JPH05500748A - 真核細胞系でのヒトプラスミノーゲンの発現方法および物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「真核細胞系でのヒトプラスミノーゲンの発現方法および物質コ！一旦 本件出願は、一般に、プラスミノーゲンを発現させる方法と物質に関し、特に、 バキュロウィルスベクター感染の昆虫細胞系におけるヒトプラスミノーゲンを発 現させる方法と物質および組織プラスミノーゲン活性化物質、すなわちウロキナ ーゼおよびストレプトキナーゼを実質的に含まない前記細胞系の生成物に関する 。

血管内への血餅タンパク質フィブリンの有害な蓄積は、フィブリンもしくはその 前駆物質のフィブリノーゲンを、酵素のプラスミン（Ｐｍ）でタンパク質分解（ フィブリン溶解反応）によって防止される。様々な疾患において、病理学的フィ ブリン堆積物は、自然には分解せず、血栓症、すなわち血餅（血栓）が血管内に 存在する疾患の原因になる。多くの症例において、血栓溶解治療法、すなわち血 餅をＰ［Ｄで溶解する方法は、唯一の実施可能な治療法である。

Ｐｍは、前駆物質である、「プロエンザイム」もしくは「チモーゲン」と称され るプラスミノーゲン（Ｐｇ）の活性化によって循環系中に生成する。血栓溶解治 療法は、プラスミノーゲン活性化物質を投与することによって行われる。かよう なプラスミノーゲン活性化物質としては、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ウロキ ナーゼ（ＩＩＫ）および組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）がある。

ヒトＰｇ　（ＨＰｇ）は、アミノ末端アミノ酸Ｇｌｕおよび７９１個のアミノ酸 を含む一本ｍ１ｍタンパク質として循環系中に存在している（したがって、循環 しているＨＰｇは（Ｇｌｕ’］プラスミノーゲンと称される）　、　［Ｆｏｒｓ ｇｒｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、ＦＥＢｓ　Ｌｅｔｔ、、２１３巻、２５４−２６０ 頁、１９８７年：Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、銘看、４２４３−４２５０頁、１９８４年ＪｃＬｅａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｎａｔｕｒｅ、３３０巻、１３２−１３７頁、１９８７年；　５ｏｔｔｒｕｐ− Ｊｅｎｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、匡阻工部明。

Ｆｉｂｒｉｎｏｌ　ｓｉｓ　Ｔｈｒｏｍｂｏｌ　ｓｉｓ　、　３−１ｅｉ、１９ １−２０９頁、１９７７年：Ｗｉｍａｎ　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、、３９８．１−９頁、１９７３年；およびＷｉｍａｎ　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７６８．１２９−１３７頁、１９７７年）。

ＨＰｇの糖質の配列を分析すると、２つのグリコジル化の変異体があり、第１の 変異体は２つのグリコジル化部位（ＡＳｎ２　ｊ　ｌとＴｈｒ”＠）を有し、第 ２の変異体は１つのグリコジル化部位（Ｔｈｒ”＠）を有し、派生型が不完全な サイレーションを示しているＣＣａ５ｔｅｌｌｉｎｏ、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｖ、 　、　８１！、４３１−４４６頁、１９８１年）。

これら形態と誘導型は、循環しているプラスミノーゲンが示す翻訳後の修飾の例 である。

ＨＰｇは、Ａｒｇｓｓ＋−ｙａｐａ２ペプチド結合の開裂反応で活性化され、２ つの連鎖がジスルフィド架橋されているセリンプロテアーゼヒトＰｍ　（ＨＰｍ ）を生成する。この開裂反応は各種の活性化物質によって触媒されるが、活性化 物質としてはＳＫ、　ＩＪＫ及びＴＰＡがある（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｃｈｅｍ、　Ｒｅｖ、、８１８．４３１−４４６頁、１９８１年） 。

血栓溶解治療法は有用だが、その治療効果は、血栓部位におけるプラスミノーゲ ンの利用可能性によって制限されている。

プラスミノーゲンの濃度は、血栓溶解治療法の結果としてのプラスミノーゲンの 消費景、血栓中に不適切の量のプラスミノーゲンが存在すること、または血栓年 齢と虚血に関連する部分的プラスミノーゲンの消耗（血流の減少による局部的な 貧血）のために制限される。（Ａｎｄｅｒｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈａｅｍｏ ｓｔａｓｉｓ　、　１８８（Ｓｕｐｐｌ、　１）、１６５−１７５頁、１９８８ 年）。したがッテ、プラスミノーゲンの局部的使用可能な量の補充が望ましい。

組換え発現系における多量のプラスミノーゲンの発現は、血栓溶解治療法で使用 するプラスミノーゲンを得るのに好適な方法であるが、細胞内プラスミノーゲン 活性化物質が哺乳類の細胞形中に隈なく存在するため、無傷のＨＰｇが哺乳類の 発現系内で発現することは非常に困難であった。これら活性化物質が存在すると 、生成したＨＰｍによるプラスミノーゲンの自己消化が原因でこのような発現系 の調製済細胞培地には、分解したＨＰｇが出現するのであろう（Ｂｕｓｂｙ、　 ｅｔ　ａｌ６．肚屁ｍ虹…バ、１皇、６４頁、１９８８年）。

それ故に、報告された系に存在する分解現象を回避できるプラスミノーゲンの発 現系が要望されている。

負匪旦夏旌 本発明は、部位特異性プラスミノーゲン活性化物質を欠いた真核細胞、好ましく は無を椎動物の細胞を提供するものであり、またプラスミノーゲン、好ましくは ヒトプラスミノーゲンをコードする遺伝子を含む発現ベクター、特にＨＰｇをコ ードする遺伝子を含む昆虫細胞発現ベクターを提供するものである。昆虫細胞発 現ベクターは、バキュロウィルスベクターでもよいが、Ｍ遷犯１餅り態月カニ辻 岨核多角体病ウィルスが好ましい。ヒトプラスミノーゲンをコードする遺伝子が ［Ｇ１ｕ’ｉプラスミノーゲンをコードし、無を椎動物の細胞がＳ　ｏｄｏ　ｔ ｅｒａ　ｆｒｕ　ｊ　ｅｒｄａ細胞が、本発明においては好ましい。

また本発明は、細胞、好ましくはＳ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ 細胞によって発現される、翻訳後修飾において環状プラスミノーゲンとは異なる 、プラスミノーゲンを提供する。ヒトプラスミノーゲン、具体的には（Ｇ］、ｕ ’］プラスミノーゲンが本発明では好ましい。

本発明のプラスミノーゲンは、活性立体構造（すなわち、活性化してプラスミン になることができる三次構造に適正に折りたたまれている分子）を有し、実質的 にプラスミノーゲン活性化物質を含有せず、ｔｌＫ、　ＳＫおよびＴＰＡを全く 含有していない。

「実質的に含有していない」という表現は、本願で用いる場合、２７°Ｃで４８ 時間インキュベートした後、実施例６（後記）で実施したウェスタンプロットで 分解を示さない（すなわち、少なくとも９９％が無傷のタンパク質）プラスミノ ーゲンを意味する。

本発明はさらに、プラスミノーゲン、好ましくはヒトプラスミノーゲンを含有す る薬剤混合物を提供する。本発明の薬剤混合物は、等張性で無菌濾過されたもの が好ましく、またＴＰＡもしくはＬＩＫ、もしくはプラスミノーゲンと複合した ＳＫのようなフィブリン溶解酵素を含有していてもよい。フィブリン溶解酵素の 活性部位は、アシル化されていてもよい。

本発明のヒトプラスミノーゲンを発現させる方法には、部位特異性プラスミノー ゲン活性化物質を含有せず、プラスミノーゲンをコードする遺伝子を含む真核細 胞、好ましくは無を椎動物の細胞を、核遺伝子が発現可能な条件下で培養する工 程が含まれ、さらに好ましくは、Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ 細胞を、ヒトプラスミノーゲンをコードする遺伝子を含有するｆｉｃａｌｉ　ｆ ｏｒｎｉｃａウィルスに感染させる工程が含まれる。また、この方法は、昆虫の 細胞を、Ｉ（Ｐｇをコードする遺伝子を含む転移プラスミドと、野生型Ａｕｔｏ 　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａウィルスのＤＮＡで、同時にトランスフ ェクトする工程が含む。本発明のプラスミノーゲンは、これら方法で製造できる 。

また、本発明には、プラスミノーゲンをコードし、かつプロモーターに作動可能 に連結された、ＪｌｔｌＤＮＡが含まれ、該ＤＮＡは好ましくは、第２図に示す コード配列のすべて、または能部分を有する。該ＤＮＡはゲノムＤＮＡでもよい 。該ＤＮＡは、該ＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターおよび、７′また は細胞からプラスミノーゲンを分泌すφためのシグナル配列を含有していてもよ い。本発明では、ＤＮＡが、無を椎動物の宿主細胞によって認識されるシグナル 配列を含むことが好ましい。

本発明の方法には、血栓溶解治療の必要のある患者に、本発明の薬剤混合物の有 効量を投与することを含み、好ましくは、血栓誘拐治療の必要がある患者に、プ ラスミノーゲンとストレプトキナーゼの複合体を含む薬剤混合物の有効量を投与 することが含まれる。

本発明の別の方法には、フィブリン溶解酵素、好ましくはストレプトキナーゼと 、プラスミノーゲン、好ましくはヒトプラスミノーゲンとの二元複合体の製造方 法を含み、その複合体は、加水分解反応で除去可能な基で遮断されているフィブ リン溶解活性にとって必須の触媒部位を有している。この方法は、次の工程から 構成されている。すなわち、内因性のプラスミノーゲン活性化物質を産生せず、 かつプラスミノーゲンをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された無 を椎動物の細胞を、上記核酸を発現できる条件下で培養し：宿主細胞の培養物か ら好ましくは細胞培養培地からプラスミノーゲンを回収し：および、前記フィブ リン溶解酵素を、化学式Ａ−Ｂもしくは化学式Ｅ−Ｆで表される遮断剤（但し、 Ａはフィブリン溶解活性のために必須の触媒部位に対して選択杓で、かつ官能基 Ｂから触媒部位に転移可能な基で、ＢはＡが酵素に連結し易くする基であり、Ｅ は遮断剤を触媒部位に配置する配置基で、Ｆは配置基から触媒部位に転移できる 官能基である）の過剰量の存在下で、プラスミノーゲンと混合する：工程から構 成されている。本発明では、遮断剤ＡＢは、ｐ−ニトロフェニル−ｐ゛−グアニ ジノベンゾエートが好ましく、さらに本発明には、形成された二元複合体を単離 する工程が含まれ、また官能基Ｅはｐ−アミジノフェニル基もしくはｐ−アセト アミドフェニル基で、官能基Ｆはベンゾイル基もしくはアクリロイル基が好まし い。

本発明において、加水分解反２て除去できる官能基としてはアシル基が好ましく 、さらに好ましくはベンゾイル基、置換ベンゾイル基、アクリロイル基もしくは 置換アクリロイル基である。

本願で用いられる「作動可能に連結されている」という表現は、構成要素が通常 の機能を果たせるように並置されていることを意味する。したがって、配列を制 御するために「作動可能に連結されている」コード配列は、コード配列の制御下 で発現でき、かつ連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、および分泌リーダ ーの場合は隣接し、かつ読取相である立体配置を意味する。例えば、プレ配列も しくは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレプロティン として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結され：プロモー ターもしくはエンハンサ−は、コード配列の転写に作用する場合、コード配列に 作動可能に連結され：またはリポソーム結合部位は、コード配列の翻訳を容易に する位置にある場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、通常の制限 部位での連結反応で行われる。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴ ヌクレオチドのアダプターもしくはリンカ−を従来法に従って用いることができ る。

本願で用いる「細胞」、ｒｍ胞系」および「細胞培養物」というｉｔは交互に用 いられているが、これらの名称にはすべて子孫が含まれている。したがって「形 質転換体」もしくは「形質転換された細胞」には、転移の数にかかわらず、これ らのものから誘導される一次の主要細胞と培養物が含まれる。また、すべての子 孫は、故意もしくは不注意の変異のためにＤＮＡの内容が正確に同一というわけ ではないことは理解されるべきである。また−次の主要細胞がスクリーニングさ れて同じ機能を有する変異子孫もこれらの語霊に含まれる。明確な名称は、本願 によって明らかになる。

「同時トランスフェクション」の場合は、ウィルスＤＮＡと転移ベクター（プラ スミド）が宿主細胞に取込まれる。プラスミドからのＤＮＡが、組換えウィルス の産生をもたらす相同的組換えによってウィルスＤＮＡに転移される。多数のト ランスフェクション法が当業者に知られている。例えばＣａＰＯ４と電気穿孔法 を利用する方法がある。トランスフェクションが成功したということが分かるの は、宿主細胞内でのベクターの作動が検出されるときである。

「感染シという語鴬は、宿主細胞によるウィルス発現ベクターの取込みを意味し 、感染によってコード配列の発現とウィルスの産生がもたらされる。

「形質転換」という語案は、ＤＮＡが染色体外要素、または染色体組込みによっ て複製可能に生物に導入されることを意味する。使用される宿主細胞によって、 形質転換は、宿主細胞に適した標準法を用いて行われる。Ｃｏｈｅｎ　、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、堕豊、２１１０頁、１９７２年に記載されている塩化カ ルシウムを利用するカルシウム処理法が、実質的な細胞壁を有する原核生物等の 細胞に一般に用いられる。

［部位特異性突然変異誘発法７は、当該技術分野では標準の方法であり、所望の 突然変異を示す限定された不整合を除いて、突然変異をさせるべき一本鎖ファー ジＤＮＡに相補性の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。簡単 に述べれば、合成のオリゴヌクレオチドが、上記ファージに相補性の一本鎖の合 成を指令するプライマーとして用いられ、得られた二本鎖ＤＮＡによってファー ジを保持する宿主細菌が形質転換される。

