JPH06506947A - 抗ウィルスハイブリッド抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ウィルス感染症の治療および予防に用いられる組換えハイブリッド分 子に関する。

体内に浸入し、疾病を引き起こし得る外来物質や生物には広範なものがある。こ のような浸入に対して、ヒトを含む哺乳動物は「免疫応答」という反応をするが 、これは、種々の細胞と体液性因子との間に生ずる多数の複雑な相互作用の結果 である。多数の異なる細胞が関与しているが、免疫応答を生起するに当ってはリ ンパ級が主要細胞であり、バクテリア、ウィルス、外来細胞等の外来物質がら固 体を防御する。

リンパ級には主に２つのクラスがあり、Ｂ細胞、Ｔ細胞と呼ばれる。各々のクラ スは原造血幹細胞がら形成される。

成熟Ｔ細胞は、それぞれが行う異なる作用に基づいて３つのサブクラスに分類さ れている。

ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、Ｂ細胞抗体産生を促進または増強する働きがある。

細胞毒性キラーＴ細胞（Ｔｋ）、もしくは細胞毒性１９２６級（ＣＴＬ）と呼ば れているものは、細胞を溶解することにより、細胞を直接殺す。サプレッサーＴ 細胞（Ｔｓ）は免疫応答を抑制または低下させこのようなＴ細胞の異なるサブク ラスは各種の細胞表面蛋白質を発現するが、その中には特定のサブクラスに特徴 的な「マーカー蛋白質」と呼ばれるものがある。例えば、大部分のＴｈ細胞は細 胞表面にＣＤ４蛋白質を発現し、一方、大部分のＣＴＬおよびＴｓ細胞は細胞表 面にＣ″Ｄ８蛋白質を発現する。スワイン（Ｓｗａｉｎ）　ｒ異なる作用分析活 性においてマウスＢ細胞成長因子に２種の別異のクラスが存在する事実Ｊ　（Ｅ ｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｗｏ　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ　 Ｍｕｒｉｎｅ　Ｂ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　Ａｃ ｔｆｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　Ｄｆｆｆｅｒｅｎｔ　Ｆｕｎｃｔｆｏｎａｌ　Ａｓ５ ａｙｓ）Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１５８：８２２　（１９８３）　ｏ　さらに、 成熟Ｔ細胞はＴ細胞受容体（Ｔ　ＣＲ）が細胞表面に存在することから、未熟細 胞（脚線リンパ級）と区別され得るが、このＴＣＲは、成熟Ｔ細胞に見出される 膜透過性蛋白質複合体であり、ＭＨＣ遺伝子によりコードされた自己抗原の関与 により抗原を認識する機能を有する。

現在知られているように、免疫応答の開始と維持は、細胞から細胞への相互作用 を伴い、Ｂ細胞、Ｔ細胞、外来物質、外来細胞および感染細胞の表面に存在する 、特定の蛋白質または蛋白質複合体の認識およびそれらの間の相互作用に依存す る。

免疫応答には、細胞仲介型反応と抗体仲介型反応という、少なくとも２種の別異 の側面が存在する。両者は共にＴ細胞が外来抗原を認識した時点で開始する。細 胞仲介型反応は抗原に出会い、活性化されたＣＴＬの細胞溶解活性を含み、Ｂ細 胞の不在下で進行する。また、ＣＴＬは非特異的に活性化され、ＣＤ３のような 細胞表面蛋白質に抗体を結合させることにより近傍の全ての細胞を溶解すること ができる。抗体仲介型反応が起こるためには、抗原に出会うことにより活性化さ れたＴｈ細胞がＢ細胞と相互作用し、免疫グロブリンまたは抗原として知られて いる体液蛋白質のＢ細胞産生を刺激する。

外来抗原に対してＴ細胞は直接的に細胞仲介型免疫応答に関与するが、抗体のＢ 細胞産生が免疫においては最も重要な側面である。各種の必須抗体は、免疫グロ ブリン遺伝子の多様性により形成される。遺伝子の再配列は、さらにその種類を 増加する。各々の組の成熟免疫グロブリン遺伝子は、更なる遺伝子の再配列に起 因するものである。さらに多様性をもたらすために、種々の特徴を持ったいくつ かの免疫グロブリンのクラスが存在する。免疫グロブリンおよび蛋白質の構造に ついては、レビン（Ｌｅｖｉｎ）著「遺伝子Ｉ１１」ジョン・ウィリーアンドサ ンズ（Ｊｏｈｎν＋Ｉｅｙ　ａｎｄ　Ｓ。

