JPH05501971A - 合成レンズの上皮化達成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成レンズの上皮化達成法 発明の背景 ■、技術分野 本発明は、上皮細胞の付着、生長、移動をｉｎ　ｖｉｔｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏの いずれにおいても支持する合成表面の改良法と、改良表面それ自体に関する。と りわけ、本発明は合成補綴装置、特にコンタクトレンズの組織接触表面を上皮細 胞の付着、生長、移動をよりよく支持するように改良する方法に関する。

本発明は補綴装置それ自体にも関する。

２、背景技術の簡単な説明 上皮組織下に完全あるいは部分的に移植することが必要な、あるいは望ましい補 綴装置が多数ある。ここでいうところの「上皮」組織とは表皮組織とその他の上 皮組織を含むと理解される。上皮下の移植は地組織へ適切な装置の固定を目的と して、あるいは美容上の目的で行われる。移植補綴の例としては義歯や矯義歯等 の歯科補綴。

補聴器、皮膚移植、過栄養と関連したもの等の血管進入装置、人工肛門形成装置 および補綴角膜がある。本発明は上皮上移植用の補綴角膜、特に上角膜水晶体レ ンズに関して記述するが勿論これに限定されるものではない。

合成上角膜水晶体レンズの永久的眼内移植は重篤な視力障害を矯正するための光 線角膜切開術等の手術に比べて大きな利点がある。合成上角膜水晶体レンズの移 植は、たとえば前房の損傷を伴わない。移植過程において、上皮膚を穿孔器と擦 過器で除去し、損傷部を削り取りレンズをはめこむ。

レンズが「再上皮化」して患者の視力が永久に矯正されることが期待される。「 再上皮化」とは上皮細胞の生長と移植（あるいは拡散）だけでなく、これらの細 胞の付着と安定化も意味する。

移植物の「再上皮化Ｊは種々の理由から重要である。

たとえば、移植物の長期固定を保証するために再上皮化は非常に重要である。新 しい細胞層は涙由来その他の物質のレンズ表面への沈着を防ぐバリヤとして働く 。残念ながら、補綴装置として形成された場合に有益な性質（安定性や免疫反応 がないこと等）を呈する多（の物質は、上皮細胞の生長、移動、付着を適正に支 持しない。

本発明の方法と改良合成表面は、上皮細胞のｉｎ　ｖｉｔｒ。

での生長にも有用である。

実験室で培養した上皮細胞は本発明によって改良した表面上で、ｉｎ　ｖｉｖｏ の上皮細胞の増殖パターンと非常によく似た付着、生長、移動を呈する。

発明の概要 一面では、本発明はナイトレン基へ転化可能なペンダント官能基を有するポリマ ーを含む表面改良組成物を合成表面に適用し、上記官能基をナイトレンへ転化し 、それにより表面改良組成物を合成表面へ共有結合させることから成る合成表面 の改良法に関する。本表面改良組成物は随意に上皮細胞の付着、生長、移動を支 持するあるいは増進する物質を含む。

もう−面では、本発明はナイトレン基へ転化可能なペンダント官能基を有するポ リマーから成る表面改良組成物を合成表面に適用し、上記官能基をナイトレンへ 転化し、それにより表面改良組成物をポリマー表面に共有結合させることによっ て合成表面を改良し、その後上皮細胞支持被覆剤を改良合成表面に適用すること から成る上皮細胞支持被覆剤による合成表面の被覆方法に関する。

好ましい実施例では、天然組織にさらによく似せるように、上皮細胞支持被覆剤 を多層被覆する。被覆剤が安定化しタンパク分解酵素の作用に耐えるように、こ れを架橋結合させてもよい。

本発明は改良合成表面それ自体にも関する。従って、本発明の一面は、合成表面 と、合成表面に共有結合して上皮細胞を支持できる表面改良組成物から成る、上 皮細胞の付着、生長、移動を支持する改良合成表面に関する。

もう−面では、本発明は合成表面９合成表面に共有結合する表面改良組成物およ び改良表面上に処理された上皮細胞支持被覆剤から成る上皮細胞の生長と移動を 支持する改良合成表面を提供する。

本発明は、表面改良組成物を共有結合させた補綴装置、複数のペンダントアミノ 基あるいはカルボキシル基を有するポリマーより成る表面改良組成物、およびそ の上の上皮細胞支持被覆剤から成るヒトあるいは動物用の処理済上皮下移植用装 置も提供する。

特に好ましい具体例では、本発明は合成レンズと、レンズに共有結合する表面改 良組成物でＮ−ヒドロキシ−スクシニミジル−４−アジドベンゾエートあるいは メチル１−４−アジ１ベンゾイミデートから誘導したペンダント基を含むよう修 飾したりジンポリマーから成る表面改良組成物、および表面改良組成物に結合し 上記処理レンズの露出表面を処理する上皮細胞支持被覆剤から成る処理済上角膜 水晶体レンズを提供する。

