JPH0538B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセルラインおよびその抗体の生産への
使用に関する。 適当な親セルラインから細胞融合技術によつて
誘導されるセルラインから単クローン性の抗体の
生産が最近かなりの注目を集めてきた。まず、免
疫を有するマウスまたはラツトからの細胞と融合
させる親セルラインとして一種または数腫のマウ
ス骨髄腫セルラインを用いてハイブリツド骨髄腫
を得、これを増殖させて免疫化に使用された免疫
原に対する抗原を生産する方法がある。この方法
の利点は非精製免疫原を用いて、極めて特異的な
抗体の生産に使用し得る点である。 この方法は免疫法に使用するための重要な新し
い器具を提供するが、入手し得る親セルラインの
性質から生ずる或る種の限界を有している。しか
しながら、1979年、ガルフレ、ミルスタインおよ
びライトらによつてラツト骨髄腫セルラインY3
−Ag1.2.3が報告され（ネイチヤー1979、
277131）、このセルラインは英国特許出願第
8000595（第2039948号として公告された）の主題
であり、この出願と関連して、1979年１月９日に
インスチチユート・パスツール（Institut
Pasteur）におけるC.N.C.M.に寄託された（C.N.
C.M.No.Ｉ−078）。セルラインY3−Ag1.2.3自体は
現存するマウス骨髄腫セルラインと比較してハイ
ブリツド骨髄腫（またはハイブリドーマ
（hybridoma））を生成する単クローン性抗体の生
産における親セルラインとして使用するためのか
なりの利点を有している。本発明者らはY3−
Ag1.2.3の誘導体であつて、この目的にとつてよ
り適当な新しいラツト骨髄腫セルラインを調製し
た。 即ち、本発明はラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20を提供する。 ラツト骨髄腫セルラインはマウス骨髄腫セルラ
インより多くの利点を有する。抗体の生産用ハイ
ブリツド・セルラインのインビボ培養はインビト
ロ組織培養法とし比較して或る種の利益−例えば
培養基と比較して動物血清中ではml当り著るしく
高いレベルの抗体が得られる−がある。インビボ
培養のためのラツトの使用はいくつかの点でマウ
スの使用より優れている。例えば血清および腹水
流体の収率が高く、同腹子（litter）が一般に大
きく、ラツトは抗原刺激に対しマウスよりよく応
答する。さらにラツトは単クローン性異種発生性
抗マウスおよび同種異系抗ラツト抗原の生産に必
要である。しかし親マウス骨髄腫セルラインと免
疫化されたラツトからの細胞の組合せによつて生
産されるハイブリツド・セルはマウスまたはラツ
トいずれにおいても容易に培養されないことがわ
かつた。加えてラツト骨髄腫セルラインは或る種
の異種融合（heterogeneous fusions）、例えばう
さぎ（rabbit）または人（human）の細胞との融
合に利点があることがわかつた。 セルラインYB2／3.0.Ag.20はもとのラツト・
セルラインY3−Ag1.2.3によつて分配される上述
の利点を有するのみならず、かなり有用な別の性
質を有している。Y3−Ag1.2.3は特有のカツパー
型のライト・チエーン（light chain）、コード名
S210、を生成および分泌し、Y3−Ag1.2.3を用い
て生産したハイブリドーマもまた、ほぼ一定不変
にこのライト・チエーンを含んでいることがわか
つた。しかしながらその調製中に使用される免疫
原に関する抗体活性は免疫化動物から誘導され、
通常ＨおよびＬとして指示される免疫グロブリ
ン・チエーンが存在するときしか一般により完全
には発現せず、かつ骨髄腫からの免疫グロブリン
は抗体の結合特性と干渉しかねないのでハイブリ
ドーマ中にそれが存在することは不利である。 ある種のマウス骨髄腫親セルラインの場合にお
いて免疫グロブリンチエーンを発現しない突然変
異体をそこから直接単離することは可能であつた
が、その後の研究にもかかわらず、同様の手がか
りはY3−Ag1.2.3セルラインの場合にも可能であ
ることは知られていなかつた。セルライン
YB2／3.0.Ag.20がやゝ常套でない方法によつて
Y3−Ag1.2.3から得られた。セルラインY3−
Ag1.2.3を用いた融合試験の一つは、セルライン
を生成する数種の抗−C3抗体を生ずる人の補体
C3に感作されたAOラツトの脾臓セルとの融合を
含むものである。その一つであるYB2／3HLは、
Y3−Ag1.2.3から誘導されるハイブリドーマ間で
は一般的ではなく、カツパー・ライトチエーンを
発現する能力を欠いている。一連のクローニング
試験によつて、後に詳述するごとく、YB2／
3HLからセルラインYB2／3.0.Ag.20を選択する
ことが可能なことがわかつた。そこではＨおよび
Ｌチエーンを発現する能力を欠き、それによつて
免疫グロブリン・チエーンを発現しないゼロ・セ
ルラインを与える。 即ち、本発明はさらに免疫グロブリン・チエー
ンを発現しないラツト骨髄腫セルラインを包含す
る。該セルラインはハツイブリツド骨髄腫セルラ
インから調製されるセルラインY3−Ag1.2.3の誘
導体である。 また本発明はセルラインY3−Ag1.2.3から誘導
されるハイブリツド骨髄腫セルラインをクローニ
ングして、それによつて免疫グロブリン・チエー
ンを発現しないY3−Ag1.2.3のラツト骨髄腫セル
ライン誘導体を単離するラツト骨髄腫セルライン
の生産方法を含む。この様なラツト骨髄腫セルラ
インは、一般にヒポキサンチン／アミノプテリ
ン／チミジン（HAT）に敏感であり（リトウル
フイールド、サイエンス、1964、145709）、これ
はこの性質を一般に有さないハイブリドーマから
親細胞の分離を容易にし、この様な感受性はしば
しば８−アザグアニン抵抗性と協合する。セルラ
インYB2／3.0.Ag.20がHAT感受性および８−ア
ザグアニン抵抗性の性質を有することが、これら
の性質を有したことを確かめるための積極的な公
報を用いることなくわかつた。しかしながら、他
の場合ではこれらの性質を有するセルラインを得
るための積極的な工程、例えば８−アザグアニン
含有媒体中でY3−Ag1.2.3の融合からハイブリド
ーマ・セルを増殖させてこの化合物に抵抗性であ
る細胞を選択する工程を採用する必要がある（上
述したごとくHAT感受性はしばしば８−アザグ
アニン抵抗性と協合し、後の性質はより容易に選
択される）。 セルラインYB2／3.0.Ag.20はその製造に使用
される二種類のラツトの標識、即ち、Lou（Y3−
Ag1.2.3骨髄腫）およびAO（人の補体C3感作脾臓
細胞）を有しているが、後者は弱くしか発現され
ないと思われる。この細胞はY3−Ag1.2.3と同じ
一般的形態を有しているが（これもまたその親
210.RCY3.Ag1と同じ一般的形態を有している）
この細胞（およびそれから誘導されるハイブリツ
ド・セルも一般に）Y3−Ag1.2.3セルよりも大き
くかつより丸くなつている。YB2／3.0.Ag.20の
培養容器、特にプラスチツク容器に対する細胞粘
着性はY3−Ag1.2.3で見られるものよりずつと小
さくNSI／1Ag4−１で見られるものに似ている。
セルラインYB2／3.0.Ag.20はY3−Ag1.2.3と似
て、８−アザグアニンに対して抵抗性であり（但
し30μｇ／mlのより高いレベルにおいて）、HAT
（リトルフイールド，サイエンス、1964、145709）
含有培地中で死ぬ。セルラインYB2／3.0.Ag.20
は優れた融合能力を保有し、典型的にはラツトの
脾臓細胞との融合において細胞106当り１の効果
のレベルを与える。さらに軟質寒天（soft agar）
中での細胞のクローン化性（clonability）は良好
であり、確かに、クローンがより密である限り
Y3−Ag1.2.3セルのそれよりも良好であり、それ
によつて一般にYB2／3.0.Ag.20から誘導される
ハイブリドーマをY3−Ag1.2.3からのものより精
製を容易にする。 セルラインYB2／3.0.Ag.20株はセンブリツジ
のメデイカル・リサーチ・カウンスルズ・ラボラ
トリー・オブ・モレキユラー・バイオロジーに保
存されており、そのセルラインは1980年６月25日
にパリのインスチチユート・パスツールのC.N.