ｎ５）Ｎ、Ｙ、　（１９８７）参照のこと。

遺伝子工学の発達した技術は、自然の免疫機構の補助や、診断試験のための試薬 の開発へ使用されている。たとえば、ワクチンに適し、種々の抗原決定因子に対 応する蛋白質配列は、合成によりまたは組換えＤＮＡ技術により調製されている 。

抗体は、その多様性および特異性から、診断と治療への応用に非常に重要である 。分子生物学の技術は、抗体の科学的応用への可能性を広げるために用いられて きた。たとえば、単一種の抗体を産生ずるＢ細胞を確立し、拡張して「モノクロ ーナル抗体（ｍＡｂ）Ｊとして知られている単一の特異性を有するインビトロ抗 体源を得ることができる。

そのような確立された細胞系を「ハイブリドーマ」と呼ぶ。

最近まで、大部分のｍＡｂの起源はマウスハイブリドーマであった。マウスｍＡ ｂは広く診断手法に用いられているが、ヒトや非同種のマウスを含む哺乳類の受 動免疫や治療用途には適していない。さらにマウス抗体は他の哺乳類には異物と して認識され、それ自身が疾病を引き起こしかねない免疫応答を生起する。それ ゆえ、ヒトｍＡｂは、広範なヒトの疾病にきわめて有用であろう。しかし、ヒト ｍＡｂの産生は、マウスｍＡｂの産生より非常に困難であることがわかっている 。従って、ヒトｍＡｂは、まだ治療に供する程十分な量と種類が得られていない 。

外来ｍＡｂに対する免疫応答と適切なヒトｍＡｂの欠如という問題を解決するた めに、少なくとも一部では遺伝子工学技術を用い、ハイブリッド免疫グロブリン 分子を構築することが行われてきた。この分子は、マウス抗体の抗原結合部位と 、残りの部分は異物と認識されないヒト抗体配列とから成る。ジョーンズ（Ｊｏ ｎｅｓ）ら「ヒト抗体の相補性決定領域のマウス抗体相補性決定領域への置換Ｊ 　（Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅ ｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ａ　Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　 ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｍｏｕｓｅ）ネイチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ ）　３２１　：　５２２−５２５（１９８Ｂ）　、これらのハイブリッド抗体は 、ヒトの治療において時として免疫応答を生起し、親であるマウス抗体はどには 機能しないことが多い。マウスおよびヒトｍＡｂの利用とその背景については、 カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）ら「９０年代のモノクローナル抗体：全能の道 具としてＪ　（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　１ｎｔｏ　ｔｈ ｅ　９０’　ｓ：ＡＩＩ　Ｐｕｒｐｏｓｅ　Ｔｏｏｌ）バイオ／テクノロジー＜ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７　：　５８７−５７３（１９８９）参照のこ と。

発明の概要 本発明は、ヒトの治療、特にウィルス感染症の治療および腫瘍の治療に用いられ 、単剤で免疫応答の細胞仲介と抗体仲介の両面をあわせ持つ新規な薬剤および方 法に関する。

ウィルス感染症の治療においては、本発明に従う新規薬剤は、ウィルス感染した 細胞に細胞毒性１９２８級を集中させて感染細胞の溶解を起こさせることにより 、ウィルス感染を阻止するよう作用する。

本発明はハイブリッド抗体を提供し、本発明のハイブリッド抗体は、ヒト免疫グ ロブリンＧのＣ領域（定常領域）（Ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｐｏｒｔｉｏｎ）に相当 する基本領域と、特定の標的抗原に対して特異性を発揮するように選択された結 合部位と、ヒトＣＴＬに結合し活性化する結合部位とから成る。このハイブリッ ド抗体がウィルス感染症の治療に用いられる場合、好ましいハイブリッドとは、 ウィルス感染に関与する蛋白質、すなわちウィルスの「細胞認識」蛋白質に結合 して、ウィルスの感染能力を中和するような標的抗原結合部位を持つものである 。細胞認識蛋白質は、ウィルス感染した細胞の表面に発現されることが多いので 、／１イブリッド抗体はこれらの感染細胞にも結合できる。ノ＼イブリ・ノド抗 体がウィルス感染細胞並びにＣＴＬの両方に結合すると、ＣＴＬの活性化、続い て感染細胞の溶解が起こる。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ：これは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原 因となる）感染の治療に用いられ、本発明に従うハイブリッド抗体は、ＣＤ３に 結合してＣＴＬを活性化する結合領域と、感染細胞の表面から生ずる全てのＨＩ Ｖ抗原に特異的な結合領域とを持つことが望ましい。たとえば、抗原認識結合部 位は、ＨＩＶのコート蛋白質に特異的な抗体のＶ領域（可変領域）である。

