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JP2557385B2 - ヒトプロテインｓ - Google Patents

ヒトプロテインｓ

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Publication number
JP2557385B2
JP2557385B2 JP62131049A JP13104987A JP2557385B2 JP 2557385 B2 JP2557385 B2 JP 2557385B2 JP 62131049 A JP62131049 A JP 62131049A JP 13104987 A JP13104987 A JP 13104987A JP 2557385 B2 JP2557385 B2 JP 2557385B2
Authority
JP
Japan
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plasmid
dna
protein
buffer
fragment
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
JP62131049A
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JPS62289199A (ja
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ジョー・アン・ホスキンス
ジョージ・ルイス・ロング
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of JPS62289199A publication Critical patent/JPS62289199A/ja
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Publication of JP2557385B2 publication Critical patent/JP2557385B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヘマトスタシス（凝血）制御因子である血
漿蛋白質、ヒトプロテインＳに関するものである。
従来技術 トロンビンの形成、即ちプロトロンビンのトロンビン
への変換は、セリンプロテアーゼ類によつて触媒される
一連の反応、即ち、コアギユレーシヨン（凝結）カスケ
ードとして知られる反応によつて制御される。これらの
プロテアーゼの最大活性は、トロンボモジユリン、V a
因子、Vlll a因子およびプロテインＳに依存している。
プロテインＳは最近発見された、凝結および血管内血栓
症のダウンレギユレーシヨンにおいて最も重要なプロテ
インＣ−プロテインＳ−トロンボモジユリン系における
主要成分である。この特殊なビタミンＫ依存性血漿タン
パク質は、燐脂質小胞体および血小板表面におけるV a
因子に対する適切に活性化されたプロテインＣ（APC）
媒介性の不活化に必要なコフアクターである。
プロテインＳはその生合成をビタミンＫに依存してい
る血漿タンパク質である。このヒトタンパク質の見かけ
の分子量（Mr）は69−85キロダルトン（kd）であり、該
タンパク質は、生物学的機能を発揮するためにビタミン
Ｋを必要とする他の蛋白質と同様、アミノ末端方向に集
まつている11個のグルタミン酸残基のガンマ（γ）−カ
ルボキシグルタミン酸（Gla）への変換、３個のアスパ
ラギン酸残基（本明細書中ではアミノ酸残基95、135、
および182と仮定）のβ−ヒドロキシアスパラギン酸へ
の変換、グルコシル化（８％重量）およびジスルフイド
結合の形成を含む広範な翻訳後のプロセツシングを必要
とする。γ−カルボキシグルタミン酸残基の機能は、カ
ルシウムと結合し、次の脂質二重層膜への分子の結合を
容易ならしめることに有ると言われている。β−ヒドロ
キシアスパラギン酸の機能は未知である。還元条件下で
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS PAGE）にかけると、75Kdの重鎖と16Kdの軽
鎖とが現われる。トロンビンと一緒にインキユベートす
ると、分子から8Kdのフラグメントが開裂され、その結
果、活性が失われる。
プロテインＳの役割を明らかにするために、この抗凝
結系の概要を簡単に示す。プロテインＳと同様、プロテ
インＣはその生合成をビタミンＫに依存しており、翻訳
後のGlu→GlaおよびAsp→β−ヒドロキシアスパラギン
酸修飾が行なわれる。正常な血漿タンパク質であるプロ
テインＣはセリンプロテアーゼの酵素原として循環して
いる。プロテインＣの生理学的活性化剤は内皮細胞膜の
糖タンパク質、トロンボモジユリンと複合体を形成して
いるトロンビンである。遊離のトロンビンは主要な凝固
タンパク質である。それはフイブリノゲンをフイブリン
に変換し、血小板と凝血カスケードにおける主たるコフ
アクターである、V aおよびVIII a因子を活性化するこ
とにより、凝結反応を強力に増幅する重要な正のフイー
ドバツクループを与える。これと対照的に遊離のトロン
ビンはプロテインＣの活性化剤としては愚鈍で効果を有
していない。トロンビンがトロンボモジユリンと複合体
（コンプレツクス）を形成すると、その酵素活性スペク
トルに衝撃的な変化がみられる。トロンボモジユリンと
複合体を形成すると、トロンビンはもはやフイブリノゲ
ンをフイブリンに変換せず、血小板を活性化せず、凝血
因子V aおよびVIII aを活性化しない。むしろ、トロン
ボモジユリン−トロンビンはプロテインＣの極めて有効
な賦活剤となる。活性化されたプロテインＣは２箇所の
攻撃ポイントを有する。それはタンパク分解的に減成
（分解）して活性型のコフアクターV aおよびVIII aを
不活化するが、前駆体形のV aおよびVIII aは、活性型
プロテインＣの基質には殆どならない。プロテインＳは
活性化されたプロテインＣの重要なコフアクターであ
る。プロテインＳが存在しないと活性型プロテインＣは
最小限の減成と、コフアクターV aおよびVIII aの賦活
化を行なう。
最初インビトロで確立されたこれらの複雑な反応は臨
床上重要な意義を有している。ホモ接合性のプロテイン
Ｃ欠損によつて、乳児期または幼児期に起きる致死的な
形の汎発性血管内凝固症である急奔性紫班病が発現す
る。深部静脈血栓症および再発生肺動脈塞栓症に関連し
たヘテロ接合性のプロテインＣ、および、とりわけプロ
テインＳ欠損の症例数が急速に増加しており、予備的な
見積りによると、再発性の深部静脈血栓症−肺動脈塞栓
症の全症例中10％がヘテロ接合性プロテインＳ欠損を示
すといわれている。
更に、最近得られた証拠は、獲得性プロテインＳ欠損
症が日常的な異常であることを強く示唆している。プロ
テインＳは循環中で２つの型、即ち、遊離のタンパク質
とC4b結合タンパク質との1:1コンプレツクスの型で存在
している。C4b結合タンパク質は分子量570Kdであつて、
液相および細胞表面の補体系のダウンレギユレーシヨン
に重要な機能を有する。C4b結合タンパク質とコンプレ
ツクスを形成しているプロテインＳの生物学的活性は未
知である。妊娠中および出産直後においては、プロテイ
ンＳが遊離形から結合形にシフトし機能的プロテインＳ
活性の鋭敏な減少が起きる。ネフローゼ症候群ではC4b
結合タンパク質とコンプレツクスを形成しているプロテ
インＳの割合が高くなつており遊離のプロテインＳが著
しく減少している。その上、今日ではまだ完全に解明さ
れていない理由により、ネフローゼ症候群における遊離
プロテインＳの比活性は実質上減少している。補体の活
性化が存在している全身性エリテマトーデス（SLE）に
おいてもプロテインＳの遊離形から結合形へのシフトが
みられる。これらの疾患状態のいずれにおいても、血栓
塞栓症が高頻度で発現する。従つて、プロテインＳの遊
離形から結合形へのシフトは、炎症または他の生理学的
変化が凝血バランスに直接影響を及ぼし得るコントロー
ルポイントをあらわしているのかもしれない。汎発性の
静脈内凝固症および肝疾患の場合にも、激しさは劣るが
なお生理学上活性な遊離形プロテインＳの顕著な減少が
見られる。
プロテインＳとC4b結合タンパク質との結合によつて
プロテインＳの活性は失われるが、このコンプレツクス
の、C4b結合タンパク質の活性は失なわれないようであ
る。しかしながら、プロテインＳタンパク質を燐脂二重
層細胞膜に埋め込む部分（アンカー）であるとされてい
るγ−カルボキシグルタミン酸残基を有するプロテイン
ＳがC4b結合タンパク質を補体ダウンレギユレーシヨン
に係る膜部位への輸送作用を行なうということは疑がわ
しい。
プロテインＳはヒトおよびウシ両方の血漿から単離さ
れた。ウシプロテインＳは報告された分子量が64Kdであ
る一本鎖ポリペプチドである。これに対してヒトプロテ
インＳの見掛け上の分子量は69−85Kdであると報告され
ている。本発明以前は、血漿からプロテインＳを得る方
法はあつたが、プロテインＳの一次および二次構造は極
僅かしか知られていなかつた。プロテインＳに関する情
報は不足しているにもかかわらずプロテインＳの生物学
的並びに潜在的な治療上の重要性は臨床面での所見から
推測される。今日得られる情報は、遺伝的なプロテイン
Ｓ欠損は日常的な異常であるらしいことを示唆してい
る。プロテインＳ欠損症患者は比較的若年期に静脈血栓
症にかかる素因を有している。ヘテロ接合体は、表面的
な血栓性静脈炎、深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症を
発現させるおそれがある。プロテインＳ欠損の重大な結
果が得られたことから、抗血栓療法における価値ある補
助物質として用いるためにヒトプロテインＳの遺伝子を
クローンし発現させることは極めて有益であると言え
る。
定義 ApR:アンピシリン耐性表現型またはそれを付与する遺伝
子。
ep:T抗原（Ａ）遺伝子のSV40初期プロモーター、Ｔ抗原
結合部位、およびSV40複製起源を含有するDNAセグメン
ト。
発現ベクター：プロモーターが挿入されており、しかも
それが、所望の遺伝子の転写を制御する位置にある、組
換えDNAクローニングベクター。
ヒトプロテインS:前駆体ポリペプチドであつて、プロ−
プロテインＳ、デス−カルボキシプロテインＳ、非カル
ボキシル化プロテインＳ、および成熟プロテイン等の中
間体をも含み、プロテインＳ活性を有するあらゆる型の
タンパク質を包含する。
HmR:ハイグロマイシン耐性表現型またはそれを付与する
遺伝子。
IVS:介在配列とも称するイントロンをコードしているDN
A。
NeoR:ネオマイシン耐性表現型、またはそれを付与する
遺伝子。
Ori:プラスミドの複製起源。
pA:ポリアデニル化シグナルをコードしているDNA配列。
プロモーター:DNAのRNAへの転写を指令するDNA配列。
プロテインＳ活性：ヒトプロテインＳの生物学的機能ま
たは抗−ヒトプロテインＳ抗体との結合活性に関わる性
質。
レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自律的な
複製をコントロールし、許容するDNA配列。
構造遺伝子：機能的なポリペプチドをコードしているDN
A配列であつて、翻訳開始シグナルおよび停止シグナル
を含む。
TcR:テトラサイクリン耐性表現型またはそれを付与する
遺伝子。
翻訳活性化配列:mRNA転写物のペプチドまたはポリペプ
チドへの翻訳を与えるDNA配列であつて、リボソーム結
合部位および５′−ATG−３′の如き翻訳開始コドンを
含む。
本発明は、ヒトプロテインＳ活性をコードしている新
規なDNA化合物および組換えDNA発現ベクターに関するも
のである。このベクターは新規なDNA化合物を真核性宿
主細胞内で発現させる。本発明は又、これらのベクター
で形質転換された宿主細胞にも関する。プロテインＳを
コードしているヒト肝cDNAをクローンし配列決定を行な
つた。そのcDNA配列は５′および３′非翻訳領域と境界
を接する、676アミノ酸前駆体の暗号領域からなる。こ
の暗号領域はリーダーペプチドの41アミノ酸、および成
熟タンパク質と終止コドンに相当する635アミノ酸とを
コードしている。従つて本発明はヒトプロテインＳおよ
びその前駆体をコードしているDNA配列を提供すること
を目的とするものである。
また、本発明の目的は、ヒトプロテインＳ活性を有す
るタンパク質の一次構造を提供することにある。
さらにまた、本発明の目的はヒトプロテインＳ前駆体
をコードしている遺伝子を含有するプラスミドを提供す
ることにある。
図面の簡単な記述 第１図はプラスミドpShd（11.5Kb）の制限サイトおよ
び機能地図である。
第２図はプラスミドpHHs−II a（7.7Kb）の制限サイ
トおよび機能地図である。括弧で囲んだPst I制限部位
は再構成されていない。
第３図はプラスミドpBKE1（7.9Kb）の制限サイトおよ
び機能地図である。
第４図はプラスミドpBKneol（11.5Kb）の制限サイト
および機能地図である。
第５図はプラスミドpSV2cat（5.015Kb）の制限サイト
および機能地図である。
第６図はプラスミドpLPcat（4.83Kb）の制限サイトお
よび機能地図である。
第７図はプラスミドpBLcat（6.09Kb）の制限サイトお
よび機能地図である。
第８図はプラスミドpL133の組み立てを図示したフロ
ーチヤートである。
第９図はプラスミドpLPC（6.5Kb）の制限サイトおよ
び機能地図である。
第10図はプラスミドpLPC4（11.7Kb）の制限サイトお
よび機能地図である。
第11図はプラスミドpSV2hyg（5.24Kb）の制限サイト
および機能地図である。
第12図はプラスミドpLPChyg1（8.3Kb）の制限サイト
および機能地図である。
第13図はプラスミドpLPChd1（10.23Kb）の制限サイト
および機能地図である。
第14図はプラスミドphd（8.55Kb）の制限サイトおよ
び機能地図である。
本発明はヒトプロテインＳ活性を有するポリペプチド
をコードしている二本鎖デオキシリボ核酸を用いて生産
された組換えヒトプロテインＳに関するものである。ヒ
トプロテインＳ活性を有するポリペプチドをコードして
いるDNAの暗号鎖と共に、ヒトプロテインＳ前駆体の全
アミノ酸配列を以下に示す。
プロテインＳ前駆体のアミノ酸配列はcDNA配列に基づ
いている。前駆体は模式的に、７つの明確な領域と一つ
の未知の領域からなる。これらの領域は概ね、以下のア
ミノ酸（aa）領域にしたがつてグループ分けされる：リ
ーダーペプチド（aa−41〜−１）；γ−カルボキシグル
タメート（Gla）セグメント（aa1〜37）；リンカー領域
（aa38〜73）;4つの上皮性成長因子領域（aa74〜121,12
2〜165,166〜207,208〜248）；並びに未知の領域（aa24
9〜635）。本明細書中、アミノ酸残基の番号は成熟タン
パク質のアミノ末端残基（上記の前駆体タンパク質配列
における残基番号42）を１に帰属し、これに基づいてい
る。本発明はまたヒトプロテインＳをコードしている遺
伝子を含有する組換えDNAプラスミド、並びにこのプラ
スミドで形質転換された微生物またはセルラインを提供
するものである。
本発明のDNA化合物は、５′および３′両側の非暗号
配列をも含む、ヒトプロテインＳ前駆体の全遺伝子をコ
ードしているヒト肝mRNAから調製された一本鎖cDNAクロ
ーンから導かれる。
まず、ヤング（Young）およびデイビス（Davis）の記
載した方法（プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンスイズ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）USA80:1194−1198））に従つてラムダ（λ）g
t11発現ベクター（lac5 nin5cI857 s100）内で、組換
えヒト肝cDNAライブラリーを調製した。
λgt11内で組み立てられた組換えヒト肝cDNAライブラ
リーはクロンテク・ラボラトリイズ（Clontech Laborat
ories）Inc.,922インダストリアルアベニユー（Industr
ial Avenue）パロ アルト（Palo Alto）カリフオルニ
ア94803から得られた。このライブラリーを通常の方法
を用い、ヤギ内で惹起させたヒトプロテインＳに対する
ポリクローナル抗体でスクリーニングした。約２×106
個の組換え体が大腸菌（エシエリヒア・コリ）Y1090の
菌叢上のフアージプラークの形でスクリーニングされ
た。大腸菌Y1090は寄託番号37197の下、ATCCから入手可
能である。
融合タンパク質の宿主に対する有害作用の危険性から
宿主を守るために、プラークの形成はプレートを42℃で
インキユベーシヨンすることにより、lacZプロモターか
らの発現なしに開始された。プラーク周囲の感染細胞数
が増えたら、イソプロピルチオ−β−ガラクトシツド
（IPTG）を加えてlacZ指令下の遺伝子発現を誘導する。
このことは、IPTGを含浸したニトロセルロースフイルタ
ー・デイスクを菌叢の上に置くことによつて行なわれ
た。インキユベーシヨン期間の後、タンパク質が結合し
たニトロセルロースフイルターを洗浄し、一次抗体、次
いでビオチニル化した２次抗体で処理した後、アビジン
−ペルオキシダーゼ・コンジユゲートで処理した。過酸
化水素に暴露した際の呈色反応に基いて陽性コロニーを
同定した。
同定された陽性コロニーをとり、プレートあたり約50
00プラークの濃度で再試験した。いくつかの陽性プラー
クを取り、プレートあたり約400プラークの濃度で再ス
クリーニングした。後のスクリーニングで単離したプラ
ークを用い、大量の精製フアージを単離した。
フアージクローン中のcDNA挿入体のマツピングの第一
段階としてEcoR Iフラグメント（類）のサイズ決定を行
なつた。ライブラリーの組み立てにあたつてはcDNAフラ
グメントを合成EcoR Iリンカーとライゲートさせ、λgt
11分子の単一のEcoR I部位に挿入した。組換えフアージ
DNA分子をEcoR Iで消化すると２個のλ“アーム”（19.