上皮細胞支持被覆剤は表面改良組成物と共有結合することが望ましい。上皮細胞 支持被覆剤は常態で架橋結合している場合もある。

好適実施例の詳細な説明 本発明によれば、通常はタンパク質の結合にあまり適合しない合成表面が表面改 良組成物の適用によりタンノ々り質結合によりよ（適合するようになる。本発明 のこの面は広範囲の合成表面に適用できる。本詳述では移植用レンズに一般的に 用いられるＮ−ビニルピロリドン／メタクリル酸メチル共重合体等のヒドロゲル に関して本発明を記述するが、これに限られるものではない。本発明により改良 できる他のヒドロゲルには、アクリル酸２−ヒドロキシエチル重合体（例ｐｏｌ ｙｍａｃｏｎ）　、メタクリル酸２−ヒドロキエチルの種々の共重合体（例ｈａ ｆｉｌｃｏｎＡ、　Ｂ、　ｖｉｆｉｌｃｏｎ　Ａ、　ｔｅｔｒａｆｉｌｃｏｎ、 　ｄｉｍｅｆｉｌｃｏｎ。

ｂｕｆｉｌｃｏｎ、　ｐｅｒｆｉｌｃｏｎ等）、Ｎ−ビニルピロリドンの共重合 体（例１ｉｄｏｆｉｌｃｏｎ　Ａ、　Ｂ、　５ｃａｆｉｌｃｏｎ　Ａ、　５ｕｒ ｆｉｌｃｏｎ、　ｖｉｆｉｌｃｏｎ、　ｆｉｌｃｏｎ　ＹＡ等）、およびコラー ゲン含有ヒドロゲル、たとえば合衆国特許第４．４５２．９２５号および４、３ ８８．４２８号オヨびＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、Ｕ　Ｓ　Ａ、　７７　（Ｉｔ　４　） 、２０６４−２０６８　（１９８０）に記載のものがある。

本発明は血管移植物の表面改良にも有用である。このような移植物は、たとえば ダクロン、ポリウレタン、ポリプロピレン、シリコン、架橋結合コラーゲン、コ ラーゲン形成合成物あるいはリン脂質ポリマーから作られる。

ヒドロゲルは透水性と、透水性による酸素、グルコースその他の栄養素と代謝物 の運搬能力があることから、上角膜水晶体レンズの好ましい構成成分である。

本発明の方法による向上される他の合成表面には組成培養皿がある。

表面改良組成物は実際には複数のペンダント基を有するすべてのポリマーを基部 とすることができる。好ましいポリマーは、複数のペンダントアミノ基やカルボ キシル基を含むもので、たとえばポリ（リジン）のようなポリ　（アミノ酸）が ある。たとえばポリエチレンイミンといった他のポリアミンや、アミン含有率の 高い他の化合物も用いることができる。代わりに、カルボキシル含有率の高い生 物学的適合性化合物を用いてもよい。

表面改良組成物に用いられるポリマーの分子量や鎖長は本発明にとって重要では ない。たとえば、９０．０００から４９０、０００ダルトンのポリーＬ−リジン とポリーＤ−レジンを本発明の表面改良法に用いて好結果が得られている。

さらに分子量の低い（あるいは高い）ポリマーも有用である。

安定性の高い改良表面を提供するため、表面改良組成物を合成表面に共有結合さ せる。共有結合は適当な結合剤によって得られる。一般に複数のペンダント基を 有するポリマーを基部とする表面改良組成物では、まずペンダント基が反応性の 高い基を作りうる官能基に転化される。次にポリマーは、光分解によることが好 ましいが、基をその対応する反応性の高い官能基に転化することにより合成表面 に共有結合する。こうして反応性の高い官能基が合成表面と共有結合する。

合成表面は表面改良組成物の適用前に誘導体化あるいはその他の特殊な処理を必 要としないという利点がある。

しかしメチルアルコール溶液（これは共重合体の膨張をひきおこす）でヒドロゲ ル表面を前処理すると結合が増強されるので、本前処理が推奨される。

１つの好ましい結合方法は、ナイトレンその他の反応性の高い基に転化可能な部 分を含む官能基によってペンダントアミノ基の約１０モルパーセントが修飾され たポリ（リジン）を基部とする表面改良組成物を合成表面に共有結合させること である。ナイトレン基は合成表面との反応性が高い基であり、アジド（−Ｎ３　 ）基の光分解等によって形成される。