図面の簡単な説明 第１図は、結合部位、ヒンジ部、Ｌ鎖（短鎖）およびＨ鎖（長鎖）並びにそれら に対応するＶおよびＣ領域から成り、Ｙ字型で示される免疫グロブリン分子の図 である。

第２図は、蛋白複合体の図であり、この複合体が、ウィルス、ウィルス感染細胞 、あるいはウィルス性抗原を認識し得る単一の免疫グロブリン結合部位と、ＣＤ ３を認識し結合してＣＴＬを活性化し得るさらに別の単一の免疫グロブリン結合 部位と、それらの結合部位を免疫グロブリンのＣ領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｄｏ ｓａｉｎ）であるＣＨ２、ＣＨ３領域から分離させている免疫グロブリンヒンジ 領域から分離させている免疫グロブリンヒンジ部とから成る様子を示している。

第３図は、ＶＨ−Ｄ−Ｊ遺伝子を含むＤＮＡ構造の模式第４図は、ＶＨ−Ｄ−Ｊ 領域のクローニング手法のフロ単一の組換え蛋白質複合体内で、細胞仲介型反応 と抗体仲介型反応を組み合わせることにより、ウィルス感染症等の疾病に対する 新規な有効療法を得ることができることを見出した。

本発明は、ヒトのウィルス感染症の治療および予防に有用であり、組換えＤＮＡ 技術により作られたハイブリッド抗体に関するものである。

本発明のハイブリッド抗体の中心には、少なくとも一部はヒト免疫グロブリンＧ （ＩｇＧ）の基本領域がある。第１図に示されるように、ＩｇＧは２本の同一の Ｈ！ＩＨＳＨ′と、２本の同一のＬ鎖ＬＳＬ’により形成される四つの蛋白質の 複合体である。これらの鎖はジスルフィド結合でつながり、Ｙ字型の複合体を組 んでいる。しかし、溶液中ではこの分子は、より球状の形態をとっている。

免疫グロブリン蛋白質のシーフェンス解析により、これら各々の鎖の中に特異領 域ないしは機能領域が存在することが明らかになった。各々の鎖はアミノ末端に Ｖ領域（ＶＬとＶＨ）を有している。ＶＬとＶＨの組み合わせにより作られるＶ 領域は、抗原認識部位または分子の「結合部位」を構成する。１個の分子当り２ つの結合部位が存在する。

これらの鎖のＶ領域は配列が高度に多様で、多様な抗体結合部位を与え、種々の 抗原に対して特異性を発揮する。また、各々の鎖は本質的にＣ領域（ｃｏｎｓｔ ａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）を有しており、このＣ領域は結合部位により認識された 抗原の性質に応じて変化するということはない。Ｌ鎖には単一のＣ領域（ｃｏｎ ｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）　（ＣＬ）があるが、他方Ｈ鎖には３つの互いに異 なるＣ領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｒｅｇｉｏｎ）　（ＣＨ１。

ＣＨ２，ＣＨ３）がある。ＣＬとＣＨＩの組が最初のＣドメイン（ｃｏｎｓｔａ ｎｔ　ｄｏｉａｉｎ）　ＣＩを形成し、ＣＬとＣＨ２の組が２番目のＣドメイン Ｃ２を形成し、ＣＬとＣＨ３の組が３番目のＣドメインＣ３を形成する。４個の Ｃドメイン、すなわち２個のＣ１と、Ｃ２およびＣ３とが免疫グロブリン分子の Ｙ字型の基本領域を構成している。さらにＨ鎖は、Ｃ１とＣ２を残りの部分から 分離しているヒンジ領域を有している。ヒンジ部は４つの蛋白質に柔軟性を供与 している。

好ましい具体例として、本発明の蛋白質複合体は、一部あるいは全部がヒト免疫 グロブリンのＣ領域と同一のＹ字型基本領域を有する。このようにヒト免疫グロ ブリンを使用すると、修飾された免疫グロブリンがそれ自身異物として認識され るという問題は除外されるので、ヒトの治療への応用が容易となる。加えて、こ の基本領域は当該分子に、インビボでの安定性、Ｆｃ受容体結合、プロティンＡ 結合、複合体固定、胎盤透過性等のエフェクター機能を付与することができる。