C.M.にC.N.C.M.No.I.126の番号で寄託された。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は種々の形態の栄
養培地で増殖できる。即ち、本発明はセルライン
YB2／3.0.Ag.20の細胞をそれ用の栄養培地に含
む細胞培養システムにも及び。この様な細胞培養
システムは常套のインビトロであり、培地は本質
的には合成培地であるが、もちろん血清のごとき
天然源から得られる成分を含んでいてもよい。こ
の様な培地の例は、熱で不活性化した馬の血清ま
たは好ましくは仔牛の胎児血清を例えば10％
（ｖ／ｖ）補給した、ダルベツコ（Dulbeccos）
変性イーグル（Eagle）最小必須培地（例えばジ
ブコ・バイオカルト社；パイスリー、スコツトラ
ンドから入手可能）である。この細胞をこれより
低い血清レベルの使用または血清を含まないアイ
ソコブ（Isocove）変性品（アイソコブおよびメ
ルチヤーズ、ジヤーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メデイシン、1978、147923）の使用に条件
づけしてもよい。抗生物質の補給は培地中に使用
してもよい。この様な培地中で増殖した細胞は短
期間の条件づけで、仔牛の胎児血清を有する
RPMI1640および細胞培養に一般に用いられ、こ
の技術分野の文献に記載されているごとき他の
種々の培地中で増殖させることができる。懸濁培
地中では一般に約24時間の培化時間（doubling
time）が得られ、この様な培地を好適には、細
胞および培地の一部を除去し、これを新鮮な培地
で置き換えることによつて一週間に３回供給す
る。一般に、低血清含量の培地、例えば約５％
（ｖ／ｖ）ないしそれ以下、例えば血清供給量2.5
％を含有する培地中で増殖するよう細胞を条件づ
けることは融合中に曝される条件を容易に受け入
れる丈夫な細胞を調製する点で価値がある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は液体窒素中で良
好な貯蔵安定性および該セルラインの多数の世代
にわたつてインビトロ培養における良好な安定性
を示す。但し、通常のごとくルーチンチエツクを
時々実施すのるが望ましい。融合能力のごとき細
胞のある種の性質は連続培養によつて改良される
得ることが理解されるであろう。確かに、例えば
連続した継代（passage）および／またはクロー
ニングを通して、殆んどの点でYB2／3.0.Ag.20
に実質上類似するが、ある種の変わつた性質を有
する種々のセルラインを得ることを可能にし、融
合に使用するための親セルラインとしての最初の
使用に加えて、セルラインの第二の使用はその様
な変異種の製法にある。この様な変異株は自然発
生的に生じ、インビトロでの継代、しばしばこれ
に続くクローニングまたは特に直接クローニング
することによつて、もとのYB2／3.0.Ag.20のバ
ルクから選定される。このクローニングは例えば
軟質寒天上で行なわれる。しかしながらこの様な
工程はむしろ単調であつて、多数のクローンの研
究を含み、変異株の生産は、後述するごとく変異
株の生産にセルラインの細胞を適応（adaption）
させる条件、特に細胞の継代における使用によ
り、しばしばより好適に達成される。 変異種は都合のよいことにはハイブリドーマの
生産におけるその使用に関連するセルライン
YB2／3.0.Ag.20の一ないしそれ以上の性質にお
ける変化を示す。この様な性質は融合特性および
増殖特性を含み、後者はハイブリドーマの増殖特
性に関係をもつている点で特に興味深い。特に興
味のある変異株はこの様な一種ないしそれ以上の
性質の向上を示すものであり、ある種の特に興味
ある特殊なタイプの変異株については後述する。
従つて、本発明はさらにセルラインYB2／3.0.
Ag.20から誘導される親骨髄腫セルライン、特に
上述の変異株に関するものである。 セルラインYB2／3.0.Ag.20および本発明に従
う他の親セルライン特有の価値は単クローン性抗
体の調製用に使用し得るハイブリツド・セルライ
ンの製造にある。この目的に使用される方法は
種々の親セルライン、即ちYB2／3.0.Ag.20それ
自体のみでなくY3−Ag1.2.3から誘導される免疫
グロブリン鎖を発現しないゼロ・セルラインおよ
びYB2／3.0.Ag.20の変異株に対し広い範囲で類
似しているが、便宜上特にYB2／3.0.Ag.20に言
及して記載する。親セルラインからハイブリツ
ド・セルラインを製造する方法は脾臓、リンパ線
または他のセルラインの細胞で免疫原に感作した
免疫細胞（即ち免疫学的に適応性を有する細胞）
を融合する工程を含む。この感作した免疫細胞は
種々のソースから採取してもよいが、最良の結果
はラツトの細胞を用いて得られ、これが他のホス
ト、即ちマウスや人から得られたものより好まし
いことがわかつた。YB2／3.0.Ag.20セルライン
はLouおよびAOラツトの両方に対して標識を有
しているので、後続のインビボ増殖によるハイブ
リドーマからの抗体の生産を意図しているときは
免疫細胞を生産するために使用するラツトはAO
またはLouラツトのいずれかであるのが好まし
い。本発明に従う他の親セルラインは後述するご
とく広く選択できる。免疫細胞の感作は正常に発
生してよく、自然発生的な免疫化によつて、しか
し好ましくは直接免疫化によつて感作させる。必
要な免疫原を免疫化工程でホスト動物に積極的に
投与する。 セルラインの細胞と適当な免疫細胞の融合は融
合を促進する試薬を含む適当な培地での混合を必
要とする。即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.
Ag.20の細胞と免疫細胞、例えばマウスまたは特
に人、就中、ラツトからの脾臓細胞を該細胞の融
合を促進する試薬を含む栄養培地で融合するシス
テムを含む。この様な培地は好適には合成物であ
つてもよいが、もちろん、所望ならば天然源から
得られる成分を含んでいてもよい。しかしなが
ら、この場合以上のごとき可能性は少ない。この
様な培地の例はイーグルの最小必須培地
（Eagle's minimum essential medium）、そのダ
ルベツコ変性培地（Dulbecco modification）、
RPMI1640および細胞培養に一般に使用され、当
該技術文献に記載された他の種々の培地であり、
細胞の培養には上述したごとく、抗菌性助剤がし
ばしば用いられる。種々の融合試剤を用いてもよ
く、例えばセンダイ・ウイルス（Sendai uirus）
のごときウイルス、ポリエチレングリコール、例
えばPEG1500が好ましい。これらの試薬での細
胞の融合は文献に記載され、本件実施例に説明さ
れているが、ガイダンスとしてはポリエチレング
リコールの約40から約55％（ｖ／ｖ）がしばしば
使用され、その最適濃度は分子量により、例えば
PEG1500では約50％（ｖ／ｖ）である。所望な
らばジメチルスルホキシドをポリエチレングリコ
ールに加えてもよい。ハイブリドーマ単離を好適
にはもとの培地を、親セルラインに対しては毒性
であるがハイブリツド・ラインに対しては一般に
毒性のないHAT培地と置き換えることによつて
補助してもよい。これに続いてクローニングとサ
ブ・クローニングを用い、抗体生産用試験に照ら
して適当なハイブリツドを選ぶ。 上に示したごとく、要求される免疫原に感作さ
れた免疫細胞は別の方法によつて得ることもでき
る。即ち、該細胞は要請される型の自然発生免疫
細胞を選択することによつて、あるいは一連の投
与量で免疫原をフロインド・アジユバンドのごと
きアジユバンド（ここでは適当である）と共に動
物（ここでは人を含む）に投与し次いで脾臓また
は他の免疫細胞を採取することを含む当該既述に
おいて記載された方法によつてうまく得られる。 免疫細胞の自然発生法の採用は人の免疫細胞に
関して特に興味深く、ここでは免疫原の投与はあ
まり魅力的ではなく、患者の感染した病気から自
然に生産された免疫細胞がもつと適当である。自
然の免疫細胞に関し特に興味のある領域は自動抗
体（auto antibody）の生産である。 本発明は蛋白質と糖蛋白、オリゴおよびポリサ
ツカライド、リポサツカライド、パプテンおよび
類似物、例えばペプチド、神経伝達物質およびホ
ルモン類のごとき抗原を含む拡範囲の免疫原に対
して感作された直接または自然に感作された動物
からの免疫細胞に適用できる。表面標識であつ
て、腫瘍性の物質、特に充実性腫瘍（Solid
tumour）から誘導される免疫原はかなり興味深
いが、本発明は細菌性およびウイルス性抗原に対
しおよび原生類および菌類から誘導される免疫原