形質転換された細胞の培養物を寒天表面でＳ養し、ファージを保持する単細胞か らプラークを形成させる。理論的には、新しいプラークの５０％が、一本鎖に変 異した形態を有し、残りの５００３が本来の配列を有している。得られたプラー クを、正確な整合を示すハイブリダイゼーション形成は可能で、元の連鎖との不 正確な整合を示すハイブリダイゼーション形成防止に充分な温度で、キテーセ処 理合成プライマーとハイブリダイゼーションさせる。次に、プローブとハイブリ ダイゼーションするプラークを選択して培養し、ＤＮＡを回収する。

「制御配列」という語貧は、特定の宿主生物内で作動可能に連結されたコード配 列の発現に必要なりＮＡ配列を意味する。

「発現系Ｊという語盆は、所望のコード配列と制御配列を作動可能に連結して含 有しているＤＮＡを意味し、その結果、これら配列で形質転換された宿主はコー ドされたタンパク質を産生できる。形質転換を行うために、発現系は、本願では 「発現ベクター」と称するベクターに含まれる。しかし、関連するＤＮＡは、宿 主染色体に組込まれてもよい。本願で用いる「翻訳後の修飾」という語貧は、主 としてグリコジル化を意味するが、タンパク質分解、リン酸化、アシル化、硫酸 化、γ−カルボキシル化またはβ−ヒドロキシル化も含まれる。

図面の梵見象朦呵 第１図は、本発明のベクターｐＨ９ＰＮ１２７．６の制限地図である。

第２図は、ヒトプラスミノーゲンの推定アミノ酸配列を含むベクターｐｌ】９Ｐ Ｎ１２７．６のヌクレオチド配列である。

第３図は、本発明の転移ベクターの構築を示す流れ図である。

第４図は、本発明のバキュロウィルス転移ベクターの制限地図である。

第５図は、本発明の宿主細胞由来の物質のウェスタンプロットを示す。

第６図は、本発明によって産生されたＨＰｇを活性化検定した結果を示すグラフ である。

第７図は、本発明によって、精製カラムから回収された画分中のＨＰｇについて の免疫ドツト検定の結果を示す図である。

第８図は、本発明のｍｙの各段階から採取した試料のウェスタンプロットを示す 。

第９図は、本発明のＨＰｇもしくは組換えＨＰｇの一部をウロキナーゼで活性化 した後、電気泳動を行ったゲルを示す図である。

詳細な説明 組換えＤＮＡ法を有効に適用してＰｇを型造するためには、発現産生物を分解せ ずに、この大きくて複雑な分子のための発現系を採用することが重要である。こ の点については、無を椎動物の発現系が有用である。すなわち、プラスミノーゲ ン活性化物質はこのような細胞中には存在しないことは明らかだからである。本 発明によれば、機能形のｊＧ１ｕ’　ｊＰｇが、無を椎動物の細胞中、またはプ ラスミノーゲン活性化物質を欠いた真核細胞中でＩＧ１ｕ’ｌＰｇ　ＤＮＡを発 現させることによって得られる。好ましくは、発現は、Ｐｇ遺伝子を含有する組 換えバキュロウィルスを感染させた昆虫細胞中に得られる。これら細胞中での発 現過程は、主要ウィルスの構造タンパク質ポリヘトリンを含むウィルスの吸蔵物 の産生へと続く。

ヒトプラスミノーゲンをコードするｃＤＮＡを、バキュロウィルスのυ上１ヒｈ ａ　ｃａｌＨｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルスのゲノムに、ポリへドリンプロモ ーターに隣接して挿入した。次にこのウィルスを、農地のアワヨトウ、Ｓ　ｏｄ ｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａの培養細胞に感染させた。

組換え！（Ｐｇ　（ｒｅｅ−ＨＰｇ）が、感染後２４時間まで培地中に分泌され たが、その時点で、ｒｅｃ４Ｐｇ抗原は事実上細胞内には残っていなかった。感 染してから４８時間後に、最大レベルの無傷のｒｅｃ−ＨＰｇが培地中に存在し ていた。培地中に見出されたｒｅｃ−ＨＰｇは少なくとも９９９４が無傷の（全 長）タンパク質である。

これに対して、仔ハムスター腎Ｈ１（ＢＨＫ”Ｉｍ胞系（Ｂｕｓｂｙ、　ｅｔａ ｌ、、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　、　２ｔｅ、６４頁、１９８８年）では、 合成されたプラスミノーゲンの１０％以下しか培地中に出現しなかったと報告さ れている。これはもともと全長のプラスミノーゲンであったが、急速に分解して 小さい形態になったのである。分解した形態のプラスミノーゲンしかＢＨＫ細胞 内には見つからなかった。

感染してから４８時間後の本発明の密集している培養物中で、ｒｅｃ−１（Ｐｇ が著しいタンパク質分解消化を受けた。この消化は、３．５Ｘ１０’細胞／ａｍ ”で接種した培養物から採取した試料のウェスタンプロット分析で、免疫反応性 バンドを観察によって検出された。これらのバンドは未変性のｒｅｃ−］（Ｐｇ より低分子量で生成した。時間の経過とともに、未変性のバンドの強度は減少し 、低分子１のバンドの強度が増大した。さらに、観察された低い位置のバンドの 分子量も減少した。

感染してから４８時間後に観察されたタンパク質分解消化は、細胞が密集してい るとき（すなわち３．５　Ｘ］Ｏ’細胞／ｃｍ２）に起こるようであり、本発明 では、細胞は低密度（１，３３Ｘ　１０’細胞／ｃｌ］］２）で培養するのが好 ましい。第５図に示すように、細胞が低密度で培養されている場合は、感染して から９３時間後でも明白な分解は起こっていない。

この発現系が産生したｒｅｃ−ＨＰｇのタンパク質の部分は分子量が血漿（Ｇｌ ｕ’ｑプラスミノーゲンと実質的に同じであった。ｒｅｃ−ＨＰｇをセファロー ス−リシンに吸着させ、ε−アミノカプロン酸で溶出した。

得られた組換えタンパク質は、ヒト血漿タンパク質と同じ方法で、血漿ＨＰｇ分 子の特有領域（クリングル１−３）に対するモノクローナル抗体のみならず、血 漿ＨＰｇに生成したポリクロ−十ル抗体とも相互に作用した。最終的に昆虫細胞 が発現したｒｅｃ−ＨＰｇはウロキナーゼでプラスミンに活性化可能であった。

これらの結果は、本発明の発現系は全長の機能性一本鎖組換えプラスミノーゲン （ｒｅｃ−１４Ｐｇ）を産生じ、そのプラスミノーゲンは、タンパク質の分泌と 長期間の分解で起こる一時的な現象についていくらか配慮することによって、培 養培地から無傷で単離できることを示している。本発明のｒｅＣ−ＨＰｇは活性 化物質によってＰｍに変換することができ、リガンドのε−アミノカプロン酸の みならず抗血漿Ｐｇのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と相互作用 を行う。これらの結果は、それら分子が、先に述べた重要な機能特性（すなわち それが機能性Ｐｇであること）を保持し、正しく折りたたまれていることを示し ている。

したがって、バキュロウィルスのゲノムに組込まれたＰｇ遺伝子は、組換えウィ ルスを感染させたｊ！虫細胞中で充分にａ話する形態で発現させることができる 。このような充分に機能する形態での発現は、現在まで、硼乳類の発現系では達 成されていないと考えられる。

本願で用いる用語の１プラスミノーゲン」または「Ｐｇ」は、第２図に示すアミ ノ酸配列を有するヒトプラスミノーゲン、ならびに未変性のヒトＰｇの生物活性 を存するその類似体と変異体のごときプラスミノーゲンを意味する。未変性Ｐｇ の生物活性は、その類似体もしくは変異体も共有しており、これら類似体もしく は変異体は、プラスミノーゲン活性化物雪（例えばストレプトキナーゼ、ウロキ ナーゼもしくは組織プラスミノーゲン活性化物質）によって切断されて、プラス ミンを産生できるか、または未変性Ｐｇの少な（とも一つのエピトープに対する 抗体と免疫学的に交差反応性の免疫エピトープを持っている。類似体もしくは変 異体は、未変性Ｐｇのアミノ酸配列、グリコジル化などの特徴が共有結合的もし くは非共有結合的に修飾されている分子と定義される。アミノ酸配列の変異体に は、第２図の配列の対立遺伝子のみならず、予め決定されたその変異体も含まれ る。

一般にアミノ酸配列変異体は、第２図の未変性Ｐｇのアミノ酸配列に対して、少 なくとも約８０％の相同性、より一般的には少なくとも約９０％の相同性のアミ ノ酸配列を持っている。したがってＰｇという用語は、ことわりがないかぎり未 変性の配列もしくは変異体の形態を意味するものとする。

［Ｇ１ｕ’ｌＰｇにおいて、潜伏性プラスミン重鎮は、］−５６１残基を持って いるが、「クリングル」と称する高度に相同性の５つの領域を含有しており（Ｓ ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　汁」ＬＪ１叩ユＦｉｂｒｉｎ ｏｌ　ｓｉｓ　Ｔｈｒｏｍｂｏｌ　ｓｉｓ、、」、１９１−２０９頁、１９７７ 年）、各領域が約８０のアミノ酸を含有している。これらのクリングルは、恐ら く独立した領域として存在しており（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ　ｅｔＢｌ、、Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５６巻、４７７８−４７８２頁、１９８１年）　 、　ＨＰｇとＨＰｍの機能特性にとって重要である。例として、クリングル〕領 域（アミノ酸残基８４−１６２）は、プラスミンらしくはプラスミノーゲンと、 フィブリンおよびフィブリノーゲンとの相互作用には重要であり（Ｌｕｅａｓ、 　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５８　Ｓ、４２４９−４２ ５６頁、１９８３年）、陽性エフェクターのε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ） に対する強いＴＧ１ｕ’ｊＰｇ結合部位を含有している（Ｍａｒｋｕｓ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５３巻、７２７−７３２頁、１ ９７８年）。さらにこの同じ部分は、ＨＰｍの、その主要血漿阻害剤のα２−抗 プラスミンとの初期の迅速な結合に関与している（Ｍｏｒｏｌ、　ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５１　Ｓ、５９５６−５９６５頁、１９７ ６年）。クリングル４領域（３５８−４３５残基）は、［ＧＩｕ’ｉＰｇに存在 する弱いＢＡＣＡ結合部位を持っているようであり、この部位は、１Ｇ１ｕ’］ Ｐｇの非常に太きなリガンドで誘発される配座の変化（Ｖｉｏｌａｎｄ、　ｅｔ 　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、厄し皇、３９０６−３９１２頁、１ ９７６年）と、陽性エフェクターＥＡＣＡの存在下で付随して起こるチモーゲン の活性化速度の増大（Ｃ１ａｅｙｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｊｍ。

敗叫江１−に艮、３４２巻、３５１−３５９頁、１９７４年）に関与している。

第２図に示す未変性のグリコジル化とアミノ酸の配列を有するＰｇを含む真核細 胞で発現されるＰｇ、他の動物種、例えばウシ、ウマ、ブタ、羊、イヌ、マウス 、ネコなどからの類似のＰｇタンパク質、それらＰｇタンパク質の脱グリコジル 化誘導体らしくは非グリコジル化誘導体、ならびにプラスミノーゲン活性を示す 対立遺伝子および生体外で生成した共有結合誘導体を含む、Ｐｇの生物学的に活 性のアミノ酸配列変異体は本発明のａ囲に含まれる。

Ｐｇのアミノ酸配列の変異体には、例えば、第２図に示すアミノ酸Ｐｇ配列内の 残基の欠失形、挿入形もしくは置換形が含まれる。最終構築物が所望の活性を持 っているならば、欠失、挿入および置換の組合わせを実施して最終の構築物を作 ってもよい。

変異体ＰｇをコードするＤＮＡになされた突然変異が、読取枠の外側に配列を置 かないことが好ましいのは明らかであり、さらに同じ変異によって二次のｍＲＮ Ａ４！ｌ遺体を産生じうる相補領域が生じないことが好ましい（例えば、欧州特 許願公開第０７５．４４４号参照）。

アミノ酸配列の挿入としては、】残基ないし特に非制限長のポリペプチドのアミ ノ末端および、／またはカルボキシ末端の融合と、単一らしくは多重のアミノ酸 残基の配列内挿入とが含まれる。配列内挿入断片（すなわち成熟ＨＰｇ配列内の 挿入断片）は、一般に約１〜１０の残基、より好ましくは１〜５の残基の範囲で ある。単一の末端挿入断片の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する成熟ＨＰｇで ある。この変異体は、人為的な組換え細胞の培養でのｒｅｃ−Ｐｇの直接発現、 すなわち、成熟ｒｅｃ−Ｐｇの分泌もしくは細胞膜会合を指令するシグナル配列 無しでの発現の結果として生成する。末端挿入の他の例には次のものがある。

（１）成熟ｒｅｃ−ＰｇＯ組換え宿主からの分泌を容易にするために、非相同も しくは相同を問わずに行うシグナル配列の、成熟ｒｅＣ−ＰｇのＮ末端への融合 、（２）免疫原生ポリペプチド（すなわち、標的配列に免疫原生を与えるのに充 分に大きいポリペプチド）、例えばβ−ラクチマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、 またはＥ、　ｃ吐Ｌ」■座でコードされた酵素のような細菌ポリペプチドの融合 、および（３）メンプランアンカーのような細胞表面結合物質との融合である。

細胞表面結合物質との融合は、組換え法で製造する必要はないが、ｒｅｃ−Ｐｇ との共有部分もしくは非共有結合による産生物であってもよい。

第３グループの変異体は、ｒｅｃ−Ｐｇ分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基 、好ましくは１つだけの残基を除いて異なる残基をその位置に挿入した変異体で ある。このような置換は、ｒｅｃ−Ｐｇの特性をうまくｙｉ整したい場合に、下 記表１にしたがって行われる。