免疫グロブリン分子に基づく修飾配列は、その修飾が免疫拒絶反応を起こさない 限りは、本発明の範囲に含まれる。

基本領域にはＣＴＬに結合し、それを活性化する結合部位と、抗原に結合する結 合部位とが追加されている。０７表面蛋白質であるＣＤ３に対して特異的な抗体 の結合部位である。同様に、ＣＴＬ活性化能のある、他のＣＴＬ表面蛋白質に対 する特異的抗体も本発明の範囲に包括される。

これらの結合部位は、免疫グロブリン様のＹ字型の基本領域のアミノ末端部分に ペプチド結合により固定されている。

抗原認識結合部位は、特定の標的生物に対する特異性を発揮するよう選択される 。たとえば、標的生物に対して特異的な抗体の結合部位は、基本領域の腕のアミ ノ末端部に固定される。

本発明の好ましい具体例としては、抗原認識結合部位はＹ字型の基本領域の一方 の腕にペプチド結合により固定され、ＣＴＬに特異的な抗体結合部位は、Ｙ字型 の基本領域のもう一方の腕にペプチド結合により固定されたものである。

本発明によるハイブリッド免疫グロブリンは、広範なウィルス感染症に有効であ る。本発明のハイブリッド免疫グロブリンは、宿主細胞の感染に際し、細胞死に 先立ってウィルスのコート蛋白質を発現するようなウィルスに感染した場合の治 療に特に適している。はとんどの場合、このように細胞においてウィルスコート 蛋白質が発現すると、細胞表面にそれらの蛋白質が形成される。そのような例と しては、インフルエンザウィルスの四球凝集素蛋白質複合体、マウス白血球のエ ンブ（ｅ　ｎ　ｖ）蛋白質、ルイス（ＲｏｕＳ）肉腫ウィルスの玉ヱブ蛋白質、 ＨＩＶの玉ンブ蛋白質などが挙げられるが、これらのみに限らない。感染細胞に より発現される蛋白質は、初期感染で細胞受容体蛋白を認識し、それと結合して 感染を開始させるものと同じウィルスコート蛋白質であることが多い。このこと はＨＩＶにおいても同様である。

微生物抗原の内部形態を有している抗イデイオタイプ抗体は、Ｔ細胞のＴＣＲに 対する抗体と同様に、体液性および細胞性の抗微生物免疫を刺激することが知ら れている。

このような新規な抗体を作出するために好ましい具体例は、遺伝子操作により、 抗原の遺伝子配列を直接的に抗体に組み込むことである。ひとつの方法としては 、遺伝子工学により、免疫グロブリン分子の一部をＢ細胞またはＴ細胞によって 認識されるＨＩＶ抗原決定因子に相当する配列に置換して、そのような抗体を作 成する。

本発明の例を挙げると、Ｔ細胞により認識されるインフルエンザウィルスの核蛋 白（ＮＰ）エピトープで抗体のＨ鎖のＣ領域を置換する。この構成体は、５Ｐ２ １０　ミエローマ細胞系で発現された。このような感染５Ｐ２１０細胞は、ＮＰ ニブトープに特異的なＴ細胞により殺された。

後に示す例においては、２個の発現ベクターｐＳＶ２ｇｐ　ｔ−９１Ａ３ＶＨ− ＣＩ　ｇＧ２ｂとｐＳＶ２ｎｅｏ−９１Ａ３Ｌは双方とも、９１八３と呼ばれる 抗ヒ酸塩抗体（ａｎｔ　１−ａｒｓｅｎａｔｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）のＨ鎮（ｈ ｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）およびＬ鎖（ｌｊｇｈｔｃｈａｉｎ）の遺伝子が組み込 まれている。ｐＳＶ２ｇｐｔ−９１Ａ３ＶＨ−Ｃ１ｇＧ２ｂは、第３図に示ｃｈ るよう１．：、Ｈｉｎｄｌｌｌ制限酵素部位に挿入されたＩ　ｇＧ２ｂのＣ領域 （ｃｏｎｓｔａｒ＋ｔ　ｒｅｇｔｏｎ）の遺伝子と、ｊｃｏＲＩ制限酵素部位に 挿入された９１八３抗体の再編成５．５ｋｂのＶＨＤＪ遺伝子を有する。５．５ ｋｂ断片は、Ｈ鎖のＩｇプロモータおよびエンハンサ−も含んでいる。ｐＳＶ２ ｎｅｏ−９］、Ａ３Ｌは、再編成されたＶＬ、ＣＬ遺伝子と、ＥｃｏＲＩ、Ｂａ ｍＨＩ制限酵素部位に挿入された、必要な調節遺伝子を宵する。これらのベクタ ーを非分泌骨腫瘍細胞系である５Ｐ２１０に共移入（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｆ ｏｎ）させると−機能的な９１八３抗体を産生ずることを見出した。