6及び24.1Kb）が生成し得る。これによつて生成される
その他のフラグメントは全て挿入されたDNAに対応す
る。挿入されたDNA配列が内在性のEcoR I部位を有しな
い場合にはただ一個のEcoR Iフラグメントのみが生じ
る。これに対応し、１又はそれ以上の内在性EcoR I部位
があれば２またはそれ以上の付加的なEcoR Iフラグメン
トが生じるであろう。従つて、精製フアージDNAをEcoR
I消化に付した後、3.5％ポリアクリルアミドゲルまたは
1.0％アガロースゲル電気泳動にかけて分離した。最大
クローンの１つ（１−１と命名）は、1.8Kbと0.8Kbの２
つのEcoR Iフラグメントを含有していた。次いで、この
クローンから単離したEcoR Iフラグメントをプラスミド
pBR322にサブクローンし、大腸菌RR1細胞の形質転換に
用いた。
形質転換及びプラスミドの同定の後、DNA配列決定に
備えて、このプラスミドDNAを増幅し、精製した。pLHS
−21およびpLHS−22と称するクローンからサブクローニ
ングされたDNAフラグメントをマキサム（Maxam）および
ギルバート（Gilbert）の方法〔メソツズ・イン・エン
ザイモロジー（Methods in Enzymology 61:497）〕に従
つて配列決定した。
EcoR I処理で生成した制限フラグメント内の特定のDN
A配列の位置決定はサザーン・トランスフアー・アナリ
シスによつて行なわれた。ハイブリダイゼーシヨンには
下記の表１に示した、２個の独立した混合プローブを用
いた。これらのプローブはシステツク（Systec）1450A
DNA合成装置（シンセサイザー）〔システツク（Syste
c）Inc.,3816チヤンドラー・ドライブ（Chandlar Driv
e），ミネアポリス（Minneapolis）,MN55421）またはAB
S 380A DNA合成装置〔アプライド・バイオシステムス
（Applied Biosystems）,Inc.リンカーンセンター・ド
ライブ（Lincoln Centre Drive）フオスターシテイ（Fo
ster City）CA 94404〕のいずれかを用いて化学合成さ
れた。当業者には多くのDNA合成装置が知られておりこ
れらをフラグメントの製造に利用することができる。ま
た、フラグメントはイタクラら（Itakura）〔サイエン
ス（Sience）198:1056〕、およびクレアら〔（Crea）19
78,プロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスイズ（Proc.Natl.Acad.Ac
i.）USA 75:5765〕の方法に実質上従つて常法通り調製
することもできる。
〔第10回血栓症と凝血に関する国際コングレス（Xth In
ternational Congress on Thrombosis and Haematostas
is），サンデイエゴ（San Diego）、カルフオルニア、1
985年７月〕によつて示された、ウシ−アミノ酸配列中
の１つのEGF領域（アミノ酸残基83−90）に対応する。
プローブ81もウシの配列に基づいており、カルボキシ末
端アミノ酸残基628−634に対応する。これら２つのプロ
ーブは〜1.8Kb EcoR Iサブクローン・フラグメントと
強くハイブリダイスした。
配列決定のデータが得られると、プロテインＳの完全
な暗号配列（特に分子の５′末端）がλgt11ライブラリ
ーから生成したクローン中に現われているわけではない
ことが明らかになつた。そこで、足りない配例を得るた
めに、第２のライブラリーを用いた。配例決定されたDN
Aに基づき、同定されたλgt11クローンから下記の表２
に示した２つのプローブ（21および22と命名）を導い
た。
プローブ22は分子の３′非翻訳領域に相当しcDNAの
３′領域を位置付けするのに用いられた。対照的に、プ
ローブ21は、分子の５′末端領域に相当し、分子の５′
暗号領域を位置付けするのに用いられた。これらのプロ
ーブを放射活性に標識し、cDNAライブラリーのプローブ
に用いた。ハイブリダイゼーシヨンした後、制限酵素マ
ツピング、サザーン・ハイブリダイゼーシヨン及びDNA
配例決定法を用い、いくつかの陽性クローンを同定し
た、１つのクローン（pHHS II aと命名）は５′及び
３′非暗号セグメント並びに完全なプロテインＳ前駆体
に対応する配例を含有していた。
プラスミドpHHS−II aは、ステンフロ（Stenflo）（1
985）によつて報告されたサイズ（〜2.5Kb）よりも著し
く大きいメツセンジヤーRNA（mRNA）に対応するcDNA
（〜3.3Kb）を含有していた。ウシおよびヒト両者の肝m
RNAをヒトcDNAプローブでノーザン分析するとcDNAのサ
イズに一致してRNA種が変化することが分かつた。
プラスミド pHHS−II aはノーザン・リージヨナル・
リサーチラボラトリー（Northern Regional Research L
aboratory）（NRRL）ペオリア、イリノイス（Peoria,Il
linois）に寄託され、そのパーマネント・ストツク・カ
ルチヤー・コレクシヨンの一部を構成している菌株、大
腸菌K12RR1/pHHS II aから常法通り単離される。大腸菌
K12RR1/pHHS II aの培養物はNRRLから寄託番号Ｂ−1807
1の下、入手可能である。プラスミドpHHS−II aの制限
サイト及び機能地図を添付の第２図に示す。
別法として、本発明の特定のDNA配列は前記の様なDNA
合成装置を用いて化学的に合成することもできる。プロ
テインＳ遺伝子のサイズはやや大きいが、今日ではこれ
らの“遺伝子機械（gene machines）”を用いて1000デ
オキシヌクレオチド以上を含有する２本鎖DNAセグメン
トが極めて容易に生成される〔カルサーズら（Caruther
s,M.H.） 1985サイエンス（Science）230:281参照〕。
プロテインＳ活性をコードしているDNAを含有する様
々な組換えDNA発現ベクターを組み立てることができ
る。哺乳類細胞の多くが、ヒトプロテインＳのアミノ末
端に存在するリーダーペプチドの認識と、適切なプロセ
ツシングに必要な細胞機構を備えている。また、ある哺
乳類宿主は、血漿中に存在するヒトプロテインＳにみら
れる様な、グリコシル化、γ−カルボキシル化およびβ
−ヒドロキシル化等の翻訳後の修飾をも与える。真核性
宿主細胞の形質転換のための広範囲に及ぶベクターが存
在しており、以下に例示する特殊なベクターは、本発明
の範囲を限定することを意図したものではない。
真核性発現ベクターの組立て出発物質として、本発明
の２つの実施態様では、pSV2型のベクターを用いる。pS
V2型ベクターは明らかにされた、真核性の転写ユニツト
・プロモーター（ep）、介在配列（IVS）およびポリア
デニル化（pA）部位を含有するSV40ゲノムのセグメント
を包含している。SV40 Ｔ−抗原が存在しないと、プラ
スミドpSV2型ベクターは、宿主細胞の染色体DNAへの組
込みによつて哺乳類および他の真核性宿主細胞を形質転
換する。当業者には種々のプラスミドpSV2型ベクターが
知られており〔真核性のウイルス性ベクター（Eukaryot
ic Uiral Vectars）グルツマン（Gluzman）編、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイズ発行、コー
ルドスプリングハーバー、ニユーヨーク、1982参照〕、
例えば、プラスミドpSV2−gpt、pSV2−neo、pSV2−dhfr
およびpSVS−β−グロビンがあり、これらベクターで
は、SV40プロモーターが挿入された遺伝子の転写を司
る。これらのベクターは、アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨン（American Type Culture Collecti
on、ATCC）ロツクビレ、メアリーランド、あるいは前記
のNRRLから入手可能である。
ヒトプロテインＳのアミノ末端における−41〜−18ア
ミノ酸残基は、肝臓から血流へのプロテインＳの分泌を
指令するシグナルペプチドとして作用すると思われる。
これらの残基は成熟プロテインＳ中には存在しない。ヒ
トプロテインＳ前駆体の残基−17〜−１は、ヒトプロテ
インＳのプロペプチドを構成しているらしく、これもタ
ンパク質のプロセツシングおよび賦活化の間に除去され
るものであり、分子の正確な折りたたみおよび修飾に係
つていると考えられている。本明細書には特に詳しく例
示していないが、本発明には「プロプロテインＳ」の如
きプロテインＳ誘導体も含まれる。本発明のDNA化合物
は、ヒトプロテインＳ前駆体のアミノ残基および−41〜
−18残基をコードしている部分を欠失させて生成する誘
導体を発現させるよう、容易に修飾され得る。
当該技術者ならば、本発明が、真核宿主内での特定の
プロテインＳの発現に限定されないことを認めるであろ
う。一般的な規則として、原核生物は真核性のシグナル
ペプチドを有効にプロセツシングすることができないの
で、ヒトプロテインＳ前駆体遺伝子のシグナルペプチド
をコードしている部分の原核生物内での発現は幾分、非
効率的になるかもしれない。本明細書中には詳しく例示
されていないが、本発明はまた、プロテインＳ活性を原
核生物内で発現、分泌させるための、原核性シグナルペ
プチドをコードしているDNAと本発明の、プロテインＳ
活性をコードしているDNAとの融合物をも含むものであ
る。
本発明の発現ベクターを調製する上で有用な出発物質
には、真核性宿主細胞内での組換え遺伝子の転写を増大
するために、大きいDNAウイルスの即初期遺伝子（immed
iate early gene）産物の存在下でBKウイルスエンハン
サー（Enh）を利用する発現ベクターが含まれる。即
ち、その様なベクターは本発明のプロテインＳをコード
している遺伝子を発現させるのに有用である。これらの
ベクターの組立ては、実施例８〜17に詳しく示されてい
る。それらの組立てを、以下に簡単に概説する。
BKウイルス（ATCC VR−837）は購入するか、あるい
は、実施例８の記載の如くにして容易に大量を単離する
ことができる。別法として、BKウイルスDNAをプラスミ
ド・クローニングベクターにクローンし、この組換えベ
クターをBKウイルスDNA配列の供給源として用いてもよ
い。結果的に、BKウイルスDNAを制限酵素EcoR Iで消化
し、BKゲノムにはEcoR I部位が唯１個しか存在しないこ
とに基づいて線状BK DNAを形成した。プラスミドpUC8
〔ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズ（Bethesda Res
earch Laboratories、BRL）、P.O.Box6009、ガイザース
バーグ、MD20877から入手可能〕を同様に制限酵素EcoR
Iで消化し、得られたEcoR I切断プラスミドpUC8 DNA
を、EcoR I切断BKウイルスDNAにライゲートさせ、BKウ
イルスDNAの方向性に関してのみ異るプラスミド、pBKE1
およびpBKE2を形成させた。プラスミドpBKE1の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第３図に示す。プラスミドpB
KE1およびpBKE2の組立ては実施例９に記載されている。
また、BKウイルス性ゲノムとプラスミドpdBＰＶ−MMT
neoの一部とを組合わせてプラスミドpBKneo1およびpBKn
eo2を組立てる。プラスミドpdBＰＶ−MMTneoはサイズ約
15Kbであり、寄託番号ATCC 37224の下、ATCCから入手可
能である。このものは、プラスミドpBR322由来のレプリ
コンとβ−ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性付与
に係る酵素をコードしている構造遺伝子を発現させる位
置にマウスメタロチオナインプロモーター（MMTpro）、
並びに約8Kbのウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）DNAとを含
有している。プラスミドpdBPV−MMTneoを制限酵素BamH
Iで消化すると、上記のBPV DNAを含有する〜8Kbフラグ
メントと、他の配列を含有する〜7Kbフラグメンの２フ
ラグメントが生成される。BKウイルスは唯１個しかBamH
I部位を有さず、BamH Iで線状化したBKウイルスDNA
に、プラスミドpdBPV−MMTneoの〜7Kb BamH I制限フラ
グメントをライゲートすることによりプラスミドpBKneo
1およびpBKneo2を組立てた。BKウイスルDNAの方向性に
関してのみ異るプラスミドpBKneo1およびpBKneo2の組立
てを実施例10に、また、プラスミドpBKneo1の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第４図に示す。
本発明の発現ベクターの組立て出発物質として有用な
別のベクターはプラスミドpBLcatと呼称される。このプ
ラスミドはタンデム（直列）に並んだBKエンハンサー配
列と、クロラムフエニコール・アセチルトランスフエラ
ーゼ酵素（CAT）を発現させるよう位置しているヒトア
デノウイルス２型の後期プロモーター（Ad2LP）とを含
有している。プラスミドpSV2catはCAT遺伝子の簡便な供
給源であり、寄託番号ATCC 37155の下、ATCCから入手可
能である。プラスミドpSV2catの制限サイトおよび機能
地図を添付の第５図に示す。ヒトアデノウイルス２型の
DNAは市販されており、また、寄託番号ATCC VR−２の
下、ATCCから得ることもできる。
簡単に述べると、プラスミドpBLcatは、ヒトアデノウ
イルス２型DNAの〜0.32Kb後期プロモーター含有Acc I−
Pvu II制限フラグメントを、このAcc I−Pvu II制限フ
ラグメントのPvu II末端のみと結合する、平滑末端化Bc
l Iリンカーにライゲートさせることにより組立てられ
た。次いで、得られたフラグメントをプラスミドpSV2ca
tの〜4.51Kb Acc I−Stu I制限フラグメントとライゲー
トさせて中間体プラスミドpLPcatを得た。このプラスミ
ドの制限サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す。
所望のプラスミドpBLcatは、複製起源とエンハンサーを
含有しているBKウイルスDNAの〜1.28Kb Acc I−Pvu II
制限フラグメントを、プラスミドpLPcatの〜4.81Kb Acc
I−Stu I制限フラグメントにライゲートさせることに
より、プラスミドpLPcatから組立てられた。得られたプ
ラスミドpBLcatの制限サイトおよび機能地図を添付の第
７図に示す。プラスミドpBLcatの組立ては、実施例11に
詳しく記載されている。
プラスミドpBLcatは、BKエンハンサー−アデノウイル
ス後期プロモーター「カセツト」、即ち、〜870bpのHin
d III制限フラグメントであつて、真核性発現ベクター
にコードされている物質の発現を増加させるために該ベ
クターに簡便に挿入することができるものの便利な供給
源である。
例えば、このBKエンハンサー−アデノウイルス後期プ
ロモーターカセツトをプラスミドpL133にライゲートす
ることにより、該カセツトを用いてヒトプロテインＣの
発現を改良することができる。プラスミドpL133の制限
部位および機能地図を添付の第８図に示す。
プラスミドpL133は、プロテインＳを発現させるため
の発現ベクターとしても好都合に用いられる。このプラ
