JPH06100591A - ペプチド、それらから誘導される抗体並びにその抗体を含有する抗ニュ−カッスル病薬 - Google Patents
ペプチド、それらから誘導される抗体並びにその抗体を含有する抗ニュ−カッスル病薬Info
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Classifications
-
- Y02A50/407—
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ニューカッスル病ウイルス感染及び感染の伝
播を阻止するような有効かつ安全なニューカッスル病
（家禽ペスト）の感染予防薬、発病予防薬又は治療薬を
提供する。 【構成】 本発明は、配列表配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列において、６番目のグリシン残基から１１番目
のアルギニン残基までのアミノ酸配列を含み、かつ６〜
１５個のアミノ酸残基からなるペプチド、該ペプチドか
ら誘導される抗体及びその抗体を有効成分として含有す
る抗ニューカッスル病薬に関する。
播を阻止するような有効かつ安全なニューカッスル病
（家禽ペスト）の感染予防薬、発病予防薬又は治療薬を
提供する。 【構成】 本発明は、配列表配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列において、６番目のグリシン残基から１１番目
のアルギニン残基までのアミノ酸配列を含み、かつ６〜
１５個のアミノ酸残基からなるペプチド、該ペプチドか
ら誘導される抗体及びその抗体を有効成分として含有す
る抗ニューカッスル病薬に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド、それらから
誘導される抗体並びにその抗体を有効成分として含有す
る抗ニューカッスル病薬に関する。
誘導される抗体並びにその抗体を有効成分として含有す
る抗ニューカッスル病薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】しばしば「家禽ペスト」とも称されるニ
ューカッスル病は、家禽を襲う最も重大な病気の一つで
ある。原因となる病原体はパラミキソウイルスに属する
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ウイルス
感染はしばしば麻痺および死につながる重篤な神経系異
常を伴う呼吸器障害を引き起こし、１鶏舎に万の単位で
飼育されるニワトリに次々と伝播して家禽飼育事業に深
刻な経済的影響を及ぼす。本ウイルス病に対してはニュ
ーカッスル病不活化予防液（佐藤株、石井株）や生ウイ
ルス予防液（Ｂ１株）などのワクチンが調製され、実用
化されている。
ューカッスル病は、家禽を襲う最も重大な病気の一つで
ある。原因となる病原体はパラミキソウイルスに属する
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ウイルス
感染はしばしば麻痺および死につながる重篤な神経系異
常を伴う呼吸器障害を引き起こし、１鶏舎に万の単位で
飼育されるニワトリに次々と伝播して家禽飼育事業に深
刻な経済的影響を及ぼす。本ウイルス病に対してはニュ
ーカッスル病不活化予防液（佐藤株、石井株）や生ウイ
ルス予防液（Ｂ１株）などのワクチンが調製され、実用
化されている。
【０００３】しかしながら、前記不活化予防液では不活
化が不十分であったり、防腐剤やアジュバント等の添加
物が原因となる事故が、また、生ウイルス予防液では生
ワクチンウイルス株の病原性復帰や製造工程中の迷入微
生物による事故が、しばしば発生している。従ってウイ
ルスの感染によるニューカッスル病の感染予防、発病予
防或は治療の方策として、より有効かつ安全な手段を提
供することが求められている。
化が不十分であったり、防腐剤やアジュバント等の添加
物が原因となる事故が、また、生ウイルス予防液では生
ワクチンウイルス株の病原性復帰や製造工程中の迷入微
生物による事故が、しばしば発生している。従ってウイ
ルスの感染によるニューカッスル病の感染予防、発病予
防或は治療の方策として、より有効かつ安全な手段を提
供することが求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＮＤＶは、感染細胞に
細胞融合を起こし、巨核細胞を形成する特徴を持ってい
るが、この融合現象はウイルス外膜上に存在する糖蛋白
質であるＦ蛋白により引き起こされる。Ｆ蛋白は分子量
約６８ｋｄの前駆体（Ｆ０）として産生された後、トリ
プシン様の宿生内プロテアーゼによる限定分解を受けて
開裂し、Ｆ１（５６ｋｄ）とＦ２（１２ｋｄ）の２つの
ジスルフィド結合ポリペプチドを形成して初めて生物活
性を発現することが知られている（Ｎａｇａｉ Ｙ．
ら、ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）７２巻、４９４〜
５０８頁（１９７６年））。限定分解認識部位のアミノ
酸配列は、細胞融合を引き起こすウイルス間でよく保存
されており、ＮＤＶにおいても強毒株、弱毒株を問わ
ず、非常に相同性が高いことが示されている（Ｒ．Ｌ．
Ｇｌｉｃｋｍａｎら、ジャーナル・オブ・ビロロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６２巻、
３５４〜３５６頁（１９８８年）、Ｎ．Ｓ．Ｍｉｌｌａ
ｒら、ジャーナル・オブ・ジエネラル・ビロロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）６９巻、６１３〜６２０頁（１９８８年））。
細胞融合を起こし、巨核細胞を形成する特徴を持ってい
るが、この融合現象はウイルス外膜上に存在する糖蛋白
質であるＦ蛋白により引き起こされる。Ｆ蛋白は分子量
約６８ｋｄの前駆体（Ｆ０）として産生された後、トリ
プシン様の宿生内プロテアーゼによる限定分解を受けて
開裂し、Ｆ１（５６ｋｄ）とＦ２（１２ｋｄ）の２つの
ジスルフィド結合ポリペプチドを形成して初めて生物活
性を発現することが知られている（Ｎａｇａｉ Ｙ．
ら、ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）７２巻、４９４〜
５０８頁（１９７６年））。限定分解認識部位のアミノ
酸配列は、細胞融合を引き起こすウイルス間でよく保存
されており、ＮＤＶにおいても強毒株、弱毒株を問わ
ず、非常に相同性が高いことが示されている（Ｒ．Ｌ．
Ｇｌｉｃｋｍａｎら、ジャーナル・オブ・ビロロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６２巻、
３５４〜３５６頁（１９８８年）、Ｎ．Ｓ．Ｍｉｌｌａ
ｒら、ジャーナル・オブ・ジエネラル・ビロロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）６９巻、６１３〜６２０頁（１９８８年））。
【０００５】Ｆ１ポリペプチドアミノ末端は疎水性に富
む部位であり、ウイルスはこの部分を介して標的細胞の
細胞膜と融合を起こす。このアミノ末端に相当する合成
ペプチド或はその類似体がパラミキソウイルスに属する
センダイウイルスや麻疹ウイルスの膜融合を抑制するこ
とが示されている（Ｓ．Ｃ．Ｈ．Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒ
ｒｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ 著、「プロブレン
ズ・オブ・アンチバイラル・セラピィ」（Ｐｒｏｂｌｅ
ｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）、
１３−３４頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８３年）。
む部位であり、ウイルスはこの部分を介して標的細胞の
細胞膜と融合を起こす。このアミノ末端に相当する合成
ペプチド或はその類似体がパラミキソウイルスに属する
センダイウイルスや麻疹ウイルスの膜融合を抑制するこ
とが示されている（Ｓ．Ｃ．Ｈ．Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒ
ｒｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ 著、「プロブレン
ズ・オブ・アンチバイラル・セラピィ」（Ｐｒｏｂｌｅ
ｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）、
１３−３４頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８３年）。
【０００６】また、Ｆ蛋白に対するウサギ抗血清がウイ
ルスと標的細胞との膜融合を阻止し、感染の拡大を抑制
することが同じパラミキソウイルスに属するパラインフ
ルエンザウイルス、シミアンウイルス５（ＳＶ５）に対
してｉｎ Ｖｉｔｒｏで示されている（Ｄ．Ｃ．Ｍｅｒ
ｚら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
シン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１５１巻、２７５−２８８頁、
（１９８０年））。しかし、ウイルスの中和に関与する
Ｆ蛋白上の抗原認識部位や感染防御の機構は明らかにさ
れておらず、またＮＤＶに関してはＦ蛋白を認識する抗
体の有効性は確認されていない。
ルスと標的細胞との膜融合を阻止し、感染の拡大を抑制
することが同じパラミキソウイルスに属するパラインフ
ルエンザウイルス、シミアンウイルス５（ＳＶ５）に対
してｉｎ Ｖｉｔｒｏで示されている（Ｄ．Ｃ．Ｍｅｒ
ｚら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
シン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１５１巻、２７５−２８８頁、
（１９８０年））。しかし、ウイルスの中和に関与する
Ｆ蛋白上の抗原認識部位や感染防御の機構は明らかにさ
れておらず、またＮＤＶに関してはＦ蛋白を認識する抗
体の有効性は確認されていない。
【０００７】本発明においては、ＮＤＶのＦ蛋白の限定
分解認識部位に相当するポリペプチドに着目し、それら
を認識する抗体を作製することにより該蛋白の開裂を阻
害し、結果としてウイルス感染及び感染の伝播を阻止す
る有効かつ安全なＮＤＶ感染予防薬、発病予防薬又は治
療薬を提供することを目的とする。
分解認識部位に相当するポリペプチドに着目し、それら
を認識する抗体を作製することにより該蛋白の開裂を阻
害し、結果としてウイルス感染及び感染の伝播を阻止す
る有効かつ安全なＮＤＶ感染予防薬、発病予防薬又は治
療薬を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＤＶの
Ｆ蛋白上にあるトリプシンと相互作用を有すると推定さ
れる一定のペプチド部分を合成し、該ペプチドから誘導
された抗体がＦ蛋白の開裂を阻害してＮＤＶの増殖を抑
制しうるとの知見を得て、本発明を完成した。
Ｆ蛋白上にあるトリプシンと相互作用を有すると推定さ
れる一定のペプチド部分を合成し、該ペプチドから誘導
された抗体がＦ蛋白の開裂を阻害してＮＤＶの増殖を抑
制しうるとの知見を得て、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、配列表配列番号１で
示されるアミノ酸配列において、６番目のグリシン残基
から１１番目のアルギニン残基までのアミノ酸配列を含
み、かつ６〜１５個のアミノ酸残基からなるペプチド、
該ペプチドから誘導される抗体及びその抗体を有効成分
として含有する抗ニューカッスル病薬に関する。
示されるアミノ酸配列において、６番目のグリシン残基
から１１番目のアルギニン残基までのアミノ酸配列を含
み、かつ６〜１５個のアミノ酸残基からなるペプチド、
該ペプチドから誘導される抗体及びその抗体を有効成分
として含有する抗ニューカッスル病薬に関する。
【００１０】本発明のペプチドには、後述するキャリア
蛋白質との連結のために、アミノ酸配列のＣ末端にシス
テインが付加されてもよい。本発明のペプチドの具体例
としては、配列表配列番号２、３又は４で示されるペプ
チドなどが挙げられる。
蛋白質との連結のために、アミノ酸配列のＣ末端にシス
テインが付加されてもよい。本発明のペプチドの具体例
としては、配列表配列番号２、３又は４で示されるペプ
チドなどが挙げられる。
【００１１】本発明のペプチドは、従来の液相法、固相
法などの方法で得ることができるが、より簡便には、固
相法による市販のペプチド合成機を用いて得ることが出
来る。
法などの方法で得ることができるが、より簡便には、固
相法による市販のペプチド合成機を用いて得ることが出
来る。
【００１２】固相法においては、ポリマー性の支持体に
前記ペプチドのＣ末端側から、そのアミノ酸残基に対応
したアミノ酸を縮合させ、ペプチド結合を形成させる。
縮合方法としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）法、酸無水物法、活性エステル法などの
方法を使用することが出来る。α−アミノ基の保護基と
してはｔ−ブトキシカルボニル（以下Ｂｏｃ）基又は９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下Ｆｍｏ
ｃ）基が使用できる。例えば、ペプチド自動合成装置を
用いて合成する時にはその装置のマニュアル指示に従い
適宜アミノ酸の性質を考慮して選択して合成するのが好
ましい。
前記ペプチドのＣ末端側から、そのアミノ酸残基に対応
したアミノ酸を縮合させ、ペプチド結合を形成させる。
縮合方法としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）法、酸無水物法、活性エステル法などの
方法を使用することが出来る。α−アミノ基の保護基と
してはｔ−ブトキシカルボニル（以下Ｂｏｃ）基又は９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下Ｆｍｏ
ｃ）基が使用できる。例えば、ペプチド自動合成装置を
用いて合成する時にはその装置のマニュアル指示に従い
適宜アミノ酸の性質を考慮して選択して合成するのが好
ましい。
【００１３】液相法にて合成する時には固相法と同様、
通常のペプチド合成法に従って行うことが出来る。公知
の方法として例えば泉屋信夫他著、ペプチド合成の基礎
と実験、丸善（株）、１９７５年などに記載されている
方法等が挙げられる。
通常のペプチド合成法に従って行うことが出来る。公知
の方法として例えば泉屋信夫他著、ペプチド合成の基礎
と実験、丸善（株）、１９７５年などに記載されている
方法等が挙げられる。
【００１４】次に保護基および支持体からの脱離は、α
−アミノ基保護基にＢｏｃ基を用いる時には、スカベン
ジャーを含むフッ化水素、トリフルオロメタンスルホン
酸などを用いて行われる。スカベンジャーとしては、チ
オアニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド
などが用いられる。またα−アミノ基保護基にＦｍｏｃ
基を用いる時には、フェノールとトリフルオロ酢酸を含
む混合液などを用いることが出来る。
−アミノ基保護基にＢｏｃ基を用いる時には、スカベン
ジャーを含むフッ化水素、トリフルオロメタンスルホン
酸などを用いて行われる。スカベンジャーとしては、チ
オアニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド
などが用いられる。またα−アミノ基保護基にＦｍｏｃ
基を用いる時には、フェノールとトリフルオロ酢酸を含
む混合液などを用いることが出来る。
【００１５】ペプチドの精製には一般的に使用されるイ
オン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィー等を単独に
或は組み合わせて用いることによって行うことが出来
る。精製されたペプチドのアミノ酸組成は、アミノ酸分
析装置により容易に測定することが出来る。
オン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィー等を単独に
或は組み合わせて用いることによって行うことが出来
る。精製されたペプチドのアミノ酸組成は、アミノ酸分
析装置により容易に測定することが出来る。
【００１６】本発明のペプチドは、主に抗体を誘導する
目的で使用される。
目的で使用される。
【００１７】本発明の抗体は、前記ペプチドから誘導さ
れ、従って該ペプチドと特異的に反応する。また該抗体
は、ニューカッスル病ウイルスの外膜上に存在するＦ蛋
白のトリプシン様プロテアーゼによる開裂を特異的に阻
害するものである。本発明の抗体にはモノクローナル抗
体或はポリクローナル抗体が含まれる。
れ、従って該ペプチドと特異的に反応する。また該抗体
は、ニューカッスル病ウイルスの外膜上に存在するＦ蛋
白のトリプシン様プロテアーゼによる開裂を特異的に阻
害するものである。本発明の抗体にはモノクローナル抗
体或はポリクローナル抗体が含まれる。
【００１８】本発明の抗体は、以下の方法によって製造
することができる。すなわち、免疫された動物の血清か
ら免疫グロブリン画分を得、次いで免疫グロブリン画分
をアフィニティークロマトグラフィーにて精製すること
によって製造される。免疫される動物としてはウサギ、
ヤギ、マウス、ラットなどが利用できる。免疫は、本発
明の前記ペプチドをキャリア蛋白質と連結して得られる
免疫原を、フロイントアジュバントと混合し、動物の皮
下、筋肉内又は腹腔内に１回に０．０５〜５０ｍｇ、７
〜３０日間隔で２〜１５週間投与することによって行わ
れる。最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から血液を採
取し、通常行われる方法により血清部分が分離、取得さ
れる。血清から免疫グロブリン画分を得る方法として
は、公知の硫安分画法が用いられる。アフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製では、抗原である本発明の
前記ペプチドが使用され、該ペプチドに結合する抗体の
みが分離、取得される。
することができる。すなわち、免疫された動物の血清か
ら免疫グロブリン画分を得、次いで免疫グロブリン画分
をアフィニティークロマトグラフィーにて精製すること
によって製造される。免疫される動物としてはウサギ、
ヤギ、マウス、ラットなどが利用できる。免疫は、本発
明の前記ペプチドをキャリア蛋白質と連結して得られる
免疫原を、フロイントアジュバントと混合し、動物の皮
下、筋肉内又は腹腔内に１回に０．０５〜５０ｍｇ、７
〜３０日間隔で２〜１５週間投与することによって行わ
れる。最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から血液を採
取し、通常行われる方法により血清部分が分離、取得さ
れる。血清から免疫グロブリン画分を得る方法として
は、公知の硫安分画法が用いられる。アフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製では、抗原である本発明の
前記ペプチドが使用され、該ペプチドに結合する抗体の
みが分離、取得される。
【００１９】モノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合
法によって製造することができる。
法によって製造することができる。
【００２０】本発明の抗体は、後記試験例に示される通
り、ニューカッスル病ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルスの産生を阻害することから、感染予防薬、
発病予防薬又は治療薬として有効である。本発明の抗体
を有効成分として含有するニューカッスル病の感染予防
薬、発病予防薬又は治療薬は、担体又は希釈剤などと共
に例えばメンブレンフィルターによる除菌操作の後に注
射剤、経鼻噴霧剤などとして家禽に投与される。
り、ニューカッスル病ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルスの産生を阻害することから、感染予防薬、
発病予防薬又は治療薬として有効である。本発明の抗体
を有効成分として含有するニューカッスル病の感染予防
薬、発病予防薬又は治療薬は、担体又は希釈剤などと共
に例えばメンブレンフィルターによる除菌操作の後に注
射剤、経鼻噴霧剤などとして家禽に投与される。
【００２１】以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２２】
実施例１ ペプチドの調製 （１）配列表配列番号２で示されるペプチドの合成。
【００２３】カルボキシ末端から出発する段階的固相合
成法により、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＰＡＭ（ＰＡＭ：４−
（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル）樹脂７１
６ｍｇ（Ｃｙｓ含量０．７ｍＭ／ｇ）を原料としてペプ
チド自動合成装置（アプライドバイオシステム社製４３
０Ａ）を用いて固相合成法によって合成した。合成手順
については、本装置の合成マニュアル指示に従い適宜ア
ミノ酸の性質を考慮して行なった。本ペプチドの合成は
常法に従い、前記アミノ酸配列に従ってＣ末端Ｃｙｓか
ら順次７個のＬ体アミノ酸をそれぞれ２ｍＭずつ反応さ
せることによって１．４ｇの保護ペプチド樹脂を得た。
この反応に用いたアミノ酸の側鎖官能基の保護基として
は、Ａｒｇのグアニジノ基には２、４、６−トリメチル
ベンゼンスルホニル基、Ｃｙｓのメルカプト基にはｐ−
メトキシベンジル基を用いた。
成法により、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＰＡＭ（ＰＡＭ：４−
（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル）樹脂７１
６ｍｇ（Ｃｙｓ含量０．７ｍＭ／ｇ）を原料としてペプ
チド自動合成装置（アプライドバイオシステム社製４３
０Ａ）を用いて固相合成法によって合成した。合成手順
については、本装置の合成マニュアル指示に従い適宜ア
ミノ酸の性質を考慮して行なった。本ペプチドの合成は
常法に従い、前記アミノ酸配列に従ってＣ末端Ｃｙｓか
ら順次７個のＬ体アミノ酸をそれぞれ２ｍＭずつ反応さ
せることによって１．４ｇの保護ペプチド樹脂を得た。
この反応に用いたアミノ酸の側鎖官能基の保護基として
は、Ａｒｇのグアニジノ基には２、４、６−トリメチル
ベンゼンスルホニル基、Ｃｙｓのメルカプト基にはｐ−
メトキシベンジル基を用いた。
【００２４】乾燥後、この保護ペプチド樹脂１．４ｇを
０．７ｍｌのエタンジチオールと１．４ｍｌのチオアニ
ソールの混合液で氷冷下１０分間攪拌後、１４ｍｌのト
リフルオロ酢酸を加え１０分間攪拌した。この混合液の
中に１．４ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸を加え
１０分間攪拌後、さらに室温にて５０分間攪拌した。そ
の後、５０ｍｌの無水エーテルを加えて粗ペプチドを沈
澱させ、グラスフィルターにて粗ペプチドと脱離した樹
脂とを濾過した。グラスフィルター上の粗ペプチドに５
ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え、溶解後、このものに無
水エーテルを加えて粗ペプチドの沈澱を得た。このもの
を分離後、無水エーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥し
た。このようにして得られたペプチド２００ｍｇを高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて次のような条
件で精製した。カラムは逆相系ＯＤＳ（商品名：ＵＬＴ
ＲＯＮ Ｓ−Ｃ１８）で０．１％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリルにて直線グラジエント法（６０分間で
アセトニトリル１００％流量１０ｍｌ／分）により分
離、精製した。この条件でのペプチドの保持時間は２
４．２分であった。必要な溶出画分を濃縮後、凍結乾燥
することによって目的とするペプチド９０ｍｇを得た。
０．７ｍｌのエタンジチオールと１．４ｍｌのチオアニ
ソールの混合液で氷冷下１０分間攪拌後、１４ｍｌのト
リフルオロ酢酸を加え１０分間攪拌した。この混合液の
中に１．４ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸を加え
１０分間攪拌後、さらに室温にて５０分間攪拌した。そ
の後、５０ｍｌの無水エーテルを加えて粗ペプチドを沈
澱させ、グラスフィルターにて粗ペプチドと脱離した樹
脂とを濾過した。グラスフィルター上の粗ペプチドに５
ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え、溶解後、このものに無
水エーテルを加えて粗ペプチドの沈澱を得た。このもの
を分離後、無水エーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥し
た。このようにして得られたペプチド２００ｍｇを高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて次のような条
件で精製した。カラムは逆相系ＯＤＳ（商品名：ＵＬＴ
ＲＯＮ Ｓ−Ｃ１８）で０．１％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリルにて直線グラジエント法（６０分間で
アセトニトリル１００％流量１０ｍｌ／分）により分
離、精製した。この条件でのペプチドの保持時間は２
４．２分であった。必要な溶出画分を濃縮後、凍結乾燥
することによって目的とするペプチド９０ｍｇを得た。
【００２５】ペプチドのアミノ酸分析については６規定
塩酸で１１０℃２０時間加水分解した後、アミノ酸分析
装置Ｌ８５００（日立製作所製）にて測定した。 アミノ酸の分析結果
塩酸で１１０℃２０時間加水分解した後、アミノ酸分析
装置Ｌ８５００（日立製作所製）にて測定した。 アミノ酸の分析結果
【００２６】（２）配列表配列番号４で示されるペプチ
ドの合成 前記（１）と同様の方法によりペプチドの合成を行い更
に精製することにより（精製はＨＰＬＣの条件としてペ
プチドの保持時間は２８．４分）、目的とするペプチド
９０ｍｇを得た。 アミノ酸の分析結果
ドの合成 前記（１）と同様の方法によりペプチドの合成を行い更
に精製することにより（精製はＨＰＬＣの条件としてペ
プチドの保持時間は２８．４分）、目的とするペプチド
９０ｍｇを得た。 アミノ酸の分析結果
【００２７】実施例２ 抗ＮＤＶペプチド抗体の調製 （１）キャリア蛋白質へのペプチドの連結 キャリア蛋白質、キーホールリンペットヘモシアニン
（以下ＫＬＨ、カルバイオケミ社）に連結する際に、５
０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む１ｍｌの
リン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ＰＨ８．０）中に
実施例１（１）の方法により合成されたペプチド２０ｍ
ｇを溶解させた。ＫＬＨ９ｍｇを２０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液−０．１５Ｍナトリウム塩液（ＰＨ９．０）
に溶解させ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）１０
０μｌで溶液を中性付近に戻し、その液に対し、連結剤
であるスクシニル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ
レイト（以下ＳＭＰＢ、ピアス社）０．８ｍｇをジオキ
サンに溶解させた溶液を徐々に加えた。得られた混合液
を１時間撹拌した後、カラムクロマトグラフィにて精製
した。カラムはセファデックスＧ−２５（ファルマシア
社）を用い、生理食塩リン酸緩衝液（以下ＰＢＳ、２０
ｍＭリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）によ
り分離、精製した。
（以下ＫＬＨ、カルバイオケミ社）に連結する際に、５
０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む１ｍｌの
リン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ＰＨ８．０）中に
実施例１（１）の方法により合成されたペプチド２０ｍ
ｇを溶解させた。ＫＬＨ９ｍｇを２０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液−０．１５Ｍナトリウム塩液（ＰＨ９．０）
に溶解させ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）１０
０μｌで溶液を中性付近に戻し、その液に対し、連結剤
であるスクシニル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ
レイト（以下ＳＭＰＢ、ピアス社）０．８ｍｇをジオキ
サンに溶解させた溶液を徐々に加えた。得られた混合液
を１時間撹拌した後、カラムクロマトグラフィにて精製
した。カラムはセファデックスＧ−２５（ファルマシア
社）を用い、生理食塩リン酸緩衝液（以下ＰＢＳ、２０
ｍＭリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）によ
り分離、精製した。
【００２８】このように前もって処理されたペプチド液
を撹拌しながらキャリア蛋白質液を滴下し混合した。混
合液は室温で３時間穏かに撹拌した後ＰＢＳに対し一夜
透析した。
を撹拌しながらキャリア蛋白質液を滴下し混合した。混
合液は室温で３時間穏かに撹拌した後ＰＢＳに対し一夜
透析した。
【００２９】このように合成されたＫＬＨキャリア一連
結ペプチドについてポリアクリルアミド電気泳動を行
い、分子量の増加により確かに免疫原が作成されたこと
を確認した。各試料を１０ｍＭのＤＴＴを含有するＬａ
ｅｍｍｌｉ’ｓサンプル・バッファー（６２．５ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．０１％プロモフェニルブルー及び１０％グリ
セロール）に加え〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２
２７巻，６８０頁（１９７０）〕の方法に準じ８％の分
離用ゲルを用いて泳動を行った。分離用ゲル中の蛋白質
をクマシー・ブリリアント・ブルーで染色することによ
り確認した。
結ペプチドについてポリアクリルアミド電気泳動を行
い、分子量の増加により確かに免疫原が作成されたこと
を確認した。各試料を１０ｍＭのＤＴＴを含有するＬａ
ｅｍｍｌｉ’ｓサンプル・バッファー（６２．５ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．０１％プロモフェニルブルー及び１０％グリ