この抗体のＶＨは１５８８株に由来し、また、Ｃ領域（Ｄｓｅｇｍｅｎｔ）はお そらく抗原結合部位に関与する。これらの見解は、このＣ領域が表面に露出して いることを示唆する。

事実、９１Ａ　３　Ｖ　Ｈの親水性によっても、Ｄ領域が表面に露出しているこ とが予測される。これらの理由より、９１Ａ３ＶＨＤＪがＮＰエピトープを持つ １ｇキメラの構築に選択された。本研究の目標は、第３図に示すように、９個の アミノ酸より成るＤ領域を１５個のアミノ酸より成るＮＰ　ＣＴＬエピトープで 置換することである。

このエピトープは、ＰＲ８ウィルスのＮＰ中の１４７−１８１アミノ酸機基に対 応し、これはＢａ１ｂ／ｃマウスではウィルス特異的ＣＴＬを誘導するが、Ｃ５ ７ＢＬ／６マウスでは誘導しないことが知られている。

本発明の分子は、組換えＤＮＡ技術あるいは化学的交叉結合により作られる。適 切な配向に分子を融合し、適した宿主細胞に該遺伝子を導入し、かつ蛋白質を発 現させ、精製する方法は、当該分野で既知であり、その例を以下に示す。ＤＮＡ クローニング法の詳細については多数の出典がある。たとえば、サンプルツク（ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら「分子クローニング実験マニニアル（Ｍｏｌｅｗｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　Ｊコールド　スプ リング　ハーバ−ラボラトリ−プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）ＮＹ（１９８９）などを参照。

融合遺伝子がクローニングされると、該遺伝子は適切な宿主に移入（トランスフ ェクト、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）されて、コードされた蛋白質の発現が行われる。

クローニングされた遺伝子は適切なベクターへまず挿入されるか、あるいは、リ ニアＤＮＡとして細胞へ移入され、宿主ゲノムと再結合される。適切な発現ベク ターとしては、プラスミド、ウィルス、レトロウィルスなどが挙げられるが、こ れらに限らない。どのベクターが適切かという選択は、蛋白質発現にどの宿主を 用いるかという選択に部分的に依存する。適切な宿主としては、バクテリア、哺 乳類由来の細胞系、トランスジェニックマウスなどの動物個体、昆虫由来の細胞 系などが挙げられるが、これらに限定されない。昆虫由来の細胞系は、これまで 免疫グロブリンの発現に用いられてはいないが、哺乳類由来の細胞系にくらべ、 糖蛋白質の違いから、より有効な蛋白質を生産すると考えられる。昆虫由来の細 胞系は、哺乳類細胞に比べて維持費が安く、蛋白質産生量が多いため、大量の蛋 白質生産にはより適している。

昆虫由来の細胞系で発現する遺伝子はエクソン部を含まないことから、昆虫由来 の細胞系内での発現に先立って、エクソン部を切除しておかなければならない。

切除は比較的簡単に行われ、たとえば、オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的 突然変異法により直接的に行われ、または、ＣＤＮＡクローニングにより間接的 に行うことができる。

遺伝子の宿主への移入は、当該分野でよく知られた任意の方法により可能である 。たとえば、遺伝子移入法には、バクテリアや真核生物の場合の塩化カルシウム （ＣａＣ１２）媒介移入、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）媒介移入、レトロウ ィルスの潜伏感染を含むウィルス感染、エレクトロポレーション、リポソーム媒 介によるＤＮＡ移入、マイクロインジェクションなどが挙げられるが、これらに 限らない。