ポリ（リジン）ポリマーのペンダントアミノ基部分はりジンポリマーをアミノ反 応基とアジド基を含む多官能基化合物であるＮ−ヒドロキシスクシニミジル−４ −アジドベンゾエート（ｒＨ８ＡＢＪ　）と反応させて誘導できる。ヒドロゲル レンズをＨ８ＡＢ誘導ポリ　（リジン）とインキュベーションし、ＵＶ光（一般 には２６５−２７５ｎｍ）で光分解することによりポリ（リジン）鎖がヒドロゲ ルに共有結合する。ポリマー鎖間での架橋結合も起こる。メチル１−４−アジド ベンゾイミデート（ＭＡＢＩ）もリジンポリマーを改良するもう一つの有用な化 合物である。当該技術分野の専門家は他の適当な多官能基結合剤を選択すること ができるだろう。

本発明は表面改良組成物中への種々の他物質の包含も提供する。望むなら、組成 物は傷の治ゆを促進する薬剤その他の物質を含むこともできる。たとえば、抗生 物質を表面改良組成物中に分散させることができる。適当な抗生物質にはゲンタ マイシン、ネオマイシン、バシトラシン等がある。加えて、他の抗菌剤、抗ウィ ルス剤、抗炎症剤、蛋白分解酵素抑制剤、ホルモン、ビタミン、鎮痛剤、キレー ト剤、細胞分裂促進剤（成長因子を含む）等も表面改良組成物中に組み込むこと ができる。

表面改良組成物への組み込みが好ましい物質は上皮細胞の付着、生長、移動を支 持することが知られている生物学的物質である。このような物質をここでは「上 皮細胞支持」物質とする。表面改良組成物に組み込む物質は修飾や誘導体化を必 要としないという利点がある。有用な天然の非誘導体化物質にはＩ、Ｉ［Ｉ、Ｉ Ｖ、その他の型のコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、硫酸コンドロイチ ンおよび実質的には合成表面への共有結合が望まれる全てのタンパク質その他の 望ましい物質が含まれる（がこれに限るものではない）。望むなら、これらの物 質はＨ８ＡＢ−改良ポリ（リジン）と結合させヒドロゲルに適用する前に、変化 、誘導体化、あるいは架橋結合させてもよい。光分解で、含有物質はポリ（リジ ン）に付帯するナイトレン基の一部により架橋結合するが、ポリ（リジン）に付 帯する残りのナイトレン基はレンズ表面に共有結合する。このようにしてレンズ （あるいは他の合成表面）は表面改良組成物の共有結合付着層で被覆される。

誘導体化ポリ（リジン）分子は本来のポリ（リジン）を適当な条件下で二官能基 架橋結合剤Ｈ３ＡＢとインキュベーションして調製する。未反応の架橋結合剤は 限外ろ過あるいは透析等の非破壊的な他方法により除去する。

ポリ（リジン）のみならず、光照射により反応性の高い基を形成しうる第二基を 含む二官能基架橋結合剤に結合できる他のポリマーも本方法に用いることができ る。

実施例Ｉ Ｈ８ＡＢ誘導ポリ（リジン）を実施例５に詳述する方法に従い調製する。Ｈ８Ａ ＢはＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、 　ＩＬ、　ＵＳＡより入手できる。Ｎ−ビニルピロリドン、メタクリル酸メチル の共重合体から調製したヒドロゲルレンズを前面を上にしてチャンバー内に入れ ＨＳＡＢ誘導ポリ（リジン）溶液（２，０から１０．０■／ｄ。

５、０■／−が好ましい）（以後これをｒ　ＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓ」とする） とインキュベーションするが、被覆処理中ヒドロゲルを膨張させるために１０− ２０％ＭｅＯＨを添加してもよい（しなくてもよい）。その後レンズにＵＶ光を １被覆につき４から１０分間、５から１０回照射する。その後レンズを純水、塩 水あるいは０．０５Ｍ氷酢酸の水溶液に抽出し未結合ＨＳ　Ａ　Ｂ−１）ｌｙｓ を除去する。

ロットから取った試験レンズ上の被覆剤は、ヒドロゲルレンズ上に共有結合した Ｈ　Ｓ　Ａ　Ｂ　−ｐｌｙｓだけを可視化する新規のＣｏｏｍａｓｓｉｅ”　染 色／脱色法により、確認することができる。被覆レンズと対照（非被覆）レンズ をＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーＲ（Ｓｉｇｍａ　Ｂ−０６３０）０． １から０．２５％（ｗ／ｖ）、氷酢酸７から１０％、メタノール２５％の水溶液 から成る染料中に浸す（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ２２７、 ６８０．（１９７０）参照）。あるいは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブル ーＲＯ，Ｉから０．２５％（ｗ／ｖ）、氷酢酸Ｏから１０％、メタノール４５％ 、アセトン４５％（平衡水、メタノールおよび／あるいはアセトン）から成る染 料を用いてもよい。Ｌａｅｍｍｌｉ法では重要なタンパク質をアクリルアミドゲ ルに固定するため氷酢酸を用いるが、本方法ではポリ（リジン）が合成表面に共 有結合するので酢酸の使用は必要ない。