表１ 元の残基　代表的な置換基 Ａｌａ　Ｇｌｙ；　Ｓｅｒ Ａｒｇ　Ｌｙｓ Ａｓｎ　Ｇｌｎ；　Ｈｉｓ ＧＩＹ　Ａｌａ；　Ｐｒ。

１（ｉｓ　Ａｓｎ：　Ｇ１ｎ １ｉｅ　Ｌｅｕ；　Ｖａｌ Ｌｅｕ　ｌｉｅ；　Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ａｒｇ；　Ｇｉｎ；　Ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ；　Ｔｙｒ；　１ｉｅ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ；　Ｌｅｕ；　Ｔｙｒ Ｖａｌ　ｌｉｅ：　Ｌｅｕ 機能性もしくは免疫学的同一性の実質的変更は、表１の置換基より保存性が小さ い置換基を選択して行われる。すなわち、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の 構造、例えばシート状らしくは、螺旋状の構造、（ｂ）分子の標的部位における 電荷らしくは疎水性、または（Ｃ）側鎖の大きさを維持する作用が一層有意に異 なる残基が選択される。ｒｅｃ−Ｐｇ特性を最も大きく変化させると一般に考え られる置換は、以下の置換である。すなわち（ａ）グリシンおよび７／またはプ ロリンを、他のアミノ酸で置換、欠失、または挿入する：（ｂ）親水性残基、例 えばセリルもしくはスレオニルを、疎水性の基、例えばロイシル、イブロイシル 、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルで置換、またはその逆の置換を行 う、（Ｃ）システィンを他のいずれかの基で置換、またはその逆の置換を行う； （ｄ）電気的陽性の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルもしくはヒス チジルを、電気的陰性の残基、例えばグルタミルもしくはアスパルチルで置換、 またはその逆の置換を行う、または（ｅ）大きさの大きい側鎖を有する残基、例 えばフェニルアラニンを、このような側鎖をもっていない残基、例えばグリシン で置換、またはその逆の置換を行う。

変異体は、ＰｇをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異性突然変異誘発 を行って、変異体をコードするＤＮＡを製造し、次いでそのＤＮＡを無を推動物 の細胞培養で発現させることによって製造できる。

また、Ｐｇもしくはその変異体をコードするＤＮＡは、宿主細胞中で発現させる 前に、様々な方法のいずれかで化学的に合成し構築することができる（例えば、 Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの米国特許第４．５００．７０７号；　Ｂａ１ｌａｎｄ、　 ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　、　６７８．７２５−７３６頁、１９８５ 年；　Ｅｄｇｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、２９２　Ｓ、７５６−７８ ２頁、１９８２年参照）。約１００までの残基を有する変異体Ｐｇの断片は、生 体外の合成で簡便に製造できる。その変異体は、天然に生成する形態のものと同 じ性質の生物活性を示す。

アミノ酸配列の変化を導入する部位は予め決めておくが、それ自体の変化は予め 決めておく必要はない。例えば、所定の部位での変異の実施を最適化するために 、ランダム突然変異誘発を標的のコドンもしくは領域で実施し、発現されたＰｇ 変異体を所望の活性の最適の組合わせについてスクリーニングする。既知の配列 を有するＤＮＡ中の予め決められた部位で置換変異を行う方法は公知であり、例 えばＭ１３プライマー突然突然変異性がある。

アミノ酸配列の欠失は、一般に約１〜３０の残基の範囲であり、より好ましくは １〜１０の残基であり、一般に隣接している。

欠失と挿入の大部分と、特に置換は、ｒｅｃ−Ｐｇ分子の特性に急激な変化を与 えるとは考えられない。しかし、置換、欠失もしくは挿入を行う前に、それらの 正確な作用を予測することが難しい場合は、例えばＰｇの活性部位もしくは免疫 エピトープを修飾するときに、当業者は、その作用を日常のスクリーニング検定 法で評価することができる。例えば変異体は、未変性Ｐｇをコードする核酸の部 位特異性突然変異を誘発させ、組換え細胞の培養で変異体の核酸を発現させ、次 いで、例えば、ウサギのポリクローナル抗Ｐｇカラムに免疫親和性吸着させるこ とによって（変異体を少なくとも１つの残留エピトープで吸着させるために）細 胞培養物から任意に精製することによって製造される。

次いで、細胞溶解物もしくは精製Ｐｇ変異体の活性を、所望の特性について、適 切なスクリーニング検定法でスクリーニングできる。例えば、所定の抗体に対す る親和性のようなＰｇの免疫学的特性の変化は、競合免疫検定法で測定すること ができる。活性化レベルの変化は適当な検定法で測定される。レドックス安定性 もしくは熱安定性、疎水性、タンパク質分解反応に対する感受性、または担体に よって凝集する傾向、もしくは多量体になる傾向のような上記タンパク質の修飾 は、当業者に周知の方法で検定される。

本発明によれば、細胞が内因性プラスミノーゲン活性化物質を含んでいないのな らば、いずれの細胞培養も、を椎動物もしくは無を椎動物の細胞にかかわらず、 原則として実施できる。

本願発明が目的とする「プラスミノーゲン活性化物質」は、チモーゲンプラスミ ノーゲンを活性化して、フィブリンを含む各種のタンパク質を分解するセリンブ ロティナーゼブラスミンを生成（Ａｒｇ！４Ｇ４ａ１６６１における切断による ）する酵素である。

プラスミノーゲン活性化物質の中で、ストレプトキナーゼは細菌タンパク質であ り、ウロキナーゼは腎臓その他で合成され、元来、尿から抽出される酵素であり 、ヒト組織プラスミノーゲン活性化！Ｐ！ＪＷは、血管壁をライニングする細胞 によって産生される酵素である。

酵母培養物のような真核微生物が、本発明で用いられる。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくは通常の製パン用酵 母が、真核微生物中で最も普通に用いられるが、その他のいくつかの菌株も普通 に利用できる。鉢競匝匹肛並辷風の微生物での発現には、例えばブラミドＹＲｐ ７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８２豊、 ３９頁、１９７９年；　Ｋｊｎｇｓｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、堕吠、」、１４１ 頁、１９７９年；　Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、１０８． １５７頁、１９８０年）が通常用いられる。このプラスミドは、トリプトファン 中で増殖する性質を欠いている酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ第４４．０７６ 号もしくはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　８５１ｉ、１２ 頁、１９７７年）の選択マーカーを提供するＴｒｐｌ遺伝子を含む。酵母宿主細 胞ゲノムの特徴としてＴｒｐｌｆｌｉ域が存在していることは、トリプトファン 無しでの増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。

酵母ベクター中の適切なプロモーター配列としては、３−ホスの他の解糖酵素Ｃ Ｈｅ５ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚ　’ｍｅ　Ｒｅ　、−１ 」、１４９頁、１９６８年：　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、肛匹迫叶壮■ 、１７１ｉ、４９００頁、１９７８年）例えば、エロナーセ、グリセルアルデヒ ド−３〜リン酸デヒドロゲ＋−ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホ スホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラー ゼ、ホスホグルコースイソメラーセ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含 まれる。

適切な発現プラスミドを構築する際に、これらの遺伝子に結合される終止配列は 、発現されてｍＲＮＡをポリアデニル化して停止することが望まれる配列の発現 ベクターの３゛末端に連結される。

池のプロモーターであって、転写が培養条件によって制御されるという別の利点 を備えたものとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ１ 酸性ホスフ７ターセ、窒素代謝に関連する分解酵素および前記グリセルアルデヒ ド−３−リン酸デヒドロゲテーゼ、ならびにマルトースとガラクトースの利用に 関与している酵素類のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製 開始点および終止配列を含有しているプラスミドベクターはいずれも適切である 。

゛微生物に加えて多細胞生物由来の細胞の培養物も宿主として使用できる。原則 として、かような細胞培養物は、を椎動物もしくは無を椎動物にかかわらず利用 できる。天然には、内因性プラスミノーゲン活性化物質を含有していない細胞、 例えば無を椎動物のａ胞が好ましい。本願では・−プラスミノーゲン活性化物質 シは、チモーゲンプラスミノーゲンを活性化して、フィブリンを含む各種のタン パク質を分解するセリンブロティナーセブラスミンを（Ａｒｇｌｏ−ｖａ１６１ １でのプラスミノーゲンの切断により）生成する酵素である。本願で引用する「 部位特異性プラスミノーゲン活性化物質」は、ストレプトキナーゼ（細菌タンパ ク質）、ウロキナーゼ（腎臓などで合成され元来尿素から抽出される酵素）およ びヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（血管壁をライニングする細胞が産生ず る酵素）である。

またを椎動物の細胞は、たとえ天然に内因性プラスミノーゲンを持っていても、 そのような活性化物質をコードする遺伝子を本発明で使用する前に欠失させるな らば、宿主細胞として使用することができる。を椎動物細胞の培養（組織培養） による繁殖は、現在では日常行われる方法になっている。突然変異を起こすこと ができる有用な宿主細胞形の例には、ＶＥ！ＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニ ーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ならびにＷ２Ｂ５、ＢＨＫ　、　ＣＯ３ −７、２９３およびＭＤＣＫの細胞系が含まれる。

このような細胞の発現ベクターは、通常（必然的に）、’ＩＩＭ開始点、必要な リポソーム結合部位とともに発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーター 、ＲＮＡ接着部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ一部位を含む 。

哺乳類の細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能は、ウィルス物質で与えら れる場合が多い。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマウィルス 、アデノウィルス２、および最も多いのはシミアンウィルス（ＳＶ４０）由来の ものである。

ＳＶ４０の初期プロモーターと後期プロモーターは特に有用である。

その理由は、これらのプロモーターはＳＶ４０ウィルスの’ＩＩＭ開始点を含む 断片として、このウィルスから容易に得ることができるからである（Ｆｉｅｒｓ 、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２７３８．１１３頁、１９７８年）。ＳＶ４ ０の大きい断片もしくは小さい断片も、約２５０　ｂｐの配列が複製開始点内に 位置し１（ｉｎｄＩ［部位からＢｇ１１部位まで延びていれば使用できる。さら に、所望の遺伝子配列と通常連結しているプロモーターもしくは制御配列を、宿 主細胞系と適合して複製開始点は、ＳＶ４０もしくは池のウィルス（例えば、ポ リオーマウィルス、アデノウィルス、ＶＳＶ　、　ＲＰＶ）起源のような外因性 の複製開始点を含むベクターを構築するか、または宿主細胞の染色体の複製機構 によって与えることができる。ベクターが宿主ｌＩＢ胞の染色体に組込まれれば 充分な場合が多い。

ＰｇとＤＨＰＲのタンパク質の両者をコードするＤＮＡ配列を含む本発明のベク ターでトランスフェクトするのに好ましい宿主細胞を選択する場合、使用される ＤＨＰＲタンパク質の種類によって宿主を選択することが適切である。野生型Ｄ ＨＦＲタンパク質が用いられる場合、ＤＨＦＲが不足している宿主細胞を選択す ることが好ましく、このような選択を行うと、ヒボキサンチン、グリシンおよび チミジンを欠いた選択培地でうまくトランスフェクトするだめのマーカーとして ＤＨＰＲをコートする配列を使用することができる。この場合の適切な宿主細胞 は、ＤＨＰＲ活性が不足しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系 （Ｕｒｌａｕｂ、　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　（ＬＩＳＡ）　、７７（７）巻、４２１６−４２２０頁、１９８０年に記 載されているようにして作製し繁殖させる）であり、本発明によってプラスミノ ーゲン活性化物質の活性を低下させる。プラスミノーゲン活性化物質遺伝子の欠 失は、一般に次のような方法で行われる。すなわち、Ｔｈｏｍａｓ、　ｅｔ　ａ ｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、３２４　Ｓ、３４−３８頁、１９８８年；　５ｅｄｉｖｙ、　Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　、。

１１．１１９２−１１９６頁、１９８８年；　Ｒａｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１゜Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＩＪＳＡ）　、　８３８． ５５８７−５５９１頁、１９８６年；　Ａｙａｒｃｓｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ｔｌｓＡ）、８３巻、５１９９−５２０３ 頁、１９８６年；　Ｒｏｉｚｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４．７６９． ３３１号、およびＶａｎｉａｔｊｓ、　Ｎａｔｕｒｅ、３］７８．２０５−２０ ６頁、１９８５年に記載されている方法である。

ＭＴＸに対する結合親和性が低いＤＨＰＲタンパク質を制御配列として用いる場 合は、ＤＨＦＲＨＦ側胞を使用する必要はない。変異体１））（ＰＲはメトトレ キセートに対して耐性なので、宿主細胞自体がメトトレキセート感受性ならば、 ＭＴＸ含有培地を選択の手段として使用できる。ＭＴＸを吸収できるほとんどの 真核細胞は、メトトレキセート感受性のようである。このような有用な細胞系は ＣＨＯ系でありＣＩ（０−Ｋｌ　（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ　６１）がある。

多数のバキュロウィルスのウィルス株と変異体、およびＡｅｄｅｓ粘且ｕ１匹蚊 ）　、Ａｅｄｅｓ　ａｌｂｏ　１ｃｔｕｓ　（蚊）、叶立伊垣士り岨貝皿眩牡肛 （ショウジヨウバエ）および如可■Ｌ彫１しの宿主細胞のような由来宿主び対応 する昆虫宿主の許容細胞が固定された（例えばＬｕｃｋｏｗ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　、　６８．４７−５５頁、１９８８年：およびＭ ａｅｄａ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻、５９２−５９４頁、１９ ８５年参照）。各種のこのようなウィルス株は公に入手することができ、例えば Ａｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｊｃａＮＰＶのＬ−１変異体と坦岐■ ｍｏｒｉ　ＮＰＶのＢ［Ｄ−５株があり、特に鉦回翌圏劉加鼠細胞のトランスフ ェクションに用いる本発明のウィルスとして使用できる。

フィブリン溶解酵素とプラスミノーゲンとで形成された複合体は、さらにＳｍ１ ｔｈ、　ａｔ　ａｌ、ｍ、の米国特許第４．８０８．４０５号に記載されている ように血栓溶解剤として使用できる。この特許の開示事項は本願に援用するもの とし、下記の実施例１１で説明する。ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンの 二成分複合体を含む酵素誘導体を作製することができる。この複合体は、加水分 解反応で除去可能な官能基で遮蔽されたフィブリン溶解活性に必須の触媒部位を もっており、その誘導体の加水分解反応の疑似−次反応の速度定数は、触媒部位 を遮蔽する官能基がｐ−グアニジノ−ベンゾイル基でない場合、等張水性媒体中 ｐＨ７，４，３７°Ｃにて１０−’　５ｅｅ−’　〜１０−’　５ｅｅ−’の範 囲にある。このような官能基の適切な例としては、ベンゾイル基、置換ベンゾイ ル基、アクリロイル基もしくは置換アクリロイル基のようなアシル基がある。