宿主により産生された蛋白質を精製する任意の適切な方法を用いて、本発明を実 施する。ウェッブ（Ｗｅｂｂ）ら「バキュロウィルス感染昆虫細胞において産生 されたヒトＣＤ４の細胞表面発現とその精製Ｊ　（Ｃｅｅｌ−ｓｕｒｆａｃｅ　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ 　ＣＤ４　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅＣ，ｔ ｅｄ　Ｉｎ５ｅｃ↑ｃｅ１１ｓ）Ｐｒｏｃ、、Ｎｏｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｕ、ＬＩ ＳＡ、８５ニア７３１−７７３５（１９８９）　；モラン（Ｍｏｒａｎ）ら「種 々のインフルエンザウィルスの抗原に特異的な抗体のＶ領域遺伝子の解析と交差 反応性イディオタイプｊ　（Ｃｈａｒａｃｉ、ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖａ ｒｉａｂＩｅ−Ｒｅｇｉｏｎ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　５ｈａｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｊｖｅ　１ｄｌｏｔｙｐｅｓ　。

ｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏ ｒ　Ｖａｒｉｏｕｓ　Ｉｎｆｂｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）Ｖｉｒ、Ｉａ＋ｗ ｕｎｏ１．．１：１−１２（１９８７）を参照されたい。

本発明は、ウィルス感染に対する細胞仲介型免疫応答を導くのにａ効である。こ こでは、ＨＩＶ感染細胞が本発明の利用例として挙げられているが、その他の疾 病にも応用することかでき、本発明の範囲に包括されると考えるべきである。

全ての薬剤と同様に、本発明における抗体の有効量は実験的に定められなければ ならない。考慮すべき因子としては治療すべき状態、抗体が毒物と複合体形成ま たは共有結合するか否かということ、薬剤組成物の投与法（すなわち、静注、筋 注、皮下性など）、投与回数が含まれる。このような因子は、当該分野で知られ ていることであり、過度の実験をせずにこれらの決定を下すことは医師の能力で 十分である。

以下の例は本発明を説明するものであるが、限定するものではない。

例１−ＤＮＡクローニング ＩｇＧのＤ領域をコードする２７ヌクレオチドを切除し、ＮＰエピトープに対応 する４５塩基を挿入する手順は、第４図に要約されている。全ての酵素は、メー カーの指示に従って使用した。にュー　イングランド　バイオラブズ（Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）　、マサチ ューセッツ）。特に述べていない限り、ＤＮＡクローニングはマニアティス（Ｍ ａｎｉａｔｌｓ）らの方法（１９８２）に従って実施した。

この方法を用いて、９１Ａ３抗ヒ酸塩抗体のＶＨ領領域Ｄ領域を、以下のいずれ かと置換する。

（ａ）ｇｐ１２０のシスティンループにあるＢ細胞エピトープの共通配列。この エピトープの配列は多様性があるが、ＨＩＶの２４１の培養株から得られた２４ ５の配列より推察することにより、共通配列が確立された。この共通配列のアミ ノ酸配列はｇ　ｐ１２０の３０１−３１９残基に対応し、次に示すものである。

Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−１ｉｅ−Ｈｉｓ−１ｉｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−１１ｅ− １１ｅ（ｂ）　ＨＩ　ＶのＨＸＢ２培養株中のｇａｇの１２−３５残基のＴ細胞 エピトープ。

Ｇｌ　ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ａｒ ｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙ ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉ　ｓ−１１ｅ−Ｖａ　１（ｃ）ＨＩＶ−１の 逆転写酵素のＴ細胞エピトープ。３２５−３４９残基。

Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｈｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ− １ｉｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ− Ｐｒ。

−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｖａ　ｌ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ端的に言えば、クローニ ングは、ｐＵｃ１９プラスミドのＥｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入しり５．５　ｋ 　ｂ　ノ９１Ａ　３　Ｖ　ＨＤＪをサブクローニングすることにより行った。２ ケ所の特有な制限酵素部位（ＮｃｏｌとＡｐｅＩ、６３ｇ塩基対離れている）が Ｄ領域を囲んでいることが明らかとなった。

第４図に示されるプライマーＰ１とＰ３は、対応する鎖と完全に相補性である。

しかし、Ｐ２はＤ領域の５′末端ヌクレオチドに至るまでの相補性鎖に適合する 。（黒塗り部）残りの３０ヌクレオチド（斜線部）がＮＰエピトープである。

プライマーＰ４は、Ｄ領域の５′末端ヌクレオチドに至るまでの鎖に相補的なヌ クレオチドを有する。適合しない残りのヌクレオチドは、ＮＰエピトープの３０ 塩基際に対応する。Ｐ２とＰ４の間で重複するヌクレオチドの中に、５ｐｒＩ制 限酵素部位が生じた。