レンズを染料中で２０分から３０分間インキユーベーショコンる。レンズを０か ら１０％（Ｗ／Ｖ）氷酢酸、４５％メタノール、４５％アセトン（平衡水、メタ ノールおよび／あるいはアセトン）から成る脱色溶液で２０分間３回（あるいは 対照レンズが完全に透明になるまで）抽出し未結合Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料を除 去する。アセトンは未結合染料の解離促進に都合がよいようにヒドロゲルを膨張 させる。この染色／脱色条件下で未結合Ｈ５ＡＢ−ｐｌｙｓ（あるいはｐｌｙｓ のみ）はレンズから除去され、ポリ（リジン）が共有結合しているレンズだけが 染料を保持する。

ＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓだけによる表面改良を行ったこのレンズは上皮細胞に接 合できるが、細胞はうまく広がらないようである。従って、上皮生長を支持する ためこのポリ（リジン）にコラーゲンその他の上皮細胞支持物質を結合させるこ とが望ましい。これは上皮細胞改良組成物に上皮細胞支持物質を組み込むことに より一段階で、あるいは表面改良組成物上に上皮細胞支持被覆を施すことにより 数段階で成しとげられる。

上述した脱色溶液の変種は可能である。一般に、アセトン１０−４５％、メタノ ール２５−４５％、　ｇｌｙｍｅ（ジメトキシエタン）１０−２５％、平衡水お よび／あるいは氷酢酸（ＨＯＡｃ　）を含む脱色溶液がヒドロゲル（あるいは他 のポリマー）を膨張させて未結合Ｃｏｏｍｓｓｉｅ型染料を除去す型染上に有用 である。特定例を以下に示すが数字はすべてパーセント（ｗ／ｖ）である： アセトン　メタノール　水　氷酢酸　Ｇｌｙｍｅｌ）　４５　４５　０−１０　 ０−１゜脱色溶液中のアセトン成分はヒドロゲルのポリ（メタクリル酸メチル） 成分を軟化し未結合染料の解離を促す溶媒として機能すると思われる。同様に機 能する他の溶媒をアセトンの代りに、あるいはアセトンを併用して用いてもよい 。勿論、特定溶媒の選択は本発明に従って処理される合成表面の組成に基づいて なされる。

実施例２ 一段階法では、ＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓと非修飾コラーゲンを下記の方法で同時 にヒドロゲル表面に共有結合させる。

ヒドロゲルレンズをＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓとコラーゲン１．ＩＩＩおよび■の 混合物（フィブロネクチン、ラミニン、硫酸コンドロイチンその他の望ましい物 質を随意に併用）をＨ８ＡＢ−ｐｌｙｓ：：＋ラーゲン重量化１００：１からｌ ：１００の範囲で（あるいはポリ（リジン）上のＨ８ＡＢの一部をヒドロゲルレ ンズへの結合に、また一部をコラーゲンへの結合に用いることのできる他の比率 で）含有する溶液とインキュベーションする。照射によってレンズ上に多数（５ −１０）被覆剤を結合させる。タンパク質被覆剤は上述したように染色により可 視化できる。コラーゲンその他の物質をポリ（リジン）染色と区別するために別 個の特異的染料を用いてもよいが、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色により実施例Ｉに記 述した方法を用いてコラーゲン／ポリ（リジン）被覆剤とポリ（リジン）被覆剤 の識別もできる。

コラーゲンとポリ（リジン）がヒドロゲル表面に共有結合していることをさらに 証明するため、これらの被覆レンズをオートクレーブ処理すると、コラーゲン／ ポリ（リジン）被覆の保持が染色処理により認められる。

しかし、このようなオートクレーブ処理レンズでの細胞培養結果は陰性で、細胞 はこのようなレンズ上には付着あるいは拡散しない。従って、コラーゲンはオー トクレーブ処理で変性した場合でも、ヒドロゲル表面に依然として共有結合して いる。

実施例３ 二段階法で、ＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓとコラーゲン（あるいは他分子）がヒドロ ゲル表面に結合させる。まず、Ｈ８ＡＢ−ｐｌｙｓを上述したようにＵＶ光の存 在下でヒドロゲルとインキュベーションして表面に共有結合させる。次に、コラ ーゲンやカルボキシル基を含有する他分子を、コラーゲンを結合ポリ（リジン） に架橋結合させることによってヒドロゲルレンズに結合させる１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピルノ力ルポジイミド（ｒＥＤＣｌ　Ｐｉｅｒｃｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ、　ＵＳＡよ り入手できる）あるいは他のカルボジイミドのような架橋結合物質の存在下で、 ポリ（リジン）被覆レンズとインキュベーションする。ポリ（リジン）の代りに 他の誘導ポリマーを用いてヒドロゲルレンズに共有結合させる場合は、ポリマー の官能基を上皮増殖を支持する物質あるいは他の望ましい分子に架橋結合させる ことのできる他の架橋結合物質を選択する。従って同種二官能基架橋結合物質と 異種二官能基架橋結合物質のいずれも適当なところで用いることができる。多重 被覆（４−５）はこのようにして表面上に共有結合する。塩水あるいは塩水中１ ００から５００μｇ／−硫酸ゲンタマイシン溶液による大量抽出を行い非共有結 合物質および試薬を除去する。