スミドを制限酵素Bcl Iで消化（プロテインＣを含有す
るフラグメントを欠失させるため）し、クレノウ処理す
ることにより線状の、平滑末端フラグメントを得ること
ができる。次いで、〜2.7Kb FnuD II−EcoR V制限フラ
グメントに含まれている全プロテインＳ遺伝子をクレノ
ウ処理したBcl Iベクターフラグメントとライゲートさ
せると、プロテインＳ発現ベクターが得られる。実施例
12にその組立てを示したプラスミドpL133は、さらに別
の発現ベクターの組立てのための中間体プラスミドとし
ても用いられる。即ち、このプラスミドを制限酵素Hind
IIIで消化した後、プラスミドpBLcatの〜0.87Kb Hind
III制限フラグメントにライゲートさせることによりプ
ラスミドpLPCを得た。プラスミドpLPCの制限サイトおよ
び機能地図を添付の第９図に示し、このプラスミドpLPC
の組立てを実施例13に示す。
プラスミドpLPCは、プラスミドpL133と同様、エンハ
ンサー、初期および後期プロモーター、Ｔ−抗原結合部
位、およびSV40の複製起源を含有している。これらの要
素（エレメント）はSV40DNA上に接近して一緒に存在し
ており、その輪郭を示すことは困難である。SV40の複製
に必要な、Ｔ抗原のＴ抗原結合部位への結合によりSV40
後期プロモーターからの転写が促進されることが知られ
ているが、驚ろくべきことに、これは、BKの初期および
後期プロモーターに対しても同様の効果を有していた。
SV40複製起源を含有しているプラスミドにおいて、Ｔ抗
原誘導性の複製が高レベルで起きることは一般に宿主細
胞にとつて致死的であるので、SV40T抗原の存在下で
は、プラスミドpLPC、プラスミドpL133の両者はエピソ
ーマル（染色体外性）要素として安定に維持されない。
むしろ、これら２プラスミドが安定に維持されるために
は、これらが宿主細胞の染色体DNAに組込まれなければ
ならない。
形質転換された真核細胞内で安定に維持される要素と
して存在し得る、プラスミドpLPCの誘導体を組立てるた
めに、全BKゲノムを、EcoR Iで線状化された制限フラグ
メントとしてプラスミドpLPCの単１のEcoR I部位に挿入
した。この挿入によつて、BKのEcoR Iフラグメントの方
向性に関してのみ異る２つのプラスミド、pLPC4およびp
LPC5が生産された。プラスミドpLPC4の制限サイトおよ
び機能地図を添付の第10図に、また、プラスミドpLPC4
およびpLPC5の組立てを実施例14に示す。
組換えDNA発現ベクターの染色体外での維持が宿主細
胞の染色体への組込みよりも常に好ましいとは限らな
い。しかしながら、プラスミドpLPCには真核細胞内で機
能的な選択マーカーが存在しないので、選択マーカーを
含有している他のプラスミドと同時形質転換しなけれ
ば、プラスミドpLPCの安定な真核性形質転換体を同定す
ることは困難である。そこで、プラスミドpLPCを修飾
し、真核性宿主細胞内で選択可能なプラスミド誘導体を
生産した。
このことは、プラスミドpLPCを、ハイグロマイシン耐
性付与遺伝子を含有しているプラスミドである、プラス
ミドpSV2hygの一部とライゲートさせることで行われ
た。プラスミドpsV2hygは寄託番号NRRL Ｂ−18039の
下、NRRから入手可能であり、その制限サイトおよび機
能地図を添付の第11図に示す。プラスミドpSV2hygを制
限酵素BamH Iで消化し、全ハイグロマイシン耐性付与遺
伝子を含有している〜2.5Kb BamH I制限フラグメントを
単離し、クレノウ酵素（大腸菌のDNAポリメラーゼＩを
サブチリシン開裂に付した際に生成される大きいフラグ
メント）で処理した後、クレノウ処理した、プラスミド
pLPCの〜5.82Kb Nde I−Stu I制限フラグメントにライ
ゲートさせてプラスミドpLPC hyg1およびpLPC hyg2を得
た。プラスミドpLPC hyg1とpLPC hyg2とはハイグロマイ
シン耐性付与フラグメントの方向性に関してのみ異つて
いる。プラスミドpLPC hyg1の制限サイトおよび機能地
図を添付の第12図に示し、プラスミドpLPC hyg1およびp
LPC hyg2の組立てプロトコールを実施例15に記載する。
プラスミドpLPC hyg1を修飾し、ジヒドロ葉酸還元酵
素（dhfr）遺伝子を導入した。dhfr遺伝子はdhfr陰性細
胞中で選択可能なマーカーであり、これを用いると宿主
細胞を濃度を次第に増加させたメトトレキセートに暴露
することによりDNAセグメントのコピー数を増加させる
ことができる。dhfr遺伝子はプラスミドpSV2−dhfr（AT
CC37146）から得られた。特定のdhfr遺伝子を用いるこ
とは、本発明のベクターの組立てにとつて重要なことで
はない。
単離した後、dhfr遺伝子を含んだ〜1.9Kb BamH I制限
フラグメントをクレノウ酵素で処理し、EcoR I部分消化
プラスミドpLPC hyg1に挿入し、プラスミドpLPChd1およ
びpLPChd2を得た。プラスミドpLPChyg1は２つのEcoR I
制限酵素認識部位、１つはハイグロマイシン耐性付与遺
伝子の中にあり、もう１つはプラスミドpBR322から導か
れた配列の中にある、を含有している。dhfr遺伝子を含
んだフラグメントをプラスミドpLPChyg1の、pBR322誘導
配列中に存在するEcoR I部位に挿入してプラスミドpLPC
hd1とpLPChd2とを得た。プラスミドpLPChd1の制限サイ
トおよび機能地図を添付の第13図に示す。dhfr遺伝子含
有DNAセグメントの方向性に関してのみ異るプラスミドp
LPChd1およびpLPChd2の組立てを実施例16に示す。
プラスミドpLPChd1を修飾し、BKエンハンサー−アデ
ノウイルス後期プロモーターカセツト、並びにハイグロ
マイシン耐性付与およびdhfr遺伝子の両者を含有するプ
ラスミドphdを組立てた。プラスミドphdを組立てるため
に、プラスミドpLPChd1をdam-大腸菌宿主細胞から調製
し、制限酵素Bcl Iで消化した後、再環化することによ
りヒトプロテインＣをコードしているDNAを欠失させ
た。プラスミドphdは単１のBcl I制限酵素認識部位を含
有しており、これは、本発明のBKエンハンサー−アデノ
ウイルス後期プロモーターから発現させることが望まれ
る配列を挿入する上で好都合な位置にある。プラスミド
phdの制限サイトおよび機能地図を添付の第14図に、ま
た、プラスミドphdの組立て手順を実施例17に示す。
最後に、プラスミドPHHS−II aから得た〜2.7Kbのプ
ロテインＳ含有FnuD II−EcoR V制限フラグメントを、B
cl I消化し、クレノウ処理したプラスミドphdにライゲ
ートさせることにより本発明のプラスミドpShdを組立て
た。得られたプラスミドは、BKエンハンサー−アデノウ
イルス後期プロモーターカセツトを用いてヒトプロテイ
ンＳを発現させる。
本発明の他の実施態様では、単に、プラスミドpL133
中のBcl I制限部位（これらは次いでクレノウ処理され
る）によつて囲まれているプロテインＣ遺伝子を、プラ
スミドpHHS−II aから単離された〜2.7Kb FnuD II−Eco
R V制限フラグメントで置き換え、上記の方法に従つて
組み立てを行う。得られた発現ベクターは、SV40初期プ
ロモーターを用いてヒトプロテインＳを発現させる。こ
れらのプロテインＳ発現ベクターはいずれもヒトプロテ
インＳの生産に有用である。
プロテインＳが幾つかの領域における抗血栓症治療の
価値ある補助剤となり得ることが予測される。既に述べ
たように、最も明らかなのは、ヘテロ接合体性プロテイ
ンＳ欠損症が、かなりの数の再発性深部静脈血栓症−肺
動脈塞栓症患者と関係しているという点である。その様
な患者の急性血栓症発症時には、プロテインＳを静脈内
注入で投与することが考えられる。また、プロテインＳ
は、これまでに同定された、妊娠中や、SLE、ネフロー
ゼ症候群の如き、後天（獲得）性のプロテインＳ欠損症
の治療にも有用であることが予測される。後天性プロテ
インＳ欠損に関連する疾患状態のリストが、自己免疫疾
患やがん等と同様、多くの急性および慢性の炎症状態を
も含む（カバーする）までに拡張されるとの予測は決し
て不当ではない。必要とされる投与量は、臨床前および
臨床中の試行においてのみ確実に定めることができるの
であつて、以下に示す計算値は仮定の値と考えられねば
ならない。血漿中の総プロテインＳの正常値は30μg/ml
であり、遊離プロテインＳの正常値は10〜15μg/mlであ
る。患者の循環液中のプロテインＳレベルを５〜10μg/
ml増加させたい場合には、プロテインＳの拡散容量がIX
因子のそれと同一であると仮定して、30〜60mgの静脈内
投与が必要となろう。プロテインＳの生物学的半減期
は、人間において、40〜48時間であると、確立されてい
る。従つて、疾患の急性期における患者には、36〜48時
間毎に注入すれば充分であると思われる。
プロテインＳは、補体の活性化が起きている膜表面上
の部位へのC4b結合タンパク質の結合に際して有用な作
用を果し得る可能性がある。この仮説が立証されたなら
ば、プロテインＳの治療上の役割は、広範な一連の自己
免疫疾患や感染性患者を含めて、補体の活性化が重要な
病理学的因子となつている数多くの疾病状態にまで拡張
されるであろう。
以下に実施例を挙げ、本明細書中に開示した発明をさ
らに詳しく説明する。これらの実施例では、ヒトプロテ
インＳをコードしている遺伝子物質の単離および同定に
おける手法、並びにヒトプロテインＳ活性をコードして
いる遺伝子の化学合成に用い得る方法について述べる。
また、発現ベクターの組立てに用いた方法をも示す。方
法の説明は、適宜記載した。
実施例１ ヒトプロテインＳに対するポリクローナル抗
体と反応するタンパク質を発現するλgt11フアージのス
クリーニングおよび同定 本発明で用いた特定のλgt11ライブラリーはクロンテ
クラボラトリイズ、Inc.922インダストリアルアベニユ
ー、パロ・アルト、カルフオルニア94303から購入し得
る、このλgt11ライブラリーはヒト肝cDNAから生成し、
５×105プラークという複合性を示していた。このライ
ブラリーを希釈し、約200,000フアージを、TY寒天（ト
リプトン10g、NaCl10g、酵母エキス5gおよび寒天15gを
１中に含有する）を含んだ150mmの培養皿10個の各々
にプレートした（平板培養した）。下記のスクリーニン
グ法は、実質上、供給者の指示に従つた。フアージをプ
レートした後、直ちに皿を42℃で３時間半インキユベー
トした。各プレートに10mMIPTG飽和ニトロセルロースフ
イルターを重層し、37℃に移して約16時間処理した。少
くとも15分間、プレートを４℃に冷却した後、フイルタ
ーをインジア（India）インキでマークし、洗浄バツフ
アーTBST（50mM Tris−HCl、pH＝7.9、150mM NaCl、0.0
5％ Tween20）に移した。フイルターをこのバツフアー2
00ml中、１回の洗浄時間５分で、３回洗浄した。洗浄お
よび反応は全て室温で行われた。次いで、ニトロセルロ
ースに対する、抗体の非特異的な結合を減ずるために、
TBST中20％ウシ胎児血清でフイルターを30分間処理し、
前記の如くに洗浄した。第１番目の抗体反応には、ヒト
プロテインＳに対してヤギ内で惹起されたポリクローナ
ル抗体を用いた。これらの抗体は、「メソツズ・イン・
エンザイモロジイ（Methods in Enymology）104:381−3
87」に記載の多くの常套手段のいずれかを用いて単離さ
れ得る。一次抗体と１時間インキユベートした後、再び
フイルターを洗浄し、次いで、ビオチニル化した二次抗
体〔ベクターラボラトリイーズ（Vector Laboratorie
s）Inc.バーリンガム（Burlingame）、CA 94010〕で30
分間処理した。フイルターを再度洗浄し、アビデインと
コンジユゲートした西洋ワサビのペルオキシダーゼコン
プレツクスを含んだTBST内に30分間移した。最終的な洗
浄にはTBS（Tween 20を含有しない）のみを用いる。ペ
ルオキシダーゼ基質溶液は3mg/mlのメタノール中、４−
クロロナフトールを、TBS＋0.01Mイミダゾールと混合す
ることにより調製された。３％過酸化水素を1/250容量
まで加え、得られた溶液を直ちにフイルターに加えた。
呈色反応（“陽性プラーク”は紫色に変化）は、30分以
内に完了した。
陽性プラークを同定した後、元のプレートの対応する
領域を除き、滅菌したラムダ希釈バツフアー（10mM Tri
s−HCl、pH＝7.5、10mM MgSO4）に加え、クロロホルム
数滴と一緒に４℃で保存した。後に、これらのフアージ
を100mmの皿当り、約5000プラークの密度に平板培養
し、同じ方法でスクリーニングした。陽性のプラーク
を、100mm皿当り、100プラークの密度で第３ラウンドの
スクリーニングに付し、単離したプラークを収穫し、前
と同様に保存した。
実施例２ 精製フアージのcDNA領域のマツピングおよび
サブクローニング プレートリゼイト法〔デイビス（Davis）、ボツテイ
ン（Botstein）およびロス（Roth）1980、アドバンスド
・バクテリアル・ジエネテイツクス（Advanced Bacteri
al Genetics）コールド・スプリングハーバー・ラボラ
トリイズ（Cold Spring Harbor Laboratories）〕によ
り、下記の如く、大量の精製フアージDNAを得た。10枚
の150mmの皿各々に、約106プラーク精製フアージに感染
させた大腸菌をプレートした。42℃で４時間後、略全面
的な溶解が達成された。この時点で、４℃において１時
間プレートを冷却し、０℃のラムダ希釈バツフアー10ml
を流し、４℃で一夜保存した。翌朝、バツフアーを注意
深く除去し、クロロホルム数滴で処理して残存する細胞
を溶解した。18℃において、20,000rpmで３時間遠心す
ることにより上清からフアージ粒子を除き、ペレツトを
ラムダ希釈バツフアー1mlに再懸濁した。塩化セシウム
・グラデイエントでフアージ粒子をさらに精製した：フ
アージ標本1mlに溶液Ｉ（5M CsCl、10mM MgSO4、0.1mM
Na2EDTA、10mM Tris、pH＝8.0）1mlおよび溶液II（3M C
sCl、10mM MgSO4、0.1mM Na2EDTA）3mlの段階グラジエ
ントを重層した。30,000rpm（18℃）で60分間処理した
後、フアージ粒子に対応する、かすかな青色バンドが境
界面に認められた。注射筒と針を用い、界面の溶液0.5m
lを除いた。所望により、この時点で第２回目のグラデ
イエントを行つてもよい。
コートタンパク質からフアージDNAを放出させるため
に、各標本に等容量の脱イオンホルムアミドを混合し、
室温で更に30分間放置した。この溶液を水0.5mlで希釈
し、室温のエタノール２容量を加えてDNAを析出させ
た。10,000rpmで10分間遠心することによりDNAを集め、
ペレツトを68％エタノール（−20℃）5mlですすぎ、乾
燥し、TE（10mM Tris−HCl、pH＝8.0および1mmEDTA）50
μに再懸濁した。全フアージDNAを計200〜1000μｇ回
収することができた。
６つの陽性クローンそれぞれから得たフアージDNA
を、cDNA挿入体から生成したEcoR Iフラグメント（類）
のサイズを決定するための試験に付した。精製DNA約50
μｇをEcoR Iバツフアー（100mM Tris−HCl、pH＝7.5、
10mM MgCl2、50mM NaCl）20μとEcoR I50単位とを含
有する容量200μ中で90分間、37℃において消化し