上記複合体の製造方法は次のとおりである。すなわち、化学式Ａ−ＢもしくはＥ −Ｆで表される遮蔽剤の過剰量の存在下で、ストレプトキナーゼとプラスミノー ゲンを混合しくここでＡはツブリン溶解のために必須の触媒部位に対して選択的 でかつ官能基Ｂから触媒部位に転移可能な基であり、ＢはＡが酵素に連結し易く なるようにする基であり、Ｅは遮蔽剤を触媒部位に配置する配置基であり、Ｆは 配置基から触媒部位に転移できる官能基である）、次いで生成した誘導体を任意 に単離することからなる方法である。加水分解反応で除去しうる官能基として好 ましいのは、アシル基、最も好ましいのは、ベンゾイル基、置換ベンゾイル基、 アクリロイル基、または置換アクリロイル基であり、例えばハロゲン、ＣＩ−ａ アルキル、Ｃｌ−１アルコキシ、ＣＩ−、アルカノイルオキシもしくはＣ１−、 アルカノイルアミノで置換されたベンゾイル基、またはａｔ−Ｓアルキル、フリ ル、フェニル、もしくはＣ１−＠アルキルフェニルで置換されたアクリロイル基 である。また、好ましい化学式ＡＢの遮蔽剤はｐ−ニトロフェニル−ｐ−グアニ ジノベンゾエートであり、好ましい官能基Ｅはｐ−アミジノフェニルもしくはｐ −アセトアミドフェニルで、好ましい官能基Ｆはベンゾイルらしくはアクソロイ ル基である。

ヒトプラスミノーゲンを含む薬剤混合＠ｌも本発明に含まれる。

このような混合物は、好ましくは、等張水性緩衝液らしくは医薬品としての「注 射用液」のような薬学的に許容される担体を含む。さらに本発明には、次のよう なものを含む医薬製剤が含まれる。すなわち、薬学的に許容される担体とフィブ リン溶解酵素、好ましくは酵素とプラスミノーゲンの複合体、より好ましくはス トレプトキナーゼとプラスミノーゲンの二成分複合体、および最も好ましいのは 、Ｓｍ１ｔｈ、　ｅｔ　ａｌの米国特許第４．８０８．４０５号に記載されてい る、内部ペプチド結合切断の無いｐ−アニフィルストレプトキナーゼ７′プラス ミノーゲン複合体である。別の態様では、フィブリン溶解活性に関与してる複合 体の活性部位が、複合体の加水分解反応の疑似−次反応の速度定数が、ｐＨ７， ４の等張水性媒体中３７℃にて］Ｏ−’　５ｅｅ−’　〜１Ｏ−３ｓｅｃ−’の 範囲にあるような加水分解で除去できる官能基で遮蔽されている。

本発明の混合物は、ヒトに非経口投与するのに適した標準の方法にしたがって調 製される。

一般に、静脈投与用混合物は、無菌誘導体の無菌等張水性緩衝液による溶液であ る。必要な場合、混合物は複合体の可溶化剤を含む。一般に、複合体は、−回投 与量の形態で、例えば、アンプルのような密閉容器にいれた乾燥粉末もしくは水 を含まない濃縮物として供給される。注入による投与に用いられる場合、複合体 は、注射用の無菌医薬品水の入った注入用ビンから分配される。注射による投与 の場合、複合体は、注射用無菌水の入ったガラス瓶から分配される。注射用もし くは注入用混合物は、投与する前に成分を混合することによって調製される。

投与される複合体の有効量は、多くの要因によって決まるが、その要因としては 、必要なフィブリン溶解量と溶解に要する速度、血栓閉栓症の程度および血栓の 位置と大きさがあるが、上記量は一般に、得られる結果すなわち血栓の溶解によ って決められる。例えば、肺動脈塞栓症もしくは致命的な血栓を有する患者は、 急速に作用する物質の丸薬を投与する必要がある。一方、手術後に血栓が生成す るのを防止したい場合は、少量の緩慢に作用する物質が特に有用である。使用さ れる正確な投与量と投与法は、医師が確認した状況によって決定される。しかし 、一般に、中位の大きさの血栓の治療をうけている患者は、注射（８回投与まで ）または注入によって１日に１ｋｇの体重当り０、１０〜１．０　ｍｇの投与ｌ を受ける。

本発明の方法、原料および製品についてのより具体的な説明を以下の実施例で行 う。

実施例１において、ＨＰｇを含む転移ベクターの構築を説明する。

実施例２では、宿主細胞が実施例１の転移ベクターと野生型バキュロウィルスで 同時にトランスフェクトされている実験が記載されている。

実施例３では、ウィルスベクターのＤＮＡが、サザンプロット法で、ＨＰｇ　Ｄ ＮＡの存在について検査される。

実施例４では、ＨＰｇを含むウィルスベクターを感染させた細胞の培養と、これ らの細胞で発現されたｒｅｃ−ＨＰｇの精製について説明する。

実施例５では、宿主細胞でのｒｅｃ−ＨＰｇの発現の時間経過を試験する実験を 説明する。

実施例６では、実施例５の細胞混入培地のウェスタンプロット分析を説明する。

実施例７では、実施例５の細胞混入培地の定ｌ免疫検定法を説明する。

実施例８では、実施例５の培養物由来の物質からのＩ（Ｐｇについてなされた放 射化検定を説明する。

実施例９にて、実施例４より規模が大きいｒｅｅ−ＨＰＨの製造について述べる 。

実施例１０では、ウロキナーゼによるこの発明のＰｇの活性化について述べる。

実施例１１では、本発明で製造したＨＰｇを用いたストレプトキナーゼプラスミ ノーゲン複合体の構築を説明する。

実施例１２では、部位特異性プラスミノーゲン活性化物質を欠いた細胞の構築方 法と、その方法で製造される細胞について説明する。

実施例１ プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ　、マジソン、ライスコンシン）から入手した制限 エンドヌクレアーゼを、販売者指定の条件で使用して、ＨＰｇをコードするＤＮ Ａを含むバクロビールスベクターを構築した。

ｐｔｌｃ１１９ＰＮ１２７．６で示されるプラスミドを下記要領で調製した。

５人から単離した肝臓のｍＲＮＡで構成されるｎ−オリゴ（ｄＴ）を組み込んだ ｃＤＮＡライブラリーから最初のｃＤＮＡを単離した（Ｏｋｙａｍａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、」、１６１−１７０頁、 １９８２年、及びＧｕｂｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、２５８．２６３ −２６９頁、１９８３年）。サイズを揃えた（６００塩基対より大きい）　ｃＤ ＮＡは、λｇｔｌｏバクテリオファージベクターに結紮しくカリフォルニア、サ ンディエゴ方式による）、増幅せずにスクリーニングした（Ｄｒａｙｎａ、　ｅ ｔ　ａｌ、。

践旦岨、蔓り皇、６３２−６３４頁、１９８７年）。ｅＤＮＡを下記リンカ−を 用いてλｇｔｌＯベクターに結紮した。

Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｓａｃ　ｌ／５ｓｔｌ　Ｓａｌ　ｌλｇｔｌｏ−ＣＤＮＡクロー ンは、ヒトプラスミノーゲンｃＤＮＡのヌクレオチド１３０６〜１３８０に相当 する７５塩基のオリゴヌクレオチド試験＜ｐＬ、　１）で回収した（）す−スグ レン池、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、２１３８．２５４−２６０頁、１９８７年）。

濾過物を５　Ｘ５ＳＣ（１５０ｍＭ　Ｎａｃｌ、１５ｄクエン酸３ナトリウム） 　、　５０　ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ８，７）、５Ｘデンハルツ液、２０ ９４ホルムアミド、１０９４硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの煮沸、超 音波処理したサケ精子ＤＮＡ中で４２°Ｃで一昼夜ハイブリダイズし、２　Ｘ５ ＳＣ、０，１％ＳＤＳ中、５５°Ｃで１時間洗浄してからＸ線フィルムにさらし た。λｇｔｌｏクローン（λｇｔｌｏ：　ｐｍｇｎ＃１２７と表示）は５ｓｔＩ で切断し、Ｓｓｔ　Ｉ−切断ｐｔｌｃ１１９に結紮してｐＵｃ１１９ＰＮ１２７ ．６を得、その制限地図を第１図に、ヌクレオチドと推定アミノ酸配列を第２図 に示す。

クローンの配列は決定されていた。ＤＮＡ配列分析は、ｐＬ］ｃ１１９ベクター へ二次クローンした後、二次クローンされた二本鎖ｃＤＮＡの両方の鎖上で（Ｓ ａｎｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、　（ＬＩＳＡ）、７４８．５４８３−５４６７頁、１９７７年）、直接 二本鎖ＤＮＡ上で、又は一本鎖上で（Ｃｈｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＤＮＡ、」 、１６５−１７０頁、１９８５年）、ジデオキシチェインターミネータ−法によ り行った。

転移ベクターｐＡ■６は、ＡｃＭＮＰＶポリヘトリン（ＰＨ）遺伝子を囲むＤＮ Ａ配列を含む構成である。プラスミドｐＡＶ６は、ＰＨ遺伝子の５′側のＸｈｏ Ｉ部位からポリヘトリン開始コドン（ＡＴＧ）までの１，８ｋｂのポリへドリン プロモーターを含む。また、プラスミドｐＡＶ６は、ポリヘトリン遺伝子内のＫ ｐｎ　］部位から同一遺伝子のＢａｍＨ１部位の３゛側に達するまでの１．５ｋ ｂの断片も含んでいる。ＸＨｏ１とＢａｍ旧部位は、これ等断片のクローニング 中に欠失した。

転移ベクターｐＡＶ６を下記の様に構策し、第３図にその構築図を示す。ｐＥｃ ｏＲｌｌで示される（Ｓｍｉｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　 ４５豊、２１５−２２５頁、１９８３年；Ｓｍｊｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌ、　、４６８．５８４−５９３頁、１９８３年）　、Ａｕｔｏ　ｒａ 　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ＤＮＡのポリヘトリン遺伝子と側鎖配列を含 むＥｃｏＲＩ断片？、２ｋｂをＸｈｏｌとＢａｍ旧で切断した（ＳａｉｌとＸｈ ｏｌでの切断は不適合端末を作る）。切断した Ｘｈｏｌ／ＢａｍＨＩ断片を、５ａｉｌとＢａｍＨＩで切断したｍｐ１９ベクタ ー（ベセスダ研究所、ガイターバーブ、メリーランド）に結紮してｍｐ１９　Ｘ ｈｏ−Ｂａｍで表示した構造とした。このプラスミドｍｐ１９Ｘｈｏ−Ｂａｍを ＥｃｏＲＶとＫｐｎ　］で切断し、最初の合成オリゴヌクレオチド（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター市、カリフォルニアから人手した自動 ＤＮＡ合成機の３８ＯＡモデル上に構成した。以下に述べるオリゴヌクレオチド も同様である）を切断したｍｐ１９Ｘｈｏ−Ｂａｍに結紮してｍｐ１９ＡＩＤと 示したベクターを得た。最初の合成オリゴヌクレオチドは下記の配列を持ち、示 した制限部位と転写開始部位を含んでいる。

一転写開始 ５°−ＧＡＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＣ ＴＣＧＣＡＡＡＢａｍＨ］　［！ｃｏＲＩ　ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣ２Ａ ＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＧＧ Ｓａｉｌ　Ｋｐｎｌ 最初の合成オリゴヌクレオチドは、［Ｄｐ１９Ｘｈｏ−ＢａＩＩ］中のＸｈｏｌ ／ＢａｍＨｌ断片の５°端末の配列をＥｃｏＲＶ部位からＣＡＰと推定される部 位に転移し、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、　５ａｉｌ及びＫｐｎ１部位を有する多 数のクローニング部位を含んでいる。

次に、ｐｔ］Ｃ１２ベクター（ベセスダ研究所）をＨｉｎｄｌｌ［と５ｓｔｌで 切断し、ｍｐ１９ＡＩＤをＨｉｎｄｌ［とＫｐｎ　Ｉで切断して、ポリヘトリン 遺伝子の５゛端側を保護する配列を含む１．８ｋｂ断片を単離した。プラスミド ｐｌＥｃｏｌｌをＢａｍＨＩ　とＫｐｎ　Ｉで切断し、分解生成物の中からポリ ヘトリン遺伝子内のＫｐｎ　１部位からＢａｍＨＩの３゛端側からの部位に達し ている１、５ｋｂ断片を単離した。これら３つの断片（ｐｔｌｃ１２．１．８ｋ ｂと１．５ｋｂ）を、５−ＧＡＴＣＡＧＣＴ配列を有する第２合成オリゴヌクレ オチドに結紮して、ｐＡＶｌで示された構造を得た。

ｐＡＶｌをＢａｍＨＩ　とＫｐｎ　Ｉで切断して得た断片を第３合成オリゴヌク レオチドに結紮してｐＡＶ２で示された構造を得た。第３合成オリゴヌクレオチ ドは下記のヌクレオチド配列を有する。

ｒｕ　Ｉ Ｂｇｌ　Ｉ［５ｓｔｌ　ＢａｍＨＩ　ＢｓｔＥＩＩＸｂａ　Ｉ　Ｓｍａ　Ｉ ５゛−ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ　ＣＧＡ　ＴＧＧ　ＡＴ ＣＣＣＧ　ＧＧＴ　ＡＡＣ３’　−ＡＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＣＧＣＴ 　ＡＣＣＴＡＧ　ＧＧＣＣＣＡ　ＴＴＧｐｎ　Ｉ ＣＧＧ　ＴＡＣ Ｃ プラスミドｐＤＳは、ｐＢＲ３２２（ベセスダ研究所から入手した４、４ｋｂプ ラスミド）をＨｉｎｄｕと５ａｌｌで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を埋め込んで結 紮して構築した。従って、プラスミドｐＤＳはＨｉｎｄＩ［と５ａｉｌ間の配列 が欠落し、５ａｉｌ部位は無いが、ＨｉｎｄＩ［部位は保持している。