ＥＤＣ架橋結合は標準どうり低いｐＨで行うか、あるいは被覆剤にめられること のあるラミニンや基底膜抽出物のような反応性の高い分子や物質をゆっくり結合 させるための共反応物としてＮ−ヒドロキシスルホスクシニミド（ｒｓｕｌｆｏ −Ｎ　ＨＳ　Ｊ　これもＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから 入手できる）を用いて生理学的ｐＨで行うこともできる。ラミニンは中性ｐＨで のＥＤＣ架橋結合中に添加できる。

ＥＤＣ／コラーゲン／低ｐＨ混合物とレンズをインキュベーションした後、結合 させるラミニンその他の反応性の高い分子の添加前にｐｌ（を上げる。

ポリ　（リジン）とコラーゲン（や他の上皮細胞支持物質）で共有結合被覆した 上記レンズは、コラゲナーゼ活性に対して安定化し、上皮移動にさらに望ましい 被覆を提供するため、さらにグルタルアルデヒドのみ、あるいはグルタルアルデ ヒドとシアン水素化臭素ナトリウムに架橋結合させることができる。被覆レンズ は低濃度グルタルアルデヒド溶液（０゜２％）、および／あるいは高濃度溶液（ ２，０％まで）、あるいは地濃度溶液と、リン酸ナトリウム／塩化ナトリウム緩 衝液中で架橋結合する。本レンズは大量抽出され、ホウ酸塩／グリシン緩衝液で 処理し未反応グルタルアルデヒドを中和する。未結合物質は上述したように塩水 あるいは塩水中値酸ゲンタマイシンの水溶液中の大量抽出で除去する。このよう なレンズのコラゲナーゼ消化に対する被覆安定性は、グルタルアルデヒド被覆を 施さない対照レンズより大きく、これは染色／脱色法で可視化される。細胞培養 および動物試験（ウサギとネコ）でこのレンズはよく機能し、０．２から２．０ ％の濃度のグルタルアルデヒドとの後あるいは中間架橋結合は上皮細胞生長を阻 止することはなく、それどころか上皮細胞生長を促進することが示される。この レンズをさらにシアン水素化臭素ナトリウムで処理してグルタルアルデヒドで形 成された架橋結合をさらに安定化しても（経時的な逆戻りを防ぐため）」１皮細 胞生長は妨げられない。

さらに、ポリ　（リジン）表面改良剤とコラーゲン層（および随意にフィブロネ クチン、ラミニン、その他の望ましい物資も含む）を有し、続いてグルタルアル デヒド処置を行った上記レンズに、さらに上皮細胞生長を支持するためコラーゲ ン■、■および／あるいは■、ラミニン、フィブロネクチン、あるいはこれらの 併用あるいはその他の適当な分子の追加被覆を上述した方法で結合させることが できる。追加被覆により拡散する上皮細胞にとってより自然に近い表面か与えら れる。望むなら、この特別被覆にも架橋結合段階（たとえばグルタルアルデヒド で）を行い全被覆をさらに架橋結合することもできる。上述のように処理したヒ ドロゲルレンズは細胞培養１−２日で１００％の細胞集合を与える。

ウサギに移植すると、レンズは４−７日間で本質的に完全に再上皮化される。

下記の実施例は本発明の実践をさらに例示するよう意図されたもので、その範囲 を制限するつもりは全くない。

実施例４ カルボキシル基を有するヒドロゲル表面へのコラーゲンの直接結合。

本実施例におけるヒドロゲルはビニルピロリドンとメタクリル酸メチルから成り 、カルボキシル官能基源と・してメタクリル酸を含むポリマーである。コラーゲ ンはＩ型、子牛革、２．５■／−を酸性溶液で供給する。ヒドロゲルをコラーゲ ンおよびＥＤＣとｐＨ４のリン酸ナトリウム緩衝液中室温で１時間インキュベー ションした後すすいだ。タンパク質染色で見られるように、ヒドロゲルはタンパ ク質の薄被覆を獲得した。

実施例５ 異種二官能基架橋結合物質、Ｈ８ＡＢで誘導したポリーＬ−リジンの調製 ポリーＬ−リジン（４９０，０００ダルトン）、　５００■を０．５Ｍトリエタ ノールアミン、　０．２Ｍ　ＮａＣ１緩衝液、ｐｆ（８１−８，４，９５ｒＩＴ ｌに溶解する。利用できる総アミン基に対してモル比ｌＯ％のＨ３ＡＢを少量の ＤＭＦ　（３Ｊ）に暗所で溶解する。次にＤＭＦ中Ｈ３ＡＢをポリーＬ−リジン に撹拌しながら加え、暗所４℃で２時間、あるいは５ｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎ カラムを用いたＨＰＬＣにより結合過程の終了か確認されるまでインキュベーシ ョンするＨ８ＡＢ−誘導ポリ−Ｌ−リジン（ＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓ）を限外ろ 過による数回の交換で水中へ移行させ滅菌ろ過し、使用するまで４℃で暗所に保 存する。