に適用してもよい。 即ち、本発明は更にラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20または前述した本発明の他の親
セルラインと動物、例えばマウス、特に人、就中
ラツトからの免疫原に感作した脾臓または免疫細
胞間のハイブリツドである細胞を含む。 ハイブリツド・セルは親YB2／3.0.Ag.20細胞
と、および前述のものと同じ一般的な型の培地で
の培養によつて維持してもよい。 本発明のセルラインによる抗体の製法はそれ用
のインビトロまたはインビボ培地いずれかでセル
ラインを培養することによつて行なつてもよい。
即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.Ag.20また
は本発明に従つた他の親セルラインから誘導され
るハイブリツド・セルをインビトロまたはインビ
ボ培地で培養し、その後該培地から抗体を単離す
る工程を含む抗体の生産方法を提供する。 インビトロとインビボの選定は種々の因子によ
る。即ち、インビトロ培養は、抗体が必要とされ
る用途が化学的な性質よりむしろ免疫学的であ
り、かつラツト中でのインビボ増殖からのラツト
免疫グロブリン汚染物の存在が望ましくないとこ
ろで必要とされる。インビトロ増殖はまた免疫細
胞が得られるラツトの素質（strain）は重要でな
いと云う利点を有する（インビボ増殖では重要で
ある）。さらにハイブリドーマ・セルはインビボ
では増殖しない場合がある。しかしながら、イン
ビボ培養はインビトロ培地と比較してml当り著し
く高い抗体のレベルが一般に得られる（血清およ
び／または腹水中）。インビボ培養は好ましくは
ラツト中で行ない、セルラインYB2／3.0.Ag.20
の場合には（これは前述のごとくラツトのAOま
たはLou種からの免疫細胞とうまく融合し、そこ
では得られた抗体生産用ハイブリドーマのインビ
ボ培養が意図されている）ラツトは好ましくは
Lou×AOハイブリツドである（ラツトのAOまた
はLou純潔種においては増殖の容易さが劣る場合
がある）。加えて、放射線照射および／または免
疫抑制剤の使用によつてラツトの不適合種中でハ
イブリドーマの生育を達成することも可能であろ
う。 ラツトの単一種、例えばラインY3−Ag1.2.3の
場合における種Louから親骨髄腫セルラインが誘
導されるときは、ハイブリドーマを生産する親セ
ルラインと融合する免疫細胞を供給するためラツ
トのどの純潔種を使用してもよく、また親セルラ
インと免疫細胞の誘導に相当する株のハイブリツ
ド中でハイブリドーマの易インビボ増殖が起るで
あろうと云う利点がある。従つて前に言及したご
とくセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株の典形
はセルラインがラツトの純潔種、特にAOまたは
Lou（後者の場合、AO標識が失われているかマス
クされたもの）中での増殖に適応（adapt）され
たものである。この方法でセルラインYB2／3.0.
Ag.20を適応するための好ましい方法はラインが
それに適応されるべき種である多数のラツト（例
えば少なくとも５匹、特に約10匹）を通してそれ
を継代することである。この方法ではセルライン
によつて誘発された腫瘍の明らかな退行が生じて
いる一連の二、三の速いラツトに最初にみられる
増殖のモードから、退行なしに容易に増殖する一
連の遅いラツトにみられるモードにセルラインを
適応することが可能である。最後のラツトから単
離された腫瘍細胞を次いで培養し、所望ならばク
ローンし、変異株と融合するための免疫細胞を提
供するために都合よく使用されるラツトの種類の
ある範囲に関して高められた性質を示すべく適応
されるセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株を提
供する。この形の種々の適応されたセルラインを
調製してもよく、好ましい例はYB2／3.0.Ag.20
の融合特性の保持または改良に対して選ばれる。 インビトロの系の場合は用いられる培地は細胞
培養システムに関連して上記したものと同じであ
つてもよいが、血清レベルはできるだけ低く、例
えば５％（ｖ／ｖ）ないしそれ以下、好ましくは
約2.5％（ｖ／ｖ）より多くなく、好適には0.5％
（ｖ／ｖ）程度であるのが好ましい。アイソコブ
血清（Isocove）−微変性を使用してもよい。この
細胞は都合のよいことには対数相を越えてうまく
増殖させることができ、これによつて最終生存度
を犠牲にして最大最終濃度を達成できる。細胞の
定常相（stationary phase）における短期間の生
育は、抗体の最終収量を改良するので好ましい。
抗体生産の適当な組織培養法の例は紡すい状容器
（spinner container）中での塊状増殖（massive
grawth）および当該技術分野においてよく知ら
れた大量培養法である。インビボ法は好ましくは
ラツトに接種して充実または腹水腫瘍を生産する
方法を含む。接種に先立つてラツトを免疫抑制す
るかおよび／または腹水の分泌をうながすプリス
タン（Pristane）のごとき薬剤で処理してもよ
い。腫瘍を適当な期間増殖させた後、動物を殺
し、抗体単離のために腹水および／または血清を
集め、腹水腫瘍の場合はその期間後生きた動物か
ら腹水を集めてもよい。即ち腹水腫瘍はより多量
の液を生産する能力を有するが、この技術の価値
は腹水および／または血清中に存在する抗体の濃
度にある。インビトロまたはインビボ法いずれか
からの抗体の単離は、沈澱、透析、免疫−吸着剤
（immunoabsorbent）の使用を含むクロマトグラ
フイー、および膜濾過を含む当該技術において記
載された方法によつてうまく達成できる。 即ち、本発明は動物、特にラツトに本発明に従
うYB2／3.0.Ag.20または他の親セルラインから
誘導されるハイブリツド・セルを接種し、充実性
または腹水腫瘍をラツト中に増殖させ、次いでラ
ツトの血清および／または腹水から抗体を単離す
る工程を含む単クローン性抗体の生産法を含む。 本発明は本発明に従うセルラインYB2／3.0.
Ag.20または他の親セルラインから誘導されるハ
イブリツド・セルを用いて調整される抗体にも及
ぶ。この様に抗体は治療および特に診断、および
親和クロマトグラフイー（affinity
chromatography）等の種々の用途を有する。生
産される単クローン性抗体の一例は人の細胞の亜
個体群（sub−population）を認知する種々の人
原発生腫瘍細胞に対する抗体であり、これは血液
学的診断に有用である。他の形の用途として自然
に発生する物質、例えばこの物質の精製用蛋白質
に対する抗体の使用が例示される。 本発明を以下の実施例で説明する。 実施例 １ ハイブリツド・セルラインYB2／3HLからの
セルラインYB2／3.0.Ag.20の調整 セルラインY3−Ag1.2.3から誘導されるハイブ
リツド・セルラインYB2／3HLの細胞をダルベ
ツコ変性イーグルス培地にもとづく培地（これは
DMMと同じであり、DMMはダルベツコ変性イ
ーグルス培地にある種の添加物を加えた市販調整
品であり、以下の成分を含む： 500mlダルベツコMEM（4500mgグルコース／
を含みピルビン酸Naは含まない）−ジブコ−バイ
オカルト・カタログNo.320−1965， ５mlピルビン酸Na MEM（100mM）−ジブコ・
カタログNo.320−1360 10mlペニシリン／ストレプトマイシン（5000単
位ペニシリン／500mcgストレプトマイシン／ml） 培地はNaHCO3含量3700mg／、pH7.2〜7.5
である）に牛の胎児血清［FCS；異なつたバツチ
から選ぶ（セラーラブ・カタログNo.5−000−
1a）10％（ｖ／ｖ）を補給した培地から得、本
質的にコツトンらによりヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジー、1973、3136に記載され
たごとき軟質寒天中でクローンした。総計116の
ランダム・クローンを培養し、この培養上澄液
を、塩化クロムと結合した羊の赤血球（SRBC）
の羊中に生じた抗ラツトｇに対する間接凝集に
より、ラツトｇの生産に対してスクリーンする
（ケーラーら、ヨーロピアン、ジヤーナル・オ
ブ・イムノロジー、1976，６，292）。各ケースに
おいて、上澄液をSRBCと混合し、10分間静置
後、遊離抗ラツトｇを加えると上澄液中にラツ
トｇの存在するものは凝集する。116クローン
からラツト免疫グロブリン生産に関し陰性である
かごく弱い陽性を示す３クローンが選択され、こ
れらの３クローンはP1.F11、P2.G11およびP.