プラスミドｐＡＶ２をＨｉｎｄｕとＢａｍ旧で切断し、１．５ｋｂの旧ｎｄ■／ Ｂ話旧断片（５゛側鎖配列を含む）を単離した。次に、ｐＡＶ２をＢａｍ　Ｈｌ とＥｃｏ　Ｒ１で切断し、無数のクローニング部位中のＢａｍＨ１部位から３′ 側鎖配列に隣接するＥｃｏ　ＲＩ部位に達する１、５ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ ＨＩ断片を単離した。プラスミドｐＤＳをＨｉｎｄｌｌ［とＥｃ。

Ｒ１で切断し、ｐＡＶ２から作製した二つの断片に結紮した。得られた、プラス ミドをｐＡＶ３と表示する。

プラスミドｐＡＶ３をＢａｍＨＩ　と５ａｉｌで切断した。ベクターｐＡＣ３７ ３［Ｓｍ１ｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｊｏｌ、、」、 ２１５６−２１６５頁、 １９８３年１　（ポリヘトリン遺伝子の約１　ｋｂ５゛側の５ａｉｌ部位からヌ クレオチド−８（“ＡＴＧ”開始部位の“Ａ”が＋１の時）に挿入されたＢａｍ Ｈ１部位迄のウィルスＤＮＡのＮＰＶを含む）をＢａｍＨＩ　と５ａｉｌで切断 し、ＢａｍＨＩ／５ａｌｌ切断ｐＡＶ３に結紮してｐＡＶ４と示したベクターを 構築した。

ベクターｐＡＶ４をＥｃｏ　Ｒ１で切断し、両端にフレナラ断片を埋めて結紮し 、（ｐＡＶ４のＥｃｏＲ１部位が欠けている）　ｐＡＶ６と示したベクターを得 た。

全ＨＰｇアミノ酸配列を［Ｇ１ｕ１］ＨＰｇの形でコードしたｃＤＮＡを含むＢ ａｍ旧ハａｅｌ断片をプラスミドｐＨ９ＰＮ１２７．６から切除して、プラスミ ドｐＡＶ６のＢａｍ旧部位とＳｍａ１部位に挿入した。ｐＡＶ６ＨＰｇで示した 組換転移プラスミドの制限地図を第４図に示す。第４図中、制限部位を下記の様 に示した。Ｒ，Ｅｅｏ　Ｒ１；　Ｘ、　Ｘｈｏ　Ｉ　：Ｖ、Ｅｃｏ　ＲＶ：　Ｈ ，Ｈｉｎｄ　ＩＩ；　Ｓ、　ＳｍａＩ　；　Ｋ、　ＫｐｎＩ　；及びＮ、Ｎａｅ ＩａこのプラスミドｐＡＶ６　ＨＰｇは、ＨＰｇシグナルと成熟［Ｇ１ｕ’ｉＰ ｇコード配列に結合しているＡｃＭＮＰＶポリヘトリン（ＰＨ）プロモーターを 含んでいる。挿入１（Ｐｇは、（５゛から３°にかけて）　ｐＵＣ１１９から２ ０塩基、リンカ−の３８塩基および５′の未翻訳配列、ＨＰｇシグナル配列から ５７塩基、翻訳処理された最終ＨＰｇ配列の２３７３塩基、３゛の未翻訳配列プ ラスポリ−Ａ配列とリンカ−の３２２塩基、ならびにｐｔｌｃ　１１９からの３ ６７塩基を含む。ｐＡＶａ中のＢａｍ旧部位は、ＰＩ（遺伝子のヌクレオチド８ に相当する位置にあった（８個のヌクレオチドがＰＨ−開始のメチオニン慰塊の ５°に位置していた）。　転移ベクターｐＡＶ６　ＨＰｇは、Ａｍｅｒｉｃａｎ 　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（１２３０１、パークローン ドライブ、ロックビル、メリーランド ２０８５２）に、１９８９年４月１８日に、Ｅ、　Ｃｏ１１　ＤＨ５ａを宿主と して、寄託し、寄託番号６７９２９が付与された。

実施例２ 合成ｐＡＶ６　ＨＰｇと野生型ウィルスＤＮＡを用いて培養ぴ刑事１罰坦行邸山 閂４０細胞の同時トランスフェクトを行った。細胞中では、転移ベクターの対応 ポリヘトリンを保護している領域と、ウィルス間の交差はＰｉ（遺伝子の代わり にＨＰｇ遺伝子を運ぶ組み換えウィルスの全長に及んでいた。

組換用宿主ウィルスとしては、−Ω且堕犯３狙望」］よ■男１頂遷）核多角体病 ウィルスのＡｃＴＲ抗温度不活性株（ＡｃＭＮＰＶ）を用いた。

クローンした（例えば、Ｓｆｑ細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ロックビル、メリーランド）の寄託番号Ａ、Ｔ、 Ｃ，Ｃ，ＣＲＬ　１７１１で入手可能）、あるいは未クローンの鋒剋ｎ圏匹 む旦ｌμ扛迦ユ細胞系を用いて、全ウィルスの培養と操作用の宿主細胞としても 良い（Ｖａｕｇｈｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ　ＶＮｒｏ、　１３８．２１３− ２１７頁、１９７７年）。昆虫細胞の培養手順は、Ｇｊｂｃｏ粉末Ｇｒａｃｅｓ ’　ｓ　Ａｎｔｅｒａｅａ培地、旧ｎｋ培地（ＴＮＭ−ＫＨ培地の代わり）、及 びペニシリン、・′ストレプトマイシン７′画性Ｂ抗生物質混合物をその３８頁 に記載の手順に代えて用いた以外はＳｕｍｍｅｒｓ、　ｅｔａｌｏ、テキサス農 業試験所公報Ｎｏ、１５５５　（１９８７年）の１０−３１頁と３８頁に記載の 通りである。

詳細に言えば、ピンク培地（Ｈ３ｎｋ、践包匹、Ｕ虹豊、４６６−４６７頁、１ ９７０年、プラス１０　％牛脂児血清（ＦＢＳ）　（Ｓｍｉｔｈ、　ｅｔａｌ、 、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、３８．２１５６−２１６５頁、１９８３ 年）中のＳ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｊ　ｅｒｄａ細胞（３Ｘ１０＠）を６ ０　ｍｍ　ｊ？ｂ１皿に入れる。

２時間後培地を除き、細胞をＡｃＭＮＰＶからの野生型ＤＮＡ（０，１μｇ）、 プラスＮａＣ１（０，８ｇ／ｌ）、ＫＣＩ　（０，３７ｇ／ｌ）／ＮａＪ２ＰＯ ，＋２Ｈ２０（０，１２５ｇ／ｌ）、デキストローゼ（Ｉｇ／ｌ）及びＨｅｐｅ ｓ−Ｎａｉｌ（（５ｇ／ｌ）中のｐＡＶ６ＨＰｇ転移プラスミドＤＮＡ　（１μ ｇ）ノ懸濁液０．５１［１１中ｐＨ７，２で恒温培養した。約２７°Ｃで一昼夜 培養後、ＤＮＡ　ｇ、濁液を取除き、細胞をピンク培地プラス１０％ＦＢＳ中で ５日間恒温培養した。

Ｓ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ細胞は、コーニング社のにューヨ ーク市、ニューヨーク）低速攪拌器をセルグロ低速磁気攪拌機（サーモライン社 製、デュバック市、アイオワ）に取り付けて、懸濁液中で培養しても良い。１０ １００Ｏ攪拌器の各々に、不完全なピンク培地（８，３％ＰＢＳと前記のペニシ リン／ストレプトマイシン／両性Ｂ混合物で補う）　３００　［０１を加える。

次に、容器に５×１０６細胞を加え、８０　ｒｐｍで攪拌する。細胞は２〜３Ｘ １０’細胞／ｍｌ密度に達したら、細胞懸濁液１５０〜２５０　［＋１１を取り 除いて新しい培地に替え２次培養する。懸濁液で成長した細胞はフラスコに付着 し、単一層を必要とする操作に用いられる。

また、細胞をＪＲ，５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ウッドランド、カリフォルニア） が製造する限定、低タンパク培地ＥＸ−ＣＥＬＬ　４００中で培養してら良い。

この培地は、完全なヒンク培地の代わりに単層中、震盪フラスコ懇濁培養液中、 あるいは通気バイすりアクタ−中（ｑ、ｖ、　Ｍａｉｏｒｅｌｌａ、　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　、　８８．１４０６−１４１０頁、１９８８年 ）での細胞培養に用いて良い。

同時トランスフェクションで得た子孫のウィルスは、ベスト試験で検査した。光 線顕微鏡で観察して閉塞人体に陰性のペス）（ＯＢ−）からウィルスを選び、更 に２回のベスト試験を行って精製した。この様なベストがあると、感染性ウィル スはもはやＰＨタンパクを製造せず、また［Ｇ１ｕ’］Ｐｇ遺伝子はウィルス性 円（配列にかわったことが判明した。

実施例３ ベスト精製を３回したＯＢ−ウィルスから得たＤＮＡのＥｃｏＲ］切断からサザ ーン・プロットを調製した。

３Ｘ１０’のａＢ胞を６０玉ペトリ皿に入れ、３種朋のベスト精製したＯＢ−ウ ィルスに１０倍多重度で感染させた。７２時間のプログラム指示で、ピペットを 静かに使って細胞を再懸濁させ、３５００ｇで１６℃、２０分間ペレット化させ た。この細胞ペレットを、４■グアニジニウムイソチオシアネート１０．５９４ サルコシル１５［１１Ｍクエン酸ナトリウム１０．１１１１！＋１β−メルカプ トエタノール中に憲濁、緩解した。調製した溶液をフェノール／クロロホルムで ４回抽出し、ＤＮＡはエタノールで２度沈澱した。

この３種のウィルスＤＮＡ試料、野生型ウィルスＤＮＡ　、及び本来のｐＡＶ６ ＨＰｇ転移ベクターとをＥｃｏＲ］で切断してサザーン・プロット評価試験を行 った。分解試料を０．８５９４アガローズゲル上に分離し、バイオランド移植ユ ニット（バイオランド、リソチモンド、カリフォルニア）、及びハイオラソト試 験用非変性ゲルを用いてナイロン膜上に電気吸着させた。］（Ｐｇ含有プラスミ ドｐＨ９Ｐ！１１１２７．６とｐＵｃ］３のコピーにｐ３２でニック・トランス レーション法により標識をつけ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｊｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ ｌ、コールドスプリングハーバ−研究所、ニューヨーク、１０９−１１２頁、３ ８７−３８９頁、１９８２年：及び、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ ｉｏｌ、　、９８豊、５０３−５１７頁、１９７５年に一般的に記載されている 通り）、ハイブリダイゼーション・プローブに用いた。

濾過物を前処理ハイブリダイゼーション液中（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ 　Ｍａｎｕａｌ、同上、１０９−１１２頁、３８７−３８９頁、１９８２年、に 記載されている）で、３７℃、３時間恒温培養し、水洗後、各試験体を前処理ハ イブリダイゼーション液中に溶解して３７℃で１８時間恒温培養した。標識付し たプローブを取除き、非特異放射能をｐｉ（８，０の［ＥＤＴＡ　１０　ｍＭ／ Ｑ。

２％ＮａＤｏｄＳＯ４（ｗ／ｖ）中、３７℃で４５分間濾過物を静かに揺らして 除去した。洗浄液は４回変えた。ハイブリダイズした帯は、オートラジオグラフ ィーで視覚化した。

転移ベクター中のＨＰｇ遺伝子からの２．２　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片に相当する 位置に新しいバンドが存在するのを示したのは１つのベストであった（データ示 さず）。Ｐｇ３Ａで示されたこのウィルスクローンを、以下の実施例で使用した 。Ｐｇ３ＡからのＤＮＡのサザンプロットは、この［Ｇ１ｕ’］Ｐｇ遺伝子がウ ィルス性ＤＮＡ中に挿入されたことを示すものである。

実施例」 ２０■１のヒンク培地プラス１０％牛脂児血清を入れた組織培養フラスコ（１５ ０ａｍ”）、総数４５個に、２Ｘ１０’細胞／Ｃ１［１２を接種して、細胞を３ 培のＰｉ（３Ａウイルスに感染させた。４８時間後、成長培地を傾斜して捨て、 ］Ｏ単位／ｍｌのアプロチニン（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ） を加えて、残渣細胞と細胞破片とを４°ＣＩＯ分間の、１３０００　ｇでの遠心 分離により取り除いた。

以下、特に記載がなければ、すべての精製工程は４°Ｃで行った。

上澄み液を集め、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）を４回変えて透析し、 凍結乾燥した。

最小量のＨ，Ｏに溶解後、上澄み液を０．５［＋１１／分の流速でセフ了ローズ ーリシン親和性支持体のカラム５ｍｌ上に通した（Ｂｌｏｃｋ−ｗａｙ、　ｅｔ 　ａｌ、、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　、１５１　皇、 １９４−１９９頁、１９７２年）。次に、カラムを０．１ｖのリン酸ナトリウム （ｐＨ７，４）で洗浄し、１００　ｍＭリン酸ナナトリウム／２５ｍＭ　ＢＡＣ Ａ　ＣｐＨ８，０）又は０、１Ｍリン酸士トリウム（ｐＨ８，０）中の直線勾配 （３０ｍｌ　Ｘ３０ｍ１）のＥＡＣＡ　（出発濃度・ゼロＥＡＣＡ、限界濃度： 　２０　ｍＭ　ＥＡＣＡ）で溶出した。Ｐｇを含有する画分（ドツト・プロット 分析法による）を集めて１（２０を３回変えて透析し、凍結乾燥して一２０’Ｃ で貯蔵した。

免疫ドツト分析法ではバイオラッドマイクロ濾過装置にニトロセルロース獲を使 用する。試料５０μ］をウェルに入れ、バイオラッド取扱説明書に記載されてい る通りに分析を続けた。ウサギの抗ＨＰｇを使ってＰｇの存在を検出し、次いで ヤギの抗つサギＩｇＧ−アルカリ性フォスフ了ターゼ結合を用いて、この膜を装 置からはずし、陽性のウェルを下記のウェスタン分析法に説明する様に視覚化し た。