た。本明細書中で引用した酵素単位は、酵素の供給源は
異なつていても、全てニユーイングランドバイオラボス
（New England Biolabs）、32トザーロード（Tozar Roa
d）、ベバーリイ）Beverly）、MA01915の単位に関する
定義に従うものとする。試料をエタノール沈殿に付し、
適切な、市販品から入手可能なサイズマーカーと一緒に
3.5％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス
−アクリルアミド、29:1）または1.0％アガロースゲル
を用いた電気泳動に付した。臭化エチジウムを用いてDN
Aを観察し、ゲル中での移動度に基づいて各バンドのサ
イズを計算した。Xmn I、Sst IおよびKpn Iを用いて同
様に消化し、挿入体のサイズとフラグメントの方向性を
確かめた。最大クローンの１つ（１−１と命名）は1.8
および0.8kbのEcoR Iフラグメントを含有しており、全
挿入体のサイズは2.6kbであつた。
最初のサブクローンはクローン１−１のEcoR I消化物
から生成された。フアージDNA約50μｇを上記の如くEco
R Iで消化し、次いで、EcoR I消化、脱りん酸化pBR322
約100ngとライゲートさせた。
ライゲーシヨンは、１×リガーゼバツフアー（50mM T
ris−HCl、pH＝7.8、10mM MgCl2、20mM DDT、1mM ATP）
20μとリガーゼ400単位の全容量中、1.5℃で一夜行わ
れた。大腸菌RR1細胞〔ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リイズ（Bethesda Research Laboratories）Inc.ガイザ
ースバーグ（Gaithersburg）MD20877から入手可〕を用
い、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリイズによつて示さ
れた手順に従つて形質転換し、形質転換された細胞をア
ンピシリン50μg/mlを含んだTYプレート上で選択した。
プレートを37℃で一夜インキユベートした。無作為に選
択した12のクローンからプラスミドDNAを単離し、EcoR
Iで消化し、サブクローンされたフラグメントのサイズ
を求めた。予測される1.8kbおよび0.8kbフラグメントを
個別にpBR322にサブクローンし、得られたプラスミドを
それぞれpLHS−22およびpLHS−21と命名した。大量のプ
ラスミドDNAを、最小培地中でクロラムフエニルコール
増幅に付した後、アルカリ溶解することによりマニアテ
イス（Maniatis）、フリツツ（Fritsch）およびサムブ
ロツク（Sambrook）〔1982、モレキユラークローニング
（Molecular Cloning）、コールドスプリングハーバー
ラボラトリイズ〕の記載の如く、DNA配列決定に備えて
精製した。
実施例３ プラスミドpLHS−22の〜1.8kb EcoR I制限フ
ラグメントの単離 水60μ中のプラスミドpLHS−22 50μｇを、10×Eco
R I制限バツフアー20μおよび水120μと混合した。
この混合物を37℃において、EcoR Iで消化が完了するま
で消化した。このEcoR I消化DNAを3.5％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけ、他の消化産物から〜1.8kbの
バンドが分離するまで分離処理した。次いで、臭化エチ
ジウムの希釈液中でゲルを洗浄し、紫外線照射下でバン
ドを観察した。
〜1.8kb EcoR I制限フラグメントを含有するゲル上の
領域をゲルから切り取り、試験管内に入れ、小フラグメ
ントに破壊した。フラグメントを入れた試験管に抽出バ
ツフアー（500mM NH4OAc、10mM MgOAc、1mM EDTAおよび
１％SDS）1mlを加えた。この試験管を37℃で一夜インキ
ユベートした。遠心してアクリルアミドを除き、上清を
新らしい試験管に入れた。アクリルアミドを抽出バツフ
アー200μで１回洗浄し、再度遠心した後、上清を集
め、グラスウール製のプラグを通過させて残存する汚染
物質を除去した。２容量のエタノールでDNAを析出さ
せ、良く混合し、ドライアイス−エタノール浴中に、10
〜30分間保持した。遠心してDNAを回収した。
この方法で約15μｇの〜1.8kb EcoR I制限フラグメン
トを回収した。この精製フラグメントをTEバツフアー10
μに再懸濁し、４℃で保存した。
実施例４ ヒトプロテインＳをコードしているcDNAの配
列決定 ヒトプロテインＳをコードしているcDNAのDNA配列
を、実質上、マキサム（Maxam）およびギルバート（Gil
bert）法（メソツズ・イン・エンザイモロジイ、1980）
に従つて決定した。
実施例５ プロテインＳサブクローンのサザーン分析 フアージ１−１から得た1.8および0.8kbフラグメント
を含めて、pBR322にサブクローンされた幾つかのプロテ
インＳのEcoR Iフラグメント（実施例３に記載）からプ
ラスミドDNAを調製した。このDNAを実施例２の教示の如
くにしてEcoR Iで消化し、1.0％アガロースゲル電気泳
動にかけて分離した。ゲルの調製条件、実際の移動、お
よびハイブリダイゼーシヨン法は実質上、スミス（Smit
h）およびサマース（Summers）〔1980、アナル・バイオ
ケム（Anal.Biochem.）109:123〜129〕の教示に従つて
行われた。ハイブリダイゼーシヨンには、表１に示した
２つの独立した、混合プローブを用いた。既述の如く、
第１プローブ、＃80は、ステンフロ（J.Stenflo）（198
5）から供給されたウシのアミノ酸配列から導かれた。
このプローブは、ウシ分子のEGF領域の１つであるアミ
ノ酸、＃83−90に対応する。プローブ81もウシの配列に
基づいており、これは、カルボキシ末端のアミノ酸、＃
628〜634に対応する。フアージ１−１由来の1.8kb EcoR
Iフラグメントはこれらの両プローブと強くハイブリダ
イズした。
実施例６ 大腸菌K12 RR1/pHHS−II aの培養およびプラ
スミドpHHS−II aの単離 A.大腸菌K12 RR1/pHHS−II aの培養 Ｌ−ブロス（ペプトン10g、NaCl10gおよび酵母エキス
5g）5mlに大腸菌K12 RR1/pHHS−II a（NRRLB−18071）
の培養物を接種し、空気振とう器内で37℃において16時
間インキユベートした。この培養物少量を、テトラサイ
クリン15μg/mlを含んだＬ−ブロス寒天プレート上で画
線培養し、37℃で約16時間増殖させた。単離したコロニ
ーをテトラサイクリン15μg/mlを含んだＬ−ブロス5ml
に接種し、振とう下、37℃で約16時間増殖させた。
次いで、この培養物を用いてテトラサイクリン12μg/
mlを含んだＬ−ブロス１に接種し、空気振とう器中、
37℃において、590nmにおける光学密度（O.D.）が〜0.6
吸収単位になるまでインキユベートし、この時点で培養
物にクロラムフエニコール250mgを加えた。約16時間、
インキユベーシヨンを続けた；クロラムフエニコールの
添加によりタンパク質の合成が阻害され、その結果、以
後の細胞分裂が阻害されるが、プラスミドの複製は継続
される。
B.プラスミドpHHS−II aの単離 実施例6Aで調製した培養物をソーバール（Sorvall）G
SAローター〔デユポン（DuPontCo.）、インスツルメン
ツ・プロダクツ（Instruments Products）、バイオメデ
イカル・デイビジヨン、ニユータウン、CN06470〕中、
４℃で５分間、6000rpmで遠心し、上清を捨てた。得ら
れた細胞ペレツトを−20℃で最少２時間凍結し、次いで
解凍した。解凍した細胞ペレツトを25％スクロース/50m
M Tris−HCl、pH＝８溶液6.25mlに再懸濁した。10mg/ml
リゾチーム溶液1.5ml、0.5M EDTA（pH＝8.0）1.25mlを
加えて混合した後、得られた溶液を氷上で10分間インキ
ユベートした。このリゾチーム処理細胞に、溶解溶液
（0.1％Triton X−100、0.125M EDTA、pH＝８、50mM Tr
is、pH＝８）10mlを加え、混合し、得られた溶液を氷上
でさらに10分間インキユベートした。
SS34ローター（ソーバール）中、19,000rpmで30分間
遠心することにより溶液から細胞破片を除去した。TEで
溶液の容量を30mlに調節し、次いでCSCl28.9gおよび10m
g/ml臭化エチジウム3.75mlを加え、得られた溶液をVti5
0超遠心管〔ベツクマン（Beckman）、リンカーンウツ
ド、IL60646〕内にデカントした。管をシールした後、V
ti50ローター中、49,000rpmで約16時間、溶液を遠心し
た。紫外線の下で観察されたプラスミドのバンドを単離
した。臭化エチジウムをTE−飽和イソブタノールで抽出
し、溶液を３容量の水で希釈した。次いで、この溶液に
1/40容量の2.0M NaOAc、pH＝５および２容量のエタノー
ルを加え、−20℃で一夜インキユベートした。SS34ロー
ター（ソーバール）中、10,000rpmで30分間、溶液を遠
心してプラスミドDNAをペレツト化した。このDNAを0.3M
NaOAc5mlに再懸濁した。これに、エタノール10mlを加
え、得られた溶液を−20℃で一夜インキユベートした。
直前に記載した如くにしてプラスミドDNAをペレツト化
した。
この方法で得られたプラスミドpHHS−II a DNA〜1mg
をTEバツフアー1mlに懸濁し、４℃で保存した。プラス
ミドpHHS−II aの制限サイトおよび機能地図を添付の第
２図に示す。
実施例７ ヒト肝cDNAライブラリーのプロービング フアージクローン１−１は分子の５′末端および３′
末端の両方を欠如していたので、付加的な配列を含有す
るクローンを再スクリーニングする必要があつた。この
工程のために様々なヒト肝cDNAライブラリーを用いた。
pBR322ベクターを用いるライブラリーが文献に記載され
ている〔ベツクマンら（R.J.Beckmanm）、ヌクレイツク
アシツズ・リサーチ、13:5233、1985〕。既知のDNA配列
を基に、２つのプローブを単離し、21および22と命名し
た。これら各々の配列を表２に示す。５′末端領域とホ
モローガスなプローブ21は、Hinc IIおよびHind IIIの
認識配列によつて境界を隔てられた、110bpフラグメン
トで構成されている。プローブ22は分子の３′非翻訳領
域に対応し、Hinf IおよびEcoR Iの認識配列によつて境
界を隔てられている。これらのプローブを放射活性に標
識し、標準的な手法（マニアテイスら、1982）に従つて
cDNAライブラリーをプローブするために用いた。プロー
ブをハイブリダイズし、これらを68℃で洗浄した。全て
の過操作を２回繰り返した。この方法で数個の陽性ク
ローンが同定された。制限酵素マツピング、サザーンハ
イブリダイゼーシヨンおよびDNA配列決定によりpHHS−I
I aと命名された１つのクローンがプロテインＳ前駆体
の完全な暗号領域を含有しているものと同定された。
実施例８ BKウイルスDNAの調製 BKウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチー・コレ
クシヨンから寄託番号ATCC VR−837の下で得られる。こ
のウイルスは凍結乾燥形で得られ、これをハンクの（Ha
nk′ｓ）平衡（バランス）塩類（ギブコ、3175スタレー
・ロード、グランドアイランド、NY14072）に再懸濁
し、力価を105プラーク形成単位（pfu）/mlとする。BK
ウイルスDNAを調製するために最適な宿主とされるのは
一次ヒト胚性腎（PHEK）細胞であり、これは、フローラ
ボラトリイズ（Flow Laboratories）Inc.,7655オールド
・スプリングハウス・ロード（Old Springhouse Road）
マクレーン（mclean）、VA22101から、カタログ番号０
−100の下、あるいはバイオプロダクツ（Bioproducts）
から、カタログ番号70−151の下で得ることができる。
約106のPHEK細胞が全面成長した単一層を含む約５個
の75mm2ポリスチレンフラスコをウイルスの調製に用い
る。各フラスコに力価105pfu/mlのBKウイルス約1mlを入
れ、37℃で１時間インキユベートした後、新鮮な培養培
地（デルベツコの改良イーグル培地（Delbecoo′s Modi
fied Eagl′s Medium）、ギブコ、10％ウシ胎児血清を
補充〕を加え、感染した細胞を37℃で10〜14日間、ある
いはウイルスの細胞変性効果が完全に認められるまでイ
ンキユベートする。この細胞変性効果はセルラインとセ
ルライン、ウイルスとウイルスの間で異なるが、一般に
細胞の集合、密集および培養皿からの脱落からなる。
細胞を３回の凍結−解凍サイクルに付すことによりウ
イルスを放出させ、5000×ｇで遠心することによつて細
胞破片を除く。上清液１にPEG−6000を100g加え、得
られた溶液を４℃で24時間インキユベートし、5000×ｇ
で20分間遠心することにより、上清１中のウイルスを
沈殿させ、収穫する。ペレツトを元の容積の1/100にな
る様、0.1×SSCバツフアー（１×SSC＝0.15M NaCl、5mM
EDTA、および50mM Tris−HCl、pH＝7.8）に溶解する。
このウイルス懸濁液を、管内の飽和KBr溶液15ml上に重
層し、75,000×ｇで３時間遠心する。KBr溶液中に２つ
のバンドが示される。完全なビリオンを含有している下
側のバンドを集め、セフアデツクスＧ−50カラムに適用
し、TEを溶融バツフアーとして用いて脱塩処理する。
カラムから得た精製ビリオンにドデシル硫酸ナトリウ
ム（SDS）を濃度１％となるように加え、さらに、プロ
ナーゼを濃度100μg/mlとなるように加えて得られた溶
液を37℃で２時間インキユベートする。次いで、この溶
液に塩化セシウムを濃度1.56g/mlで加え、さらに臭化エ
チジウムを終濃度が100μg/mlとなる様に加える。この
溶液をSorval 865ローターまたは類似の垂直ローターを
用い、260,000×ｇで24時間遠心する。遠心後、ウイル
スDNAのバンドを単離し、100mM Tris−HCl、pH＝7.8を
飽和したイソアミルアルコールで５回抽出する。次い
で、BKウイルクDNAの溶液を、DNAの260nm/280nm吸収比
が1.75から1.90の間になるまで、TEバツフアーに対して
透析する。NaCl濃度を0.15Mに調節し、２容量のエタノ
ールを加え、得られた溶液を−70℃で少くとも２時間イ
ンキユベートした後、12,000×ｇで10分間遠心すること
によりDNAを沈殿させる。生成したBKウイルスDNAのペレ
ツトを、TEバツフアーに濃度1mg/mlとなる様、懸濁す
る。
実施例９ プラスミドpBKE1およびpBKE2の組立て 実施例８で調製したTEバツフアー１μ中約１μｇの
BKウイルスDNAを10×EcoR Iバツフアー（1.0M Tris−HC
l、pH＝7.5、0.5M NaCl、50mM MgCl2、および1mg/mlBS
A）２μと水15μとに溶かした。このDNA溶液に制限
酵素EcoR I約２μ（〜10単位）を加え、得られた反応
混合物を37℃で２時間インキユベートした。
TEバツフアー１μ中のプラスミドpUC8〔フアルマシ
ア（Pharmacia）Ｐ−Ｌバイオケミカルス（Biochemical
s）800センテニアルアベニユー、ピスカツタウエイ、NJ
08854〕約１μｇを、実質上、EcoR I消化BKウイルスDNA