H12として同定される。この３個のクローンによ
る細胞外および細胞内［14Ｃ］−リジン取込みを、
通常のリジン含量の培地を［14Ｃ］−リジンで置
き替えたDMM−５％FCS（使用されるFCSは透
析されたもの）中でインキユベートすることによ
り研究した。上澄液をケーラーおよびミルスタイ
ンのヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・イムノロ
ジー、1976、６、511に記載されているごとく、
総減数（total reduction）後、ドデシルサルフ
エートNa塩／ポリアクリルアミド電気泳動
（SDS−PAGE）を用いて分析した。 得られた結果を表に示す。 【表】 この３個のクローンを更に研究するため、フル
オレツセン・イソチオシアネートラビツト抗ラツ
トｇ（ブラツドストツクらジヤーナル・オブ・
ナシヨナル・カンサー・インスチチユート、65、
No.7，81）を用いる内部細胞蛍光顕微鏡法によ
りスクリーンし、ゼロ・セルラインの単離に対し
最も有望なものとしてクローンP2.G11が現われ、
これは40％の強い陽性に対しほぼ60％の陰性の個
体数を示した。 従つてクローンYB2／3HL P2.G11を軟質寒天
でクローンし、得られた43クローンを内部細胞蛍
光顕微鏡法でスクリーンし、22の明らかな陰性体
が９の明らかな陽性体および12の明瞭でないクロ
ーンまたは混合クローンと共に見出された。内部
細胞蛍光顕微鏡法によるスクリーニングにおいて
陰性であるこの22個のクローンをさらにスクリー
ンし、継続するSDS−PAGE分析によつて、クロ
ーンYB2／3HL P2.G11.16（０）が内部細胞［14
Ｃ］−リジン取込み上にチエーンを有さないもの
として選択された。これらの細胞は30μｇ／mlの
８−アザグアニンに対し抵抗性であることは既に
見出されているので、この細胞を８−アザグアニ
ンに対し適応させる必要はない。これらの細胞、
即ちYB2／3HL.P2.G11.16（０）Agを８−アザグ
アニン30μｇ／mlの存在下に軟質寒天中でクロー
ンし、このクローンをクローンが密に増殖した基
体上で選定する。さらにクローンYB2／3HL・
P2.G11.16（０）Ag.20をその増殖速度の速さの観
点で選定し、試料をHAT感受性に対して試験し
た。 即ちYB2／3HL.P2.G11.16（０）細胞はハイブ
リドーマを生産する単クローン性抗体に導く融合
において親骨髄腫細胞として使用し、セルライン
YB2／3.0.Ag.20を構成するのに適した性質を示
す。この細胞を観点から採取し、20％（ｖ／ｖ）
FCS含有DMM培地を加えたリンブロ・プレート
（Linbro plate）の２mlの穴に入れた。この細胞
を増殖し、徐々により大きな容器で増殖し、かつ
培養器に供給する代替培地の血清レベルを減少さ
せる通常の方法によつて低い血清レベルに条件づ
けした（培養は37℃、C0210％（ｖ／ｖ）／空気
90％（ｖ／ｖ），雰囲気下）。この方法で、細胞は
［2.5％（ｖ／ｖ）FCS／2.5％（ｖ／ｖ）熱で不活
性化した馬の血清］、次いで［５％（ｖ／ｖ）
FCS］および最後に［2.5％（ｖ／ｖ）FCS］中
で増殖するよう条件づけられ、最終的に１紡錘
状フラスコ中、37℃、10％（ｖ／ｖ）CO2／90％
（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下および95％湿度で培養
した。 セルラインの凍結試料（カルチユアー・コレク
シヨンに寄託したものを含めて）を５×105／ml
の細胞数を越えない段階で指数的に増殖する細胞
から調製した。１×107より多い細胞を含む培地
を７分間で600ｇの割合で遠心分離した。細胞ペ
レツトを４℃に冷却し、これを90％（ｖ／ｖ）
FCS−10％ジメチルスルホキシドに懸濁して濃度
５％106（細胞）／mlにした。この懸濁液１ml（４
℃）をアンプルに入れ、シールして、４℃から１
℃／時間の割合で冷却して凍結した。細胞が−50
℃に達したとき液体窒素中に浸漬した。この様な
凍結アンプルから細胞を再生するにはアンプルの
内容物を急速に４℃にし、次いで迅速に冷（４
℃）DMM−10％（ｖ／ｖ）FCSで20mlの容積ま
で稀釈した。次いで細胞を７分間で600ｇの割合
で遠心し、２ml培地中に各１／２、１／４、１／
８、１／16および１／32ペレツト化細胞を含むよ
う再懸濁した。その後、培地を37℃、10％（ｖ／
ｖ）CO2／90％（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下で増殖
させ、さらに凍結前の細胞に対して記載したのと
同様に増殖させる。新しい凍結株を調製するため
には解凍後最少１週間、最大３週間の間に得られ
た培養物を増殖する必要がある。その間に細胞は
24時間の培化時間で指数的に増殖する。 ハイブリツド・セルラインYB2／3HL源 YB2／3HLセルを以下のごとく調製した。イ
ヌリン（ブリテイシユ・ドラツグ・ハウシズ）の
りん酸塩バツフア・ザリーン（100mg／ml）懸濁
液を１分間超音波処理し、次いで懸濁液0.5mlを
正常な人の血清（エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，N′−テトラ酢酸
（EGTA）10mMおよびMgCl2でMg7mMにした
もの）10mlで37℃で15分間処理し、イヌリンに対
するC3の固定および補体経路（complement
pathway）のいずれかを活性化させる。懸濁液を
生理食塩水、2MNaClおよび再び生理食塩水で遠
心分離して正常し、生理食塩水で原容量１mlとす
る。 ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ペニシ
リン500単位−ストレプトマイシン500mcｇ／ml）
250μ、正常なラツトの血清50μをフロインド
完全アジユバンド（CFA）約１ml中に加えた液
で抗原補体１mlを乳化して最終容量2.4mlとした。
この調製品0.1mlを２匹のAOラツトそれぞれに各
４箇所（合計ラツト１匹に0.4ml）筋肉注射した。
３週間後、各ラツトにCFAを含まないがビー・
ペルツシス５×109を含む類似の抗原調製物0.5ml
を骨膜内（intraperistoneal）注射する。４週間
後、いかなる形態のアジユバンドも有さない抗原
調製品0.5mlを静脈注射し次の月の間にさらに５
回類似の静脈注射を行なつた。 最後に静脈注射３日後にラツトを殺した。各ラ
ツトにつき、滅菌条件下で脾臓を除去し、補給血
清を含まない新しく調製したDMM培地５mlを入
れた氷冷した小さなペトリ皿に置いた。脾臓を切
つた後、前述の血清を含まないDMM培地４mlを
含む10mlプラスチツク製丸底チユーブに移し、う
まく適合しない（２mmのクリアランス）テフロン
製乳棒で潰した。得られた混合物を１分間氷の上
に放置し、上層3.5mlをプラスチツク製の普通の
チユーブに移した。潰した脾臓の残りをDMM5
mlで洗い、混合物を１分間立てて、大部分の破片
を沈殿させた。上澄液を破片から傾瀉し、チユー
ブ中の細胞に加えた。このチユーブをDMMで満
たし、ベンチ遠心機を用い600rpmで７分間回転
した。次いで上澄液を傾瀉し、細胞をDMM中に
再分散した。細胞108を含むこの懸濁液の１アリ