セロール）に加え〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２
２７巻，６８０頁（１９７０）〕の方法に準じ８％の分
離用ゲルを用いて泳動を行った。分離用ゲル中の蛋白質
をクマシー・ブリリアント・ブルーで染色することによ
り確認した。
【００３０】（２）試験動物の接種 前記実施例２（１）で得られたＫＬＨ連結ペプチド５０
０μｇ／１６０μｌをＰＢＳで希釈し、１：１の割合で
完全フロイントアジュバント（ＩＣＮイムノバイオロジ
カルズ社）と共に乳化した。続いて日本白色種ウサギ
（１．５ｋｇ、オス、清水実験材料株式会社）に２５０
μｇ／１ｍｌの乳化物を皮下注射により接種した。続い
て一週間間隔で２回完全フロイントアジュバントを用い
て接種を行い、さらに一週間間隔で４回不完全フロイン
トアジュバント（ナカライテスク社）を１：１で混合し
たＫＬＨ連結ペプチドを追加免疫注射した。最終免疫後
５日目に動物から採血した。血清を公知の硫安分画法
（５０％飽和硫安）にて精製し、血清中の免疫グロブリ
ン画分を得、これを部分精製物とした。このようにして
抗ペプチド抗体を含有する免疫グロブリン画分２８．３
ｍｇ／ｍｌを得た。前記実施例１（２）で得られたペプ
チドについても前記実施例２（１）及び（２）の場合と
同様に処理したところ同様な結果が得られ、以後これら
に対する抗体をそれぞれＦｃｌ−２およびＦｃｌ−１と
略祢する。
０μｇ／１６０μｌをＰＢＳで希釈し、１：１の割合で
完全フロイントアジュバント（ＩＣＮイムノバイオロジ
カルズ社）と共に乳化した。続いて日本白色種ウサギ
（１．５ｋｇ、オス、清水実験材料株式会社）に２５０
μｇ／１ｍｌの乳化物を皮下注射により接種した。続い
て一週間間隔で２回完全フロイントアジュバントを用い
て接種を行い、さらに一週間間隔で４回不完全フロイン
トアジュバント（ナカライテスク社）を１：１で混合し
たＫＬＨ連結ペプチドを追加免疫注射した。最終免疫後
５日目に動物から採血した。血清を公知の硫安分画法
（５０％飽和硫安）にて精製し、血清中の免疫グロブリ
ン画分を得、これを部分精製物とした。このようにして
抗ペプチド抗体を含有する免疫グロブリン画分２８．３
ｍｇ／ｍｌを得た。前記実施例１（２）で得られたペプ
チドについても前記実施例２（１）及び（２）の場合と
同様に処理したところ同様な結果が得られ、以後これら
に対する抗体をそれぞれＦｃｌ−２およびＦｃｌ−１と
略祢する。
【００３１】（３）免疫学的検定（ペプチド被覆プレー
トに対する抗ペプチド血清を用いる酵素的結合免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ））
トに対する抗ペプチド血清を用いる酵素的結合免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ））
【００３２】この試験では、本発明のペプチドにより動
物内で生成した抗血清がそのペプチドに特異的に結合す
ることを測定した。試験の結果、本発明のペプチドが免
疫原性を有し、試験動物内で抗体を誘発することが確め
られた。
物内で生成した抗血清がそのペプチドに特異的に結合す
ることを測定した。試験の結果、本発明のペプチドが免
疫原性を有し、試験動物内で抗体を誘発することが確め
られた。
【００３３】検定ではファルコン３９１２マイクロテス
トＩＩＩＴＭフレキシブルアッセイプレート（ベクトン
ディッキンソンラブウエア社）を用いた。このプレート
にＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌの濃度のペプチド５０μ
ｌを被覆し、そのプレートを３７℃で３０分インキュベ
ートした。その後プレートを倒立させ全ての穴を空に
し、ＲＩＡバッファー（ＰＢＳ／０．１％アジ化ナトリ
ウム、０．５％牛血清アルブミン）／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３回洗浄した。ペーパータオルの上で軽く叩
いて吸取りプレートを乾燥させた。プレートの吸取りの
後１００μｌのＲＩＡバッファーをそれぞれの穴に添加
し３７℃で３０分インキュベートした。その後前述の場
合と同様にプレートを洗浄し吸取った。
トＩＩＩＴＭフレキシブルアッセイプレート（ベクトン
ディッキンソンラブウエア社）を用いた。このプレート
にＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌの濃度のペプチド５０μ
ｌを被覆し、そのプレートを３７℃で３０分インキュベ
ートした。その後プレートを倒立させ全ての穴を空に
し、ＲＩＡバッファー（ＰＢＳ／０．１％アジ化ナトリ
ウム、０．５％牛血清アルブミン）／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３回洗浄した。ペーパータオルの上で軽く叩
いて吸取りプレートを乾燥させた。プレートの吸取りの
後１００μｌのＲＩＡバッファーをそれぞれの穴に添加
し３７℃で３０分インキュベートした。その後前述の場
合と同様にプレートを洗浄し吸取った。
【００３４】その後前記実施例２（２）の方法で得られ
た抗ペプチド抗体を含む免疫グロブリン画分を、調製し
た被覆プレート上で検定した。最初、免疫画分を１：５
０に希釈したのに続きＲＩＡバッファーでの連続２倍希
釈でペプチド抗原に対する抗体応答を検定した。
た抗ペプチド抗体を含む免疫グロブリン画分を、調製し
た被覆プレート上で検定した。最初、免疫画分を１：５
０に希釈したのに続きＲＩＡバッファーでの連続２倍希
釈でペプチド抗原に対する抗体応答を検定した。
【００３５】３７℃で３０分インキュベートした後、前
述の場合と同様にプレートを洗浄し、吸取った。その後
ＲＩＡバッファー中の１：４０００希釈ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧアルカリホスファターゼ（タゴ社）５０μｌをそれ
ぞれの穴に添加し、３７℃で３０分インキュベートし
た。その後前述の場合と同様にプレートを洗浄し吸取っ
た。ＤＥＡバッファー（１０％ジエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ９．８）／０．０２％アジ化ナトリウム、０．
０１％塩化マグネシウム６水和物）中、４ｍＭのｐ−ニ
トロフェニルホスフェイト（シグマ社）を５０μｌずつ
穴に添加した。１５分後２５μｌの１ＭＮａＯＨで酵素
反応を停止した。その後マイクロプレート読取り機（バ
イオラッド社、モデル２５５０ＥＩＡリーダー）を用い
４０５ｎｍで分光光度的にプレートを解析した。この結
果、希釈依存的に吸光度が減少したことから両ペプチド
に対するＦｃｌ−１、Ｆｃｌ−２それぞれの抗血清がペ
プチドに結合することを観測した。
述の場合と同様にプレートを洗浄し、吸取った。その後
ＲＩＡバッファー中の１：４０００希釈ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧアルカリホスファターゼ（タゴ社）５０μｌをそれ
ぞれの穴に添加し、３７℃で３０分インキュベートし
た。その後前述の場合と同様にプレートを洗浄し吸取っ
た。ＤＥＡバッファー（１０％ジエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ９．８）／０．０２％アジ化ナトリウム、０．
０１％塩化マグネシウム６水和物）中、４ｍＭのｐ−ニ
トロフェニルホスフェイト（シグマ社）を５０μｌずつ
穴に添加した。１５分後２５μｌの１ＭＮａＯＨで酵素
反応を停止した。その後マイクロプレート読取り機（バ
イオラッド社、モデル２５５０ＥＩＡリーダー）を用い
４０５ｎｍで分光光度的にプレートを解析した。この結
果、希釈依存的に吸光度が減少したことから両ペプチド
に対するＦｃｌ−１、Ｆｃｌ−２それぞれの抗血清がペ
プチドに結合することを観測した。
【００３６】（４）抗ペプチド血清の精製 ウイルス作用の検定を行うにあたっては、できるだけ他
のウイルス阻害因子を除外する為、アフィニティカラム
クロマトグラフィによる精製を行ってもよい。ここでは
ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ（バイオプ
ローブインターナショナル社）を用いた精製法を述べ
る。
のウイルス阻害因子を除外する為、アフィニティカラム
クロマトグラフィによる精製を行ってもよい。ここでは
ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ（バイオプ
ローブインターナショナル社）を用いた精製法を述べ
る。
【００３７】１５ｍｌの炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリ
ウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中、４０ｍｇのＫ
ＬＨを溶解させる。このＫＬＨ液に対し、１・５ｇの乾
燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ）
を液を攪拌しながら徐々に加え、その液を４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後３０ｍｌの炭酸ナトリウム−
重炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で、
続いて３０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．
２）でゲルを洗浄した。このようにして得られたＫＬＨ
結合ゲルは１５ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．２）に懸濁された。このＫＬＨ（キーホールリンペ
ットヘモシアニン）結合ゲル液に対し、０．３ｍｌのジ
オキサンに溶解した２０ｍｇのＳＭＰＢ（スクシニル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレイト）を混合し、
その混合液を室温で１時間穏かに攪拌した。その後３０
ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でＫＬＨ
−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。得られたＫＬＨ−ＳＭ
ＰＢ結合ゲルは未反応の水酸基を不活化する為に２０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する５０ｍｌのト
リス−塩酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に懸濁し、
４℃で６時間穏かに攪拌した。その後、以下の順でＫＬ
Ｈ−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。４０ｍｌの酢酸ナト
リウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．５）、４０ｍｌの酢
酸ナトリウムバッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ４．
５、０．５ＭＮａＣｌ）、４０ｍｌのトリス塩酸バッフ
ァー（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）、４０ｍｌのトリス塩酸
バッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．５ＭＮ
ａＣｌ）、最後に４０ｍｌのホウ酸バッファー食塩水
（２０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄
した。
ウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中、４０ｍｇのＫ
ＬＨを溶解させる。このＫＬＨ液に対し、１・５ｇの乾
燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ）
を液を攪拌しながら徐々に加え、その液を４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後３０ｍｌの炭酸ナトリウム−
重炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で、
続いて３０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．
２）でゲルを洗浄した。このようにして得られたＫＬＨ
結合ゲルは１５ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．２）に懸濁された。このＫＬＨ（キーホールリンペ
ットヘモシアニン）結合ゲル液に対し、０．３ｍｌのジ
オキサンに溶解した２０ｍｇのＳＭＰＢ（スクシニル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレイト）を混合し、
その混合液を室温で１時間穏かに攪拌した。その後３０
ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でＫＬＨ
−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。得られたＫＬＨ−ＳＭ
ＰＢ結合ゲルは未反応の水酸基を不活化する為に２０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する５０ｍｌのト
リス−塩酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に懸濁し、
４℃で６時間穏かに攪拌した。その後、以下の順でＫＬ
Ｈ−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。４０ｍｌの酢酸ナト
リウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．５）、４０ｍｌの酢
酸ナトリウムバッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ４．
５、０．５ＭＮａＣｌ）、４０ｍｌのトリス塩酸バッフ
ァー（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）、４０ｍｌのトリス塩酸
バッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．５ＭＮ
ａＣｌ）、最後に４０ｍｌのホウ酸バッファー食塩水
（２０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄
した。
【００３８】このようにして得られたＫＬＨ−ＳＭＰＢ
結合ゲルに、前記実施例２（２）で得られた抗ペプチド
抗体含有部分精製物約１５ｍｌを混合し、４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後グラスフィルターにてゲルと
抗ペプチド抗体含有液とを濾過、分離した。グラスフィ
ルター上のゲルに１０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー
食塩水（０．１５ＭＮａＣｌ）続いて１０ｍｌの２０ｍ
Ｍホウ酸バッファー食塩水（０．４ＭＮａＣｌ）を加え
ゲルを洗浄した。濾液と洗浄液は回収し、次の操作まで
４℃で貯蔵した。
結合ゲルに、前記実施例２（２）で得られた抗ペプチド