実施例６ ＵＶ光照射によるＨ５ＡＢ−ポリーＬ−リジンの官能基のないヒドロゲル表面へ の結合 ヒドロゲル（カルボキシルあるいはアミン官能基のないビニルピロリドン、メタ クリル酸メチルの共重合体）をＨ８ＡＢ−ｐｌｙｓ（実施例５のもの）の５■／ −溶液とインキュベーションしＵＶ光で１０分間光分解する。溶液を交換し、本 処理を計ｌＯ回反復しポリーＬ−リジンの１０重被覆をレンズ表面と被覆自体へ 、共有結合させる。

レンズを大量の水ですすぎ細胞培養に植えつけるか、ウサギに移植する。細胞培 養の結果、第２−５日までに４０％までの表面への付着を示す細胞の分離斑点が 見られる。この結果は細胞付着が達成されても、細胞の拡散はこの表面では達成 されないことを意味する。ラビット移植は安定していたが、レンズ表面の上皮化 は起きなかった。

実施例７ ＵＶ光照射によるＨ８ＡＢ−ポリーＬ−リジンとコラーゲンの官能基のないヒド ロゲル表面への同時結合。

ヒドロゲルレンズを、コラーゲン濃度２■／−で、コラーゲンＩＶ：Ｈ８ＡＢ− ｐｌｙｓのモル比を１０：　１．３０：　ｌ。

および１００：ｌで含有する溶液とインキュベーションした。ＵＶ光を１０分間 照射して１０重の被覆を施した。この被覆を施したレンズは細胞培養で上皮増殖 を支持し、被覆は第１日までに８５−９０％、第４日までに１００％であった。

ウサギ移植は第２日までに穿孔器傷までの上皮生長を示し、最高で第６日までの 上皮被覆が３５％で、その後第８日までに上皮はレンズから完全に退去した。

実施例８ 被覆ヒドロゲルレンズとグルタルアルデヒドとの架橋結合 レンズを実施例７のようにコラーゲン■対ＨＳＡＢ−ｐｌｙｓ　１５：　１でＵ Ｖ光で被覆処理した。その後、被覆レンズを０，５Ｍリン酸ナトリウム、０．１ ５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７，４緩衝液中０．２％グルタルアルデヒド溶液と２ 回、４５分間インキュベーションした。レンズを注射用水ですすぎ、０．０５Ｍ ホウ酸ナトリウム、０．０２５Ｍグリシン溶液と３回、各２０分間インキュベー ションし、続いて大量の水性溶液ですすいだ。このレンズは細胞培養で、上皮増 殖を支持し第１日までに９０％、第２日までに１００％の被度を示した。ウサギ 移植では第３日から第８日までにレンズの最高被度４０％を示し、第１４日まで に０％へ退行した。ネコ移植では５週間後に７０％の安定した最高被度を示し、 ３日間で５０％へ退行し突出した。

実施例９ ヒドロゲルレンズ被覆剤への１％硫酸コンドロイチンの添加。

レンズを実施例７と同様にＵＶ光を用いて各被覆毎５分間のＵＶと、コラーゲン ２．０■／ｍｌと硫酸コンドロイチン０．０２■／−を含有する細胞支持物質と ＨＳＡＢ−ｐｉｙｓを１５＋１の比率で用いて１０回被覆処理した。

レンズを実施例８のようにグルタルアルデヒド処理した。ウサギ移植結果は実施 例８と同様で、第４日までに最高被度４０％、第９日までに２０％へ退行した。

実施例１０ コラーゲン：ポリ−リジン被覆レンズへのカルボジイミド結合によるコラーゲン 被覆の追加。

実施例７と同様にしてコラーゲンＩＩＶ　：　ＨＳＡＢ−ｐｌｙｓをモル比１５ ：１で用いて９−１０回被覆処理してレンズを調製した。その後このレンズを酸 性条件下でコラーゲン■２．０■／−とＥＤＣ１９，２■／−と共にインキュベ ーションし各２０分間４回被覆処理した。これ以上の追加処理をしないレンズと 、重量比１％で硫酸コンドロイチン（Ｃ８）、フィブロネクチン（Ｆｎ）、ある いは硫酸コンドロイチンとフィブロネクチンを追加処理したレンズがあった。レ ンズを実施例８のようにグルタルアルデヒドで処理した。後続のＥＤＣ被覆処理 によるレンズ結果を表１に示す。表記したパーセントは再上皮化率である。