小規模培養（６０ｍｍベトリ皿中）のＰｇ３Ａ感染昆虫細胞をＥＬＩＳＡ、ウェ スタン・プロット−活性化分析試験法により活性化ｒｅｃ−ＨＰｇを分析した。

活性化可能なｒｅｃ−ＨＰｇが、ＥＬＩＳＡ抗原試験の陽性結果と活性化試験の 陽性結果で示される様に、少なくとも３例で観察されたが、タンパク質の分解形 跡も見られた。従って、発現の経時試験を行った。

実施例５ 経時試験では、プログラム指示により、２４．４８．６６．７０．７４．８０及 び９３時間に細胞と細胞上澄み液の試料を取り除いた。各時点毎に８枚の６０ｍ ｍ皿を用意した。即ち、野生型（ＡｃＭＮＰＶ）と擬似感染皿ぐ１．８　Ｘ　１ ０６細胞／ｃｍ２で）：　及び７Ｘ１０’細胞／ａｍ”、１．８　ＸＩＯ’ＩＯ ’Ｃｍ”、及び３．５　ＸＩＯ’細胞／細胞７ｃク’の細胞密度の各々に２枚づ つの皿で、各々が上述の様にＰｇ３Ａウィルスの３倍または１０倍多重度で感染 されている。

ウィルス懸濁液を除去する際、細胞をブレースの昆虫培地（Ｇｊｂｃｏ　、グラ ンドアイランド、ニューヨーク）で洗浄し、ブレース培地中で恒温培養を継続し た。前記の時間に、成長培地中に適当な細胞を静かにピペットで入れて再懸濁さ せて、各試料の活動中の溶液を得て、これを遠心分離して細胞ペレットから培地 を分離した。洗浄したペレットは、ＰＢＳ中に再懸濁し、ガラスピーズ存在下で 渦巻回転させて溶解した。得られた細胞破片を遠心分離でペレットとし、上澄み 液を集めた。プログラム指示により、２４．４８．６６．７０．７４．８０及び ９３時間に、各試料の培地と細胞ペレット上澄み液をＥＬＩＳＡとウェスタン・ プロット法によりＨＰｇ抗原の存在を試験し、また活性化分析試験法に実施例５ の細胞と培地のウェスタン分析用に、非還元条件下の９０６　（ｗ／ｖ）のポリ アクリルアミドゲルで、ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａ ｔｕｒｅ、２２７　Ｓ、６８０−６８５頁、１９７０年）によりタンパク質試料 を分離した。分離タンパク帯をＢｕｒｎｅｔｔｅ、　ＡｎａｌユＢｉｏｃｈｅｍ 、、旦Ｌ１．１９５−２０３頁（１９８１年）の一般原則に従って、ニトロセル ロースに移した。転移条件は４“Ｃで、トリス−ＭＣＩ２０　ｍＭ／グリシン１ ５０　ｍＭ／メタノール２０！％　（ｖ／ｖ）中、ｐＨ８，３，１９ボルト、１ ８時間である。濾過物をトリス−１（ＣＩ　２０山Ｍ／ＮａＣｌ３００ｍＭ、　 ｐＨ７，５で洗浄しくＴＢＳ）、３７°Ｃで１時間ＴＢＳ（阻止緩衝液）中のゼ ラチン（ハイオーラッドＥＩＡ級）１％（胃／Ｖ）で恒温培養した。この溶液を 、阻止緩衝液中のウサギ抗−ＨＰｇ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、インディアナ）を２μｇ／ｍｌ含む他 の液と交換して、混合しながら室温で９０分間恒温培養した。

濾過物を、ＴＢＳ（洗浄緩衝液）中の０．０５９４　（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２ ０（登録商標）で５回交換し、室温３０分以上で洗浄した。次に、濾過物を室温 で９０分間、阻止緩衝液中のウサギ抗ヤギＩｇＧ−アルカリ性フすスファターゼ 結合を用いて混合しながら恒温培養し、その後、上記と同様に洗浄した。培養後 、陽性ハンドを室温で基質液（１ｍｌ　Ｉ２０中にニトロブルーテトラゾリウム １６．５　ｍｇ／７０％　（ｖ／ｖ）水性ＤＭＦ　０．５　ｍｌ／プロモクロロ インドリルフすスフエイト８．５ｍｇ、これをトリス−ＭＣＩ　０．１　Ｍ／Ｎ ａＣ１０，１Ｍ／ＭｇＣ１□０．００５　！ｄ　５０ｍ１　ｐＨ９，５に加えて 調整した）を用いて視覚化した。Ｉ２０を数回交換して、洗浄して反応を終了さ せた。ウィルス性１０多重重度でのウェスタン分析の結果を第２図に示すが、ウ ェスタン・プロットにより、３種の細胞からの培地へのＨＰｇ経時分泌が、ペプ チド信号とＨＰｇコード配列を含む組み換えウィルスｐＡＶ６ＨＰｇに感染させ たＳ　ｏｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｃｌａ−細胞を培養した事が分かる 。３種の細胞密度（０，７Ｘｌ０ｈ、１．８　ＸＩＯ’及び３．５×１０５細胞 ／ｃｍ２）はｐＡＶ６ＨＰｇの１０倍多重度で感染していた。

本発明の０．７　ＸＩＯ’細胞／ｃＩＩ１２密度の宿主細胞、本発明の分泌１（ Ｐｇ　、１．８Ｘ１０’細胞／ｃｍ２密度の本発明の宿主細胞からの物質、本発 明の分泌ＨＰｇ　、並びに３．５　Ｘｌ０６細胞／ｃｍ”密度の本発明の宿主細 胞からの物質、本発明の分泌ＨＰｌｊそれぞれのウェスタン・プロットを第５図 に示す。三実験例全てにおいて、第１と第２列は各々野生型ウィルス感染からの 細胞と培地、第３と第４列は組み換えウィルスｐＡＶ６　）［Ｐｇに感染のプロ グラム指示が２４時間での細胞と培地、第５と第６列は、ｐＡＶ６　ＨＰｇ感染 のプログラム指示が４８時間での細胞と培地、そして第７〜第１１列は、ｐＡＶ ６ＨＰｇに感染した細胞からの、プログラム指示が各々６６時間、７０時間、７ ４時間、８０時間、９３時間での培地試料を表す。

第５図の結果からも明らかな様に、ＨＰｇシグナルペプチドが昆虫細胞に認めら れる。これはプログラム指示が２４時間時点で細胞試料にｒｅｃ−ＨＰｇ抗原が 認められたより高密度細胞で容易にわかる。プログラム指示が４８時間に至るま でに、ｒｅｃ−ＨＰｇ抗原の約９０％が培地に認められた。ＡｃＭＮＰＶと攪似 感染細胞のどちらでも、どの時点でも陽性結果は得られなかった。低密度の二実 験例で、プログラム指示が９３時間の時点でさえ、ｒｅｃ−ＨＰｇの目に見える 分解は無かった。しかし、細胞が過密状態である最高密度の細胞では、プログラ ム指示が４８時間の時点で始まる分解がはっきりと認められた。ｒｅｃ−ＨＰｇ が無傷状態で残り、培地中に分泌される条件が判明したので、この分解要因をこ れ以上解明しなかった。

第５図に示す経時試験結果より、プラズマ）［Ｐｇに対して生じるポリクロ−カ ル抗体プールに対する反応性により、認識可能な］（Ｐｇが培地へ分泌される条 件が容易に分かるのは明白である。

ｒｅｃ−ｔ（Ｐｇのバンドが１対から構成されるのも第５図から分かる。ヒトプ ラズマ、プラスミノーゲンに於てら、タンパク質が二つの特異的グリコジル化さ れた形状を有するために、この様３４−３７頁、１９８６年）。

実施例７ 実施例５の培養菌からの細胞や上澄み液中に存在するｒｅｃ−ＨＰｇレベルを測 定するために、酵素結合の免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を公知手順（Ｐｌｏｐ ｌｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ、針車、５８９１−５８９７ 頁、１９８２年）の応用法で行った。ヤギ抗ＨＰｇポリクローナル抗体プール（ シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ）をポリビニルプレートに塗布して 試料を加え、室温で１時間恒温培養した。リン酸ナトリウム１０　ｍＭ／ＮａＣ １１５０ｍＭ　（ＰＢＳ）　、ｐＨ８，０でプレートを洗浄してからウサギの抗 ＨＰｇ抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）を添加した。ウサギ抗ＨＰｇ プールは、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　（インディアナポリス、イ ンディアｆ）から入手した。指示薬のｐ−ニトロフェニルフすスフエイトを加水 分解後、抗つサギＩｇＧ−アルカリ性フｔスファターゼ結合を用いて吸着アルカ リ性フｔスファターゼにより、第２の抗体を検出した。検出の下限は一般に、Ｂ ｒｏｃｋｖａｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

肛羽脹ユ、■し豊、１９４−１９９頁、１９７２年に従って、新鮮な人血漿をセ フ了ローズーリシン上で精製して得た標準［Ｇ１ｕ’］Ｐｇに対して、約３０　 ｎｇ／ｍｌであった。

第５図に示すように、これら培養物からの細胞と上澄み液中に存在する抗原レベ ルの定１分析では、はとんど計測不可能なｒｅｃ−ＨＰｇ抗原が、プログラム指 示が２・１時間という早い時点で細胞中に認められた。培地分析試験の際に得た 結果にばらつきがあるので、約６６時間のプログラム指示によって、抗原を０． ７〜１．０μｇ／ＩＡ＠細胞のレベルで分泌する。３倍および１０倍のウィルス 多重度での細胞感染を比較して、ｒｅＣ−ＨＰｇ抗原レベルに有意の差を認めた 。

発現に関する経時試験から、プラズマＩ（Ｐｇに対して生じるポリクローナル抗 体プールへの反応性により認識可能なＨＰｇが、約１μｇ／［［１１のレベルで 培地に分泌される条件が容易に分かるのは明白である。

実施例８ 実施例５の培養物から誘導した物質に対するｒｅｅ−ＨＰｇ機能を測定するため に、２つの活性化試験を行ったが、その際、活性化に先立ってタンパク質分子の 特異構造に反２する試薬を用いて、培地から酵素原を除去した。第１の分析試験 では、３５−Ｊ−４で示したマウス−抗−ＨＰｇクリングル、１−３モノクロー ナル抗体が、ポリビニルプレートのウェルに吸着し、次に、試験対象物を吸着さ せた。第２の分析試験では、免疫プロット装置のウェルを３　ＭＭペーパーで遮 蔽し、セフ了ローズーリシン５０μｍを加え、次に、同様にして試験対象物をを 加えた。ＨＰｇへのモノクロ−カル抗体を作成するハイブリドーマ細胞が作成さ れ、スクリーニングしてから、Ｐｌｏｐｌｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｊｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒ、２１−１．５８９］−５８９７頁（１９８２年）の説明に沿って安 定化させた。

モノクローナル抗体３５−Ｊ−４は、ｌ（Ｐｇのクリングル１−３区域に対して 現れ、ＨＰｇ−セフ了ローズ上の親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｈ Ｐｇのクリングル１−３区域（残渣７９−３５５）を制限エラスターゼ消化でｔ Ｓｔ、、セファローズ−リシン上の親和性クロマトグラフィーを行った。ＥＬＩ ＳＡ試験により（Ｐｌｏｐｌｉｓ。

ｅｔ　ａｌ、、　肛坦迫叶旺■、２１！、　５８９１−５８９７頁、１９８２年 ）、この抗体の解＃ｌ（親和性）定数を測定し、結果は下記の通りであった。（ Ｇｌｕ’：Ｐｇ２　Ｘｌ０−’　Ｍ；プラスミン重鎮（残渣１−５６１）　３　 Ｘ　１０−’　Ｍ；　！Ｌｙｓ”）Ｐｇ　２．７ｘｌＯ−’　Ｍ；　クリングル １−４区域（残渣８Ｏ−４４０）　４．ｌＸ１０−’　Ｍ；及びクリングル１− ３区域（残渣８０−３３８／３５４）３．９　Ｘｌ０−’　Ｍ。還元されカルボ キシメチル化されたＨＰｇへの、無傷クリングル４への、プロトロンビンへの、 あるいは組織プラスミノーゲン活性化物、すなわち、あらゆるクリングル含有タ ンパク質への結合は皆無であった。

各分析試験では、室温で１時間試料と共に恒温培養した後、各ウェルを０．１Ｍ 　リン酸ナトリウムｐＨ８，０で洗浄し、次にｐＨ７，４でＨｅｐｅｓ−ＮａＯ Ｈ１０ｍＭ／Ｎａ０Ａｃ　１００　ｍＭ（反応緩衝液）で洗浄し、ウロキナーゼ で活性化した（反応緩衝液巾約１００ｍＭ）。ヒト腎臓の二本鎖ウロキナーゼは 、アボット研究所から入手したもので、主として低分子量のものであった。反応 緩衝液中のプラスミン色素形成性基質液、叶ｖａｌ−１ｅｕ−１ｙｓ−ｐ−ニト ロアニリド（Ｓ　２２５１）（最終濃度０．５ｍＭ）を添加し、３７°Ｃで、少 なくとも６時間恒温培養した。Ｓ　２２５１からのｐ−ニトロアニリド放出に起 因する４０５ｎｍでの吸光度が観測され、テスト試料の代わりに標準［Ｇ１ｕ’ 　：Ｐｇを用いた。−組の二倍連続希釈で得た吸光度と対照した。

第６図に第５図の作成に用いたのと同一試料で行った活性化試験の結果を示す。

ポリビニルクロライドミクロティーチルプレートのウェルに吸着したＨＰｇのク リングル１−３区域に対するテスト試料とモノクローナル抗体との相互作用の後 で、ウロキナーゼによる第５図試料の活性化能力を試験した。縦軸に活性化後６ 時間に測定したプラスミン基ＭＳ　２２５１のネット加水分解を、４０５　ｎｍ 波長での吸光度として表す。第６図中の実線は培地試料の結果を、また破線は細 胞の試験結果を示し、円形は二倍多重度のウィルスに感染した細胞の結果、角型 は１００倍多度のウィルスに感染した細胞の結果を示す。