の調製に用いた方法に従い、EcoR Iで消化した。このEc
oR I消化プラスミドpUC8 DNAをTEバツフアーで100μ
に希釈し、該溶液にウシ腸由来のアルカリホスフアター
ゼ〜0.06単位を加え、得られた溶液を37℃で30分間イン
キユベートした。この溶液を１×SET（5mM Tris−HCl、
pH＝7.8、5mM EDTA、および150mM NaCl）、0.3M NaOA
c、および0.5％SDSを含有する様調節した後、65℃で45
分間インキユベートした。このホスフアターゼ処理は、
pUC8の自己ライゲーシヨンを防止する。
このEcoR I消化BKウイルスとプラスミドpUC8 DNAと
を、まず、緩衝化フエノール、次いで、クロロホルムで
抽出した。各DNA溶液のNaCl濃度を0.25Mに調節し、２容
量のエタノールを加え、得られた混合物をドライアイス
−エタノール浴中で５分間インキユベートし、遠心して
DNAをペレツト化することによりDNAを収獲した。上清を
捨て、ペレツトを70％エタノールで洗浄し、乾燥した
後、BK標本およびプラスミドpUC8標本を調製するため
に、それぞれ、TEバツフアー10μおよび30μに再懸
濁した。
EcoR I消化BKウイルス２μとEcoR I消化プラスミド
pUC8 DNA1μの混合物に10×リガーゼバツフアー１μ
と水約３μを加えた。このDNA溶液にT4 DNAリガー
ゼ１μ（〜1000単位）を加え、得られた反応混合物を
16℃で一夜インキユベートした。ライゲートしたDNAは
挿入されたBKウイルスDNAの方向性のみが異る所望のプ
ラスミドpBKE1およびpBKE2を構成していた。プラスミド
pBKE1の制限サイトおよび機能地図を添付の第３図に示
す。
Ｌブロス中の大腸菌K12 JM103（フアルマシアＰ−Ｌ
バイオケミカルスから入手可）培養物50mlを、650nmに
おける光学密度（O.D.650）が約0.4吸収単位になるまで
増殖させた。この培養物を氷上で10分間冷却し、遠心し
て細胞を集めた。この細胞ペレツトを100mMの冷MgCl2 2
5mlに再懸濁し、氷上で25分間インキユベートした。遠
心して細胞を再度ペレツト化し、得られたペレツトを10
0mMの冷CaCl2 2.5mlに再懸濁して氷上で30分間インキユ
ベートした。このインキユベーシヨンの後、細胞は形質
転換用DNAの取込みに受容能力のある細胞（コンピテン
ト細胞）となる。この方法は、以後の実施例において
も、コンピテント細胞を用いる必要のある場合に採用さ
れる。
この細胞遊離液200μを上で調製した、ライゲート
したDNAと混合し、氷上で30分間インキユベートした。
この期間の終了時に、細胞を42℃の温水浴中に２分間、
次いで、氷上に戻してさらに10分間、放置した。遠心し
て細胞を収獲し、Ｌブロス1mlに再懸濁して37℃におい
て１時間インキユベートした。
この細胞混合物の一部を、アンピシリン100μg/ml、
Ｘ−gal 40μg/mlおよびIPTG 40μg/mlを含んだＬ−寒
天（１あたり寒天15gを含有するＬブロス）プレート
上においた。このプレートを37℃で一夜インキユベート
した。挿入体を含まないプラスミドを含有するコロニー
（例、大腸菌K12 JM103/pUC8）は、これらのプレート上
で青色を呈する。挿入体を含んだプラスミドを含有する
コロニー（例、大腸菌K12 JM103/pBKE1）は白色を呈す
る。数個の白色コロニーを選択し、そのプラスミドDNA
を、BKウイルスの〜5.2kb EcoR I制限フラグメントの存
在に関して制限酵素分析法でスクリーニングした。大腸
菌K12 JM103/pBKE1および大腸菌K12 JM103/pBKE2細胞か
らのプラスミドDNAの取得は、実質上、後述の実施例に
記載されているプラスミドDNA単離法に従つて行われ
た。ただし、方法は小規模に行われ、また、単に制限酵
素分析のためにプラスミドDNAを単離する場合にはCsCl
グラデイエント工程を省略した。
実施例10 プラスミドpBKneo1およびpBKneo2の組立て 大腸菌K12 HB101/pdBPV−MMTneo細胞は、アメリカン
・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンから、寄託番号AT
CC 37224の下、凍結乾燥品の形で得ることができる。こ
の凍結乾燥細胞をアンピシリン100μg/ml含有Ｌ−寒天
プレート上におき、37℃でインキユベートして単一のコ
ロニー単離体を得る。
アンピシリン50μg/mlを含んだＬブロス１に、大腸
菌K12HB101/pdBPV−MMTneoのコロニーを接種し、空気振
とう器中、37℃において、O.D.590が〜１吸収単位にな
るまでインキユベートした後、クロラムフエニコール15
0mgを培養に加えた。約16時間インキユベーシヨンを続
けた；クロラムフエニコールの添加によりタンパク質の
合成が阻害され、その結果、以後の細胞分裂が阻害され
るが、プラスミドの複製は継続される。
培養を、Sorvall GSAローター（デユポンCo.インスツ
ルメンツ・プロダクツ、バイオメデイカル・デイビジヨ
ン、ニユータウン、CN06470）中、４℃において、6000r
pmで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレツトをTES
バツフアー（10mM Tris−HCl、pH＝7.5、10mM NaClおよ
び1mM EDTA）40mlで洗浄した後、再度ペレツト化した。
上清を捨て、ドライアイス−エタノール浴中で細胞ペレ
ツトを凍結した後、解凍した。解凍した細胞を25％スク
ロースと50mM EDTAの溶液10mlに再懸濁した。5mg/mlリ
ゾチーム溶液約1ml、0.25M EDTA（pH＝8.0）3ml、およ
び10mg/ml RNAseA100μをこの溶液に加えた後、氷上
で15分間インキユベートした。溶解溶液（10％Triton−
X100 3ml、0.25M EDTA pH＝8.0、75ml、1M Tris−HCl、
pH＝8.0、15mlおよび水7mlを混合して調製）3mlをリゾ
チーム処理細胞に加えて混合し、得られた溶液を氷上で
さらに15分間インキユベートした。溶解した細胞をドラ
イアイス−エタノール浴中で凍結した後、解凍した。
SW27ローター（ベツクマン、7360N.リンカーンアベニ
ユー、リンカーンウツド、IL60646）中、25,000rpmで40
分間遠心し、緩衝化フエノールで抽出することにより、
溶液中の細胞破片を除去した。この細胞抽出物にCsCl約
30.44gと5mg/ml臭化エチジウム溶液〜1mlを加え、溶液
の容量をTESバツフアーで40mlに調節した。この溶液をV
Ti50超遠心管（ベツクマン）にデカントした後、シール
し、VTi50ローター中、42,000rpmで〜16時間遠心した。
生成したプラスミドバンドを紫外線下で観察し、単離し
た後、Ti75管およびローター（ベツクマン）内に入れ、
50,000rpmで16時間遠心した。容量の調節が必要とされ
る場合には、常に、0.761g/mlのCsClを含有するTEを用
いて行つた。
再びプラスミドバンドを単離し、塩−飽和イソプロパ
ノールで抽出して臭化エチジウムを除去し、TESバツフ
アーで1:3に希釈した。次いで、この溶液に２容量のエ
タノールを加えた後、−20℃で一夜インキユベートし
た。溶液を、SS34ローター（Sorvall）内で10,000rpmに
おいて15分間遠心することによりプラスミドDNAをペレ
ツト化した。
この方法で得たプラスミドpdBPV−MMTneo DNA〜1mgを
TEバツフアー1mlに懸濁し、−20℃で保存した。上記の
プラスミド単離法は、以後の実施例を通じて、大量の、
非常に純度の高いプラスミドを必要とする場合に一般的
に用いられる。この方法は、形質転換体を特定のプラス
ミドの存在に関してスクリーニングする場合の如く、よ
り純度の低いDNAを少量、迅速に必要とするときには、
培養細胞を5ml程度だけ用い、この細胞を適宜スケール
ダウンした量の溶解バツフアーに溶解し、さらに、遠心
工程をフエノールおよびクロロホルム抽出で置きかえる
ことによつて改良してもよい。
上で調製したプラスミドpdBPV−MMTneo DNA約５μｇ
（５μ）と実施例８で調製したBKウイルスDNA5μｇ
（５μ）を、それぞれ、10×BamH Iバツフアー（1.5M
NaCl、60mM Tris−HCl、pH＝7.9、60mM MgCl2、および
1mg/ml BSA）２μ、制限酵素BamH I1μ、および水
７μを含んだ溶液中、37℃において２時間、消化し
た。等容量のフエノールで抽出した後、クロロホルムで
２回抽出することにより反応を停止させた。各BamH I消
化DNAが沈殿するので、これを遠心して集め、水５μ
に再懸濁した。
BamH I消化プラスミドpdBPV−MMTneo1μおよびBamH
I消化BKウイルスDNA1μの混合物に10×リガーゼバツ
フアー約１μを加えた。このDNAの混合物にT4DNAリガ
ーゼ１μ（〜1000単位）と水６μとを加えた後、得
られた反応混合物を16℃で一夜インキユベートした。ラ
イゲートしたDNAは、BKウイルスDNAの方向性のみが異つ
ている、所望のプラスミドpBKneo1およびPBKneo2を構成
していた。プラスミドpBKneo1の制限サイトおよび機能
地図を添付の第４図に示す。
大腸菌K12HB101細胞は、NRRLから、寄託番号NRRL Ｂ
−15626の下、凍結乾燥品の形で入手可能である。大腸
菌K12HB101細胞を培養して形質転換受容能を与え、上で
調製した、ライゲートしたDNAで形質転換した。形質転
換した細胞をアンピシリン100μg/mlを含んだＬ−寒天
プレート上で平板培養した。大腸菌K12HB101/pBKneo1お
よび大腸菌K12/pBKneo2形質転換体を、そのアンピシリ
ン耐性表現型とプラスミドDNAの制限酵素分析によつて
同定した。
実施例11 プラスミドpBLcatの組立て A.中間体プラスミドpLPcatの組立て アデノウイルス２（Ad2）のビリオンDNAはサイズ約3
5.94kbの二本鎖線状分子である。Ad2後期プロモーター
は、Ad2ゲノムの〜0.316kb Acc I−Pvu II制限フラグメ
ント上に単離される。この〜0.32kb制限フラグメントは
Ad2ゲノムのヌクレオチド5755〜6071位の間の配列に対
応している。所望の〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フラグ
メントを単離するために、Ad2DNAをまず、制限酵素Bal
Iで消化して〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フラグメント
の全配列を含有している〜2.4kb Bal I制限フラグメン
トを単離する。次に、この〜2.4kb Bal I制限フラグメ
ントをAcc IとPvu IIで消化することにより、所望のフ
ラグメントを得る。
Ad2 DNA（BRLから入手可）約50μｇを水80μおよび
10×Bal Iバツフアー（100mM Tris−HCl、pH＝7.6、120
mM MgCl2、100mM DDT、および1mg/ml BSA）10μに溶
かす。このAd2 DNA溶液に制限酵素Bal I約10μ（約20
単位）を加え、得られた反応混合物を、37℃で４時間イ
ンキユベートする。
Bal I消化DNAをアガロースゲル上に充填し、制限フラ
グメントが充分に分離するまで電気泳動する。ゲルを臭
化エチジウムの希釈溶液（0.5μg/ml）で染色し、染色
されたゲルに長波長の紫外線（UV）線を照射することに
より電気泳動されたDNAの観察を行う。アガロースから
のDNA単離法の１つを以下に示す。所望のフラグメント
の前方に細いスリツトを設け、NA−45 DEAEメンブラン
〔シライヒヤー（Schleicher）およびシユエル（Schuel
l）、ケーン（Keen）NH03431〕の小片を各スリツト内に
おく。さらに電気泳動すると、DNAは、DEAEメンブラン
と非共有結合的に結合する。DEAEメンブランに所望のフ
ラグメントが結合した後、該メンブランを除いて低塩バ
ツフアー（100mM KCl、0.1mM EDTAおよび20mM Tris−HC
l、pH＝８）で洗浄する。次いで、このメンブランを小
さい管に入れ、高塩バツフアー（1M NaCl、0.1mM EDT
A、および20mM Tris−HCl、pH＝８）に浸漬した後、65
℃で１時間インキユベートし、DEAE紙からDNAを除去す
る。65℃でのインキユベーシヨンの後、インキユベーシ
ヨンバツフアーを集め、高温バツフアーでメンブランを
洗浄する。この高塩洗浄液を高塩インキユベーシヨン液
と一緒にプールする。
この高塩DNA溶液の容量を、NaCl濃度が0.25Mになる
様、調節した後、冷たい無水エタノール３容量をこの溶
液に加える。得られた溶液を混合した後、−70℃で10〜
20分間放置する。次いで、この溶液を15,000rpmで15分
間遠心する。もう一度沈殿させて残存する塩を除き、DN
Aペレツトをエタノールで洗浄した後、乾燥し、TEバツ
フアー20μに再懸濁すると、これは、所望のAd2の制
限フラグメント約３μｇで構成されている。得られた精
製フラグメントをTEバツフアー10μに溶かす。
Ad2の〜2.4kb Bal I制限フラグメントの溶液に水約６
μおよび10×Acc Iバツフアー（60mM NaCl、60mM Tri
s−HCl、pH＝7.5、60mM MgCl2、60mM DDT、および1mg/m
l BSA）２μを加える。このDNA溶液に制限酵素Acc I
約２μ（〜10単位）を加えた後、反応混合物を37℃で
２時間インキユベートする。Acc I消化の後、エタノー
ル沈殿によりDNAを集め、水16μおよび10×Pvu IIバ
ツフアー（600mM NaCl、60mM Tris−HCl、pH＝7.5、60m
M MgCl2、60mM DDTおよび1mg/ml BSA）２μに再懸濁
する。このDNA溶液に制限酵素Pvu II約２μ（約10単
位）を加えた後、反応混合物を37℃で２時間インキユベ
ートする。
Acc I−Pvu II消化した、Ad2の〜2.4kb Bal I制限フ
ラグメントを〜６％ポリアクリルアミドゲルに充填し、
Ad2後期プロモーターを含有する〜0.32kb Acc I−Pvu I
I制限フラグメントが他の消化産物から分離されるまで
電気泳動する。ゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光を
用いて観察し、〜0.32kb Acc I−Pvu II制限フラグメン
トを含有するゲルのセグメントをゲルから切り取り、破
砕し、抽出バツフアー〜250μ中に、一夜室温で浸漬
する。翌朝、混合物を遠心し、ペレツトを捨てる。上清
中のDNAをエタノールで沈殿させ、約２μｇのtRNAを加
えて所望のフラグメントを確実に沈殿させる。〜0.32kb
Acc I−Pvu II制限フラグメント約0.2μｇを得、水７
μに懸濁する。
約0.25μｇ（0.5μ中）のBcl Iリンカー（５′−CT
GATCAG−３′、ニユーイングランドバイオラボから入手
可）をキナーゼ処理し、下記の方法でライゲーシヨンの
ために調製した。リンカー４μ（〜２μｇ）を水20.1
5μと10×キナーゼバツフアー（500mM Tris−HCl、pH
＝7.6および100mM MgCl2）５μに溶かし、90℃で２分
間インキユベートした後、室温に冷却した。この混合物
に〔γ−32P〕−ATP（〜20μci）５μ、1M DTT2.5μ
およびポリヌクレオチドキナーゼ（〜10単位）５μ
を加え、37℃で30分間インキユベートした。次いで、0.