表　１ コラーゲン■ニー細胞培養、第２日までに８０％、第６日までに９０％、健常細 胞 一ウサギ移植、第７までに８５％、第８〜９日まで（こ１００％、第１４日まで に１０％へ退行 コラーゲン■ ＋１％ＣＳニー細胞培養、第２日までに８０％、健常細胞コラーゲン■ ＋１％Ｆｎニーウサギ移植、第４日までに１００％、第８日までに９０％、第１ ４日までに１０％へ退行＋１％ＣＳニー細胞培養、第２日までに８０％、第６日 までに９５−９８％、球状化細胞が認められる一ネコ移植、上皮被度１００％、 最終観察時の３０週１まで安定 実施例１１ 実施例８のように被覆処理したレンズへの下記の種々の他処理（ｌ−７型）によ るＵＶでのＨＳ　Ａ　Ｂ−ｐｌｙｓ。

中性ｐＨＥＤＣ被覆、ラミニン、２゜θ％グルグルアルデヒド架橋結合およびコ ラーゲン■、硫酸コンドロイチン。

ラミニンの付加ＥＤＣ保護膜の追加 全レンズを以下の方法で被覆処理した（１−７段階）１．１０％ＭｅＯＨでのＨ ＳＡＢ−ポリーＬ−リジンの５回のＵＶ被覆処理、各４分間照射。

２、コラーゲンＩ：Ｈ８ＡＢ−ポリ−Ｌ−リジンを重量比１２：ｌで１０回被覆 処理、コラーゲン１■／−でステップｌのように照射 ３、コラーゲン■２■／−とラミニン００とＥＤＣ／ＮＨ３−スルホ”　ｐＨ７ ，４の４回被覆処理。

４、実施例８の条件下で０．２％グルタルアルデヒド−晩。

５、同一条件で２．０％グルタルアルデヒド４５分間。

６、コラーゲン■、ラミニン、０．２％硫酸コンドロイチンとＥＤＣ／ＮＨＳ− スルホｐＨ７，４で２回被覆処理。

７、下記の変更あるいは追加処理のうち一つ。

ｌ型：後続処理なし ２型：第一、第二段階でポリーＤ−リジンを用いた。

３型：第三段階の最初の三回の被覆処理の間に非誘導ポリ−リジンのＥＤＣ／Ｎ Ｈ３−スルホ被覆を加えた。

４型：全被覆処理後（上記第６段階後）、実施例８と同一条件下での２．０％グ ルタルアルデヒド架橋結合。

５型：４型の２．０％グルタルアルデヒド段階の後、シアン水素化臭素ナトリウ ム処理＠９＠ ６型：全被覆処理後（上記第６段階後）シアン水素化臭素処理のみ ７型：被覆表面を粗（するため被覆処理前にレンズを食刻した。

＊　ＥＤＣ／ＮＨ３−スルホはリン酸ナトリウム緩衝液中Ｅ　Ｄ　Ｃ１９，２ｍ ｇ／ｒｒｌ、　ＮＨＳ−スルホ９．６ｍｇ／−を含む中性ｐＨ溶液。

零零　ラミニンはコラーゲン混合液にラミニン１３μｇ／ｒｎｌを加えて供給し た。

ｍ　シアン水素化臭素ナトリウムは５０ｍＭのシアン水素化臭素ナトリウムを０ ．５　Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，４に加えて供給した。

得られた結果は以下のとうりである： ｌ型から６型のレンズをウサギに移植した。５型の最良レンズは第８日までに９ ８％の被度を達成し第６２日現在７５％の被度を維持した。４型の最良レンズは 第７日までに８０−８５％の被度を達成し第２９日現在７０％の被度を維持した 。３型の最良レンズは第６日までに７０−７５％の被度を達成し第２２日現在６ ０％の被度を維持した。ｌ、２および６型のレンズは最高上皮細胞被度が約７０ ％で、第４０日までに１５％以下に退行した。

本発明を、ある好ましい具体例と特定の実施例に関して記述してきたが、これに 限られるものではない。添付するクレームの範囲内における変種は当該技術分野 の専門家に容易に理解されるであろう。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成　４年　３ 月１３日