抗体含有部分精製物約１５ｍｌを混合し、４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後グラスフィルターにてゲルと
抗ペプチド抗体含有液とを濾過、分離した。グラスフィ
ルター上のゲルに１０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー
食塩水（０．１５ＭＮａＣｌ）続いて１０ｍｌの２０ｍ
Ｍホウ酸バッファー食塩水（０．４ＭＮａＣｌ）を加え
ゲルを洗浄した。濾液と洗浄液は回収し、次の操作まで
４℃で貯蔵した。
【００３９】次にＦＭＰ−アクティベーティドアビッド
ゲルＦに抗原ペプチドを結合させる。
ゲルＦに抗原ペプチドを結合させる。
【００４０】０．０５Ｍジチオスレイトールを含有する
２０ｍｌのリン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）
中に抗原ペプチド１６ｍｇを溶解させた。このペプチド
溶液に２ｇの乾燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドア
ビッドゲルＦ）を、液を攪拌しながら徐々に加え、添加
後、室温で１５分攪拌した。その後そのペプチド、ゲル
混合液を更に室温で８時間穏かに撹拌した後、５０ｍｌ
のリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）でゲルを
洗浄した。このようにして得られたペプチド結合ゲル
は、前記ＫＬＨ−ＳＭＰＢの場合と同様にして未反応の
水酸基を不活化する為に前記したように処理を行った。
その後前述の場合と同様にしてペプチド結合ゲルの洗浄
を行い、最後に２０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食
塩水（ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）に懸濁した。
２０ｍｌのリン酸バッファー（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）
中に抗原ペプチド１６ｍｇを溶解させた。このペプチド
溶液に２ｇの乾燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドア
ビッドゲルＦ）を、液を攪拌しながら徐々に加え、添加
後、室温で１５分攪拌した。その後そのペプチド、ゲル
混合液を更に室温で８時間穏かに撹拌した後、５０ｍｌ
のリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）でゲルを
洗浄した。このようにして得られたペプチド結合ゲル
は、前記ＫＬＨ−ＳＭＰＢの場合と同様にして未反応の
水酸基を不活化する為に前記したように処理を行った。
その後前述の場合と同様にしてペプチド結合ゲルの洗浄
を行い、最後に２０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食
塩水（ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）に懸濁した。
【００４１】最後に、先に述べた操作により回収した抗
ペプチド抗体含有液とペプチド結合ゲルとの結合及び抗
ペプチド抗体の溶出について述べる。作成したペプチド
結合ゲルと抗ペプチド抗体含有液を混合し、４℃で１０
時間穏かに攪拌した。これにより抗ペプチド抗体はペプ
チド結合ゲルに結合する。この抗ペプチド抗体結合ゲル
を適当なガラスカラム（１．２ｃｍφ×１８ｃｍ）に入
れ５０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ
８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄し、続いて５０ｍ
ｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ８．５、
０．４ＭＮａＣｌ）で、最後に２０ｍＭホウ酸バッファ
ー食塩水（ｐＨ８．０、０．４ＭＮａＣｌ）で洗浄し
た。最後の洗浄は溶出液を分光光度計で測定し、測定波
長２８０ｎｍで吸光度が０．０１〜０．０２になるまで
洗浄を行った。
ペプチド抗体含有液とペプチド結合ゲルとの結合及び抗
ペプチド抗体の溶出について述べる。作成したペプチド
結合ゲルと抗ペプチド抗体含有液を混合し、４℃で１０
時間穏かに攪拌した。これにより抗ペプチド抗体はペプ
チド結合ゲルに結合する。この抗ペプチド抗体結合ゲル
を適当なガラスカラム（１．２ｃｍφ×１８ｃｍ）に入
れ５０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ
８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄し、続いて５０ｍ
ｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ８．５、
０．４ＭＮａＣｌ）で、最後に２０ｍＭホウ酸バッファ
ー食塩水（ｐＨ８．０、０．４ＭＮａＣｌ）で洗浄し
た。最後の洗浄は溶出液を分光光度計で測定し、測定波
長２８０ｎｍで吸光度が０．０１〜０．０２になるまで
洗浄を行った。
【００４２】このようにして作成された抗ペプチド抗体
結合アフイニティーゲルカラムに０．１Ｍグリシン塩酸
バッファー（ｐＨ２．４）を供給し抗ペプチド抗体を溶
出した。溶出液は０．５ｍｌずつ回収され、１〜３０画
分中、画分番号１３〜１８の範囲に抗体成分が回収され
た。このようにして得られたアフィニティー精製抗ペプ
チド抗体中のＩｇＧ含有量は０．３ｍｇ／ｍｌであっ
た。
結合アフイニティーゲルカラムに０．１Ｍグリシン塩酸
バッファー（ｐＨ２．４）を供給し抗ペプチド抗体を溶
出した。溶出液は０．５ｍｌずつ回収され、１〜３０画
分中、画分番号１３〜１８の範囲に抗体成分が回収され
た。このようにして得られたアフィニティー精製抗ペプ
チド抗体中のＩｇＧ含有量は０．３ｍｇ／ｍｌであっ
た。
【００４３】実施例３ 精製抗ペプチド抗体の性状 本発明の精製抗ＮＤＶペプチド抗体の反応特異性に関
し、Ｆｃｌ−１を例にとって説明する。
し、Ｆｃｌ−１を例にとって説明する。
【００４４】精製Ｆｃｌ−１抗体は公知のウエスタンブ
ロッティング法により分析した結果、抗原に用いた合成
ペプチドと特異的に反応することが確認された。また本
抗体は精製ＮＤＶ（宮寺株：名古屋大学永井教授より分
与）の構成成分のうち、Ｆ蛋白と特異的に反応し、この
うち主としてＦ２蛋白部分を認識することが明らかとな
った。
ロッティング法により分析した結果、抗原に用いた合成
ペプチドと特異的に反応することが確認された。また本
抗体は精製ＮＤＶ（宮寺株：名古屋大学永井教授より分
与）の構成成分のうち、Ｆ蛋白と特異的に反応し、この
うち主としてＦ２蛋白部分を認識することが明らかとな
った。
【００４５】さらに、本抗体のＦ蛋白の開裂阻害作用を
以下の手順に従って調べた。２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞（幼若ハムスター腎
臓由来細胞株、ＡＴＣＣクローンＮｏ．ＣＣＬ−１０）
に、５％子牛血清を含むイーグルＭＥＭ培地（（財）微
生物病研究会製）で希釈したＮＤＶを感染させ、３７℃
で培養した。４時間後、３５Ｓラベルしたメチオニン
（１００μＣｉ／ｍｌ）と精製抗体（０．０３ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えてさらに培養を続けた。３０時間後、感染細
胞を集め、界面活性剤で溶解した後、ＮＤＶのＦ蛋白に
対するマウスモノクローナル抗体（北海道大学喜田教授
より分与）を用いて免疫沈降を行い、電気泳動法によっ
てＦ蛋白の開裂状態を分析した。精製抗体を加えない場
合、ほぼ全てのＦ０蛋白が開裂を受けているのに対し
て、精製抗体を加えた場合は、Ｆ０蛋白が明らかに開裂
阻害を受けていた。また、これらのＦ０蛋白は、主とし
て細胞表面に分布していた。以上から、ＮＤＶのＦ蛋白
の限定分解認識部位に対する抗体は感染細胞の表面にお
いてＦ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害する性質を有
することが示された。
以下の手順に従って調べた。２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞（幼若ハムスター腎
臓由来細胞株、ＡＴＣＣクローンＮｏ．ＣＣＬ−１０）
に、５％子牛血清を含むイーグルＭＥＭ培地（（財）微
生物病研究会製）で希釈したＮＤＶを感染させ、３７℃
で培養した。４時間後、３５Ｓラベルしたメチオニン
（１００μＣｉ／ｍｌ）と精製抗体（０．０３ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えてさらに培養を続けた。３０時間後、感染細
胞を集め、界面活性剤で溶解した後、ＮＤＶのＦ蛋白に
対するマウスモノクローナル抗体（北海道大学喜田教授
より分与）を用いて免疫沈降を行い、電気泳動法によっ
てＦ蛋白の開裂状態を分析した。精製抗体を加えない場
合、ほぼ全てのＦ０蛋白が開裂を受けているのに対し
て、精製抗体を加えた場合は、Ｆ０蛋白が明らかに開裂
阻害を受けていた。また、これらのＦ０蛋白は、主とし
て細胞表面に分布していた。以上から、ＮＤＶのＦ蛋白
の限定分解認識部位に対する抗体は感染細胞の表面にお
いてＦ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害する性質を有
することが示された。
【００４６】実施例４ ウイルスに対する作用の検定（中和試験）：ＮＤＶ感染
細胞からの感染性ウイルスの産生に対する阻害効果 ＮＤＶ感染細胞の培養液中にＦｃｌ−１を添加しながら
培養を行い、感染細胞からの新たな感染性ウイルスの産
生がどの程度阻害されるかを検定した。５％子牛血清を
含むイーグルＭＥＭ培地で希釈したＮＤＶ（７０プラー
ク形成単位／２００μｌ）を２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞に吸着（３７℃、１
時間）させた後、未吸着ウイルスを除去、洗浄し段階希
釈したＦｃｌ−１（終濃度０．１、０．０１、０３００
１及び０ｍｇ／ｍｌ）を含む同培地１ｍｌを加えて、５
％炭酸ガス下３７℃で培養した。２０時間後、培養上清
中のＮＤＶの感染価をプラーク法により算出した。結果
を図１に示す。
細胞からの感染性ウイルスの産生に対する阻害効果 ＮＤＶ感染細胞の培養液中にＦｃｌ−１を添加しながら
培養を行い、感染細胞からの新たな感染性ウイルスの産
生がどの程度阻害されるかを検定した。５％子牛血清を
含むイーグルＭＥＭ培地で希釈したＮＤＶ（７０プラー
ク形成単位／２００μｌ）を２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞に吸着（３７℃、１
時間）させた後、未吸着ウイルスを除去、洗浄し段階希
釈したＦｃｌ−１（終濃度０．１、０．０１、０３００
１及び０ｍｇ／ｍｌ）を含む同培地１ｍｌを加えて、５
％炭酸ガス下３７℃で培養した。２０時間後、培養上清
中のＮＤＶの感染価をプラーク法により算出した。結果
を図１に示す。
【００４７】ＮＤＶのＦ蛋白の開裂部位に対する抗体
は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗体非存在下の場合の
ウイルス産生量に対して約６０％の阻害効果を示した。
従って、本抗体は感染細胞から新たに感染力を持ったウ
イルスが産生されるステップに対しては細胞表面におい
てウイルスＦ蛋白の開裂を抑制することによって感染阻
害効果を示すことが明らかとなった。
は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗体非存在下の場合の
ウイルス産生量に対して約６０％の阻害効果を示した。
従って、本抗体は感染細胞から新たに感染力を持ったウ
イルスが産生されるステップに対しては細胞表面におい
てウイルスＦ蛋白の開裂を抑制することによって感染阻
害効果を示すことが明らかとなった。
【００４８】
【発明の効果】本発明の抗体は、細胞表面において、Ｎ
ＤＶのＦ蛋白、Ｆ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害
し、その結果として、ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルス粒子の産生を阻害する。従って、本抗体
は、ＮＤＶの感染宿生、主として家禽における本ウイル
スの感染予防薬或は発病予防薬として利用できるばかり
でなく、既に発病したものに対しても新たなウイルス産
生を抑制することによって、治療薬として利用できる。
同時に、先にも述べた通り、本抗体の抗原認識部位はＮ
ＤＶの異なるクローン間で良く保存されており、抗原性
の変化が生じる頻度は極めて低い部分と考えられること
から、ＮＤＶ変異株が出現した場合でも引き続き本抗体
が有効に作用して感染防御効果を発揮できる。
ＤＶのＦ蛋白、Ｆ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害
し、その結果として、ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルス粒子の産生を阻害する。従って、本抗体
は、ＮＤＶの感染宿生、主として家禽における本ウイル
スの感染予防薬或は発病予防薬として利用できるばかり
でなく、既に発病したものに対しても新たなウイルス産
生を抑制することによって、治療薬として利用できる。
同時に、先にも述べた通り、本抗体の抗原認識部位はＮ
ＤＶの異なるクローン間で良く保存されており、抗原性
の変化が生じる頻度は極めて低い部分と考えられること
から、ＮＤＶ変異株が出現した場合でも引き続き本抗体
が有効に作用して感染防御効果を発揮できる。
【００４９】
【図１】抗ペプチド抗体の感染性ＮＤＶ産生に対する阻
害効果を示す図である。
害効果を示す図である。
【００５０】
配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００５１】配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００５２】配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００５３】
配列番号：４ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年６月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド、それらから
誘導される抗体並びにその抗体を有効成分として含有す
る抗ニューカッスル病薬に関する。
誘導される抗体並びにその抗体を有効成分として含有す
る抗ニューカッスル病薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】しばしば「家禽ペスト」とも称されるニ
ューカッスル病は、家禽を襲う最も重大な病気の一つで
ある。原因となる病原体はパラミキソウイルスに属する
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ウイルス
感染はしばしば麻痺および死につながる重篤な神経系異
常を伴う呼吸器障害を引き起こし、１鶏舎に万の単位で
飼育されるニワトリに次々と伝播して家禽飼育事業に深
刻な経済的影響を及ぼす。本ウイルス病に対してはニュ
ーカッスル病不活化予防液（佐藤株、石井株）や生ウイ
ルス予防液（Ｂ１株）などのワクチンが調製され、実用
化されている。
ューカッスル病は、家禽を襲う最も重大な病気の一つで