プログラム指示が２４時間の時点で、細胞試料中にはある活性が存在しており、 それはプログラム指示が６６時間に至るまでにゼロに減少する。同時に活性化可 能なｒｅｃ−ＨＰｇの大半は培地に分泌され、それは７０〜９０時間で僅かに増 加する。活性化に先立ってテスト試料から選択的にｒｅｃ−ＨＰｇを除去するた めに、マウス抗−人のＨＰｇ（クリングル１−３）モノクローナル抗体３５−Ｊ −４か、セフ了ローズーリシン親和性支持体のどちらを使用したかにかかわらず 、定性的には同様の結果が得られた。

活性化試験ではプラスミノーゲン活性最高レベルは６６〜７２時間の間で測定さ れた。現時点では培地を４８〜５４時間の間で回収するのが好ましい。

ｒｅｃ−ＨＰｇは二つの特定法、すなわち分子のクリングル１−３領域（第６図 ）に配座的に向けられるモノクロ−チル抗体に対する反応性による方法と、ＨＰ ｇのクリングル領域配座の完全性に同様に依存する配位子ＥＡＣＡへの）ｆＰｇ の親和性（データを図示せず）による方法で、培地から取り除いた後も、ｒｅｃ −ＨＰｇのプラスミンに対する活性化が可能である。このように、ｒｅｃ−ＨＰ ｇはその活性化に適した配座へと昆虫細胞により分泌されるだけでなく、小配位 子と同様、特定のモノクローナル抗体との相互反応用に適当に構策され、これに よって、ＨＰｇ活性化における重要な調整機能が果たせるのである。

寒凰纒主 大規模なｒｅｃ−ＨＰｇ　Ｍ造を行って、総数１．４　ＸＩＯ’の細胞をウィル スをコードするＨＰｇ遺伝子で３倍多重度で感染させた。プログラム指示が４８ 時間で！貴１３００ｍｌの培地を容器に傾斜して細胞から除去し、ｒｅｃ−ＨＰ ｇの存在を試験した。５ｍＭのリン酸ナトリウムリＨ８，Ｏ）による大規模な透 析をし、凍結乾燥による培地の濃縮後、試料をＨ２Ｏ中に再溶解し、前記と同様 にセフ了ローズーリシンカラムを通して濾過し、ｒｅｃ−ＨＰｇを０〜２０ｍＭ の［！ＡＣＡ勾配で溶出した。ポリクローナルウサギ−抗ヒトＨＰｇを用いて免 疫プロット検定法でｒｅｃ−ＨＰｇを同定した。

第７図にセファローズ−リシン親和性クロマトグラフィーによる（ｐＡＶ６　Ｈ Ｐｇに感染した昆虫細胞から回収した培地のＥＡＣＡ勾配溶出後に行う）分離で 得た画分中のＨＰｇの存在を確かめる免疫プロット試験の結果を示す。カラムで 得た画分をいくつかに分けて、プロット試験装置のウェルからニトロセルロース 紙へと吸着させた。この紙上のＨＰｇの存在を、ウサギ−抗ＨＰｇ　、引き続き アルカリ性フすスファターゼに結合しているヤギー抗ウサギ−１ｇＧを加えてか ら、免疫プロット試験法を行って検出した。プラズマＨＰｇに対するヤギー抗ヒ トポリクロ−＋ル抗体プールは、シグマ化学社から入手し、同様のウサギ−抗ヒ ト抗体プールはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社から入手した。

第７図ではＥＡＣＡ勾配（０〜２０　ｍＭ）の始まりを〉で示している。

ｒｅｃ−ＨＰｇを含む一連の画分の始まりと終りでのＥＡＣＡ濃度を、２Ｆと４ Ｅの左に各々示す。ドツト・プロットＡ〜Ｅは、１００ｍＭ　ＥＡＣＡカラム洗 浄のものであり、５ＦとＧは対照試験のものである。図中の最後のドツト・プロ ットは、約２００ｎｇ／ｍｌ濃度でのプラズマＨＰｇ標準である。カラムからの 溶出の進行はプレートを上から下へ（Ａ−Ｈ）そして左から右へ（１〜５）読み 取る。

第７図に示した結果から、ｒｅｃ−ＨＰｇ抗原が、８　［１１Ｍ　〜１２ｍＭの ＥＡＣＡ１１度で溶出した事が分かり、これはヒトプラズマＨＰｇの親和性クロ マトグラフィ一応用例１とほぼ同位置にある（Ｂｌｏｃｋ−＊ａｙ、　ｅｔ　ａ ｌ、、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　、１５１　Ｉｔ、１ ９４−１９９頁、１９７２年）。

ｒｅｃ−ＨＰｇを分泌した昆虫細胞とＥＡＣＡとの相互反応の強度は、原プラズ マＨＰｇのそれとかなり似ており、これは同一の親和性クロマトグラフィーカラ ム（第７図）から、ｒｅｃ−ＨＰｇが溶出するため、特にプラズマＨＰｇを溶出 するのに要したＥＡＣＡ濃度範囲と酷似する。従って、前述の実施例結果と考え 合わせると、これらデータは、無を椎動物細胞から分泌される検出可能なｒｅｃ −ＨＰｇが、起源のＨＰｇにそれと非常に酷似した配座に存在している事を強く 示唆する。

第７図で説明した親和性クロマトグラフィーカラムで精製した、大規模試験での 種々試験過程で得たウェスタン・プロット試料を第８図に示す。ＮａＤｏｄ　Ｓ Ｏ４／Ｐ、ＡＧＥゲルからニトロセルロース紙へと電気泳動で移した試料を全タ ンパクで染色（ジャンセンオーロ染色）するか、または上記第５、第７図で説明 した］（Ｐｇに対する免疫分析試験によって検出する。第１列はＨＰｇの親和性 変種工と■の標準混合物である。第２列は、全タンパクを染色したｐＡＶ６　Ｈ Ｐｇ感染の昆虫細胞からの培地、第３列は全タンパクを染色された第２列で述べ た培地から精製したＨＰｇ　、第４〜６列は、各々１〜３列のものを第５と第８ 図で説明した様に免疫染色したものを示す。

第８図から、全タンパク染色により昆虫細胞限定培養液には三種の主要タンパク 質バンド（菫２列）があることが判明し、その内の一つが免疫染色法（第５列） によってＨＰｇと同定された。セフ了ローズ／リシンカラムから溶出した物質は 、全タンパク染色法（第３列）と免疫染色法（第６列）とによってＨＰｇと同定 された。

第８図のゲル（第３と第６列）は、単離されたｌＩＰｇの分子量が、はぼ完全に グリコジル化された形態のプラズマＨＰｇの親和性クロマトグラフィー変種工の 分子量とはとんと同一であることを示している。実際、一定条件下ではＨＰｇが ｐＡＶ６　ＨＰｇ感染細胞が分泌する三種の主要成分の一つであることを第８図 のデープラスミノーゲン活性化物質によるｒｅｃ−ＨＰｇの活性化を検査した。

二種類の反応−混合液を用意した。一方には１００μｇ／ｍｌのｒｅｃ−ＨＰｇ 　、もう一方には１００　ｕ　ｇ／ｍｌプラズマＨＰｇを各々１０ｍＭＨｅｐｅ ｓ−ＮａＯＨ中、ｐＨ７，，１に含有させた。上口時点で、各混合液から３０μ ｍの部分標本を採り、それをβ−メルカプトエタノールを含む１５μｍのＮａＤ ｏｄ　ＳＯ４／ＰＡＧＥを担持する緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、５判匹、互り豊 、６８０−６８５頁、１９７０年）に加えた。ウロキナーゼ（ＬＩＫ）を各々の 反応混合液に加え、最終濃度を２　ｎＭとした。二本鎖のヒト腎臓ウロキナーゼ はアボット研究所から人手したもので、主として低分子量のものであった。１ｏ 、２ｏ、３ｏ、６ｏ、９０及び１２０分経過時点て各々部分標本を採り、上述の ゲルを担持する緩衝液１５μｍに即時に加えて活性化反応を終了させた。試料を 還元条件て９０１１ｉ（＊／ｖ）ＮａＤｏｄ　ＳＯ４／Ｐ、ＡＧＥゲル上で分離 し、銀試験で視覚化した。

ｒｅｃ−ＨＰｇの活性化速度を測定する連続複合分析試験を３７°Ｃ１ｐＨ７， ４のＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ１０ｍＭ／Ｎａ０Ａｃ　１００　ｍＭ中で、Ｕｒａｎ ｏ、　ｅｔ　ａｌｌ、の方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、硯ζ）、１５９ ５９−１５９６４頁、１９８７年）で行った。分析試験成分は、ｒｅｃ−１（Ｐ ｇ　Ｏ，２２〜０．６６　ｍＭ　、　０．５　ｍＭのＨＰｍ基質、Ｄ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ２２５１）および２　ｍＭＥＡＣＡ’ 最終体積は０１８ｍ１であった。ＵＫを添加して最終濃度を２ｏＭとして反応を 開始した。

第９図に低分子量ウロキナーゼによるプラズマＨＰｇとｒｅｃ−Ｐｇの活性化の 、還元ＮａＤｏｄ　５Ｏ４−Ｐ、ＡＧＥ分析を示す。二つのｐｇの形態は一本鎖 （ｐｇ）から二本鎖＜Ｐｍ）へと経時的に変化している。同一実験のウェスタン 分析では、同じタンパク質ハンドのすへてか存在することがわかり（データは示 さず）、すなわち、全部がＨＰｇに起因する事を示している。プラズマＨＰｇよ りも組み換え物質において、多くの低分子量ＨＰｇ（および、それに相当する長 Ｒ）が見られた。これらのハンドは、ヒトプラズマＨＰｇを用いた多くの研究で も見られ、その相対的量は活性化条件に依存し、活性化して生じたＨＰｍによる 限定された特殊なＨＰｇタンパク分解のフィードバックに起因する。しかし、二 つの反応液の最終ＨＰｍ　鎖は同一であった。二つのプラスミノーン中で酷似し た、］（Ｐｇの低分子量形態の活性化反応の結果でもある低分子量ＨＰｍ重鎖が 認められた。

ｒｅｃ−Ｐｇウロキナーゼ活性化も、連続複合分析試験により分析し、引き続き プラスミン基ｆｓ２２５１の転移を行った。２．０ｎｌＪのＩＪＫと０．３３μ ｍのプラズマＨＰｇを使って活性化速度を測定し、７ＸＩＯ−１２Ｍ／秒を得た 。緩衝液成分としてＮａ０ＡｃとＥＡＣＡを使用したので、［Ｇ１ｕ’　ｉＰｇ の活性化速度は、もっと迅速な（Ｌｙｓ７−Ｐｇ活性に機能上等しくなった。こ れは、プラズマｆＧ１ｕｌ：Ｐｇとｒｅｃ−ＨＰｇの活性化速度差が、実際、ま たは機能上の［Ｌｙｓ”］Ｐｇ存在のあり得る影響によるものではないことを意 味する。得られた速度データは、プラズマＨＰｇの速度（Ｂｕｒｎｅｔｅ、　Ａ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、旦ｌ、１９５−２０３頁、１９８１年）と同様の 、または明らかに少し速い活性化速度でｔｌＫがｒｅｃ−ＨＰｇを活性化するこ とを示している。

第９図に活性化分析の結果を示す。第９図中、第１〜７列はプラズマＨＰｇ試料 、第８〜１４列はｒｅｃ−ＨＰｇ試料である。下記の時点における結果ら第９図 に示す。零分、第１と第８列；１０分、第２と第９列；２０分、第３と第１０列 、３０分、第・１と第１１列、６０分、第５と第１２列、９０分、第６と第１３ 列：１２０分、第７と第１・１列。二本鎖の重鎮と軽鎖を各々Ｈとして表示する 。

第９図に表した結果は、ｒｅｃ−ＨＰｇがプラズマＨＰｇと同様な速度、あるい はさらに速く触媒的なＬＩＫの量によって二本鎖へと変化しえることを示してい る。組み換えタンパクと、その対応ヒトプラズマとの間に相違があるものと考え られ、活性化反応の初期にＨＰｍに対し十分に活性化されている低分子量ＰＨｇ が複数存在する事が第９図に示されている。プラズマＨＰｇの同様な低分子量形 態が報告、単離、定性されており（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ。

Ｂｉｏ　ｈｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　、１０２巻、４６−５２頁（１９８１ 年）、二種の１（Ｐｇ生成では、生成に至る中間過程の速度のみが異なることが 示された。これはグリコジル化の相違によるものと考えられる配座の相違がＨＰ ｇに存在し、この結果、ＨＰｍフィードバック限定タンパク分解をはるかに容易 に起こさせることになる。

実施例１１ 繊維溶解性酵素とプラスミノーゲンとで形成した錯体を、血栓溶解体として使用 した。繊維溶解性酵素の触媒部位を一定条件の加水分解で除去可能な官能基で紙 幣した（Ｓｍｉｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、。

米国特許４．８０８．４０５号：及びＳｍ１ｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒ ｅ、２９０　Ｓ、５０５−５０８頁、１９８１年）。従って、本発明によるＨＰ ｇが、唯一の血栓溶解体として、または繊維溶解性酵素との錯体として、または アシル化繊維溶解性酵素との錯体として、またはアシル化プロエンチームとして 、または職！ｌ：溶解性酵素との錯体中のアシル化プロエンチームとして、また はアシル化繊維溶解性酵素として使用された。本発明によるアシル化ストレプト キナーゼ７アシル化プラスミノーゲン錯体を下記のようにして生成した。