01MATP3.35μとキナーゼ５μとを加え、37℃におい
てさらに30分間、反応を続けた。リンカーが標的DNAに
ライゲートしたか否かを決定するためには放射活性なAT
Pが役立つ。
このキナーゼ処理したリンカーを〜0.32kb Acc I−Pv
u II制限フラグメントの溶液に加えた後、T4 DNAリガー
ゼ１μ（〜1000単位）および10×リガーゼバツフアー
１μをこのDNA溶液に加えた。得られた反応混合物を1
6℃で一夜インキユベートした。Bcl Iリンカーは、Acc
I−Pvu II制限フラグメントのPvu II末端とのみライゲ
ートし得た。後のDNA配列決定により、Acc I−Pvu II制
限フラグメントのPvu II末端に４個のBcl Iリンカーが
結合していることが分つた。これらの余分のBcl Iリン
カーは、Bcl I消化した後、再ライゲーシヨンすること
で除去し得るが、これらのリンカーはベクターの適切な
機能を干渉しないので、余分なBcl Iリンカーの除去は
行わなかつた。
大腸菌K12HB101/pSV2cat細胞を、寄託番号ATCC 37155
の下、ATCCから凍結乾燥品の形で入手し、該細胞からプ
ラスミドpSV2cat DNAを単離した。プラスミドpSV2catの
制限サイトおよび機能地図を添付の第５図に示す。プラ
スミドpSV2cat DNA約1mgを得、TEバツフアー1mlに溶か
した。プラスミドpSV2cat DNA約３μｇ（３μ）を10
×Acc Iバツフアー２μおよび水16μに加え、次い
で、このpSV2cat DNAの溶液に制限酵素Acc I 3μ（約
９単位）を加え、得られた反応混合物を37℃で２時間イ
ンキユベートした。次いで、Acc I消化プラスミドpSV2c
at DNAに10×Stu Iバツフアー（1.0M NaCl、100mM Tris
−HCl、pH＝8.0、100mM MgCl2、60mMDTTおよび1mg/ml B
SA）３μ、水５μおよび制限酵素、Stu I約２μ
（約10単位）を加えて制限酵素Stu Iで消化した。得ら
れた反応混合物を37℃で２時間インキユベートした。反
応混合物をフエノールで１回、次いでクロロホルムで２
回抽出することにより反応を終了させた。所望のフラグ
メント約0.5μｇを得、これをTEバツフアー20μに溶
かした。
Acc I−Stu I消化プラスミドpSV2cat DNA約４μとA
d2の〜0.32kb Acc I−Pvc II（Bcl Iリンカーが結合し
たもの）制限フラグメントとを混合した後、10×リガー
ゼバツフアー３μ、水15μおよびT4DNAリガーゼ２
μ（約1000単位）を加え、このライゲーシヨン反応混
合物を16℃で一夜インキユベートした。ライゲートした
DNAは所望のプラスミドpLPcat、即ち、Ad2後期プロモー
タを、クロラムフエニコール・アセチルトランスフエラ
ーゼ遺伝子転写させ、さらに発現させる位置に含有して
いるプラスミドを構成していた。プラスミドpLPcatの制
限サイトおよび機能地図を添付の第６図に示す。
ライゲートしたDNAを用いて大腸菌K12HB101細胞を形
質転換し、形質転換された細胞をアンピシリン50μg/ml
を含んだＬ寒天上で平板培養した。大腸菌K12HB101/pLP
cat形質転換体を同定するのにプラスミドDNAの制限酵素
分析を利用した。次いで、形質転換体からプラスミドpL
Pcat DNAを単離し、以後のベクターの組立てに供した。
B.プラスミドpBLcatの最終組立て TEバツフアー50μ中のプラスミドpBKneo1DNA約88μ
ｇを10×Acc Iバツフアー7.5μ、水30μ、および制
限酵素Acc I 15μ（約75単位）に加え、得られた反応
混合物を37℃で２時間、インキユベートした。このAcc
I消化BKウイルスDNAをアガロースゲル上に充填し、BKエ
ンハンサーを含有する〜1.4kbフラグメントを他の消化
産物から分離した。次いで、実質上、実施例９に記載の
方法に従い、〜1.4kb Acc I制限フラグメントを単離し
た。このフラグメント約５μｇを10×Pvu IIバツフアー
５μ、水45μ、および制限酵素Pvu II 5μ（約25
単位）中に再懸濁し、得られた反応混合物を37℃で２時
間インキユベートした。次いで、実質上、実施例９の方
法に従い、Pvu II消化DNAを単離し、ライゲーシヨンの
ために調製した。所望の〜1.28kb Acc I−Pvu IIフラグ
メント約２μｇを得、TEバツフアー５μに溶かした。
プラスミドpLPcat DNA約１μｇを10×Acc Iバツフア
ー５μおよび水40μに溶かした。このプラスミドpL
Pcat DNA溶液に制限酵素Acc I約５μ（〜25単位）を
加え、得られた反応混合物を37℃でインキユベートし
た。Acc I消化プラスミドpLPcat DNAをエタノール沈殿
に付し、10×Stu Iバツフアー５μ、水40μおよび
制限酵素Stu I 5μ（約25単位）に再懸濁し、得られ
た反応混合物を37℃で２時間インキユベートした。Acc
I−Stu I消化プラスミドpLPcat DNAをエタノールで数回
沈殿させ、大腸菌の複製起源、およびサイズ約16bpの制
限フラグメントである、他の消化産物を除去されたAd2
の後期プロモーターを含有している〜4.81kb Acc I−St
u I制限フラグメントを精製した。所望の〜4.81kb制限
フラグメント約１μｇを得、TEバツフアー20μに溶か
した。
プラスミドpLPcatの〜4.81kb Acc I−Stu I制限フラ
グメント５μをBKウイルスの〜1.28kb Acc I−Pvu II
制限フラグメント５μに加えた。10×リガーゼバツフ
アー３μ、水15μおよびT4DNAリガーゼ２μ（約1
000単位）をDNA混合物に加えた後、得られたライゲーシ
ヨン反応混合物を16℃で一夜インキユベートした。ライ
ゲートしたDNAは、所望のプラスミドpBLcatを構成して
いた。プラスミドpBLcatの制限サイトおよび機能地図を
添付の第７図に示す。
ライゲートしたDNAを用い、大腸菌K12HB101細胞を形
質転換し、大腸菌K12HB101/pBLcat形質転換体を、その
プラスミドDNAの配列決定によつて同定した。次いで、
以後のベクターの組立てに用いるためにプラスミドpBLc
at DNAを調製した。
実施例12 プラスミドpL133の組立て A.中間体プラスミドpSV2−HPC8の組立て プラスミドpHC7はヒトプロテインＣをコードしている
DNAを含有している。テトラサイクリン15μg/mlを含ん
だＬ−ブロス１に大腸菌K12RR1/pHC7（NRRL B−1592
6）を接種し、実質上、実施例10の方法に従つてプラス
ミドpHC7 DNAを単離し、精製した。この方法で約1mgの
プラスミドpHC7 DNAを得、これをTEバツフアー1mlに懸
濁し−20℃で保存した。プラスミドpHC7の制限サイトお
よび機能地図を添付の第８図に示す。
プラスミドpHC7 DNA50μを制限酵素Ban I 5μ
（〜50単位）、10×Ban I反応バツフアー（1.5M NaCl、
60mM Tris−HCl、pH＝7.9、60mM MgCl2、および1mg/ml
BSA）10μ、および水35μと混合し、消化が完了す
るまでインキユベートした。次いで、Ban I消化プラス
ミドpHC7 DNAを、〜1.25kb Ban I反応フラグメントが他
の消化産物から分離するまで3.5％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけた。〜1.25kb Ban I制限フラグメン
トを含んだゲルの領域を実施例３の教示に従つて単離し
た。
この方法で〜1.25kb Ban I反応フラグメント約８μｇ
が得られた。この精製フラグメントをTEバツフアー10μ
に懸濁し、−20℃で保存した。プラスミドpSV2−HPC8
を組立てるために、このBan I制限フラグメントにリン
カーを付加して修飾する必要があつた。このリンカーの
組立てに用いられたDNAフラグメントは、Systec1450A
DNA合成装置またはABS380A DNA合成装置のいずれかを
用いて合成された。
各１本鎖リンカー500ピコモルを、T4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ15単位（〜0.5μ）、10×リガーゼバツフ
アー２μ、500μM ATP10μ、および水7.5μを含
んだ反応バツフアー20μ中でキナーゼ処理した。キナ
ーゼ反応混合物を37℃で30分間インキユベートした後、
100℃で10分間インキユベートして反応を止めた。キネ
ーシヨン（kination）を確実に完了させるために、氷上
で反応混合物を冷却し、該反応混合物に0.2Mジチオトレ
イトール２μ、5mM ATP2.5μ、およびT4ポリヌクレ
オチドキナーゼ15単位を加えて混合し、反応混合物を37
℃でさらに30分間インキユベートした。100℃でさらに1
0分間インキユベートした後、氷上で冷却することによ
り反応を止めた。
キナーゼ処理は別個に行ない、２個の１本鎖DNAリン
カーを、キナーゼ反応後に一緒にした。これらの鎖をア
ニーリングするために、水約150mlの入つた水浴（100
℃）中で10分間、キナーゼ反応混合物をインキユベート
した。このインキユベーシヨンの後、水浴を閉じ、室温
まで放冷した（この工程には約３時間を要した）。キナ
ーゼ処理したDNAの管を入れたまま、水浴を４℃で一夜
インキユベートした。この方法で一本鎖がアニーリング
された。組立てられたリンカーは、以下の式： で示される構造を有する。このリンカーを、使用まで−
20℃で保存した。
リンカー約50μ（約500ピコモル）、T4DNAリガーゼ
１μ（約500単位）、10×リガーゼバツフアー10μ
、および水29μに〜1.25kb Ban Iフラグメント約８
μを加えて混合し、得られたライゲーシヨン反応混合
物を４℃で一夜インキユベートした。65℃で10分間イン
キユベートしてライゲーシヨン反応を止めた。NaOAcを
終濃度0.3Mまで加え、エタノール２容量を加えてドライ
アイス−エタノール浴中で冷却した後、該溶液を遠心す
ることによりDNAをペレツト化した。
このDNAペレツトを150×Apa I反応バツフアー（60mM
NaCl、60mM Tris−HCl、pH＝7.4、60mM MgCl2および60m
M 2−メルカプトエタノール）10μ、制限酵素Apa I 5
μ（〜50単位）および水85μに溶かし、反応混合物
を37℃で２時間放置した。次いで、反応を止め、上記の
如くDNAをペレツト化した。このDNAペレツトを10×Hind
III反応バツフアー10μ、制限酵素Hind III 5μ
（〜50単位）および水85μに溶かし、反応混合物を37
℃で２時間放置した。Hind III消化の後、反応混合物を
3.5％ポリアクリルアミドゲルで処理し、所望の1.23kb
Hind III−Apa I制限フラグメントを単離した。所望の
フラグメント約５μを得、これをTEバツフアー10μ
に懸濁し、−20℃に保存した。
プラスミドpHC7 DNA50μを、制限酵素PSTI5μ
（〜50単位）、10×Pst I反応バツフアー（1.0M NaCl、
100mM Tris−HCl、pH＝7.5、100mM MgCl2、および1mg/m
l BSA）10μ、および水35μに溶かし、37℃で２時
間インキユベートした。次いで、Pst I消化プラスミドp
HC7 DNAを3.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、所望の〜0.88kbフラグメントを実質上、上記の方法
に従つて精製した。所望のフラグメント約５μｇを得、
TEバツフアー10μに懸濁し、−20℃で保存した。
〜0.88kb Pst Iフラグメント約５μｇを、自動DNA合
成装置を用いて組立てられた、式： で示されるリンカー約50μに加えて混合した。
T4DNAリガーゼ約１μ、10×リガーゼバツフアー10
μ、および水29μをDNA混合物に加え、得られたラ
イゲーシヨン反応混合物を４℃で一夜インキユベートし
た。
65℃で10分間インキユベートすることによりライゲー
シヨン反応を止めた。ライゲートしたDNAを沈降させた
後、DNAペレツトを10×Apa I反応バツフアー10μ、反
応酵素Apa I 5μ（〜50単位）および水85μに溶か
し、反応混合物を37℃で２時間放置した。次いで、反応
を止め再びDNAをペレツト化した。このDNAペレツトを10
×Bal II反応バツフアー（1M NaCl、100mM Tris−HCl、
pH＝7.4、100mM MgCl2、100mM 2−メルカプトエタノー
ル、および1mg/ml BSA）10μ、制限酵素Bgl II 5μ
（〜50単位）、および水85μに溶かし、反応混合物を
37℃で２時間放置した。Bal II消化の後、反応混合物を
3.5％ポリアクリルアミドゲル処理し、所望の〜0.19kb
Apa I−Bgl II制限フラグメントを単離した。所望のフ
ラグメント約１μｇを得、TEバツフアー10μに懸濁し
て−20℃で保存した。
プラスミドpSV2gpt DNA（ATCC37145）約10μｇを10×
Hind III反応バツフアー10μ、制限酵素Hind III 5μ
（〜50単位）および水85μに溶かし、反応混合物を
37℃で２時間放置した。次いで、反応混合物をNaOAc 0.
25Mに調節し、エタノール２容量を加えてドライアイス
−エタノール中でインキユベートした後、遠心してDNA
をペレツト化した。このDNAペレツトを10×Bgl IIバツ
フアー、制限酵素Bgl II 5μ（〜50単位）および水85
μに溶かし、この反応混合物を37℃で２時間放置し
た。Bal II消化の後、反応混合物を１％アガロースゲル
電気泳動にかけ、フラグメントを分離した。ゲルを臭化
エチジウムで染色し、紫外線照射下で観察して所望の〜
5.1kb Hind III−Bgl IIフラグメントを含んだバンドを
ゲルから切り、透析チユーブの中に入れ、DNAがアガロ
ースから放出されるまで電気泳動を続けた。透析チユー
ブから得た、DNAを含んだバツフアーをフエノールおよ
びCHCl3で抽出した後、DNAを沈降させた。このペレツト
をTEバツフアー10μに再懸濁すると、これは、所望
の、プラスミドpSV2gptの〜5.1kb Hind III−Bgl II制
限ブラグメント〜５μｇからなつていた。
〜1.23kb Hind III〜Apa I制限フラグメント２μ、
〜0.19kb Apa I〜Bal IIフラグメント３μ、および〜
5.1kb Hind III〜Bal IIフラグメント２μを混合した
後、10×リガーゼバツフアー10μ、T4DNAリガーゼ１
μ（〜500単位）および水82μと一緒に16℃で一夜
インキユベートした。ライゲートしたDNAは、所望のプ
ラスミドpSV2−HPC8を構成していた。このプラスミドの
制限サイトおよび機能地図を添付の第８図に示す。
大腸菌K12RR1（NRRL Ｂ−15210）細胞を形質転換受
容細胞とし、これを、上で調製した、ライゲートしたDN
Aを用いて形質転換した。形質転換混合物の一部をと
り、100μg/mlアンピシリンを含んだＬ−寒天プレート
にのせた。このプレートを37℃でインキユベートした。
大腸菌K12 RR1/pSV2−HPC8形質転換体を、そのプラスミ
ドDNAの制限酵素分析に基づいて確認した。
B.プラスミドpL133の最終組立て プラスミドpSV2−HPC8 50μｇを10×Hind III反応バ
ツフアー10μ、制限酵素Hind III 5μ（〜50単位）
および水85μに溶かし、反応混合物を37℃で２時間イ
ンキユベートした。Hind III消化の後、DNAを沈殿さ
せ、このDNAペレツトを10×Sal I反応バツフアー（1.5M
NaCl、60mM Tris−HCl、pH＝7.9、60mM MgCl2、60mM 2
−メルカプトエタノールおよび1mg/ml BSA）10μ、制
限酵素Sal I 5μ（〜50単位）、および水85μに溶
かした。得られたSal I反応混合物を37℃で２時間イン
キユベートした。このHind III−Sal I消化プラスミドp
SV2−HPC8を3.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、所望の〜0.29kb Hind III−Sal I制限フラグメント
が他の反応産物から分離するまで泳動させた。ゲルから
所望のフラグメントを単離し、得られた約２μｇのフラ
グメントをTEバツフアー10μに懸濁した。
プラスミドpSV2−HPC8 50μｇ、10×Bal II反応バツ
フアー10μ、制限酵素Bgl II 5μ（50単位）および
水85μに溶かし、この反応混合物を37℃で２時間イン
キユベートした。Bgl II消化の後、DNAを沈殿させ、得
られたDNAペレツトを10×Sal I反応バツフアー10μ、
制限酵素Sal I 5μ（〜50単位）および水85μに溶
かした。得られたSal I反応混合物を37℃で２時間イン
キユベートした。このSal I−Bgl II消化プラスミドpSV
2−HPC8を3.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、所望の〜1.15kb Sal I−Bgl II制限フラグメントが
他の反応産物から分離するまで泳動させた。ゲルから〜
1.15kb Sal I−Bgl II制限フラグメントを単離し、フラ
グメント約８μｇを得てTEバツフアー10μに懸濁し
た。
プラスミドpSV2−β−グロビンDNA（NRRL B−15928）
約10μｇを10×Hind III反応バツフアー10μ、制限酵
素Hind III 5μ（〜50単位）、および水85μに溶か
し、得られた反応混合物を37℃で２時間放置した。次い
で、この反応混合物をNaOAc 0.25Mとし、２容量のエタ
ノールを加え、ドライアイス−エタノール浴中でインキ
ユベートした後、遠心してDNAをペレツト化した。Hind
III消化プラスミドpSV2−β−グロビンを10×Bgl IIバ
ツフアー10μ、制限酵素Bgl II 5μ（〜50単位）お
よび水85μに溶かし、反応混合物を37℃で２時間置い
た。Bgl II消化の後、反応混合物を１％アガロースゲル
電気泳動にかけてフラグメントを分離した。所望の〜4.