ある。原因となる病原体はパラミキソウイルスに属する
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）である。ウイルス
感染はしばしば麻痺および死につながる重篤な神経系異
常を伴う呼吸器障害を引き起こし、１鶏舎に万の単位で
飼育されるニワトリに次々と伝播して家禽飼育事業に深
刻な経済的影響を及ぼす。本ウイルス病に対してはニュ
ーカッスル病不活化予防液（佐藤株、石井株）や生ウイ
ルス予防液（Ｂ１株）などのワクチンが調製され、実用
化されている。
【０００３】しかしながら、前記不活化予防液では不活
化が不十分であったり、防腐剤やアジュバント等の添加
物が原因となる事故が、また、生ウイルス予防液では生
ワクチンウイルス株の病原性復帰や製造工程中の迷入微
生物による事故が、しばしば発生している。従ってウイ
ルスの感染によるニューカッスル病の感染予防、発病予
防或は治療の方策として、より有効かつ安全な手段を提
供することが求められている。
化が不十分であったり、防腐剤やアジュバント等の添加
物が原因となる事故が、また、生ウイルス予防液では生
ワクチンウイルス株の病原性復帰や製造工程中の迷入微
生物による事故が、しばしば発生している。従ってウイ
ルスの感染によるニューカッスル病の感染予防、発病予
防或は治療の方策として、より有効かつ安全な手段を提
供することが求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＮＤＶは、感染細胞に
細胞融合を起こし、巨核細胞を形成する特徴を持ってい
るが、この融合現象はウイルス外膜上に存在する糖蛋白
質であるＦ蛋白により引き起こされる。Ｆ蛋白は分子量
約６８ｋｄの前駆体（Ｆ０）として産生された後、トリ
プシン様の宿生内プロテアーゼによる限定分解を受けて
開裂し、Ｆ１（５６ｋｄ）とＦ２（１２ｋｄ）の２つの
ジスルフィド結合ポリペプチドを形成して初めて生物活
性を発現することが知られている（Ｎａｇａｉ Ｙ．
ら、ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）７２巻、４９４〜
５０８頁（１９７６年））。限定分解認識部位のアミノ
酸配列は、細胞融合を引き起こすウイルス間でよく保存
されており、ＮＤＶにおいても強毒株、弱毒株を問わ
ず、非常に相同性が高いことが示されている（Ｒ．Ｌ．
Ｇｌｉｃｋｍａｎら、ジャーナル・オブ・ビロロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６２巻、
３５４〜３５６頁（１９８８年）、Ｎ．Ｓ．Ｍｉｌｌａ
ｒら、ジャーナル・オブ・ジエネラル・ビロロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏ１ｏｇ
ｙ）６９巻、６１３〜６２０頁（１９８８年））。
細胞融合を起こし、巨核細胞を形成する特徴を持ってい
るが、この融合現象はウイルス外膜上に存在する糖蛋白
質であるＦ蛋白により引き起こされる。Ｆ蛋白は分子量
約６８ｋｄの前駆体（Ｆ０）として産生された後、トリ
プシン様の宿生内プロテアーゼによる限定分解を受けて
開裂し、Ｆ１（５６ｋｄ）とＦ２（１２ｋｄ）の２つの
ジスルフィド結合ポリペプチドを形成して初めて生物活
性を発現することが知られている（Ｎａｇａｉ Ｙ．
ら、ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）７２巻、４９４〜
５０８頁（１９７６年））。限定分解認識部位のアミノ
酸配列は、細胞融合を引き起こすウイルス間でよく保存
されており、ＮＤＶにおいても強毒株、弱毒株を問わ
ず、非常に相同性が高いことが示されている（Ｒ．Ｌ．
Ｇｌｉｃｋｍａｎら、ジャーナル・オブ・ビロロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６２巻、
３５４〜３５６頁（１９８８年）、Ｎ．Ｓ．Ｍｉｌｌａ
ｒら、ジャーナル・オブ・ジエネラル・ビロロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏ１ｏｇ
ｙ）６９巻、６１３〜６２０頁（１９８８年））。
【０００５】Ｆ１ポリペプチドアミノ末端は疎水性に富
む部位であり、ウイルスはこの部分を介して標的細胞の
細胞膜と融合を起こす。このアミノ末端に相当する合成
ペプチド或はその類似体がパラミキソウイルスに属する
センダイウイルスや麻疹ウイルスの膜融合を抑制するこ
とが示されている（Ｓ．Ｃ．Ｈ．Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒ
ｒｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ 著、「プロブレン
ズ・オブ・アンチバイラル・セラピィ」（Ｐｒｏｂｌｅ
ｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）、
１３−３４頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８３年）。
む部位であり、ウイルスはこの部分を介して標的細胞の
細胞膜と融合を起こす。このアミノ末端に相当する合成
ペプチド或はその類似体がパラミキソウイルスに属する
センダイウイルスや麻疹ウイルスの膜融合を抑制するこ
とが示されている（Ｓ．Ｃ．Ｈ．Ｓｔｕａｒｔ−Ｈａｒ
ｒｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ 著、「プロブレン
ズ・オブ・アンチバイラル・セラピィ」（Ｐｒｏｂｌｅ
ｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）、
１３−３４頁、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８３年）。
【０００６】また、Ｆ蛋白に対するウサギ抗血清がウイ
ルスと標的細胞との膜融合を阻止し、感染の拡大を抑制
することが同じパラミキソウイルスに属するパラインフ
ルエンザウイルス、シミアンウイルス５（ＳＶ５）に対
してｉｎ ｖｉｔｒｏで示されている（Ｄ．Ｃ．Ｍｅｒ
ｚら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
シン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１５１巻、２７５−２８８頁、
（１９８０年））。しかし、ウイルスの中和に関与する
Ｆ蛋白上の抗原認識部位や感染防御の機構は明らかにさ
れておらず、またＮＤＶに関してはＦ蛋白を認識する抗
体の有効性は確認されていない。
ルスと標的細胞との膜融合を阻止し、感染の拡大を抑制
することが同じパラミキソウイルスに属するパラインフ
ルエンザウイルス、シミアンウイルス５（ＳＶ５）に対
してｉｎ ｖｉｔｒｏで示されている（Ｄ．Ｃ．Ｍｅｒ
ｚら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイ
シン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１５１巻、２７５−２８８頁、
（１９８０年））。しかし、ウイルスの中和に関与する
Ｆ蛋白上の抗原認識部位や感染防御の機構は明らかにさ
れておらず、またＮＤＶに関してはＦ蛋白を認識する抗
体の有効性は確認されていない。
【０００７】本発明においては、ＮＤＶのＦ蛋白の限定
分解認識部位に相当するポリペプチドに着目し、それら
を認識する抗体を作製することにより該蛋白の開裂を阻
害し、結果としてウイルス感染及び感染の伝播を阻止す
る有効かつ安全なＮＤＶ感染予防薬、発病予防薬又は治
療薬を提供することを目的とする。
分解認識部位に相当するポリペプチドに着目し、それら
を認識する抗体を作製することにより該蛋白の開裂を阻
害し、結果としてウイルス感染及び感染の伝播を阻止す
る有効かつ安全なＮＤＶ感染予防薬、発病予防薬又は治
療薬を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＤＶの
Ｆ蛋白上にあるトリプシンと相互作用を有すると推定さ
れる一定のペプチド部分を合成し、該ペプチドから誘導
された抗体がＦ蛋白の開裂を阻害してＮＤＶの増殖を抑
制しうるとの知見を得て、本発明を完成した。
Ｆ蛋白上にあるトリプシンと相互作用を有すると推定さ
れる一定のペプチド部分を合成し、該ペプチドから誘導
された抗体がＦ蛋白の開裂を阻害してＮＤＶの増殖を抑
制しうるとの知見を得て、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、配列表配列番号１で
示されるアミノ酸配列において、６番目のグリシン残基
から１１番目のアルギニン残基までのアミノ酸配列を含
み、かつ６〜１５個のアミノ酸残基からなるペプチド、
該ペプチドから誘導される抗体及びその抗体を有効成分
として含有する抗ニューカッスル病薬に関する。
示されるアミノ酸配列において、６番目のグリシン残基
から１１番目のアルギニン残基までのアミノ酸配列を含
み、かつ６〜１５個のアミノ酸残基からなるペプチド、
該ペプチドから誘導される抗体及びその抗体を有効成分
として含有する抗ニューカッスル病薬に関する。
【００１０】本発明のペプチドには、後述するキャリア
蛋白質との連結のために、アミノ酸配列のＣ末端にシス
テインが付加されてもよい。本発明のペプチドの具体例
としては、配列表配列番号２、３又は４で示されるペプ
チドなどが挙げられる。
蛋白質との連結のために、アミノ酸配列のＣ末端にシス
テインが付加されてもよい。本発明のペプチドの具体例
としては、配列表配列番号２、３又は４で示されるペプ
チドなどが挙げられる。
【００１１】本発明のペプチドは、従来の液相法、固相
法などの方法で得ることができるが、より簡便には、固
相法による市販のペプチド合成機を用いて得ることが出
来る。
法などの方法で得ることができるが、より簡便には、固
相法による市販のペプチド合成機を用いて得ることが出
来る。
【００１２】固相法においては、ポリマー性の支持体に
前記ペプチドのＣ末端側から、そのアミノ酸残基に対応
したアミノ酸を縮合させ、ペプチド結合を形成させる。
縮合方法としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）法、酸無水物法、活性エステル法などの
方法を使用することが出来る。α−アミノ基の保護基と
してはｔ−ブトキシカルボニル（以下Ｂｏｃ）基又は９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下Ｆｍｏ
ｃ）基が使用できる。例えば、ペプチド自動合成装置を
用いて合成する時にはその装置のマニュアル指示に従い
適宜アミノ酸の性質を考慮して選択して合成するのが好
ましい。
前記ペプチドのＣ末端側から、そのアミノ酸残基に対応
したアミノ酸を縮合させ、ペプチド結合を形成させる。
縮合方法としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイ
ミド（ＤＣＣ）法、酸無水物法、活性エステル法などの
方法を使用することが出来る。α−アミノ基の保護基と
してはｔ−ブトキシカルボニル（以下Ｂｏｃ）基又は９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下Ｆｍｏ
ｃ）基が使用できる。例えば、ペプチド自動合成装置を
用いて合成する時にはその装置のマニュアル指示に従い
適宜アミノ酸の性質を考慮して選択して合成するのが好
ましい。
【００１３】液相法にて合成する時には固相法と同様、
通常のペプチド合成法に従って行うことが出来る。公知
の方法として例えば泉屋信夫他著、ペプチド合成の基礎
と実験、丸善（株）、１９７５年などに記載されている
方法等が挙げられる。
通常のペプチド合成法に従って行うことが出来る。公知
の方法として例えば泉屋信夫他著、ペプチド合成の基礎
と実験、丸善（株）、１９７５年などに記載されている
方法等が挙げられる。
【００１４】次に保護基および支持体からの脱離は、α
−アミノ基保護基にＢｏｃ基を用いる時には、スカベン
ジャーを含むフッ化水素、トリフルオロメタンスルホン
酸などを用いて行われる。スカベンジャーとしては、チ
オアニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド
などが用いられる。またα−アミノ基保護基にＦｍｏｃ
基を用いる時には、フェノールとトリフルオロ酢酸を含
む混合液などを用いることが出来る。
−アミノ基保護基にＢｏｃ基を用いる時には、スカベン
ジャーを含むフッ化水素、トリフルオロメタンスルホン
酸などを用いて行われる。スカベンジャーとしては、チ
オアニソール、エタンジチオール、ジメチルスルフィド
などが用いられる。またα−アミノ基保護基にＦｍｏｃ
基を用いる時には、フェノールとトリフルオロ酢酸を含
む混合液などを用いることが出来る。
【００１５】ペプチドの精製には一般的に使用されるイ
オン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィー等を単独に
或は組み合わせて用いることによって行うことが出来
る。精製されたペプチドのアミノ酸組成は、アミノ酸分
析装置により容易に測定することが出来る。
オン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマト
グラフィー、逆相型液体クロマトグラフィー等を単独に
或は組み合わせて用いることによって行うことが出来
る。精製されたペプチドのアミノ酸組成は、アミノ酸分
析装置により容易に測定することが出来る。
【００１６】本発明のペプチドは、主に抗体を誘導する
目的で使用される。
目的で使用される。
【００１７】本発明の抗体は、前記ペプチドから誘導さ
れ、従って該ペプチドと特異的に反応する。また該抗体
は、ニューカッスル病ウイルスの外膜上に存在するＦ蛋
白のトリプシン様プロテアーゼによる開裂を特異的に阻
害するものである。本発明の抗体にはモノクローナル抗
体或はポリクローナル抗体が含まれる。
れ、従って該ペプチドと特異的に反応する。また該抗体
は、ニューカッスル病ウイルスの外膜上に存在するＦ蛋
白のトリプシン様プロテアーゼによる開裂を特異的に阻
害するものである。本発明の抗体にはモノクローナル抗
体或はポリクローナル抗体が含まれる。
【００１８】本発明の抗体は、以下の方法によって製造
することができる。すなわち、免疫された動物の血清か
ら免疫グロブリン画分を得、次いで免疫グロブリン画分
をアフィニティークロマトグラフィーにて精製すること
によって製造される。免疫される動物としてはウサギ、
ヤギ、マウス、ラットなどが利用できる。免疫は、本発
明の前記ペプチドをキャリア蛋白質と連結して得られる
免疫原を、フロイントアジュバントと混合し、動物の皮
下、筋肉内又は腹腔内に１回に０．０５〜５０ｍｇ、７
〜３０日間隔で２〜１５週間投与することによって行わ
れる。最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から血液を採
取し、通常行われる方法により血清部分が分離、取得さ
れる。血清から免疫グロブリン画分を得る方法として
は、公知の硫安分画法が用いられる。アフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製では、抗原である本発明の
前記ペプチドが使用され、該ペプチドに結合する抗体の
みが分離、取得される
することができる。すなわち、免疫された動物の血清か
ら免疫グロブリン画分を得、次いで免疫グロブリン画分
をアフィニティークロマトグラフィーにて精製すること