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．移植補綴装置の合成表面を改良する方法で、ａ）前記合成表面に共有結合で きる反応性官能器への転化か可能なペンダント基を有するポリマーから成る表面 改良組成物を前記合成表面に適用すること；とｂ）前記ペンダント基を反応性官 能基へ転化し、それによって前記表面改良組成物を前記合成表面に共有結合させ ること；から成る方法。
2. ２．前記補綴装置がレンズであることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．前記表面改良組成物がペンダントアジド基を有するポリマーから成ることを 特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
4. ４．前記表面改良組成物がポリ（アミノ酸）から成ることを特徴とする請求の範 囲１に記載の方法。
5. ５．前記アミノ酸かリジンであることを特徴とする請求の範囲４に記載の方法。
6. ６．前記表面改良組成物がナイトレン官能基へ転化可能なペンダント基を約１０ モルパーセント含む修飾ポリ（リジン）から成ることを特徴とする請求の範囲１ に記載の方法。
7. ７．前記ペンダント基がアジド基から成ることを特徴とする請求の範囲６に記載 の方法。
8. ８．前記ペンダント基がＮ−ヒドロキシ−スクシニミジル−４−アジドベンゾエ ートあるいはメチル１−４−アジドベンゾイミデートから誘導したものであるこ とを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。
9. ９．前記転化段階が前記表面改良組成物に光照射することから成ることを特徴と する請求の範囲１，６あるいは８いずれか１項に記載の方法。
10. １０．前記表面改良組成物がさらに上皮細胞支持物質を含むことを特徴とする請 求の範囲１に記載の方法。
11. １１．前記上皮細胞支持物質がコラーゲンＩ，コラーゲンＩＩＩ，コラーゲンＩ Ｖ，フィブロネクチン，硫酸コンドロイチンおよびラミニンのうち一つ以上を含 むことを特徴とする請求の範囲１０に記載の方法。
12. １２．合成表面を上皮細胞支持被覆剤で被覆処理する方法で、 ａ）合成表面に共有結合できる反応性官能基への転化が可能なペンダント基を有 するポリマーから成る表面改良組成物を前記合成表面に適用すること；と、ｂ） 前記ペンダント基を反応性官能基へ転化し、それによって前記表面改良組成物を 前記ポリマー表面に共有結合させることが前記合成表面を改良すること；と、ｃ ）続いて上皮細胞支持被覆剤を前記改良合成表面に適用すること；から成る方法 。
13. １３．上記のｃ）段階が前記上皮細胞支持被覆剤を前記表面改良組成物に共有結 合させることから成ることを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
14. １４．前記共有結合が共有結合剤によって遂行されることを特徴とする請求の範 囲１３に記載の方法。
15. １５．前記架橋共有結合剤が（１−エチル−３−（３−ジメチル）−アミノプロ ピル）カルボジイミドを含むことを特徴とする請求の範囲１４に記載の方法。
16. １６．上皮細胞の付着，生長および移動を支持する改良合成表面で； ａ）合成表面； ｂ）前記合成表面に共有結合することにより前記合成表面を改良する表面改良組 成物；およびｃ）前記改良表面に処理した上皮細胞支持被覆剤；から成る改良合 成表面。
17. １７．前記上皮細胞支持被覆剤が前記表面改良組成物に共有結合することを特徴 とする請求の範囲１６に記載の改良合成表面。
18. １８．前記上皮細胞支持被覆剤が（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプ ロピル）カルボジイミドから誘導した官能基によって前記表面改良組成物に共有 結合することを特徴とする請求の範囲１６に記載の改良合成表面。
19. １９．前記表面改良剤が複数のペンダントアミノ基あるいはカルボキシル基を有 するポリマーを基部とすることを特徴とする請求の範囲１８に記載の改良合成表 面。
20. ２０．前記ポリマーかポリ（アミノ酸）から成ることを特徴とする請求の範囲１ ９に記載の改良合成表面。
21. ２１．前記上皮細胞支持被覆剤が架橋結合していることを特徴とする請求の範囲 １６に記載の改良合成表面。
22. ２２．処理済上角膜水晶体レンズで、 ａ）合成物質から成るレンズ； ｂ）前記レンズに共有結合する表面改良組成物で、Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミ ジル−４−アジドベンゾエートあるいは１−４−アジドベンゾイミデートから誘 導したペンダント基を含むように修飾したリジンポリマーから成る表面改良組成 物；および、 ｃ）前記表面改良組成物に結合する上皮細胞支持被覆剤；から成るレンズ。
23. ２３．前記上皮細胞支持被覆剤が前記表面改良組成物に共有結合していることを 特徴とする請求の範囲２２に記載のレンズ。
24. ２４．前記上皮細胞支持被覆剤が架橋結合していることを特徴とする請求の範囲 ２３に記載のレンズ。
25. ２５．前記上皮細胞支持被覆剤が、コラーゲンＩ，コラーゲンＩＩＩ，コラーゲ ンＩＶ，ラミニン，フィブロネクチンおよび硫酸コンドロイチンのうち一つ以上 を含むことを特徴とする請求の範囲２４に記載のレンズ。
26. ２６．メタクリル酸メチル含有ヒドロゲル表面に共有結合するタンパク質および ポリ（アミノ酸）を可視化する染色／脱色方法で、 ａ）Ｃｏｏｍａｓｓｌｅブルーを含む染料溶液でヒドロゲルを染色すること；と 、 ｂ）メタクリル酸メチルの溶媒を含む脱色溶液で脱色すること；から成る方法。
27. ２７．前記脱色溶液がアセトンを含むことを特徴とする請求の範囲２６に記載の 方法。