2kb Hind III−Bgl II制限フラグメントをゲルから単離
し、得られた約５μｇの所望のフラグメントをTEバツフ
アー10μに懸濁した。
プラスミドpSV2−HPC8の〜0.29kb Hind III−Sal Iフ
ラグメント２μ、プラスミドpSV2−HPC8の〜1.15kb S
al I−Bgl IIフラグメント２μ、およびプラスミドpS
V2−β−グロビンの〜4.2kb Hind III−Bgl IIフラグメ
ント２μを一緒に混合し、実質上、実施例12Aの方法
に従つてライゲートさせた。ライゲートしたDNAは所望
のプラスミドpL133を構成していた。第８図はこの実施
例に記載した種々の出発物質からのプラスミドpL133の
組立てを、模式的に示したフローチヤートである。所望
の大腸菌K12RR1/pL133形質転換体を組立て、プラスミド
pLPCの組立てに用いるためにプラスミドDNAを単離し
た。
実施例13 プラスミドpLPCの組立て プラスミドpBLcat DNA約20μｇを、10×Hind IIIバツ
フアー10μおよび水80μに溶かした。制限酵素Hind
III約10μ（〜100単位）を、プラスミドpBLcat DNA
の溶液に加え、得られた反応混合物を37℃で２時間イン
キユベートした。このHind III消化プラスミドpBLcat D
NAをアガロースゲル電気泳動にかけ、BKエンハンサーと
Ad2後期プロモーターとを含有する〜0.87kb Hind III制
限フラグメントが他の消化産物から分離されるまで泳動
させた後、〜0.87kbフラグメントを単離し、実質上、実
施例９の方法に従つてライゲーシヨンのために調製し
た。所望のフラグメント約２μｇを得、これをTEバツフ
アー５μに溶かした。
プラスミドpL133 DNA約1.5μｇを、10×Hind IIIバツ
フアー２μおよび水16μに溶かした。このDNA溶液
に、制限酵素Hind III約１μ（〜10単位）を加え、得
られた反応混合物を37℃で２時間インキユベートした。
次いで、このDNAをTEバツフアー100μで希釈し、実質
上、実施例９の方法に従い、ウシ腸のアルカリホスフア
ターゼ処理した。このHind III消化プラスミドpL133 DN
Aをフエノールで２回、さらにクロロホルムで１回抽出
し、エタノール沈殿に付した後、TEバツフアー10μに
再懸濁した。
1.5μのHind III消化プラスミドpL133に〜0.87kb H
ind III制限フラグメント約５μを加え、次いで、10
×リガーゼバツフアー１μ、T4DNAリガーゼ１μ
（〜1000単位）および水1.5μをこのDNA溶液に加え、
得られた反応混合物を16℃で一夜インキユベートした。
ライゲートしたDNAは所望のプラスミドpLPCを構成して
いた。
ライゲートしたDNAを用い、大腸菌K12HB101を形質転
換した。形質転換された細胞をアンピシリンを含んだＬ
寒天上で平板培養し、アンピシリン耐性形質転換体のプ
ラスミドDNAを制限酵素分析で調べ、大腸菌K12HB101/pL
PC形質転換体を同定した。BKエンハンサーとAd2後期プ
ロモーターとをコードしている〜0.87kb Hind III制限
フラグメントはHind III消化プラスミドpSBLcatに、１
または２方向性で挿入され得るが、その内１方のみがプ
ラスミドpLPCを与える。プラスミドpLPCの制限サイトお
よび機能地図を添付の第９図に示す。
実施例14 プラスミドpLPC4およびpLPC5の組立て 実施例８で調製したBKウイルスDNA約１μｇ（１μ
）およびプラスミドpLPC1μｇ（１μ）を10×EcoR
Iバツフアーおよび水14μに溶かした。制限酵素EcoR
I約２μ（〜10単位）をDNA溶液に加え、得られた反応
混合物を37℃で２時間インキユベートした。BKウイルス
とプラスミドpLPC DNAとのEcoR I消化混合物を、緩衝
化フエノールで１回、クロロホルムで１回抽出した。次
いで、NaCl濃度を0.25Mに調節し、エタノール２容量を
加え、該溶液をドライアイス−エタノール浴中で２分間
インキユベートし、溶液を遠心してDNAをペレツト化す
ることにより、DNAを集めた。上清を捨て、DNAペレツト
を70％エタノールで洗浄し、乾燥してTEバツフアー12μ
に再懸濁した。
BKウイルスとプラスミドpLPC DNAのEcoR I消化混合
物に、水約13μと10×リガーゼバツフアー３μとを
加えた。このDNA溶液にT4DNAリガーゼ２μ（〜1000単
位）を加え、得られた反応混合物を16℃で２時間インキ
ユベートした。ライゲートしたDNAは所望のプラスミドp
LPC4およびpLPC5（これらは挿入されたBKウイルスの方
向性に関してのみ異る）を構成しており、これらを用い
て大腸菌K12HB101コンピテント細胞を形質転換した。形
質転換された細胞を100μg/mlアンピシリンを含んだＬ
寒天上にプレートした。大腸菌K12HB101/pLPC4および大
腸菌K12HB101/pLPC5形質転換体をそれらのアンピシリン
耐性表現型とプラスミドDNAの制限酵素分析により同定
した。プラスミドpLPCの制限サイトおよび機能地図を添
付の第10図に示す。
実施例15 プラスミドpLPChyg1およびpLPChyg2の組立て 大腸菌K12RR1/pSV2hyg細胞は、NRRLから、寄託番号NR
RL B−18039の下、入手される。プラスミドpSV2 hyg DN
Aは、この細胞から、実質上、実施例10の方法に従つて
得られる。プラスミドpSV2 hygの制限サイトおよび機能
地図を添付の第11図に示す。
プラスミドpSV2 hyg約10μｇ（TEバツフアー10μ
中）を10×BamH Iバツフアー２μと水６μとに加え
た。このDNA溶液に制限酵素BamH I約２μ（約20単
位）に加え、得られた反応混合物を37℃で２時間インキ
ユベートした。得られた反応混合物をまずフエノール、
次いでクロロホルムで２回、抽出した。このBamH I消化
プラスミドpSV2 hyg DNAをアガロースゲルに適用し、ハ
イグロマイシン耐性遺伝子を含んだ〜2.5kb制限フラグ
メントを単離した。
BamH I消化プラスミドpSV2 hyg DNAの溶液に、10×ク
レノウ（Klenow）バツフアー（４種類のdNTP各0.2mM、
0.5M Tris−HCl、pH＝7.8、50mM MgCl2、0.1M ２−メ
ルカプトエタノール、および100μg/ml BSA）約５μ
および水35μを加えた後、このDNA混合物にクレノウ
酵素約25単位（BRL供給の品、約５μ）を加え、得ら
れた反応混合物を16℃で30分間インキユベートした。こ
の、クレノウ処理した、BamH I消化プラスミドpSV2 hrg
DNAをフエノールおよびクロロホルムで各１回抽出した
後、エタノール沈殿に付した。所望のフラグメント約２
μｇを得、TEバツフアー５μに懸濁した。
プラスミドpLPC DNA約10μｇ（10μ）を、10×Stu
Iバツフアー２μおよび水６μに加えた。制限酵素S
tu I約２μ（〜10単位）をこのDNA溶液に加え、得ら
れた反応混合物を37℃で２時間インキユベートした。こ
のStu I消化プラスミドpLPC DNAをエタノール沈殿に付
した後、遠心して集め、10×Nde Iバツフアー（1.5M Na
Cl、0.1M Tris−HCl、pH＝7.8、70mM MgCl2、60mM 2−
メルカプトエタノール、1mg/ml BSA）２μと水16μ
に再懸濁した。このStu I消化DNAの溶液をエタノール沈
殿に付し、遠心して集め、10×Nde Iバツフアー（1.5M
NaCl、0.1M Tris−HCl、pH＝7.8、70mM MgCl2、60mM
２−メルカプトエタノールおよび1mg/ml BSA）２μお
よび水16μに再懸濁した。このStu I消化DNAの溶液
に、制限酵素Nde I約２μ（〜10単位）を加え、得ら
れた反応混合物を37℃で２時間インキユベートした。
Nde I−Stu I消化プラスミドpLPC DNAをエタノール
沈殿に付し、遠心して集め、10×クレノウバツフアー５
μおよび水40μに再懸濁した。クレノウ酵素約５μ
（〜25単位）をこのDNA溶液に加え、得られた反応混
合物を16℃で30分間インキユベートした。クレノウ反応
の後、反応混合物をアガロースゲルに適用し、ゲルから
〜5.82kb Nde I−Stu I制限フラグメントを単離した。
所望のフラグメント約５μｇを得、これをTEバツフアー
５μに懸濁した。
プラスミドpSV2 hygの〜2.5kbクレノウ処理したBamH
I制限フラグメント約２μを、プラスミドpLPCの〜5.8
2kbクレノウ処理したNde I−Stu I制限フラグメント約
１μと混合し、このDNA溶液に、10×リガーゼバツフ
アー約３μ、T4 DNAリガーゼ２μ（〜1000単位）、
T4 RNAリガーゼ１μ（〜１単位）、および水14μを
加えた。得られた反応混合物を16℃で一夜インキユベー
トした。ライゲートしたDNAは、クレノウ処理した、プ
ラスミドpSV2 hygの〜2.5kb BamH I制限フラグメントの
方向性に関してのみ異る、所望のプラスミド、pLPChyg1
およびpLPChyg2を構成していた。プラスミドpLPChyg1の
制限サイトおよび機能地図を添付の第12図に示す。ライ
ゲートされたDNAを用いて大腸菌K12HB101を形質転換
し、所望の大腸菌K12HB101/pLPChyg1および大腸菌K12HB
101/pLPChyg2形質転換体を、アンピシリンを含んだＬ寒
天上にプレートし、それらのプラスミドDNAの制限酵素
分析によつて同定した。
実施例16 プラスミドpLPChd1およびpLPChd2の組立て TEバツフアー20μ中、約20μｇのプラスミドpSV2−
dhfr（ATCC37146）を10×BamH Iバツフアーおよび水60
μに加える。制限酵素BamH I約10μ（〜50単位）を
加え、得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベー
トする。次いで、BamH I消化プラスミドDNAをエタノー
ル沈殿に付し、遠心して集め、10×クレノウバツフアー
５μ、水45μ、およびクレノウ酵素２μ（〜100
単位）に再懸濁する。反応混合物を16℃で30分間インキ
ユベートした後、反応混合物をアガロースゲル電気泳動
にかけ、消化産物が明瞭に分離するまで泳動させる。dh
fr遺伝子を含有する、クレノウ処理された、〜1.9kb Ba
mH I制限フラグメントを、実質上、実施例９の方法に従
つてゲルから単離し、ライゲーシヨンのために調製す
る。所望のフラグメント約４μｇを得、TEバツフアー５
μに懸濁する。
TEバツフアー100μ中、プラスミドpLPChyg1約200μ
ｇを10×EcoR Iバツフアー15μおよび水30μに加え
た。このプラスミドpLPChyg1DNAの溶液に制限酵素EcoR
I約５μ（〜50単位）を加え、得られた反応混合物を3
7℃で約10分間インキユベートした。反応時間が短かい
のはEcoR I部分消化のためである。プラスミドpLPChyg
は２個のEcoR I制限部位、１つはハイグロマイシン耐性
付与（HmR）遺伝子の暗号配列内にあるが、dhfr遺伝子
含有制限フラグメントは、プラスミドpLPChyg1の、この
HmR遺伝子内にあるEcoR I部位と異なるEcoR I部位に挿
入されるのが望ましい。部分的なEcoR I消化プラスミド
pLPChyg1 DNAをアガロースゲル電気泳動にかけ、１箇所
を切断されたpLPChyg DNAが、非切断プラスミドDNAおよ
び他の消化産物から分離するまで泳動させた。実質上、
実施例９の方法に従い、１箇所切断DNAをゲルから単離
し、ライゲーシヨンのために調製した。単１のEcoR I切
断プラスミドpLPChyg1約２μｇを得、TEバツフアー25μ
中に懸濁した。この試料に、クレノウ酵素約５μ
（〜25単位）、10×クレノウバツフアー５μ、および
水40μを加え、得られた反応混合物を16℃で60分間イ
ンキユベートした。次いで、クレノウ処理した、EcoR I
部分消化DNAをフエノールで２回、さらに、クロロホル
ムで１回抽出し、エタノール沈殿に付し、TEバツフアー
25μに再懸濁した。
dhfr遺伝子を含有する〜1.9kbのクレノウ処理したBam
H I制限フラグメントと単１のEcoR I切断プラスミドpLP
Chyg1 DNAとを一緒に混合し、10×リガーゼバツフアー
１μ、水５μ、T4 DNAリガーゼ１μ（〜500単
位）、およびT4 RNAリガーゼ１μ（〜２単位）をDNA
混合物に加え、得られた反応混合物を16℃で一夜インキ
ユベートした。ライゲートしたDNAは、dhfr遺伝子を含
んだ〜1.9kbフラグメントの方向性に関してのみ異る所
望のプラスミドpLPChd1およびpLPChd2を構成していた。
ライゲートしたDNAを用い、コンピテントな大腸菌K12
HB101細胞を形質転換した。形質転換された細胞をアン
ピシリン100μg/mlを含んだＬ寒天上にプレートし、ア
ンピシリン耐性の形質転換体をそのプラスミドDNAの制
限酵素分析によつて分析し、大腸菌K12HB101/pLPChd1お
よび大腸菌K12HB101/pLPChd2形質転換体を同定した。プ
ラスミドpLPChd1の制限サイトおよび機能地図を添付の
第13図に示す。次いで、適切な形質転換体からプラスミ
ドpLPChd1およびプラスミドpLPChd2を単離した。
実施例17 プラスミドphdの組立て プラスミドphdを組立てるには、dam遺伝子等にコード
されており、その産物が配列:5′−GATC−３′中のアデ
ニン残基をメチル化する、アデニンメチラーゼを欠いて
いる大腸菌宿主細胞からプラスミドphdの組立て出発物
質であるプラスミドpLPChd1 DNAを調製する必要があつ
た。大腸菌K12GM48（NRRL B−15725）は機能的なdamメ
チラーゼを欠いており、従つて、プラスミドphdの出発
物として用いられるプラスミドpLPChd1 DNAを調製する
ための宿主として適する。
大腸菌K12GM48細胞を培養し、形質転換受容能を有す
る細胞を調製し、プラスミドpLPChyg1を用いてこの大腸
菌K12GM48細胞を形質転換した。形質転換された細胞
を、アンピシリンを含んだＬ寒天上にプレートし、アン
ピシリン耐性の、大腸菌K12GM48/pLPChd1形質転換体が
コロニーを形成した後、その様なコロニーの１つを用い
てプラスミドpLPChd1 DNAを調製した。プラスミドpLPCh
d1 DNA約1mgを得、これをTEバツフアー約1mlに懸濁し
た。
TEバツフアー２μ中のプラスミドpLPChd1DNA約２μ
ｇを、10×Bcl Iバツフアー（750mM KCl、60mM Tris−H
Cl、pH＝7.4、100mM MgCl2、10mM DTTおよび1mg/ml BS
A）２μおよび水14μに加えた。このプラスミドpLP
Chd1 DNAの溶液に制限酵素Bcl I約２μ（〜10単位）
を加え、得られた反応混合物を50℃で２時間インキユベ
ートした。混合物をフエノールで１回、クロロホルムで
２回抽出することにより反応を止めた。
Bcl I消化プラスミドpLPChd1 DNAを10×リガーゼバツ
フアー１μ、水８μおよびT4 DNAリガーゼ１μ