コートをケンブリツジにあるアム・アール・シー
ズ・ラボラトリー・オブ・モレキユーラ・バイオ
ロジーに保存されている株から得られる洗浄した
Y3−Ag1.2.3細胞107と50ml円錐遠心管中で混合
した。次いでDMM培地を細胞混合物に加え全体
を遠心分離した。 液を切つた細胞ペレツトを含むチユーブを37℃
に水浴中に置き軽くたたいた。ポリエチレングリ
コール（PEG）1500のDMM50％（ｗ／ｖ）溶液
0.8mlを37℃において、１分間かけて該細胞中に
加え、ピペツトを用いてゆるくかき混ぜた。ゆる
やかな攪拌をさらに１分間続け、DMM培地２ml
を２分間にわたつて加え、次いで３分間かけて
DMM9mlを加え、さらにDMM10mlを滴下した。
この細胞を回転し、次いで別のバツチ（セルーラ
ボ カタログNo.５−000−1a）からの牛の胎児血
清（FCS）20％（ｖ／ｖ）を補給しておいた予備
加温（37℃）DMM培地に初めはその２、３滴中
に次いでその25mlにゆつくりと再懸濁させた。容
積を予め加温した同じ培地で50mlにした（この段
階および以下のインキユベーシヨン中に使用され
たFCSを56℃で30分間熱不活性化処理した）。 二匹のラツトから得られた細胞含有培地をリン
ブロ・プレートの２mlの穴96個に分配し、同じ培
地１ml中に約１×105個の洗浄脾臓細胞を含む液
を各穴にフイーダー（feeder）として加え、全体
を37℃でインキユベイトした。次の日、培地２ml
のうち１mlを各穴から除き、20％FCSおよび
HAT（リトルフイールド、サイエンス、9764、
145，709）を含むDMM培地１mlで置換する。イ
ンキユベイシヨンを37℃で２週間続け、その培地
の半分を最初の置換後２日目およびその後は２〜
３日間隔を置てHAT培地で同様に置換した。 ２週間後に80個の穴に活性な増殖が観察され、
この増殖はハイブリツド骨髄腫の存在を示した。
80個の培養基それぞれの使用済みの培地を以下の
ごとき間接的な結合アツセイにより抗体生産用に
試験した。複合体をラツクマンおよびホバート、
1978、コンプリメント・テクノロジー、ザ・ハン
ドブツク・オブ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー、著者デイー・エム・ワイヤー（ブラツクウ
エル・サイエンテイフイツク・パプリケイシヨ
ン）の方法に本質的に従つて、37℃で酵母処理し
た人の血清（R3）でエリスロサイト（EA）を有
する羊の抗体を処理し次いで洗浄することによつ
て製造する。複合体（EACと云う）のこの中間
物はC3b，C3biおよびある種のC3dをその表面に
有するが、C5は有さないか或はその上の後の成
分はR3として“非反応”（mom−reactor）血清
から得られた。EAとEACの両者は各穴からの使
用済培地の稀釈液で処理し、洗浄し、［125Ｉ］ラ
ベル化抗ラツト免疫グロブリン抗体とインキユベ
ートした。さらに洗浄した後細胞の放射能を測定
した。この間接結合アツセイで測定したときこの
80培養基のうちわずか３列が明瞭な抗体生産活性
を示し、２匹のラツトの１匹から誘導されたこれ
らの培養基の一つがハイブリツド骨髄腫YB2／
39を含んでいた。 ハイブリツド骨髄腫YB2／39を上記コツトン
らの文献に記載されたのと本質的に同じ方法を用
いて軟質寒天中でクローンした。クローニングを
数種の細胞濃度において実施し、クローンを最低
クローン濃度から選んだ。この最初のクローニン
グ段階でのクローニング効果は約10％であつたが
最初に単離された活性クローンの率は100％
（21／21）であつた。クローン39−11を選択し、
軟質寒天中でクローンして、４／４陽性クローン
を得、そこからクローン39−11−１−７を選び、
軟質寒天中でクローンしてセルラインYB2／
3HLを構成するクローン39−11−１−７を得た。
この細胞を低いクローン／プレート数（≪100）
を含む寒天プレートから採取した。クローン当り
の細胞の数は約100であつた。FCS20％（ｖ／ｖ）
含有DMM1mlを加えたリンブロ・プレートの２
mlの穴に細胞を移した。次いで細胞を20％（ｖ／
ｖ）FCS含有DMM中で増殖し、培養基を補給す
るために用いる培地の血清濃度を10％（ｖ／ｖ）
に薄めた。より大きい培養基を種々の大きさの平
底組織培養容器に移すことにより作り、空気中に
10％（ｖ／ｖ）CO2を含む雰囲気を封ずるため、
容器を気密にシールし、細胞を37℃、懸濁培養基
として、通常の方法で増殖した。 実施例 ２ セルラインYB2／3.0.Ag.20とイースト・チユ
ーブリン（yeast tubulin）で高度免疫化された
ラツトからの脾臓細胞との融合によるハイブリド
ーマの製造： ラツトのLou株を次のスケジユールに従つて免
疫化した： 第１日目：フロインド完全アジユバンド中の
20μｇイースト・チユーブリンを腹膜内（i.p.）注
射する、 第22日目：フロインド不完全アジユバンド中の
20μｇイースト・チユーブリンを腹膜内注射す
る、 第53日目：22日目と同じ、 第85日目：イースト・チユーブリン20μｇを静
脈内（i.v.）する。 89日目にラツトを殺し、その脾臓を滅菌条件下
に除き、２％（ｖ／ｖ）FCS血清補剤を含む
DMM培地を用いて融合を行ない、最終品を満た
して600r.p.mで７分間まわし、血清補剤を含まな
いDMNで再懸濁した。108個の細胞を含む再懸
濁脾臓細胞の１アリコートを同じ培地中でセルラ
インYB2／3.0.Ag.20の６×107個の細胞と混合し
た。この混合物を50mlプラスチツク製円錘チユー
ブ中で600ｇで７分間遠心にかけ、次いで上澄液
を除去し、細胞ペレツトをチユーブの底をゆるく
かき混ぜて粉砕した。さらに操作を約37℃で行な
つた。DMM培地（PH7.6−7.8：フエノール・レ
ツドで指示）中にポリエチレングリコール
（PEG）1500（新たに調製し暗所に保存）50％を
含む液１mlを用いて、この液を１分間かけて加え
ながら、細胞をゆつくりと懸濁させた。この懸濁
液を37℃で１分間保持し、DMM培地１mlをさら
に１分間かけて加えた。DMM培地を更に20ml、
５分間かけて加え、この細胞を遠心分離しFCS20
％（ｖ／ｖ）含有DMM培地中にゆるやかに再懸
濁し、総容積25mlとした。 この懸濁液を２ml穴48個を有するリンブロ
BCL−5041トレイ中に0.5ml中に以下のごとく分
配した。もとの容積25mlのうち18mlを36個の穴に
分配し、残りの７mlを14mlに稀釈した（この、お
よび後の稀釈を20％（ｖ／ｖ）FCS含有DMM培
地で行なつた）。14mlのうち６mlを12の穴に分配
し、残りの８mlを16mlに稀釈した。16mlのうち６
mlを12の穴に分配し、残りの10mlを20mlに稀釈し
た。20mlのうち18mlを36の穴に分配し残り２mlを
捨てた。96の穴それぞれを、20％（ｖ／ｖ）FCS
含有DMMで容積２mlにした。この細胞を培養
し、24時間後に培地の1/2を20％（ｖ／ｖ）FCS
およびHAT（リトルフイールド、サイエンス、
1964145709）含有DMM培地で置き換える。この
操作を２日後およびその後２日毎に繰り返した。 15〜20日後に穴中で激しい増殖がみられ、これ
はハイブリツド・クローンの成功を示す。合計52
の穴がハイブリツド増殖を示した（稀釈が増す順
