣ−アミノ酸無水物を 用いて行われる。保護されたペプチジル樹脂は、トリフルオロ酢酸／チオアニソ ール／ｍ−クレゾール／チオフェノール／エタンジチオール溶液：　９０／２／ ２／２／４を用いて３時間処理することにより完全に保護か除かれる。濾過後、 濾液は真空下で少量まで濃縮される。エーテルかペプチドを沈澱させるために添 加される。エーテル上清は除去され、ペプチドの沈澱はエーテルで２回洗浄され 、ペプチドハブテン Ａ　１ａ−Ａｓ　ｐ−５ｅｒ　（Ｘ）−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉ　Ｙ−Ｖａ　１が得られ る。ここで括弧で囲まれた部分は以下に示される環状ジペプチド類似体である。 Ｘの合成は本質的に例■に記述された方法にしたがっている。 ２、ハブテンのキャリアー分子への結合上記のようなペプチドハブテンはゲルタ ールアルデヒドを用いて、キーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）に結 合される。共役の効率は、反応液へ添加された＋２５１で標識したペプチドの微 量の結合を評価したところによれば、５０から８０９６である。 触媒抗体の免疫およびスクリーニングは本質的に上述特異的な触媒抗体によるペ プチド切断の触媒ベブチｊ・基質ＡＤＳＮＰＲＧＶ　（２，７μＭ）は上に略述 した方法により生産した触媒抗体とインキュベートされ、反応は混合物の逆相Ｈ ＰＬＣ分析によりモニターされる。ペプチド基質に対して触媒ペプチダーゼ活性 を示す抗体はＩｇＥ切断能のために処理される。 ＩｇＥ不活性化アッセイ 精製されたＩｇＥ抗ＮＰか１８ｇのＩｇＥにＩｇＥの触媒抗体を用いて、精製さ れた触媒抗体による消化に供される。インキュベーションはＰＢＳ　ＣｐＨ＆、 ５）中で各種の期間（時間から日）３７°Ｃで行われる。この反応の非特異性を コントロールするために、非触媒単クローン抗体か並行反応に含まれる。 切断を評価するために、好塩基球の結合の消失を調べる。上記の消化のＩｇＥ抗 ＮＰの試料（ｌから５ａｇ）が、２００μｌのＲＰＭ１１６４０．１０％仔牛脂 児血清および１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中で１５分間、３７℃である範囲の好塩基球細 胞（６ＸｌＯ’　・］０７細胞／ｍｌ）とインキュベートされる。これらの細胞 はその後同−緩衝液で３回洗浄され、”５−ＢＳＡ−ＮＩＰ　（０，１）ＬＣｉ ）添加後さらに３７°Ｃで１５分間インキュベートされる。 細胞は洗浄され、放射活性が計測される。ＩｇＥ対照インキュベージコンと比較 した、細胞への２ＢＳ結合の減少または消失はＩｇＥの切断が起きていることを 示す。 例Ｖ 腫瘍壊死因子を標的とした抗体酵素プロテアーゼの生産腫瘍壊死因子（ＴＮＦ） は活性化マクロファージにより分泌されるサイトカインである。ＴＮＦはエンド トキシンにより誘導されるショック、前脂肪細胞におけるリポタンパク質リパー ゼ（ＬＰＬ）活性の抑制、滑液細胞によるコラゲナーゼ活性およびプロスタグラ ンジンＥ２生産の促進、インターロイキンｌ生産の促進およびヌードマウスにお けるカヘキシーの誘導を含む各種の生物学的効果を媒介することが示されている 。ＴＮＦ特異的細胞表面受容体はいくつかの型の細胞に存在する。これらの受容 体へのＴＮＦの結合はＴＮＦの生物学的効果の誘導に必要であることが信じられ ている。ｈＴＮＦのアミノ＃１から】５に対する抗体が細胞表面受容体への結合 ４　を阻害することか示されている（Ｓｏｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　＋９ｊ８７．８４．８８２９− ８８３３）。 ｈＴＮＦのＮ末端の８つのアミノ酸は受容体認識には必要ないこともまた知られ ている。それ故、受容体結合の重要な領域は９から１５の残基を含むかもしれな い。以下の式はＴＮＦのＮ末端の２５アミノ酸、重要な残基９から１５（＊）お よび準安定部位ＮＰ、即ちＡｓｎ−Ｐｒｏを示している。 ＶＲ３ＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱジペプチド立体異性を含 むペプチド類似体の合成は前述の例■に本質的にしたかって行われる。準安定ジ ペプチド立体異性の合成は本質的には例■の記述にしたがっている。免疫原の調 製、免疫および触媒抗体のスクリーニングは、バイオアッセイがＴＮＦ抗体酵素 のタンパク分解および不活性化を決定するのに使用されたことを除いて、本質的 に上述したように行われている。 腫瘍壊死因子細胞溶解アッセイ ハツカネズミＬ−９２９線維芽細胞（３０，０００／ウエル）が、ｌμｇ／ｍｌ のアクチノマイシンＤ存在下で９６穴組織培養プレートで培養される。触媒抗体 による処理の前後にＴＮＦの連続的希釈がウェルに加えられ、１８時間インキュ ベートされる。培地はその後除去され、細胞は０．