（〜500単位）に加えた。このライゲーシヨン反応混合
物を16℃で一夜インキユベートすると、ライゲートした
DNAは所望のプラスミドphdを構成していた。プラスミド
phdは、プラスミドpLPChd1からの、プラスミドpLPcatの
組立て中に付加された余分のBcl1リンカーの欠失、並び
に、２個の隣り合つた、合計サイズ1.45kbのBcl I制限
フラグメントの欠失により得られた。プラスミドphdの
制限サイトおよび機能地図を添付の第14図に示す。プラ
スミドphdは、ヒトプロテインＳの如く、発現させるべ
きDNAを、発現にとつて適正な位置であるプラスミドphd
の単１のBcl I部位に容易に挿入することができるの
で、本発明のBKウイルスエンハンサー−アデノウイルス
後期プロモーターからのDNAの発現を促進する。
ライゲートしたDNAを用いて大腸菌K12GM48を形質転換
し、形質転換された細胞をアンピシリンを含んだＬ−寒
天上にプレートした。アンピシリン耐性大腸菌K12GM48/
phd形質転換体をそのプラスミドDNAの制限酵素分析によ
り同定した。
実施例18 ヒトプロテインＳ発現ベクターの組立て A.プラスミドpS hdの組立て TEバツフアー２μ中のプラスミドphd DNA約２μｇ
を、実質上、実施例17の教示に従つてBcl I制限酵素で
消化した。Bcl I消化プラスミドDNAをエタノール沈殿に
付し、遠心して集め、10×クレノウバツフアー50μお
よび水40μに再懸濁した。このDNA溶液にクレノウ酵
素約５μ（約25単位）を加え、得られた反応混合物を
16℃で30分間インキユベートした。クレノウ反応の後、
反応混合物をアガロースゲルに適用し、ゲルからベクタ
ーフラグメントを単離した。所望のフラグメント約0.5
μｇを得、TEバツフアー10μに懸濁した。
プラスミドpHHS−II a DNA約20μｇを10×FnuD II反
応バツフアー10μ、制限酵素FnuD II 10μ（〜20単
位）および水80μに溶かし、この反応混合物を37℃で
２時間放置した。この反応混合物にNaClを加えて50mMと
し、反応酵素EcoR V 5μ（〜50単位）を加えて調節し
た。得られた反応混合物を37℃で２時間インキユベート
した。EcoR V消化の後、反応混合物を1.0％アガロース
ゲルに適用し、所望の〜2.7kb FnuD II−EcoR V制限フ
ラグメントを単離した。プラグメント約10μｇを得、TE
バツフアー50μに懸濁した。
Bcl I消化プラスミドphd約５μと〜2.7kb FnuD II
−EcoR V制限フラグメント約２μとを、ライゲーシヨ
ン反応混合物にRNAリガーゼ（BRL）〜0.4単位を加える
こと以外は、実質上、前出の各実施例に記載した方法に
従い、ライゲートさせた。ライゲートしたDNAは所望の
プラスミドpShdを構成していた。このプラスミドの制限
サイトおよび機能地図を添付の第１図に示す。
大腸菌K12HB101細胞に形質転換受容能を与え、上で調
製した、ライゲートしたDNAを用いて形質転換した。形
質転換混合物の一部をアンピシリンを含んだＬ−寒天上
にプレートした。制御酵素分析によりアンピシリン耐性
大腸菌K12HB101/pShd形質転換体を同定した。
別法として、プロテインＳの暗号配列のみを含んだフ
ラグメントを単離したい場合には、分子の５′末端から
余分の塩基対を除去し、ATG開始コドンから始まる分子
を生成させることができる。即ち、線状DNA分子を両末
端から攻撃し、予測可能な速度で分子を漸次短かくす
る、BAL31ヌクレアーゼと呼ばれるエキソヌクレアーゼ
で、線状DNAを消化する。pHHS−II a 5μｇを、6mM NaC
l、6mM Tris−HCl、pH＝7.4、６μM MgCl2、および６μ
M2−メルカプトエタノール100μ中でFnuD II 5単位に
より消化する。エタノール沈殿の後、3.5％アクリルア
ミドゲル電気泳動にかけてDNAフラグメントを分離し、
実施例３の記載の如くにして2.7kbフラグメントを単離
する。かくして、BAL31による消化のためのフラグメン
トが調製された。反応条件を次に示す:DNA5μｇを0.5M
NaCl、12.5mM CaCl2、12.5mM MgCl2、20mM Tris−HCl、
pH＝8.0および1mM EDTA、pH＝8.0、50μに溶かす。Ba
l31を１単位加え、30℃で30秒間反応を続ける。エタノ
ール沈殿の後、T4 DNAポリメラーゼで処理してBAL31の
作用によつて残つているかもしれない粘着末端を充填す
る。このDNAを反応バツフアー〔16.6mM（NH4）2SO4、0.
67M Tris−HCl、pH＝8.8、0.67mM MgCl2、1M 2−メルカ
プトエタノール、および6.7μM EDTA〕19μに再懸濁
する。これに、50mM Tris−HCl、pH＝7.5、100mM（N
H4）2SO4、1mg/ml BSAおよび10mM2−メルカプトエタノ
ール中で1/10に希釈したT4 DNAポリメラーゼ１μ（0.
5単位）を加える。この反応混合物を37℃で10分間イン
キユベートした後、各dNTP 2mMを含んだdNTPミツクス１
μを加える。37℃でさらに10分間反応を行つた後、エ
タノール沈殿に付す。このフラグメントはあらゆる平滑
末端ベクターとのライゲーシヨンに用い得る。これらの
条件下で、BAL31は、約25塩基対／分／末端の割合で除
去する。ライゲーシヨンし、大腸菌宿主を形質転換し、
さらに独立のクローンからDNAを単離した後、このDNAを
用いて配列決定を行い、どのクローンが所望の正確な配
列を含有しているかを決定することができる。
また、プラスミドpHHS II aは、その３′末端に、暗
号配列最後のトリプレツトの直ぐ下流にある天然のTAA
終止コドンをも含めて、余分の非暗号化配列を含有して
いる。これらの配列は次の様にして除去される：無傷の
プラスミド５μｇをFnud II 5単位を含んだFnuD II反応
バツフアー100μ中で完全に消化する。DNAをエタノー
ル沈殿に付し、遠心して回収する。ペレツトを乾燥し、
EcoR I 5単位を含んだ１×EcoR Iバツフアー100μに
再懸濁する。37℃で90分間経過した後、再度DNAをエタ
ノール沈殿に付し、3.5％ポリアクリルアミドゲルに適
用する。電気泳動により生産物を分け、実施例３の記載
に従い〜2030塩基対のバンドを抽出する。EcoR I部位は
天然の終止コドンから１塩基だけ離れて位置するのでEc
oR I消化では最初のＧ残基のみが残ることとなり、従つ
て、残りのEcoR I部位の塩基、Ｔ残基および終止コドン
を置き換える必要がある。この目的のために、式： で示されるリンカーを考案した。これは、任意の標準的
な手法で合成し得る。このリンカーは天然の配列と、そ
の位置で確実に停止させるためにリーデイングフレーム
内にある終止コドンを付加的に挿入したものである。さ
らに、このリンカーは、BamH I、Bal IIまたはBcl I末
端と適合し得るCTAG突出を含有している。三片（three
piece）ライゲーシヨン反応において、これらのフラグ
メントはBamH I、Bal IIまたはBcl I末端と共に１個の
平滑末端（ブラントエンド）を有するベクターとライゲ
ートし得る。
B.形質転換 以下に述べる形質転換法は宿主セルラインとして293
細胞に関するものであるが、この方法は大多数の真核性
セルラインに適用可能である。293細胞は、ATCCから寄
託番号CRL1573の下、25mm2フラスコ内に入れた10％熱不
活化ウマ血清を含んだイーグルの最少必須培地中に全面
成長した、単層の約5.5×106細胞として得られた。フラ
スコを37℃でインキユベートし、週に２回培地を変え
た。培地を除き、ハンクの平衡塩類溶液（ギブコ）で洗
浄し、１〜２分間、0.25％トリプシンを加え、新鮮な培
地で洗浄し、吸引し、継代培養比1:5または1:10で細胞
を継代培養した。
形質転換の１日前に、培養皿１枚につき、0.7×106個
の細胞を播いた。形質転換の４時間前に培地を交換し
た。滅菌し、エタノール沈殿させたプラスミドDNAをTE
バツフアーに溶かし、これを用いて、DNA40μg/ml、お
よび250mM CaCl2を含有する２×DNA−CaCl2溶液を調製
した。２×HBSは、280mM NaCl、50mM Hepes、および1.5
mMりん酸ナトリウムを含有させ、pH7.05〜7.15に調節し
て調製された。等容量の滅菌した２×HBSに２×DNA−Ca
Cl2溶液を滴下して加えた。綿栓を付けた1mlの滅菌した
プラスチツク製ピペツトを２×HBSの入つた混合用試験
管に挿入し、DNAの添加期間中、通気して気泡を導入し
た。撹拌せず、室温で30〜45分間おいてりん酸カルシウ
ム−DNA沈殿を形成させた。
次いで、プラスチツクピペツトで静かにピペツテイン
グすることにより沈殿を混合し、沈殿1ml（プレートあ
たり）を、受容細胞を覆つている増殖培地10mlに直接加
えた。37℃で４時間インキユベートした後、10％ウシ胎
児血清を含んだDMEM培地で培地を置き換え、細胞に選択
圧を与えるまでさらに72時間インキユベートした。組換
えヒトプロテインＳを発現する形質転換体のために、増
殖培地中に、タンパク質のγカルボキシル化に必要なコ
フアクターであるビタミンＫを10μg/ml含有させる。
増殖培地にハイグロマイシンを終濃度約200μg/mlに
なるように加える。次いで、細胞を37℃において、３〜
４日おきに培地を交換しながら、２〜４週間インキユベ
ートする。得られたハイグロマイシン耐性コロニーを特
性化のために別々の培養フラスコに移す。293細胞はdhf
r陽性であるため、ヒポキサンチンおよびチミンを欠く
培地中での増殖能力として示されるdhfr陽性表現型のみ
によつてdhfr遺伝子を含有するプラスミドを持つ形質転
換体を選択することはできない。機能的なdhfr遺伝子を
含まないセルラインがdhfr含有プラスミドで形質転換さ
れた場合、dhfr+表現型に基づいて選択され得る。
文献では、遺伝子またはプラスミドをdhfr欠損セルラ
インに導入するための選択マーカーとしてジヒドロ葉酸
還元酵素を用い、続いて、プラスミドのコピー数を増加
するためにメトトレキセートを用いる方法が既に確立さ
れている。dhfr産生細胞における選択可能かつ増殖可能
なマーカーとしてのdhfrの使用はまだ充分に確立されて
いないが、文献中の証拠から、dhfrをdhfr産生細胞にお
ける選択マーカー、並びに遺伝子の増幅のために用い得
ることが示唆されている。本発明の用途は用いられる選
択マーカーによつて限定されることはない。メタロチオ
ナイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、あるい
はＰ−グリコプロテインで代表される多重遺伝子耐性族
のメンバーの如き増幅可能なマーカーを利用することも
できる。
以上、本発明をより明確にし、理解されることを目的
として代表例と実施例によりやや詳細に説明したが、本
明細書の特許請求範囲の範囲内で、ある種の変更または
改良を行い得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpShd（11.5kb）の制限サイトおよび
機能地図、第２図はプラスミドpHHs−II a（7.7kb）の
制限サイトおよび機能地図、第３図はプラスミドpBKE1
（7.9kb）の制限サイトおよび機能地図、第４図はプラ
スミドpBKneo1（11.5kb）の制限サイトおよび機能地
図、第５図はプラスミドpSV2cat（5.015kb）の制限サイ
トおよび機能地図、第６図はプラスミドpLPcat（4.83K
b）の制限サイトおよび機能地図、第７図はプラスミドp
BLcat（6.09Kb）の制限サイトおよび機能地図を示す模
式図、第８図はプラスミドpL133の組み立てを示すフロ
ーチヤート、第９図はプラスミドpLPC（6.5Kb）の制限
サイトおよび機能地図、第10図はプラスミドpLPC4（11.
7Kb）の制限サイトおよび機能地図、第11図はプラスミ
ドpSV2hyg（5.24Kb）の制限サイトおよび機能地図、第1
2図はプラスミドpLPChyg1（8.3Kb）の制限サイトおよび
機能地図、第13図はプラスミドpLPChd1（10.23Kb）の制
限サイトおよび機能地図、第14図はプラスミドphd（8.5
5Kb）の制限サイトおよび機能地図を示す模式図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，18（５) （1979）Ｐ．899−904

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトプロテインＳ前駆体をコードしている
    二本鎖デオキシリボ核酸であって、暗号鎖が式： （式中、Ｒ′は、式： を表わし、Ａはデオキシアデニル、Ｇデオキシグアニ
    ル、はＣデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示される二本鎖デオキシリボ核酸。
  2. 【請求項２】成熟ヒトプロテインＳをコードしている二
    本鎖デオキシリボ核酸であって、暗号鎖が、式： （式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇデオキシグアニル、
    はＣデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示される二本鎖デオキシリボ核酸。
  3. 【請求項３】ヒトプロテインＳ前駆体をコードしている
    二本鎖デオキシリボ核酸であって、暗号鎖が式： （式中、Ｒ′は、式： を表わし、Ａはデオキシアデニル、Ｇデオキシグアニ
    ル、はＣデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示される二本鎖デオキシリボ核酸を含有している組換
    えDNAベクター。
  4. 【請求項４】プラスミドpHHS−II aである第３項に記載
    のDNAベクター。
  5. 【請求項５】ヒトプロテインＳ前駆体をコードしている
    二本鎖デオキシリボ核酸であって、暗号鎖が式： （式中、Ｒ′は、式： を表わし、Ａはデオキシアデニル、Ｇデオキシグアニ
    ル、はＣデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示される二本鎖デオキシリボ核酸を含有している組換
    えDNAベクターで形質転換された大腸菌細胞。
  6. 【請求項６】ヒトプロテインＳ前駆体をコードしている
    二本鎖デオキシリボ核酸であって、暗号鎖が式： （式中、Ｒ′は、式： を表わし、Ａはデオキシアデニル、Ｇデオキシグアニ
    ル、はＣデオキシシチジル、Ｔはチミジルを表わす） で示される二本鎖デオキシリボ核酸を含有している組換
    えDNAベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
  7. 【請求項７】細胞がヒト腎293細胞である第６項記載の
    細胞。
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