によって製造される。免疫される動物としてはウサギ、
ヤギ、マウス、ラットなどが利用できる。免疫は、本発
明の前記ペプチドをキャリア蛋白質と連結して得られる
免疫原を、フロイントアジュバントと混合し、動物の皮
下、筋肉内又は腹腔内に１回に０．０５〜５０ｍｇ、７
〜３０日間隔で２〜１５週間投与することによって行わ
れる。最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から血液を採
取し、通常行われる方法により血清部分が分離、取得さ
れる。血清から免疫グロブリン画分を得る方法として
は、公知の硫安分画法が用いられる。アフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製では、抗原である本発明の
前記ペプチドが使用され、該ペプチドに結合する抗体の
みが分離、取得される
【００１９】モノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合
法によって製造することができる。
法によって製造することができる。
【００２０】本発明の抗体は、後記試験例に示される通
り、ニューカッスル病ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルスの産生を阻害することから、感染予防薬、
発病予防薬又は治療薬として有効である。本発明の抗体
を有効成分として含有するニューカッスル病の感染予防
薬、発病予防薬又は治療薬は、担体又は希釈剤などと共
に例えばメンブレンフィルターによる除菌操作の後に注
射剤、経鼻噴霧剤などとして家禽に投与される。
り、ニューカッスル病ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルスの産生を阻害することから、感染予防薬、
発病予防薬又は治療薬として有効である。本発明の抗体
を有効成分として含有するニューカッスル病の感染予防
薬、発病予防薬又は治療薬は、担体又は希釈剤などと共
に例えばメンブレンフィルターによる除菌操作の後に注
射剤、経鼻噴霧剤などとして家禽に投与される。
【００２１】以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２２】
【実施例】 実施例１ ペプチドの調製 （１）配列表配列番号２で示されるペプチドの合成。
【００２３】カルボキシ末端から出発する段階的固相合
成法により、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＰＡＭ（ＰＡＭ：４−
（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル）樹脂７１
６ｍｇ（Ｃｙｓ含量０．７ｍＭ／ｇ）を原料としてペプ
チド自動合成装置（アプライドバイオシステム社製４３
０Ａ）を用いて固相合成法によって合成した。合成手順
については、本装置の合成マニュアル指示に従い適宜ア
ミノ酸の性質を考慮して行なった。本ペプチドの合成は
常法に従い、前記アミノ酸配列に従ってＣ末端Ｃｙｓか
ら順次７個のＬ体アミノ酸をそれぞれ２ｍＭずつ反応さ
せることによって１．４ｇの保護ペプチド樹脂を得た。
この反応に用いたアミノ酸の側鎖官能基の保護基として
は、Ａｒｇのグアニジノ基には２、４、６−トリメチル
ベンゼンスルホニル基、Ｃｙｓのメルカプト基にはｐ−
メトキシベンジル基を用いた。
成法により、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−ＰＡＭ（ＰＡＭ：４−
（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル）樹脂７１
６ｍｇ（Ｃｙｓ含量０．７ｍＭ／ｇ）を原料としてペプ
チド自動合成装置（アプライドバイオシステム社製４３
０Ａ）を用いて固相合成法によって合成した。合成手順
については、本装置の合成マニュアル指示に従い適宜ア
ミノ酸の性質を考慮して行なった。本ペプチドの合成は
常法に従い、前記アミノ酸配列に従ってＣ末端Ｃｙｓか
ら順次７個のＬ体アミノ酸をそれぞれ２ｍＭずつ反応さ
せることによって１．４ｇの保護ペプチド樹脂を得た。
この反応に用いたアミノ酸の側鎖官能基の保護基として
は、Ａｒｇのグアニジノ基には２、４、６−トリメチル
ベンゼンスルホニル基、Ｃｙｓのメルカプト基にはｐ−
メトキシベンジル基を用いた。
【００２４】乾燥後、この保護ペプチド樹脂１．４ｇを
０．７ｍｌのエタンジチオールと１．４ｍｌのチオアニ
ソールの混合液で氷冷下１０分間攪拌後、１４ｍｌのト
リフルオロ酢酸を加え１０分間攪拌した。この混合液の
中に１．４ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸を加え
１０分間攪拌後、さらに室温にて５０分間攪拌した。そ
の後、５０ｍｌの無水エーテルを加えて粗ペプチドを沈
澱させ、グラスフィルターにて粗ペプチドと脱離した樹
脂とを濾過した。グラスフィルター上の粗ペプチドに５
ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え、溶解後、このものに無
水エーテルを加えて粗ペプチドの沈澱を得た。このもの
を分離後、無水エーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥し
た。このようにして得られたペプチド２００ｍｇを高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて次のような条
件で精製した。カラムは逆相系ＯＤＳ（商品名：ＵＬＴ
ＲＯＮ Ｓ−Ｃ１８）で０．１％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリルにて直線グラジエント法（６０分間で
アセトニトリル１００％流量１０ｍｌ／分）により分
離、精製した。この条件でのペプチドの保持時間は２
４．２分であった。必要な溶出画分を濃縮後、凍結乾燥
することによって目的とするペプチド９０ｍｇを得た。
０．７ｍｌのエタンジチオールと１．４ｍｌのチオアニ
ソールの混合液で氷冷下１０分間攪拌後、１４ｍｌのト
リフルオロ酢酸を加え１０分間攪拌した。この混合液の
中に１．４ｍｌのトリフルオロメタンスルホン酸を加え
１０分間攪拌後、さらに室温にて５０分間攪拌した。そ
の後、５０ｍｌの無水エーテルを加えて粗ペプチドを沈
澱させ、グラスフィルターにて粗ペプチドと脱離した樹
脂とを濾過した。グラスフィルター上の粗ペプチドに５
ｍｌのトリフルオロ酢酸を加え、溶解後、このものに無
水エーテルを加えて粗ペプチドの沈澱を得た。このもの
を分離後、無水エーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥し
た。このようにして得られたペプチド２００ｍｇを高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて次のような条
件で精製した。カラムは逆相系ＯＤＳ（商品名：ＵＬＴ
ＲＯＮ Ｓ−Ｃ１８）で０．１％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリルにて直線グラジエント法（６０分間で
アセトニトリル１００％流量１０ｍｌ／分）により分
離、精製した。この条件でのペプチドの保持時間は２
４．２分であった。必要な溶出画分を濃縮後、凍結乾燥
することによって目的とするペプチド９０ｍｇを得た。
【００２５】ペプチドのアミノ酸分析については６規定
塩酸で１１０℃２０時間加水分解した後、アミノ酸分析
装置Ｌ８５００（日立製作所製）にて測定した。 アミノ酸の分析結果
塩酸で１１０℃２０時間加水分解した後、アミノ酸分析
装置Ｌ８５００（日立製作所製）にて測定した。 アミノ酸の分析結果
【００２６】（２）配列表配列番号４で示されるペプチ
ドの合成 前記（１）と同様の方法によりペプチドの合成を行い更
に精製することにより（精製はＨＰＬＣの条件としてペ
プチドの保持時間は２８．４分）、目的とするペプチド
９０ｍｇを得た。 アミノ酸の分析結果
ドの合成 前記（１）と同様の方法によりペプチドの合成を行い更
に精製することにより（精製はＨＰＬＣの条件としてペ
プチドの保持時間は２８．４分）、目的とするペプチド
９０ｍｇを得た。 アミノ酸の分析結果
【００２７】実施例２ 抗ＮＤＶペプチド抗体の調製 （１）キャリア蛋白質へのペプチドの連結 キャリア蛋白質、キーホールリンペットヘモシアニン
（以下ＫＬＨ、カルバイオケミ社）に連結する際に、５
０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む１ｍｌの
リン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）中に
実施例１（１）の方法により合成されたペプチド２０ｍ
ｇを溶解させた。ＫＬＨ９ｍｇを２０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液−０．１５Ｍナトリウム塩液（ｐＨ９．０）
に溶解させ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０
０μｌで溶液を中性付近に戻し、その液に対し、連結剤
であるスクシニル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ
レイト（以下ＳＭＰＢ、ビアス社）０．８ｍｇをジオキ
サンに溶解させた溶液を徐々に加えた。得られた混合液
を１時間攪拌した後、カラムクロマトグラフィにて精製
した。カラムはセファデックスＧ−２５（ファルマシア
社）を用い、生理食塩リン酸緩衝液（以下ＰＢＳ、２０
ｍＭリン酸、１５０ｍＭのＮａＣ１、ｐＨ７．２）によ
り分離、精製した。
（以下ＫＬＨ、カルバイオケミ社）に連結する際に、５
０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む１ｍｌの
リン酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）中に
実施例１（１）の方法により合成されたペプチド２０ｍ
ｇを溶解させた。ＫＬＨ９ｍｇを２０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液−０．１５Ｍナトリウム塩液（ｐＨ９．０）
に溶解させ、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０
０μｌで溶液を中性付近に戻し、その液に対し、連結剤
であるスクシニル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチ
レイト（以下ＳＭＰＢ、ビアス社）０．８ｍｇをジオキ
サンに溶解させた溶液を徐々に加えた。得られた混合液
を１時間攪拌した後、カラムクロマトグラフィにて精製
した。カラムはセファデックスＧ−２５（ファルマシア
社）を用い、生理食塩リン酸緩衝液（以下ＰＢＳ、２０
ｍＭリン酸、１５０ｍＭのＮａＣ１、ｐＨ７．２）によ
り分離、精製した。
【００２８】このように前もって処理されたペプチド液
を攪拌しながらキャリア蛋白質液を滴下し混合した。混
合液は室温で３時間穏かに攪拌した後ＰＢＳに対し一夜
透析した。
を攪拌しながらキャリア蛋白質液を滴下し混合した。混
合液は室温で３時間穏かに攪拌した後ＰＢＳに対し一夜
透析した。
【００２９】このように合成されたＫＬＨキャリア一連
結ペプチドについてポリアクリルアミド電気泳動を行
い、分子量の増加により確かに免疫原が作成されたこと
を確認した。各試料を１０ｍＭのＤＴＴを含有するＬａ
ｅｍｍｌｉ’ｓサンプル・バッファー（６２．５ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．０１％ブロモフェニルブルー及び１０％グリ
セロール）に加え〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２
２７巻，６８０頁（１９７０）〕の方法に準じ８％の分
離用ゲルを用いて泳動を行った。分離用ゲル中の蛋白質
をクマシー・ブリリアント・ブルーで染色することによ
り確認した。
結ペプチドについてポリアクリルアミド電気泳動を行
い、分子量の増加により確かに免疫原が作成されたこと
を確認した。各試料を１０ｍＭのＤＴＴを含有するＬａ
ｅｍｍｌｉ’ｓサンプル・バッファー（６２．５ｍＭト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、０．０１％ブロモフェニルブルー及び１０％グリ
セロール）に加え〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２
２７巻，６８０頁（１９７０）〕の方法に準じ８％の分
離用ゲルを用いて泳動を行った。分離用ゲル中の蛋白質
をクマシー・ブリリアント・ブルーで染色することによ
り確認した。
【００３０】（２）試験動物の接種 前記実施例２（１）で得られたＫＬＨ連結ペプチド５０
０μｇ／１６０μｌをＰＢＳで希釈し、１：１の割合で
完全フロイントアジュバント（ＩＣＮイムノバイオロジ
カルズ社）と共に乳化した。続いて日本白色種ウサギ
（１．５ｋｇ、オス、清水実験材料株式会社）に２５０
μｇ／１ｍｌの乳化物を皮下注射により接種した。続い
て一週間間隔で２回完全フロイントアジュバントを用い
て接種を行い、さらに一週間間隔で４回不完全フロイン
トアジュバント（ナカライテスク社）を１：１で混合し
たＫＬＨ連結ペプチドを追加免疫注射した。最終免疫後
５日目に動物から採血した。血清を公知の硫安分画法
（５０％飽和硫安）にて精製し、血清中の免疫グロブリ
ン画分を得、これを部分精製物とした。このようにして
抗ペプチド抗体を含有する免疫グロブリン画分２８．３
ｍｇ／ｍｌを得た。前記実施例１（２）で得られたペプ
チドについても前記実施例２（１）及び（２）の場合と
同様に処理したところ同様な結果が得られ、以後これら
に対する抗体をそれぞれＦｃ１−２およひＦｃ１−１と
略称する。
０μｇ／１６０μｌをＰＢＳで希釈し、１：１の割合で
完全フロイントアジュバント（ＩＣＮイムノバイオロジ
カルズ社）と共に乳化した。続いて日本白色種ウサギ
（１．５ｋｇ、オス、清水実験材料株式会社）に２５０
μｇ／１ｍｌの乳化物を皮下注射により接種した。続い
て一週間間隔で２回完全フロイントアジュバントを用い
て接種を行い、さらに一週間間隔で４回不完全フロイン
トアジュバント（ナカライテスク社）を１：１で混合し
たＫＬＨ連結ペプチドを追加免疫注射した。最終免疫後
５日目に動物から採血した。血清を公知の硫安分画法
（５０％飽和硫安）にて精製し、血清中の免疫グロブリ
ン画分を得、これを部分精製物とした。このようにして
抗ペプチド抗体を含有する免疫グロブリン画分２８．３
ｍｇ／ｍｌを得た。前記実施例１（２）で得られたペプ
チドについても前記実施例２（１）及び（２）の場合と
同様に処理したところ同様な結果が得られ、以後これら
に対する抗体をそれぞれＦｃ１−２およひＦｃ１−１と
略称する。
【００３１】（３）免疫学的検定（ペプチド被覆プレー
トに対する抗ペプチド血清を用いる酵素的結合免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ））
トに対する抗ペプチド血清を用いる酵素的結合免疫吸着
法（ＥＬＩＳＡ））
【００３２】この試験では、本発明のペプチドにより動
物内で生成した抗血清がそのペプチドに特異的に結合す
ることを測定した。試験の結果、本発明のペプチドが免
疫原性を有し、試験動物内で抗体を誘発することが確め
られた。
物内で生成した抗血清がそのペプチドに特異的に結合す
ることを測定した。試験の結果、本発明のペプチドが免