酵素的ＤＮＡ増幅法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、 　ＰＣＲ）により、２個の断片が作られる。一連の反応で、プラスミドにＰ３プ ライマーおよびＰ４プライマーをアニーリングすることにより、５７０塩基対の 断片が作られる。他の一連の反応では、Ｐ１プライマー、Ｐ２プライマーをプラ スミドにアニーリングすることにより、３２Ｂ塩基対の断片が作られる。ＮＰへ の重複配列を切除するため、双方の断片は５ｐｅｌで消化される。ＮＰエピトー プの各々半部を含む２個の断片の連結（Ｉ　ｉｇａｔｆｏｎ）により、４５塩基 対のＮＰエピトープを枠にはめた形で含有する８７０塩基対が形成される。

次の段階は、当初のＰＵＣ１９−ＶＨＤＪ９１Ａ３と８７０塩基対の断片の両方 を制限酵素ＮｃｏＩとＡｐｅＩで消化する過程である。６５６塩基対の断片を消 化されたプラスミドへ組み込むことにより、Ｄ領域の代わりにＮＰエピトープを コードする領域を有するベクターが得られる。この５．５にメーカーの指示に従 い、遺伝子パルサー移入装置を用いて共移入を行った（バイオラド（Ｂｉｏｒａ ｄ））。プラスミドｐｓｖ２ｇｐ　ｔ−９１Ａ３−ＶＨＮＰＪ−ＣＩｇＧ２ｂと ｐＳＶ２ｎｅｏ−９１Ａ３Ｌとを非分泌ミエローマ細胞系５Ｐ２１０に共移入し 、ミコフェノール酸とジエネチシン（Ｇ　４１８）を用いて選択することにより 、９１Ａ　３−　Ｎ　Ｐキメラ抗体の合成と分泌が確認された。

５Ｐ２１０が、ＨＩＶエピトープを有するＨ鎖と元のし鎖で共移入されて、トラ ンスフエフトーマを作る。これらのトランスフエフトーマから産生される抗体は 、体液性または細胞性の抗ＨＩＶ免疫を誘起するのに用いられる。

例２−キメラ抗体の活性 ＮＰ特異的な細胞毒性Ｔ細胞のクローンは、ＰＲ８インフルエンザウィルスで免 疫されたＢａ１ｂ／ｃマウス内で産生され、５μｇのＮＰで被覆した放射線照射 膵臓細胞により、インビトロで増殖された。細胞毒性分析は　”Ｃｒで標識した 標的細胞とＮＰ特異的ＣＴＬを１０＝１の割合で４時間インキュベートして行っ た。標的細胞のＮＰによる被覆は、１０６個の細胞にペプチド５μｇを加えて３ ０分インキュベートし、洗浄後、イトウ（ＩＴＯ）らによるＪ、Ｉ＋ｎｕｎｏｌ 　。

Ｍｅｔ、、１０３　：　２２９（１９８７）に既に記載されているように”Ｃｒ を用いて標識した。

ＮＰペプチド（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＲＴＧＭＤＰ）はＨ−２に’の存在下に認識 されるＴ細胞エピトープであり、他方、ペプチド（ＩＡＳＮＥＮＭＤＭＥＳＳＴ Ｓ）はＨ−２ＤＩ′抗原の存在下に認識されるＴ細胞エピトープである。

結果は表１および表２に示す通りである。すなわち、インフルエンザウィルスエ ピトープを持つキメラＩｇはウサギ抗ＮＰ抗体に結合し、ヒ酸塩（ａｒｓｏｎａ ｔｅ＞への結合を失っている。これはと酸塩への結合能に重要な役割を果たすＤ 領域がウィルスペプチドに置換されたためである。

表　１ ｐＳＶ２ｇｐｔ−９１Ａ３ｇｐｔ−９１Ａ３ＶＨとｐＳＶ２ｎｅｏ−９１Ａ３Ｌ とで共移入されたＳ　Ｐ　２１０により産生された免疫グロブリンの免疫化学的 特性 ヒ酸塩への結合は、ヒ酸塩ＢＳＡまたはＢＳＡ単独でコートしたマイクロタイタ ープレートに抗体１０ｎｇを加えてインキュベートすることにより測定し、結合 抗体は＋２５　）ラット抗マウスに抗体により確認した。抗アイソタイプ抗体の 結合は、ラット抗マウスｋｍＡＢでコートしたプレート上に抗体Ｌｏｎｇを加え てインキュベートすることにより測定し、結合抗体は１２５１ヤギ抗マウスＩ　 ｇＧ２ｂ抗体を使って確認した。