に36／36，６／12，３／12及び９／36）。 ２の段階でもとのおよび非稀釈の培養基の分析
を行ない、高率の36の増殖培養基をSDS−PAGE
によつて分析した（技術上の理由から全ての培養
基の分析はできなかつた。分析した28培養基の培
養基当りのハイブリツド・クローンの平均数は１
であり、ハイブリツドの90％はIgヘビー・チエー
ンを分泌（secrete）していた。（詳細な分析は、
ヘビー・チエーンなし；３，μヘビー・チエーン
のみ；24，δヘビー・チエーンのみ；１，μおよ
びδヘビー・チエーン；０であつた）。 各ハイブリツド培養基の使用済み培地は以下の
方法うを用いて結合アツセイにも試験される（イ
エンセンおよびウイリアムス、ヨーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・イムノロジー、1974、４，91）。
イースト・チユーブリン溶液（50μｇ／ml）25μ
をステリリン平底96穴微量滴定プレートの穴に
入れ４℃で一晩保持した。イースト・チユーブリ
ンを除去し、各穴にPH7.2の0.1Mヘペス
（Hepes）、0.15MNaCl，0.8％（ｖ／ｖ）ボビン
血清アルブミンおよび0.1％（ｗ／ｖ）ナトリウ
ムアジドを含むPH7.5の0.5Mりん酸カリウム塩バ
ツフアー100μを加え、次いでこのプレートを
室温で１時間放置した。穴を同じバツフアー溶液
（２倍）100μで洗浄し、使用済み培地25μを
加えプレートを４℃で１時間維持した。穴をさら
にりん酸塩バツフアー・ザリーン（３倍）、次い
で2NNaOH水溶液100mlで洗浄した。放射能レベ
ルをカウントし、［125Ｉ］−活性度が陽性反応を
示す穴を取りあげた。この試験で52の穴のうち６
個が陽性を示した。 この６個の陽性培養基のうち４個のYOL1／
５，YOL1／19，YOL1／34およびYOL1／38
（YOL1／34はチユーブリンに対し特に高い親和
性を有する）と命名し、これらを上記コツトンら
によつて記載されたのと本質的に同じ方法を用い
て軟質寒天上でクローンした。各ケースにおいて
得られた１またはそれ以上のクローンを再び軟質
寒天上でクローンした。このクローンを第１およ
び第２クローニング後、予め使用されたものに類
似のアツセイによつてイースト・チユーブリン・
バインデイングを測定した。結果は以下の通りで
ある。 【表】 【表】 培養基YOL1／34の場合1δ3個の陽性クローン
の一種（YOL1／34，10）を再びクローンし、12
個の陽性のクローン（YOL1／34.10.1から
YOL1／34.10.12）を得た。陽性の抗体生産に関
する培養基の最初の不安定性は、第１のクローニ
ングの結果で示したごとく、第２のクローニング
で克服されたことがわかる。クローンYOL1／
34.10.1からYOL1／34.10.12の全てはもとの培養
基と同様、チユーブリンに対し非常に高い結果親
和性を有する抗体を生産した。 注記： 同じ脾臓細胞を用いた正確な比較試験において
は親ラツト骨髄腫セルラインY3−Ag1.2.3はハイ
ブリツド増殖に対し陽であるより高いレベルの穴
を与えるのみでなく、直接血球凝集アツセイで陽
性である同じ数の穴を与え、これによつて
YB2／3.0.Ag.20に対しより高い効果を予測させ
る。 実施例３：セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒト
の脾臓細胞との融合によるハイブリ
ドーマの製造 正常なヒトの脾臓細胞を実施例２に記載のよう
にして融合用に調製し、血清補液（supplement）
が存在しないDMM培地内の脾臓細胞108個のア
リクオートを同一の培地内のセルラインYB2／
3.0.Ag.20の細胞６×107個と混合した。次いでこ
の細胞混合物を実施例２に記載の手順によつて処
理してその融合をおこない、実施例２に記載のよ
うに類似の20％ｖ／vFCS含有DMM内細胞懸濁
液25mlを得た。 この懸濁液をLinbroBCL−5041トレイの48個
のくぼみの中へ0.5mlずつ分配し、各くぼみ内の
液は20％ｖ／vFCS含有DMM培地を用いて２ml
に埋合せた。次いで細胞を培養し、24時間後に培
地の半分を20％ｖ／vFCSおよびHAT｛リトルフ
イールド・サイエンス（Littlefield science）、第
145巻、第709頁（1964年）｝を含有するDMM培
地で置き換えた。この操作をその後２日おきにお
こなつた。 15〜20日後にくぼみ内では活発な増殖がみら
れ、好結果のハイブリツド・クローンが示され48
個のすべてのくぼみにおいてハイブリツド増殖が
示されることが認められた。各ハイブリツド培養
に使用された培地はシープの赤血球凝集反応の抑
制に依存する方法において試験した。使用された
細胞はヒトのガンマグロブリンを用いて被覆し、
単クローン性抗ヒユーマンカツプIgおよび単クロ
ーン性抗ヒユーマンガンマIgを用いる凝集反応に
対して試験した。遊離のヒユーマンIgの存在は抗
体との結合を妨げ、このような妨害は48個のすべ
ての培養について発生し、このことはこれらがヒ
ユーマンIgに対して陽性であることを示すもので
ある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの脾臓細胞
を用いる融合方法は成功したが、この特別な方法
によつて得られたハイブリドーマは約２週間後に
は抗体産生能を失なつた。 実施例４：セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒト
の末梢血液リンパ細胞との融合によ
るハイブリドーマの生産 (A) Rh因子陽性（rhesus positive）細胞投与に
よつてさらに感作された生まれつきRh因子陰
性（抗−Ｄ陽性）患者からのヒトの末梢血液リ
ンパ細胞によつて正常なヒトの脾臓細胞を置き
かえる以外は実施例３の手順に従つた。
LinbroBCL−5041トレイを用いて全体で96個
の培養をおこなつたところ、このうちの34個は
ハイブリツド・クローンの存在を示す活発な増
殖を呈した。34個のハイブリツドのいずれも抗
−Ｄ陽性ではなかつたが、実施例３に記載の試
験におけるヒユーマンカツパIgに対して陽性の
ものが１つ認められた。 抗−ヒユーマンカツパIgを生産するハイブリ
ドーマを、初期濃度20％（ｖ／ｖ）から最終濃
度2.5％（ｖ／ｖ）まで減少するレベルでFCS
を含有するDMM培地内で２カ月間培養し、次
いで実施例１に記載の手順により軟アガール内
でクローンした。得られた20個のクローンのう
ち、18個のヒユーマンカツパIgに対して陽性
で、これらのクローンは８−アザグアニンに適
応させると（生産されたクローンはHATにも
感作性がある）18個のうちの12個は陽性を保持
した。これらの12個のうちの１つを、初期濃度
20％（ｖ／ｖ）から最終濃度2.5％（ｖ／ｖ）
まで減少するレベルでFCSを含有するDMM培
地内でのスピナー培養において６カ月間保持し
ても陽性が保たれた。 (B) 上記手順の変形法においては融合に先だち、
イムノグロブリン生産を高める物質であるアメ
リカやまごぼうミトゲン（poke weed
mitogen）を用いて末梢血液リンパ細胞を刺激
した。(A)において用いられたリンパ細胞の同一
試料のフラクシヨンに適用されたこの手順によ