疫原性を有し、試験動物内で抗体を誘発することが確め
られた。
【００３３】検定ではファルコン３９１２マイクロテス
トＩＩＩＴＭフレキシブルアッセイプレート（ベクトン
ディッキンソンラブウエア社）を用いた。このプレート
にＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌの濃度のペプチド５０μ
ｌを被覆し、そのプレートを３７℃で３０分インキュベ
ートした。その後プレートを倒立させ全ての穴を空に
し、ＲＩＡバッファー（ＰＢＳ／０．１％アジ化ナトリ
ウム、０．５％牛血清アルブミン）／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３回洗浄した。ペーパータオルの上で軽く叩
いて吸取りプレートを乾燥させた。プレートの吸取りの
後１００μｌのＲＩＡバッファーをそれぞれの穴に添加
し３７℃で３０分インキュベートした。その後前述の場
合と同様にプレートを洗浄し吸取った。
トＩＩＩＴＭフレキシブルアッセイプレート（ベクトン
ディッキンソンラブウエア社）を用いた。このプレート
にＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌの濃度のペプチド５０μ
ｌを被覆し、そのプレートを３７℃で３０分インキュベ
ートした。その後プレートを倒立させ全ての穴を空に
し、ＲＩＡバッファー（ＰＢＳ／０．１％アジ化ナトリ
ウム、０．５％牛血清アルブミン）／０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で３回洗浄した。ペーパータオルの上で軽く叩
いて吸取りプレートを乾燥させた。プレートの吸取りの
後１００μｌのＲＩＡバッファーをそれぞれの穴に添加
し３７℃で３０分インキュベートした。その後前述の場
合と同様にプレートを洗浄し吸取った。
【００３４】その後前記実施例２（２）の方法で得られ
た抗ペプチド抗体を含む免疫グロブリン画分を、調製し
た被覆プレート上で検定した。最初、免疫画分を１：５
０に希釈したのに続きＲＩＡバッファーでの連続２倍希
釈でペプチド抗原に対する抗体応答を検定した。
た抗ペプチド抗体を含む免疫グロブリン画分を、調製し
た被覆プレート上で検定した。最初、免疫画分を１：５
０に希釈したのに続きＲＩＡバッファーでの連続２倍希
釈でペプチド抗原に対する抗体応答を検定した。
【００３５】３７℃で３０分インキュベートした後、前
述の場合と同様にプレートを洗浄し、吸取った。その後
ＲＩＡバッファー中の１：４０００希釈ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧアルカリホスファターゼ（タゴ社）５０μｌをそれ
ぞれの穴に添加し、３７℃で３０分インキュベートし
た。その後前述の場合と同様にプレートを洗浄し吸取っ
た。ＤＥＡバッファー（１０％ジエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ９．８）／０．０２％アジ化ナトリウム、０．
０１％塩化マグネシウム６水和物）中、４ｍＭのｐ−ニ
トロフェニルホスフェイト（シグマ社）を５０μｌずつ
穴に添加した。１５分後２５μｌの１ＭＮａＯＨで酵素
反応を停止した。その後マイクロプレート読取り機（バ
イオラッド社、モデル２５５０ＥＩＡリーダー）を用い
４０５ｎｍで分光光度的にプレートを解析した。この結
果、希釈依存的に吸光度が減少したことから両ペプチド
に対するＦｃｌ−１、Ｆｃｌ−２それぞれの抗血清がペ
プチドに結合することを観測した。
述の場合と同様にプレートを洗浄し、吸取った。その後
ＲＩＡバッファー中の１：４０００希釈ヤギ抗ウサギＩ
ｇＧアルカリホスファターゼ（タゴ社）５０μｌをそれ
ぞれの穴に添加し、３７℃で３０分インキュベートし
た。その後前述の場合と同様にプレートを洗浄し吸取っ
た。ＤＥＡバッファー（１０％ジエタノールアミン緩衝
液（ｐＨ９．８）／０．０２％アジ化ナトリウム、０．
０１％塩化マグネシウム６水和物）中、４ｍＭのｐ−ニ
トロフェニルホスフェイト（シグマ社）を５０μｌずつ
穴に添加した。１５分後２５μｌの１ＭＮａＯＨで酵素
反応を停止した。その後マイクロプレート読取り機（バ
イオラッド社、モデル２５５０ＥＩＡリーダー）を用い
４０５ｎｍで分光光度的にプレートを解析した。この結
果、希釈依存的に吸光度が減少したことから両ペプチド
に対するＦｃｌ−１、Ｆｃｌ−２それぞれの抗血清がペ
プチドに結合することを観測した。
【００３６】（４）抗ペプチド血清の精製 ウイルス作用の検定を行うにあたっては、できるだけ他
のウイルス阻害因子を除外する為、アフィニティカラム
クロマトグラフィによる精製を行ってもよい。ここでは
ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ（バイオプ
ローブインターナショナル社）を用いた精製法を述べ
る。
のウイルス阻害因子を除外する為、アフィニティカラム
クロマトグラフィによる精製を行ってもよい。ここでは
ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ（バイオプ
ローブインターナショナル社）を用いた精製法を述べ
る。
【００３７】１５ｍｌの炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリ
ウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中、４０ｍｇのＫ
ＬＨを溶解させる。このＫＬＨ液に対し、１．５ｇの乾
燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ）
を液を攪拌しながら徐々に加え、その液を４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後３０ｍｌの炭酸ナトリウム−
重炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で、
続いて３０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．
２）でゲルを洗浄した。このようにして得られたＫＬＨ
結合ゲルは１５ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．２）に懸濁された。このＫＬＨ（キーホールリンペ
ットヘモシアニン）結合ゲル液に対し、０．３ｍｌのジ
オキサンに溶解した２０ｍｇのＳＭＰＢ（スクシニル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレイト）を混合し、
その混合液を室温で１時間穏かに攪拌した。その後３０
ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でＫＬＨ
−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。得られたＫＬＨ−ＳＭ
ＰＢ結合ゲルは未反応の水酸基を不活化する為に２０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する５０ｍｌのト
リス−塩酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に懸濁し、
４℃で６時間穏かに攪拌した。その後、以下の順でＫＬ
Ｈ−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。４０ｍｌの酢酸ナト
リウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．５）、４０ｍｌの酢
酸ナトリウムバッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ４．
５、０．５ＭＮａＣｌ）、４０ｍｌのトリス塩酸バッフ
ァー（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）、４０ｍｌのトリス塩酸
バッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．５ＭＮ
ａＣｌ）、最後に４０ｍｌのホウ酸バッファー食塩水
（２０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄
した。
ウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）中、４０ｍｇのＫ
ＬＨを溶解させる。このＫＬＨ液に対し、１．５ｇの乾
燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドアビッドゲルＦ）
を液を攪拌しながら徐々に加え、その液を４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後３０ｍｌの炭酸ナトリウム−
重炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．４）で、
続いて３０ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．
２）でゲルを洗浄した。このようにして得られたＫＬＨ
結合ゲルは１５ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．２）に懸濁された。このＫＬＨ（キーホールリンペ
ットヘモシアニン）結合ゲル液に対し、０．３ｍｌのジ
オキサンに溶解した２０ｍｇのＳＭＰＢ（スクシニル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレイト）を混合し、
その混合液を室温で１時間穏かに攪拌した。その後３０
ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でＫＬＨ
−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。得られたＫＬＨ−ＳＭ
ＰＢ結合ゲルは未反応の水酸基を不活化する為に２０ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する５０ｍｌのト
リス−塩酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に懸濁し、
４℃で６時間穏かに攪拌した。その後、以下の順でＫＬ
Ｈ−ＳＭＰＢ結合ゲルを洗浄した。４０ｍｌの酢酸ナト
リウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ４．５）、４０ｍｌの酢
酸ナトリウムバッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ４．
５、０．５ＭＮａＣｌ）、４０ｍｌのトリス塩酸バッフ
ァー（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）、４０ｍｌのトリス塩酸
バッファー食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．５ＭＮ
ａＣｌ）、最後に４０ｍｌのホウ酸バッファー食塩水
（２０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄
した。
【００３８】このようにして得られたＫＬＨ−ＳＭＰＢ
結合ゲルに、前記実施例２（２）で得られた抗ペプチド
抗体含有部分精製物約１５ｍｌを混合し、４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後グラスフィルターにてゲルと
抗ペプチド抗体含有液とを濾過、分離した。グラスフィ
ルター上のゲルに１０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー
食塩水（０．１５ＭＮａＣｌ）続いて１０ｍｌの２０ｍ
Ｍホウ酸バッファー食塩水（０．４ＭＮａＣｌ）を加え
ゲルを洗浄した。濾液と洗浄液は回収し、次の操作まで
４℃で貯蔵した。
結合ゲルに、前記実施例２（２）で得られた抗ペプチド
抗体含有部分精製物約１５ｍｌを混合し、４℃で１０時
間穏かに攪拌した。その後グラスフィルターにてゲルと
抗ペプチド抗体含有液とを濾過、分離した。グラスフィ
ルター上のゲルに１０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー
食塩水（０．１５ＭＮａＣｌ）続いて１０ｍｌの２０ｍ
Ｍホウ酸バッファー食塩水（０．４ＭＮａＣｌ）を加え
ゲルを洗浄した。濾液と洗浄液は回収し、次の操作まで
４℃で貯蔵した。
【００３９】次にＦＭＰ−アクティベーティドアビッド
ゲルＦに抗原ペプチドを結合させる。
ゲルＦに抗原ペプチドを結合させる。
【００４０】０．０５Ｍジチオスレイトールを含有する
２０ｍｌのリン酸バッファー（０．５Ｍ、ＰＨ８．０）
中に抗原ペプチド１６ｍｇを溶解させた。このペプチド
溶液に２ｇの乾燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドア
ピッドゲルＦ）を、液を攪拌しながら徐々に加え、添加
後、室温で１５分攪拌した。その後そのペプチド、ゲル
混合液を更に室温で８時間穏かに攪拌した後、５０ｍｌ
のリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）でゲルを
洗浄した。このようにして得られたペプチド結合ゲル
は、前記ＫＬＨ−ＳＭＰＢの場合と同様にして未反応の
水酸基を不活化する為に前記したように処理を行った。
その後前述の場合と同様にしてペプチド結合ゲルの洗浄
を行い、最後に２０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食
塩水（ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）に懸濁した。
２０ｍｌのリン酸バッファー（０．５Ｍ、ＰＨ８．０）
中に抗原ペプチド１６ｍｇを溶解させた。このペプチド
溶液に２ｇの乾燥ゲル（ＦＭＰ−アクティベーティドア
ピッドゲルＦ）を、液を攪拌しながら徐々に加え、添加
後、室温で１５分攪拌した。その後そのペプチド、ゲル
混合液を更に室温で８時間穏かに攪拌した後、５０ｍｌ
のリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）でゲルを
洗浄した。このようにして得られたペプチド結合ゲル
は、前記ＫＬＨ−ＳＭＰＢの場合と同様にして未反応の
水酸基を不活化する為に前記したように処理を行った。
その後前述の場合と同様にしてペプチド結合ゲルの洗浄
を行い、最後に２０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食
塩水（ｐＨ８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）に懸濁した。
【００４１】最後に、先に述べた操作により回収した抗
ペプチド抗体含有液とペプチド結合ゲルとの結合及び抗
ペプチド抗体の溶出について述べる。作成したペプチド
結合ゲルと抗ペプチド抗体含有液を混合し、４℃で１０
時間穏かに攪拌した。これにより抗ペプチド抗体はペプ
チド結合ゲルに結合する。この抗ペプチド抗体結合ゲル
を適当なガラスカラム（１．２ｃｍφ×１８ｃｍ）に入
れ５０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ
８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄し、続いて５０ｍ
ｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ８．５、
０．４ＭＮａＣｌ）で、最後に２０ｍＭホウ酸バッファ
ー食塩水（ｐＨ８．０、０．４ＭＮａＣｌ）で洗浄し
た。最後の洗浄は溶出液を分光光度計で測定し、測定波
長２８０ｎｍで吸光度が０．０１〜０．０２になるまで
洗浄を行った。
ペプチド抗体含有液とペプチド結合ゲルとの結合及び抗
ペプチド抗体の溶出について述べる。作成したペプチド
結合ゲルと抗ペプチド抗体含有液を混合し、４℃で１０
時間穏かに攪拌した。これにより抗ペプチド抗体はペプ
チド結合ゲルに結合する。この抗ペプチド抗体結合ゲル
を適当なガラスカラム（１．２ｃｍφ×１８ｃｍ）に入
れ５０ｍｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ
８．５、０．１５ＭＮａＣｌ）で洗浄し、続いて５０ｍ
ｌの２０ｍＭホウ酸バッファー食塩水（ｐＨ８．５、
０．４ＭＮａＣｌ）で、最後に２０ｍＭホウ酸バッファ
ー食塩水（ｐＨ８．０、０．４ＭＮａＣｌ）で洗浄し
た。最後の洗浄は溶出液を分光光度計で測定し、測定波
長２８０ｎｍで吸光度が０．０１〜０．０２になるまで
洗浄を行った。
【００４２】このようにして作成された抗ペプチド抗体
結合アフィニティーゲルカラムに０．１Ｍグリシン塩酸
バッファー（ｐＨ２．４）を供給し抗ペプチド抗体を溶
出した。溶出液は０．５ｍｌずつ回収され、１〜３０画
分中、画分番号１３〜１８の範囲に抗体成分が回収され
た。このようにして得られたアフィニティー精製抗ペプ
チド抗体中のＩｇＧ含有量は０．３ｍｇ／ｍｌであっ
た。
結合アフィニティーゲルカラムに０．１Ｍグリシン塩酸
バッファー（ｐＨ２．４）を供給し抗ペプチド抗体を溶
出した。溶出液は０．５ｍｌずつ回収され、１〜３０画
分中、画分番号１３〜１８の範囲に抗体成分が回収され
た。このようにして得られたアフィニティー精製抗ペプ
チド抗体中のＩｇＧ含有量は０．３ｍｇ／ｍｌであっ
た。
【００４３】実施例３ 精製抗ペプチド抗体の性状 本発明の精製抗ＮＤＶペプチド抗体の反応特異性に関
し、Ｆｃｌ−１を例にとって説明する。
し、Ｆｃｌ−１を例にとって説明する。
【００４４】精製Ｆｃｌ−１抗体は公知のウエスタンブ
ロッティング法により分析した結果、抗原に用いた合成
ペプチドと特異的に反応することが確認された。また本
抗体は精製ＮＤＶ（宮寺株：名古屋大学永井教授より分
与）の構成成分のうち、Ｆ蛋白と特異的に反応し、この
うち主としてＦ２蛋白部分を認識することが明らかとな
った。
ロッティング法により分析した結果、抗原に用いた合成
ペプチドと特異的に反応することが確認された。また本
抗体は精製ＮＤＶ（宮寺株：名古屋大学永井教授より分
与）の構成成分のうち、Ｆ蛋白と特異的に反応し、この
うち主としてＦ２蛋白部分を認識することが明らかとな
った。
【００４５】さらに、本抗体のＦ蛋白の開裂阻害作用を
以下の手順に従って調べた。２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞（幼若ハムスター腎
臓由来細胞株、ＡＴＣＣクローンＮｏ．ＣＣＬ−１０）
に、５％子牛血清を含むイーグルＭＥＭ培地（（財）微
生物病研究会製）で希釈したＮＤＶを感染させ、３７℃
で培養した。４時間後、３５Ｓラベルしたメチオニン
（１００μＣｉ／ｍｌ）と精製抗体（０．０３ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えてさらに培養を続けた。３０時間後、感染細
胞を集め、界面活性剤で溶解した後、ＮＤＶのＦ蛋白に
対するマウスモノクローナル抗体（北海道大学喜田教授
より分与）を用いて免疫沈降を行い、電気泳動法によっ
てＦ蛋白の開裂状態を分析した。精製抗体を加えない場
合、ほぼ全てのＦ０蛋白が開裂を受けているのに対し
て、精製抗体を加えた場合は、Ｆ０蛋白が明らかに開裂
阻害を受けていた。また、これらのＦ０蛋白は、主とし
て細胞表面に分布していた。以上から、ＮＤＶのＦ蛋白
の限定分解認識部位に対する抗体は感染細胞の表面にお
いてＦ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害する性質を有
することが示された。
以下の手順に従って調べた。２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞（幼若ハムスター腎
臓由来細胞株、ＡＴＣＣクローンＮｏ．ＣＣＬ−１０）
に、５％子牛血清を含むイーグルＭＥＭ培地（（財）微
生物病研究会製）で希釈したＮＤＶを感染させ、３７℃
で培養した。４時間後、３５Ｓラベルしたメチオニン
（１００μＣｉ／ｍｌ）と精製抗体（０．０３ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えてさらに培養を続けた。３０時間後、感染細
胞を集め、界面活性剤で溶解した後、ＮＤＶのＦ蛋白に
対するマウスモノクローナル抗体（北海道大学喜田教授
より分与）を用いて免疫沈降を行い、電気泳動法によっ
てＦ蛋白の開裂状態を分析した。精製抗体を加えない場
合、ほぼ全てのＦ０蛋白が開裂を受けているのに対し
て、精製抗体を加えた場合は、Ｆ０蛋白が明らかに開裂
阻害を受けていた。また、これらのＦ０蛋白は、主とし
て細胞表面に分布していた。以上から、ＮＤＶのＦ蛋白
の限定分解認識部位に対する抗体は感染細胞の表面にお
いてＦ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害する性質を有
することが示された。
【００４６】実施例４ ウイルスに対する作用の検定（中和試験）：ＮＤＶ感染
細胞からの感染性ウイルスの産生に対する阻害効果 ＮＤＶ感染細胞の培養液中にＦｃｌ−１を添加しながら
培養を行い、感染細胞からの新たな感染性ウイルスの産
生がどの程度阻害されるかを検定した。５％子牛血清を
含むイーグルＭＥＭ培地で希釈したＮＤＶ（７０プラー
ク形成単位／２００μ１）を２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞に吸着（３７℃、１
時間）させた後、未吸着ウイルスを除去、洗浄し段階希
釈したＦｃｌ−１（終濃度０．１、０．０１、０．００
１及び０ｍｇ／ｍｌ）を含む同培地１ｍｌを加えて、５
％炭酸ガス下３７℃で培養した。２０時間後、培養上清
中のＮＤＶの感染価をプラーク法により算出した。結果
を図１に示す。
細胞からの感染性ウイルスの産生に対する阻害効果 ＮＤＶ感染細胞の培養液中にＦｃｌ−１を添加しながら
培養を行い、感染細胞からの新たな感染性ウイルスの産
生がどの程度阻害されるかを検定した。５％子牛血清を
含むイーグルＭＥＭ培地で希釈したＮＤＶ（７０プラー
ク形成単位／２００μ１）を２４ウエルプレート上で単
層状態に増殖したＢＨＫ−２１細胞に吸着（３７℃、１
時間）させた後、未吸着ウイルスを除去、洗浄し段階希
釈したＦｃｌ−１（終濃度０．１、０．０１、０．００
１及び０ｍｇ／ｍｌ）を含む同培地１ｍｌを加えて、５
％炭酸ガス下３７℃で培養した。２０時間後、培養上清
中のＮＤＶの感染価をプラーク法により算出した。結果
を図１に示す。
【００４７】ＮＤＶのＦ蛋白の開裂部位に対する抗体
は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗体非存在下の場合の
ウイルス産生量に対して約６０％の阻害効果を示した。
従って、本抗体は感染細胞から新たに感染力を持ったウ
イルスが産生されるステップに対しては細胞表面におい
てウイルスＦ蛋白の開裂を抑制することによって感染阻
害効果を示すことが明らかとなった。
は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で、抗体非存在下の場合の
ウイルス産生量に対して約６０％の阻害効果を示した。
従って、本抗体は感染細胞から新たに感染力を持ったウ
イルスが産生されるステップに対しては細胞表面におい
てウイルスＦ蛋白の開裂を抑制することによって感染阻
害効果を示すことが明らかとなった。
【００４８】
【発明の効果】本発明の抗体は、細胞表面において、Ｎ
ＤＶのＦ蛋白、Ｆ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害
し、その結果として、ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルス粒子の産生を阻害する。従って、本抗体
は、ＮＤＶの感染宿生、主として家禽における本ウイル
スの感染予防薬或は発病予防薬として利用できるばかり
でなく、既に発病したものに対しても新たなウイルス産
生を抑制することによって、治療薬として利用できる。
同時に、先にも述べた通り、本抗体の抗原認識部位はＮ
ＤＶの異なるクローン間で良く保存されており、抗原性
の変化が生じる頻度は極めて低い部分と考えられること
から、ＮＤＶ変異株が出現した場合でも引き続き本抗体
が有効に作用して感染防御効果を発揮できる。
ＤＶのＦ蛋白、Ｆ０がＦ１とＦ２に開裂するのを阻害
し、その結果として、ウイルス感染細胞からの新たな感
染性ウイルス粒子の産生を阻害する。従って、本抗体
は、ＮＤＶの感染宿生、主として家禽における本ウイル
スの感染予防薬或は発病予防薬として利用できるばかり
でなく、既に発病したものに対しても新たなウイルス産
生を抑制することによって、治療薬として利用できる。
同時に、先にも述べた通り、本抗体の抗原認識部位はＮ
ＤＶの異なるクローン間で良く保存されており、抗原性
の変化が生じる頻度は極めて低い部分と考えられること
から、ＮＤＶ変異株が出現した場合でも引き続き本抗体
が有効に作用して感染防御効果を発揮できる。
【００４９】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５２】配列番号：４ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】抗ペプチド抗体の感染性ＮＤＶ産生に対する阻
害効果を示す図である。
害効果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (7)
- 【請求項１】 配列表配列番号１で示されるアミノ酸配
列において、６番目のグリシン残基から１１番目のアル
ギニン残基までのアミノ酸配列を含み、かつ６〜１５個
のアミノ酸残基からなるペプチド。 - 【請求項２】 アミノ酸配列のＣ末端にシステインが付
加された請求項１に記載のペプチド。 - 【請求項３】 前記ペプチドが配列表配列番号２、３又
は４で示される請求項２に記載のペプチド。 - 【請求項４】 配列表配列番号１で示されるアミノ酸配
列において、６番目のグリシン残基から１１番目のアル
ギニン残基までのアミノ酸配列を含み、かつ６〜１５個
のアミノ酸残基からなるペプチドから誘導される抗体。 - 【請求項５】 前記抗体が、ニューカッスル病ウイルス
の外膜上に存在するＦ蛋白のトリプシン様プロテアーゼ
による開裂を阻害する、請求項４に記載の抗体。 - 【請求項６】 前記抗体が、前記ペプチドとキャリア蛋
白質とから誘導される免疫原により免疫された動物の血
清から免疫グロブリン画分を得、前記ペプチドを用いて
この免疫グロブリン画分をアフィニティークロマトグラ
フィーにて精製することにより取得される請求項４又は
５に記載の抗体。 - 【請求項７】 配列表配列番号１で示されるアミノ酸配
列において、６番目のグリシン残基から１１番目のアル
ギニン残基までのアミノ酸配列を含み、かつ６〜１５個
のアミノ酸残基からなるペプチドから誘導される抗体を
有効成分として含有する抗ニューカッスル病薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3182107A JPH06100591A (ja) | 1991-04-23 | 1991-04-23 | ペプチド、それらから誘導される抗体並びにその抗体を含有する抗ニュ−カッスル病薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3182107A JPH06100591A (ja) | 1991-04-23 | 1991-04-23 | ペプチド、それらから誘導される抗体並びにその抗体を含有する抗ニュ−カッスル病薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06100591A true JPH06100591A (ja) | 1994-04-12 |
Family
ID=16112461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3182107A Pending JPH06100591A (ja) | 1991-04-23 | 1991-04-23 | ペプチド、それらから誘導される抗体並びにその抗体を含有する抗ニュ−カッスル病薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06100591A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100955502B1 (ko) * | 2007-11-30 | 2010-04-30 | 대한민국 | 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는펩타이드 및 그의 용도 |
| CN110488017A (zh) * | 2018-05-14 | 2019-11-22 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN110488010A (zh) * | 2018-05-14 | 2019-11-22 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN110488011A (zh) * | 2018-05-14 | 2019-11-22 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
-
1991
- 1991-04-23 JP JP3182107A patent/JPH06100591A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100955502B1 (ko) * | 2007-11-30 | 2010-04-30 | 대한민국 | 병원성 뉴캐슬병 바이러스 항체와 특이적으로 반응하는펩타이드 및 그의 용도 |
| CN110488017A (zh) * | 2018-05-14 | 2019-11-22 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN110488010A (zh) * | 2018-05-14 | 2019-11-22 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN110488011A (zh) * | 2018-05-14 | 2019-11-22 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN110488011B (zh) * | 2018-05-14 | 2022-11-01 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
| CN110488017B (zh) * | 2018-05-14 | 2022-11-04 | 洛阳中科生物芯片技术有限公司 | 新城疫病毒抗体检测试剂盒 |
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