表　２２ ９１Ａ３キメラ免疫グロブリンの結合特性（ｃｐ纏）ヒ酸塩−ＢＳＡへの結合は 、先に例１で述べた方法に従って行った。ウサギ抗ＮＰ抗体への結合は、アフィ ニティークロマトグラフィーで精製した抗ＮＰ抗体でコートしたマイクロタイタ ープレートにトランスフエフトーマの上清を加えてインキュベートして行い、結 合抗体＋２５Ｉヤギ抗マウスＩ　ｇＧ２ｂ抗体を用いて判定した。

ＮＰ特異的ＣＴＬは、キメラＩＧ遺伝子に移入された５Ｐ２１０を殺すことがで き、このことは、ＮＰエピトープは、ウィルスに感染した細胞中と同様に細胞表 面に発現していることを示唆している。

表３　（Ａ部）のデータより次のことが示される。ＣＴＬクローンは、ＮＰでコ ートされたｐ８１５細胞同様、ＰＨ１０およびＸ３１インフルエンザウイルスが 感染したｐ８１５細胞を殺すことができる。無関係のＮＰ　（Ｃ５７ＢＬ／６マ ウスのＣＴＬにより、Ｈ−２Ｄｂの存在下で認識されることが知られている）で コートされたｐ８１５細胞では有意の細胞死は見られない。表のＢ部は、キメラ Ｉｇ遺伝子を発現する、あるいはＮＰにコートされた５Ｐ２１０細胞を殺すＮＰ 特異的ＣＴＬの能力を示している。ｖＨｗ、ｖＬｗあるいはこの両遺伝子を発現 する細胞については細胞死は観察されなかった。しかし、５Ｐ２１０　Ｖ）Ｉｃ 　ＶＬＷ）ランスフエフトーマには明らかな細胞死が観察された。

表　３ ＶＨ−ＮＰキメラ遺伝子（Ｖ　１（ｃ）を有するプラスミドを移入した５Ｐ２１ ０細胞のＮＰ特異的ＣＴＬによる細胞死＊ＮＤ−実験せず　（ｎｏｔ　ｄｏｎｅ ）これらの結果より次のことが明らかである。ＣＴＬにより認識されるインフル エンザエピトープを有するキメラ免疫グロブリン遺伝子が移入された細胞は、Ｃ ＴＬにより殺る。

バイア１ノ、（”　ＣＤ４　ｊ’もＣＤ３　分鼾ＦＩＧ、　２ ←−２９５９−→１４１ト２９４−１４５１４２ト１３９−１２０００１ＦＩＧ 、　４ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０ ２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　アビブ、ザゴウアー二アメリカ合衆国　ニューヨーク州　１０ ０２８ニユーヨーク　アパートメント　７エイイー　８５ス　ストリート１５０ Ｉ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）２つのＣ領域（ＣＨ２およびＣＨ３）の少なくとも１つと、ヒンジ部 とを含み、それらがヒト免疫グロブリンに特徴的なＹ字型構造と同様の関係にジ スルフィド結合を介して連結されている基本領域，（ｂ）ペプチド結合により基 本領域に結合された第一の結合部位であって、ハイブリッド免疫グロブリンとヒ ト細胞毒性Ｔリンパ級との間に結合を形成することができ、細胞毒性Ｔリンパ級 を活性化することができる結合部位、および （ｃ）第一の結合部位と同一でなく、ペプチド結合により基本領域へ結合されて いる第二の結合部位、から成るハイブリッド抗体。
2. ２．第一の結合部位がＣＤ３に特異的に結合することを特徴とする請求の範囲第 １項記載のハイブリッド免疫グロブリン。
3. ３．第二の結合部位がヒト免疫不全ウィルスのコート蛋白質に特異的に結合する ことを特徴とする請求の範囲第１項記載のハイブリッド免疫グロブリン。
4. ４．体液仲介型および細胞仲介型の抗ウィルス免疫応答を誘起するウィルスエピ トープを有するキメラ免疫グロブリン。