ストレプトキナーゼ約４５１　ｍｇ　（アーベーカビ社、ストックホルム、スウ ェーデンから入手）を、ｐＨ７，０のりシン７／マンニトール緩衝液約１１０　 ［［ｌｌと無菌のグリセリン約６０ｍ１　とに混合し、４°Ｃで５分間攪拌した 。ＤＭＳＯ中のｐ−アミジノ−フェニル−ｐ−アニス酸塩（約１５ｍ１、約２０ ｍＭ）を２分以上かけて加え、４°Ｃで、５分間混合液を攪拌した。本発明のＨ Ｐｇ約８０９　ｍｇを二分以上かけて加え、混合液を４°Ｃで、６０分間攪拌し た。

本発明法による薬剤混合物を上記混合物から下記のようにして製造した。ヒト血 清アルブミン（臨床向、２０％胃＃）１８．９　ｍｌを４°Ｃで、２分間攪拌し ながら混合液に加えた。リシン／マンニトール緩衝液を更に加えて体積を約４０ ０　ｍｌとした。次に、この液を１８℃で約２時間半、透析液が約２４００　ｍ ｌになるまで透析した。次に、この液を０．２２μの無菌フィルターを通して濾 過して、無菌の容器に回収し、ここから各部分標本を無菌の凍結乾燥用ガラス瓶 に入れて凍結乾燥した。

実施例１２ プラスミノーゲン活性体を示す細胞に紫外線照射をし、また当業者に公知のスク リーニング試験で、プラスミノーゲン活性体の免疫学的あるいは生物学的（例え ば繊維溶解性）特性を示す生成物を作らない細胞の子孫を選んで、プラスミノー ゲン活性体の無い細胞を構築した。

部位特異的プラスミノーゲン活性体の無い細見は、同種組み換えに基づく多数の 技術のいずれによっても構築できる。このような技術としては、例えば、Ｒｏｉ ｚｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４、７６９．３３１号；　Ｓｍ１ｔｈ、 　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、針り皇、２３０頁（１９８５年）：　Ｍａｎｊ ａｔｉｓ　ＸＮａ、ｔｕｒｅ、３１７１７．２０５−２（１Ｂ頁Ｃ１９８５年） 。

Ａｙａｒｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　’Ｐｒ６’ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　（ＩＪＳＡ）、８３８．５１９９−５２０３頁（１９８６年）；Ｒａ ｔｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ。

Ω昼穎、８３８．５５８７−５５９１頁（１９８６年）、及びＴｈｏｍａｓ、　 Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻、３４−３８頁（１９８６年）を参照されたい。

オリゴヌクレオチド、あるいは部位特異性プラスミノーゲン活性体の一部もしく は全部のヌクレオチド配列（ＬＩＫに関してはＨｅｙｎｅｃｋｅｒ、　ｅｔ　ａ ｌ、、欧州特許公報第９２．１８２号；ＴＰＡに関してはＧｏｅ、ｄｄｅｌ、　 ｅｔ　ａｌ、、欧州特許公！Ｉｊ第９３．６１９号）もしくは公知部位に対応す る終端を含むように合成した組み換え体を用いた細胞のトランスフェクションに よって、同種領域間でこれら活性体をコードする遺伝子の部分を削除したり、あ るいは不活性化することができる。この様な部位特異性プラスミノーゲン活性体 遺伝子を除去、あるいは不活性化された細胞を、本発明の宿主細胞として使用し 、さらにはｔＪＫとＴＰＡ遺伝子が部分的または全体的に除去、あるいは不活性 化された唾乳頭細胞が好ましい。

以上、本発明の好適な実施態様に関して説明したが、本発明の内容を考慮すれば 、当業者が本発明の修正や変更を想到することが予期される。従って、そのよう な修正や変更すべてが、請求の範囲に記載の発明の範切に含まれると思料する。

−ｍ− ロ　ｈ　ぬ い　い　Ｃ −ｔ＾　エ　Ｊ ■　Ｃ）　、ＱＣ〜 −ｕ　（Ｎ　＋：Ｉ ：ｒ　＋ｒ わ ＦＩＧ、５ 吸光度へ９．。

ト σ 匡 １”ｏｌ−一一一一一一峻一一−ｌ■■−−−−“１−−一一一、−１ｏ叫−＾ −一■ ムー ■ 一 国際調査報告 渭へ−ρ１０２２チ ＡＴＴＡＣＨｌａＴ　Ｔｌ）　ＰＣＴ／工ＳＡ／２１０　Ｐｆｆｌ　ＩＬ工工、 ＦＴ乙田三訊二　正Ｍ口πＲ侶：ＳＶ４０．　ＶＳＶ、　ＢＦＶ、　Ｐｌａｓｍ ｉｎｏｇｅｎ　ｄｅｆｉｃｉｅｎ？、　Ｐｌａｓｍｌｐｏｐｎ　ｄｅｌｅｔｉｏ ｎ。

Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ｐｒｕｉｆ？、　５ｉ−ｐｅｐｔｉｄｅａｎｄ　ｃｏ ｎｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｔｈｅｒｅｏｆ。

１＋１ｖｒａパｏ“１°ｐＨ＋ｌ１１６＋　Ｎｏ　ＰＣＴＡＩＳ９０１０２２９ ｂ

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．プラスミノーゲンをコードする遺伝子を含む真核細胞発現ベクター。
2. ２．前記発現ベクターが、無脊椎動物細胞発現ベクターである請求の範囲第１項 に記載の発現ベクター。
3. ３．前記無脊椎動物細胞発現ベクターが、昆虫細胞発現ベクターである請求の範 囲第２項に記載の真核細胞発現ベクター。
4. ４．前記昆虫細胞発現ベクターが、バクロウイルスベクターである請求の範囲第 ３項に記載の真核細胞発現ベクター。
5. ５．前記ハクロウイルスヘクターが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎ ｉｃａおよびＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ核多角体病ウイルスベクターからなるグル ーブから選択される請求の範囲第４項に記載の真核細胞発現ベクター。
6. ６．前記遺伝子が、ヒトプラスミノーゲンをコードする請求の範囲第１項に記載 の真核細胞発現ベクター。
7. ７．前記無脊椎動物細胞発現ベクターが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒ ｎｉｃａ核多角体病ウイルスベクターである請求の範囲第６項に記載の真核細胞 発現ベクター。
8. ８．前記ベクターが、第２図に示すようなヒトプラスミノーゲンをコードするヌ クレオチド配列を含む請求の範囲第７項に記載の真核細胞発現ベクター。
9. ９．寄託番号第６７９２９号として寄託された請求の範囲第８項に記載の真核細 胞発現ベクター。
10. １０．前記真核細胞発現ベクターが、ＳＶ４０ウイルス、ポリオーマウイルス、 アデノウイルス、ＶＳＶおよびＢＰＶからなるグループから選択される請求の範 囲第１項に記載の真核細胞発現ベクター。
11. １１．請求の範囲第１項に記載のベクターを含む部位特異性プラスミノーゲン活 性体が欠けている真核細胞。
12. １２．前記細胞が、請求の範囲第２項に記載のベクターを含む無脊椎動物細胞で ある請求の範囲第１１項に記載の真核細胞。
13. １３．前記細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｊｐｅｒｄａ細胞である請 求の範囲第１２項に記載の無脊椎動物細胞。
14. １４．前記ベクターが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角 体病ウイルスである請求の範囲第１２項に記載の無脊椎動物細胞。
15. １５．請求の範囲第１項に記載の細胞によって発現された、翻訳修飾後の環状プ ラスミノーゲンではないプラスミノーゲン。
16. １６．前記細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞である、 請求の範囲第１５項に記載のプラスミノーゲン。
17. １７．前記プラスミノーゲンが、ヒトプラスミノーゲンである請求の範囲第１６ 項に記載のプラスミノーゲン。
18. １８．請求の範囲第１５項に記載のプラスミノーゲンを含む、薬剤混合物。
19. １９．前記混合物が、さらに織維素溶解酵素を含む請求の範囲第１８項に記載の 薬剤混合物。
20. ２０．前記織維素溶解酵素の活性部位がアシル化されている、請求の範囲第１９ 項に記載の薬剤混合物。
21. ２１．前記織維素溶解酵素が、前記ヒトプラスミノーゲンと複合体化している請 求の範囲第１９項に記載の薬剤混合物。
22. ２２．前記織維素溶解酵素が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラス ミノーゲン活性体、もしくはこれらの組合わせからなるグループから選択される 、請求の範囲第２１項に記載の薬剤混合物。
23. ２３．前記織維素溶解酵素が、内部ペプチド結合開裂のないｐ−アニソイルスト レプトキナーゼ／プラスミノーゲン複合体である請求の範囲第２２項に記載の薬 剤混合物。
24. ２４．前記薬剤混合物が、等浸透圧性である請求の範囲第１８項に記載の薬剤混 合物。
25. ２５．前記薬剤混合物が、無菌濾過されたものである請求の範囲第１８項に記載 の製薬組成物。
26. ２６．請求の範囲第１１項に記載の真核細胞の培養工程を含むプラスミノーゲン の製造方法。
27. ２７．前記培養工程が、遺伝子発現が可能な条件下で、ヒトプラスミノーゲンを コードする遺伝子を含む無脊椎動物細胞を維持する工程を含み、さらに、プラス ミノーゲンを細胞培養から回収する工程を含む、請求の範囲第２６項に記載のプ ラスミノーゲンの製造方法。
28. ２８．無脊椎動物細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で あり、前記方法はさらに、ヒトプラスミノーゲンをコードする遺伝子を含むＡｕ ｔｏｇｒａｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａウイルスで、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ ｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させる工程を含む、請求の範囲第２７項に記載の プラスミノーゲンの製造方法。
29. ２９．ヒトプラスミノーゲンをコードする遺伝子を含む転移ベクターと、野生型 Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａウイルスＤＮＡで、Ｓｐｏｄｏ ｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を同時トラスフェクシヨンさせる工程を さらに含む、請求の範囲第２８項に記載のプラスミノーゲンの製造方法。
30. ３０．前記プラスミノーゲンが、翻訳修飾後の環状プラスミノーゲンではないプ ラスミノーゲンである請求の範囲第２６項に記載の方法の生成物。
31. ３１．請求の範囲第２８項に記載の方法の生成物。
32. ３２．プラスミノーゲンをコードする単離したＤＮＡであって、前記ＤＮＡと操 作可能に結合された真核プロモーターを含む。
33. ３３．前記ＤＮＡが、細胞外でのプラスミノーゲン分泌のために前記ＤＮＡと操 作可能に結合されたシグナル配列をさらに含む請求の範囲第３２項に記載の単離 したＤＮＡ。
34. ３４．前記シグナル配列が、無脊椎動物宿主細胞によって認識される請求の範囲 第３３項に記載の単離したＤＮＡ。
35. ３５．前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡである請求の範囲第３２項に記載の単離した ＤＮＡ。
36. ３６．前記ＤＮＡが、第２図に示したようなヌクレオチド配列を有する請求の範 囲第３４項に記載の単離したＤＮＡ。
37. ３７．血栓溶解治療を必要とする患者に、請求の範囲第１８項に記載の薬剤混合 物の有効量を投与する工程を含む血栓溶解治療法。
38. ３８．血栓溶解治療を必要とする患者に、請求の範囲第２２項に記載の薬剤混合 物の有効量を投与する工程を含む血栓溶解治療法。
39. ３９．前記混合物が、内部ペプチド結合開裂のないｐ−アニソイルストレプトキ ナーゼ／プラスミノーゲン複合体を含む請求の範囲第３８項に記載の血栓融解治 療法。
40. ４０．加水分解によって除去できる官能基によって遮られる織維素溶解活性に必 須の触媒部位を有した、織維素溶解酵素とプラスミノーゲンとの二元複合体の製 造方法であって、下記工程を含む： 核酸の発現が可能な条件下でプラスミノーゲンをコードする核酸を含む発現ベク ターで形質転換される、部位特異性プラスミノーゲン活性体が欠けている無脊椎 動物細胞を培養し、プラスミノーゲンを細胞培養から回収し、およびＡ−Ｂおよ びＥ−Ｆからなるグルーブから選択された化学式の過剰の遮蔽剤の存在下で二元 複合体を形成するために、織維素溶解酵素とプラスミノーゲンとを混合するもの であり、前記Ａは、織維素溶解活性に必須の触媒部位に対して選択的で、かつ官 能基Ｂから触媒部位へ転移することができ、加水分解的に化学変化を起こしやす い遮蔽官能基であり、Ｂは酵素へのＡの接着を容易にする官能基であり、Ｅは触 媒部位に遮蔽剤を置く官能基であり、Ｆは配置官能基から触媒部位へ転移するこ とができ、加水分解的に化学変化を起こしやすい遮蔽官能基である。
41. ４１．二元復合体を単離する工程をさらに含む、請求の範囲第３９項に記載の方 法。
42. ４２．前記プラスミノーゲンが、ヒトプラスミノーゲンであり、かつ前記織維素 溶解酵素がステレプトキナーゼである請求の範囲第３９項に記載の方法。
43. ４３．前記加水分解的に化学変化を起こしやすい官能基が、アシル基である請求 の範囲第４０項に記載の方法。
44. ４４．前記アシル基が、ベンゾイル、置換ベンゾイル、アクリロイル、または置 換アクリロイル基である請求の範囲第４２項に記載の方法。
45. ４５．前記ＡＢが、ｐ−ニトロフェル−Ｐ′−グアニジノベンゾエートである請 求の範囲第４２項に記載の方法。
46. ４６．前記Ｅが、ｐ−アミジノフェニルもしくはｐ−アセトアミドフェニル基で ある請求の範囲第４２項に記載の方法。
47. ４７．前記Ｆが、ベンゾイルもしくはアクリロイル基である請求の範囲第４２項 に記載の方法。
48. ４８．活性配座を有し、かつ実質的にプラスミノーゲン活性体を含まない哺乳類 プラスミノーゲン。
49. ４９．前記プラスミノーゲンが、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および組 織プラスミノーゲン活性体を完全に含まない請求の範囲第４８項に記載の哺乳類 プラスミノーゲン。
50. ５０．前記哺乳類プラスミノーゲンが、他の哺乳類のタンパク質を含まない請求 の範囲第４８項に記載の哺乳類プラスミノーゲン。
51. ５１．前記哺乳類プラスミノーゲンが、ヒトプラスミノーゲンである請求の範囲 第５０項に記載の哺乳類のプラスミノーゲン。