５％クリスタルバイオレット の２５％メタノール溶液で染色される。５４００ｍでの吸収かＢｉｏｔｅｋ　Ｅ ＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで測定される。培地のみの細胞は（ｌの溶解 であることが考えられ、３Ｍグアニジン−塩酸で処理した細胞は完全に溶解する と考えられる。ＴＮＦ　１単位は５０％の細胞溶解を起こすのに必要な量として 定義される。 参考文献 １．　Ｔ、　Ｇｅｉｇｅｒ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｃ１ａｒｋｅ、　ｊ、　Ｂｉａｌ、 　Ｃｈｅｍ、。 １９８７、２Ｇ２（２）、　７８５−７９４゜２、　Ｓ、Ｃ１ａｒｋｅ、［ｎｔ 、Ｊ、Ｐｅｐｔ、Ｐｒｐｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、。 ＋９８７．３０．８０８−８２１゜ ３、Ａ、Ａ、Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ、５ｃｉｅｎｃｅ、＋９８８．２４０゜１９ １−１９３゜ ４、　Ａ、Ｔｒａｍａｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８Ｇ、２ ３４゜１５６６、　Ｒ，Ｓｕｇａｓａｗａｒａ、λ１．　Ｐｏｗｅｌｌ、ｅｌ　 ａｌ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。 ５ｏｃ１．　＋９８７．１０９．２１７４゜５、　Ｄ、　Ｙ、　Ｊａｃｋｓｏｎ 　ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、。 １９８８、１＋０４８４１；　Ｄ、　Ｈｉｌｖｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐ、Ｎ、 Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ。 １９８８、８５．４９５３゜ ６、　Ａ、　Ｄ、　Ｎａｐｐｅｒ、　Ｓ、　Ｊ、　Ｂｅｎｋｏｖｉｃ、　ｅｔａ ｌ。 ５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８７．２３７．１０４１゜７、　Ｂ、Ｌ、　Ｉｖｅｒｓ ｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ。 ５ｃｉｅｎｃｅ、　！９８９．２３４．１１８４−１１８７゜８、５ｏｃｈｅｒ 、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ、　＋９８７．８４゜８８２９− ８８３３゜ ９、　Ｌａ５ｋｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ、　＋９８７．５０．９７５− ９８５゜１０、Ｍ、　Ｊ、　Ｄａｒｓｌｅｙ　ａｎｄ　Ａ、　Ｒ，Ｒｅｅｓ、　 ＥＡＪＢＯＪ、　。 ＋９８５．４．３８３−３９２゜ Ｉｌ、Ｒ，Ｃ，Ｒ，Ｃ，５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ　＆　Ｓ、　Ｃ１ａｒｅｋ、　Ｊ 。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、１９８９．２６４゜１２、　Ｒ，Ｌｕｒａ　ａｎｄ 　Ｖ、５ｃｈｉｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。 ＋９８９．　２７．　７６７１−７７゜６３０−６３５゜ １８、　Ｃ，ｖａｎ　ｄｅｒ　Ａｕ＋ｖｅｒａ　ａｎｄ　Ｍ、Ｔ、０．　Ａｎｔ ｅｕｖｉｕｓ。 ［ｎｔ、Ｊ、Ｒｅｐｔ、Ｐｒｏｔ、Ｒｅｓ、、１９８８．　３１．　１８６−１ ９１゜８１２０゜ ｐ７３０　（１９８０）。 ２４、　Ｒ，Ｎ、５ｃｒｉｂｎｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９７Ｇ）３８５３−３８５Ｇ。 Ｌｅｊｊｅｒｓ　２７．　４４３７−４４４０（１９８（ｉ）。 国際調査報告 ’−”””’　ＰＣ丁１０５９０１０３２２６ン ０発　明　者　マツセイ、リチャード　アメコ− 合衆国２０８１４　メリーランド州ベセスダ、　１３０５エヌ、ブッレ　ロード 　５２２５ 合衆国２０８７４　メリーランド州ジャーマンタウン、アイラニー　サークル　 １２１１６ 合衆国０１００２　メリーランド州ボトマツク、キャンドルラーン　１０９２１ 合衆国２０８５１　メリーランド州ロックビル、タルツクストレーン　１２９０ ５ リカ合衆国２０８５２　メリーランド州ロックビル、プレリアント　５

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．速度上昇抗体を引き出すための抗原であって、前記抗原は準安定結合をもつ ハプテンを含む抗原。