つて全体で37個のハイブリツドを生産したとこ
ろ、このうちの23個が蛋白質Ａで被覆されたシ
ープ赤血球の使用に基づくブロードスペクトル
試験におけるヒユーマンIgに対して陽性であつ
た。これらの細胞はラビツト抗−ヒユーマン
Ig、次いで培養培地上澄みを用いて培養し、続
いてヒユーマンIgが該上澄みによつて系内へ導
入されたなら赤血球を溶解させるモルモツト補
体を用いて処理した。しかしながら37個のうち
23個が陽性となつたが、これらのハイブリドー
マのいずれも１カ月以上にわたつてその抗体生
産能を維持しなかつた。 実施例５：酵母チユーブリンに対する単クロー
ン性抗体の生体内生産 実施例２に記載のようにして生産された
YOL1／34.10.1セルをF1ハイブリツド（lou×
AO）ラツト内で腫瘍として増殖させた。この手
順は最初は一匹のラツトを用いるが、次いでこの
ラツトから得られた腫瘍を他のラツトに移植さ
せ、そこから得られた腫瘍をさらに２回移植させ
て、全体で４世代のラツトを使用した。 全体で４世代を結びつけたラツトをそれぞれ17
匹、19匹および９匹使用する３つの別々の実験に
おいては、細胞（５×107）を皮下注射によつて
投与した。各ラツトにおいては約10日後に注射し
た部分に充実性の腫瘍がみられ、ラツトが苦痛の
徴候を示しはじめたら全身麻酔した後、動脈から
全身出血させることによつて殺した（上述のよう
にある場合には腫瘍細胞の一部は次の世代のラツ
トへの移植用に使用した）。補集された血液は37
℃で30分間凝固させ、血清は遠心分離によつて澄
ませた。３つの実験において補集された血液量は
17匹のラツトからは135ml、19匹のラツトから169
ml、９匹のラツトからは100mlであつた（血清の
収量はこれらの量の約2/3であつた）。 第４の実験においては全体で４世代を結びつけ
た11匹のラツトを用いて腫瘍は腹水腫瘍として増
殖させた。細胞（５×107）は腹腔内注射によつ
て投与し、次いで約２週間以前にプリスタン0.5
mlを腹腔内注射し、殺して腹腔内を切り開いて抗
体源として血液と含水液を補集した。補集された
血液と腹水液の全収量は271mlであつた。 ラツト１匹あたりの抗体含有液体の収量は腹腔
内に注射された腹水腫瘍ラツトに対しては高い
が、抗体力価はこれらの動物からの液体において
は一般に低く、典型的な力価は皮下注射された充
実性腫瘍ラツトに対しては５×105〜106である
が、腹水腫瘍ラツトによる力価のほんのわずかの
もののみがこれと同じぐらいの高い値を示すにす
ぎなかつた。充実性腫瘍ラツトに対するIgG含量
は典型的には10〜15mg／mlであるが、腹水腫瘍ラ
ツトに対してはしばしば８mg／ml以下となつた。 得られた血清または血清腹水液は当該技術分野
で既知の手段例えば実施例６に記載の方法を用い
ることによつてそれらの使用目的に適した程度に
までさらに精製してもよい。 実施例６：単クローン性抗体の生体外生産 ハイブリドーマセル、例えば実施例２で生産さ
れたものを最小量の血清（0.5％ｖ／ｖ）の存在
下で増殖させた。これらの細胞は、胎児性子牛血
清0.5％（ｖ／ｖ）で補充されたDMM培地を含
む５スピナーフラスコ内においてCO210％、空
気90％の雰囲気下で増殖させた。細胞は、懸濁液
が典型的には１mlあたり抗体10〜50μｇ含有す る定常相(1)に達するまで増殖する。 抗体調製品を精製するには硫酸アンモニウムを
懸濁に添加して50％飽和溶液とし、得られた沈殿
を補集する。沈殿を最小容量の燐酸塩バツフアー
サーリンに溶解させ、この溶液を同一媒体に対す
る透析に付して精製された抗体調整品を得る。 (1) 第２の変形法では細胞を最小の血清濃度を用
いて対数相（logarithmic phase）で増殖さ
せ、次いで血清を含まないがイスコブ
（Iscove）によつて推奨されているような増殖
添加剤を含有する媒体で直接希釈する。 (2) 第３の変形法では精製手順をDEAEクロマト
グラフイーまたは免疫吸着剤、例えば抗−ラツ
トイムノグロブリンを用いて続けるか、膜フイ
ルターの使用でこの手順を置きかえる。 実施例７：セルラインYB2／3.0.Ag.20の適応
生産 標準的なサーリン中のYB2／3.0.Ag.20セル108
〜109個を皮下注射によつてラウラツト（Lou
rat）に投与したところ注射した場所に充実性腫
瘍が徐々に発現した。腫瘍退化の第１の徴候がみ
られた時点でラツトを殺して腫瘍を剔出した。腫
瘍を粉砕し、標準サーリン中の腫瘍細胞108〜109
個を皮下注射によつて第２のラウラツトに投与し
た。全体で10匹のラウラツト内において細胞が増
殖するまでこの手順をくり返した。腫瘍退化の徴
候が最初の数匹において検出されたが、このよう
な徴候はセルラインがラウラツト内での増殖によ
りよく適応するようになるとその後のラツトでは
みられなかつた。これらのその後のラツトは苦痛
の徴候を示しはじめたら殺した。腫瘍の増殖が
徐々に容易になることは、最初の数匹の後の各ラ
ツト内における増殖期間が短くなることによつて
示される。10匹のラツトに注射をおこなつた日付
は次の通りである：９月９日、10月16日、10月28
日、11月12日、11月20日、11月28日、12月６日、
12月15日、12月22日および12月31日。 10匹のラツトからの腫瘍細胞は10％（ｖ／ｖ）
FCS含有DMM内へ入れ、プランジヤーを用いて
微細なナイロン網を押し通すことによつて粉砕し
て細胞懸濁液を得た。この懸濁液を種々の希釈度
で20％ｖ／vFCS含有DMM内に分配させ、培地
内のFCS濃度が徐々に減少するLinbroプレート
内でくり返して二次培養した。 ３週間後、2.5％（ｖ／ｖ）FCS含有DMM内で
の二次培養増殖物（YBO）を得た。このセルラ
インをYB2／3.0.Ag.20自体に関する実施例１に
記載の手順と同様にしてDMM／2.5％（ｖ／ｖ）
FCS内でのスピナー培養に付した。セルライン
YBOの特性は実質上はYB2／3.0.Ag.20の特性と
同様であるが、ハイブリツドLou×AOラツトに
おけると同様に純粋なLouにおける増殖にも容易
に適応し、AOマーカーはこのセルラインにおい
ては明らかに失われているか、完全に抑制されて
いる。
使用に関する。 適当な親セルラインから細胞融合技術によつて
誘導されるセルラインから単クローン性の抗体の
生産が最近かなりの注目を集めてきた。まず、免
疫を有するマウスまたはラツトからの細胞と融合
させる親セルラインとして一種または数腫のマウ
ス骨髄腫セルラインを用いてハイブリツド骨髄腫
を得、これを増殖させて免疫化に使用された免疫
原に対する抗原を生産する方法がある。この方法
の利点は非精製免疫原を用いて、極めて特異的な
抗体の生産に使用し得る点である。 この方法は免疫法に使用するための重要な新し
い器具を提供するが、入手し得る親セルラインの
性質から生ずる或る種の限界を有している。しか
しながら、1979年、ガルフレ、ミルスタインおよ
びライトらによつてラツト骨髄腫セルラインY3
−Ag1.2.3が報告され（ネイチヤー1979、
277131）、このセルラインは英国特許出願第
8000595（第2039948号として公告された）の主題
であり、この出願と関連して、1979年１月９日に
インスチチユート・パスツール（Institut
Pasteur）におけるC.N.C.M.に寄託された（C.N.