2. ２．準安定結合部位での目的の基質の反応速度を上昇できる抗体を引き出すため の抗原であって、前記抗原は前記準安定結合部位またはその近傍で目的の前記基 質をまねるハプテンを含む抗体。
3. ３．準安定結合が、ＸおよびＹがいずれかのアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ、ＡＳＰ −Ｘ、ＧＬＮ−Ｘ、ＧＬＵ−Ｘ、ＬＹＳ−Ｘ、およびＨＩＳ−Ｙ−Ｘからなるグ ループからなるグループから選択される請求項２に記載の抗原。
4. ４．前記準安定結合部位またはその近傍でアミノ酸配列と免疫学的に交差反応す るハプテンを含む請求項２に記載の抗原。
5. ５．前記ハプテンが少なくとも２個のアミノ酸のアミノ酸配列からなる請求項２ に記載の抗原。
6. ６．請求項１または２に記載の抗原により引き出される抗体。
7. ７．目的の基質の準安定持合の修飾速度を上昇させる抗体であって、 （ａ）修飾される特異的準安定結合を選択すること；（ｂ）前記準安定結合部位 またはその近傍で、前記基質をまねるハプテンを含む抗原を選択すること；（ｃ ）前記抗原に抗体産生能のある細胞をさらし、それにより抗体産生細胞を産出す ること；（ｄ）前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それにより それぞれが単クローン抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を産出すること ；および（ｅ）修飾される準安定結合部位またはその近傍のエピトープに結合し 、前記準安定結合の修飾速度を上昇させる単クローン抗体を同定するために前記 の複数の単クローン抗体をスクリーニングすることの段階を含む過程により調製 される前記抗体。
8. ８．前記準安定結合が、ＸおよびＹがいずれかのアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ、Ａ ＳＰ−Ｘ、ＧＬＮ−Ｘ、ＧＬＵ−Ｘ、ＬＹＳ−Ｘ、およびＨＩＳ−Ｙ−Ｘからな るグループから選択される請求項７に記載の抗体。
9. ９．前記準安定待合の同一性が、技術的に既知の条件下で目的の基質を修飾し、 そのような修飾で得られる産物を解析することにより決定される請求項７に記載 の抗体。
10. １０． （ａ）目的のタンパク質またはペプチド分子基質中に切断または形成される特異 的な準安定結合を選択すること； （ｂ）前記準安定結合部位またはその近傍で前記基質をまねるハプテンを含む抗 原を選択すること；（ｃ）抗体産生能のある細胞を前記抗原にさらし、それによ り抗体産生細胞を産出すること；（ｄ）前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑 種形成させ、それによりそれぞれが単クローン抗体を産生する複数のハイブリド ーマ細胞を産出すること；および（ｅ）前記準安定結合の修飾速度を上昇させる ように修飾される準安定結合部位またはその近傍のエピトープに結合する単クロ ーン抗体を同定するために前記の複数の単クローン抗体をスクリーニングするこ とという段階を含む、目的の準安定結合の切断または形成速度を上昇させる抗体 を調製する方法。
11. １１．抗体が特異的準安定結合部位またはその近傍のエピトープで基質に結合し 、反応速度を上昇させるのに十分な条件下で、前記抗体と前記基質を接触させる ことを含む目的のタンパク質またはペプチド分子基質の中で前記特異的準安定結 合の修飾速度を上昇させる方法。
12. １２．抗体が特異的準安定結合部位またはその近傍のエピトープで基質に結合し 、それにより反応速度を上昇させるのに十分な条件下で、効果的な量の前記抗体 と前記基質を接触させることを含む、目的のタンパク質またはペプチド分子基質 の中で前記特異的準安定結合の修飾速度を上昇させる方法であって、前記抗体は （ａ）修飾される特異的準安定結合を選択すること；（ｂ）前記準安定結合部位 またはその近傍で前記基質をまねるハプテンを含む抗原を選択すること；（ｃ） 抗体産生能のある細胞を前記抗原にさらし、それにより抗体産生細胞を産出する こと；（ｄ）前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と雑種形成させ、それによりそ れぞれが単クローン抗体を産生する複数のハイブリドーマ細胞を産出すること； および（ｅ）修飾される準安定結合部位またはその近傍のエピトープに結合する 単クローン抗体を同定するために前記の複数の単クローン抗体をスクリーニング するという方法により産生されたものである方法。
13. １３．修飾される目的のタンパク質またはペプチド分子基質が、ＸおよびＹがい ずれかのアミノ酸であるＡＳＮ−Ｘ、ＡＳＰ−Ｘ、ＧＬＮ−Ｘ、ＧＬＵ−Ｘ、Ｌ ＹＳ−ＸおよびＨＩＳ−Ｙ−Ｘからなるグループから選択されるアミノ酸配列を 含む請求項１２に記載の方法。