C.M.No.Ｉ−078）。セルラインY3−Ag1.2.3自体は
現存するマウス骨髄腫セルラインと比較してハイ
ブリツド骨髄腫（またはハイブリドーマ
（hybridoma））を生成する単クローン性抗体の生
産における親セルラインとして使用するためのか
なりの利点を有している。本発明者らはY3−
Ag1.2.3の誘導体であつて、この目的にとつてよ
り適当な新しいラツト骨髄腫セルラインを調製し
た。 即ち、本発明はラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20を提供する。 ラツト骨髄腫セルラインはマウス骨髄腫セルラ
インより多くの利点を有する。抗体の生産用ハイ
ブリツド・セルラインのインビボ培養はインビト
ロ組織培養法とし比較して或る種の利益−例えば
培養基と比較して動物血清中ではml当り著るしく
高いレベルの抗体が得られる−がある。インビボ
培養のためのラツトの使用はいくつかの点でマウ
スの使用より優れている。例えば血清および腹水
流体の収率が高く、同腹子（litter）が一般に大
きく、ラツトは抗原刺激に対しマウスよりよく応
答する。さらにラツトは単クローン性異種発生性
抗マウスおよび同種異系抗ラツト抗原の生産に必
要である。しかし親マウス骨髄腫セルラインと免
疫化されたラツトからの細胞の組合せによつて生
産されるハイブリツド・セルはマウスまたはラツ
トいずれにおいても容易に培養されないことがわ
かつた。加えてラツト骨髄腫セルラインは或る種
の異種融合（heterogeneous fusions）、例えばう
さぎ（rabbit）または人（human）の細胞との融
合に利点があることがわかつた。 セルラインYB2／3.0.Ag.20はもとのラツト・
セルラインY3−Ag1.2.3によつて分配される上述
の利点を有するのみならず、かなり有用な別の性
質を有している。Y3−Ag1.2.3は特有のカツパー
型のライト・チエーン（light chain）、コード名
S210、を生成および分泌し、Y3−Ag1.2.3を用い
て生産したハイブリドーマもまた、ほぼ一定不変
にこのライト・チエーンを含んでいることがわか
つた。しかしながらその調製中に使用される免疫
原に関する抗体活性は免疫化動物から誘導され、
通常ＨおよびＬとして指示される免疫グロブリ
ン・チエーンが存在するときしか一般により完全
には発現せず、かつ骨髄腫からの免疫グロブリン
は抗体の結合特性と干渉しかねないのでハイブリ
ドーマ中にそれが存在することは不利である。 ある種のマウス骨髄腫親セルラインの場合にお
いて免疫グロブリンチエーンを発現しない突然変
異体をそこから直接単離することは可能であつた
が、その後の研究にもかかわらず、同様の手がか
りはY3−Ag1.2.3セルラインの場合にも可能であ
ることは知られていなかつた。セルライン
YB2／3.0.Ag.20がやゝ常套でない方法によつて
Y3−Ag1.2.3から得られた。セルラインY3−
Ag1.2.3を用いた融合試験の一つは、セルライン
を生成する数種の抗−C3抗体を生ずる人の補体
C3に感作されたAOラツトの脾臓セルとの融合を
含むものである。その一つであるYB2／3HLは、
Y3−Ag1.2.3から誘導されるハイブリドーマ間で
は一般的ではなく、カツパー・ライトチエーンを
発現する能力を欠いている。一連のクローニング
試験によつて、後に詳述するごとく、YB2／
3HLからセルラインYB2／3.0.Ag.20を選択する
ことが可能なことがわかつた。そこではＨおよび
Ｌチエーンを発現する能力を欠き、それによつて
免疫グロブリン・チエーンを発現しないゼロ・セ
ルラインを与える。 即ち、本発明はさらに免疫グロブリン・チエー
ンを発現しないラツト骨髄腫セルラインを包含す
る。該セルラインはハツイブリツド骨髄腫セルラ
インから調製されるセルラインY3−Ag1.2.3の誘
導体である。 また本発明はセルラインY3−Ag1.2.3から誘導
されるハイブリツド骨髄腫セルラインをクローニ
ングして、それによつて免疫グロブリン・チエー
ンを発現しないY3−Ag1.2.3のラツト骨髄腫セル
ライン誘導体を単離するラツト骨髄腫セルライン
の生産方法を含む。この様なラツト骨髄腫セルラ
インは、一般にヒポキサンチン／アミノプテリ
ン／チミジン（HAT）に敏感であり（リトウル
フイールド、サイエンス、1964、145709）、これ
はこの性質を一般に有さないハイブリドーマから
親細胞の分離を容易にし、この様な感受性はしば
しば８−アザグアニン抵抗性と協合する。セルラ
インYB2／3.0.Ag.20がHAT感受性および８−ア
ザグアニン抵抗性の性質を有することが、これら
の性質を有したことを確かめるための積極的な公
報を用いることなくわかつた。しかしながら、他
の場合ではこれらの性質を有するセルラインを得
るための積極的な工程、例えば８−アザグアニン
含有媒体中でY3−Ag1.2.3の融合からハイブリド
ーマ・セルを増殖させてこの化合物に抵抗性であ
る細胞を選択する工程を採用する必要がある（上
述したごとくHAT感受性はしばしば８−アザグ
アニン抵抗性と協合し、後の性質はより容易に選
択される）。 セルラインYB2／3.0.Ag.20はその製造に使用
される二種類のラツトの標識、即ち、Lou（Y3−
Ag1.2.3骨髄腫）およびAO（人の補体C3感作脾臓
細胞）を有しているが、後者は弱くしか発現され
ないと思われる。この細胞はY3−Ag1.2.3と同じ
一般的形態を有しているが（これもまたその親
210.RCY3.Ag1と同じ一般的形態を有している）
この細胞（およびそれから誘導されるハイブリツ
ド・セルも一般に）Y3−Ag1.2.3セルよりも大き
くかつより丸くなつている。YB2／3.0.Ag.20の
培養容器、特にプラスチツク容器に対する細胞粘
着性はY3−Ag1.2.3で見られるものよりずつと小
さくNSI／1Ag4−１で見られるものに似ている。
セルラインYB2／3.0.Ag.20はY3−Ag1.2.3と似
て、８−アザグアニンに対して抵抗性であり（但
し30μｇ／mlのより高いレベルにおいて）、HAT
（リトルフイールド，サイエンス、1964、145709）
含有培地中で死ぬ。セルラインYB2／3.0.Ag.20
は優れた融合能力を保有し、典型的にはラツトの
脾臓細胞との融合において細胞106当り１の効果
のレベルを与える。さらに軟質寒天（soft agar）
中での細胞のクローン化性（clonability）は良好
であり、確かに、クローンがより密である限り
Y3−Ag1.2.3セルのそれよりも良好であり、それ
によつて一般にYB2／3.0.Ag.20から誘導される
ハイブリドーマをY3−Ag1.2.3からのものより精
製を容易にする。 セルラインYB2／3.0.Ag.20株はセンブリツジ
のメデイカル・リサーチ・カウンスルズ・ラボラ
トリー・オブ・モレキユラー・バイオロジーに保
存されており、そのセルラインは1980年６月25日
にパリのインスチチユート・パスツールのC.N.
C.M.にC.N.C.M.No.I.126の番号で寄託された。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は種々の形態の栄
養培地で増殖できる。即ち、本発明はセルライン
YB2／3.0.Ag.20の細胞をそれ用の栄養培地に含
む細胞培養システムにも及び。この様な細胞培養
システムは常套のインビトロであり、培地は本質
的には合成培地であるが、もちろん血清のごとき
天然源から得られる成分を含んでいてもよい。こ
の様な培地の例は、熱で不活性化した馬の血清ま
たは好ましくは仔牛の胎児血清を例えば10％
（ｖ／ｖ）補給した、ダルベツコ（Dulbeccos）
変性イーグル（Eagle）最小必須培地（例えばジ
ブコ・バイオカルト社；パイスリー、スコツトラ
ンドから入手可能）である。この細胞をこれより
低い血清レベルの使用または血清を含まないアイ
ソコブ（Isocove）変性品（アイソコブおよびメ
ルチヤーズ、ジヤーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メデイシン、1978、147923）の使用に条件
づけしてもよい。抗生物質の補給は培地中に使用
してもよい。この様な培地中で増殖した細胞は短
期間の条件づけで、仔牛の胎児血清を有する
RPMI1640および細胞培養に一般に用いられ、こ
の技術分野の文献に記載されているごとき他の
種々の培地中で増殖させることができる。懸濁培
地中では一般に約24時間の培化時間（doubling
time）が得られ、この様な培地を好適には、細
胞および培地の一部を除去し、これを新鮮な培地
で置き換えることによつて一週間に３回供給す
る。一般に、低血清含量の培地、例えば約５％
（ｖ／ｖ）ないしそれ以下、例えば血清供給量2.5
％を含有する培地中で増殖するよう細胞を条件づ
けることは融合中に曝される条件を容易に受け入
れる丈夫な細胞を調製する点で価値がある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は液体窒素中で良
好な貯蔵安定性および該セルラインの多数の世代
にわたつてインビトロ培養における良好な安定性
を示す。但し、通常のごとくルーチンチエツクを
時々実施すのるが望ましい。融合能力のごとき細
胞のある種の性質は連続培養によつて改良される
得ることが理解されるであろう。確かに、例えば
連続した継代（passage）および／またはクロー
ニングを通して、殆んどの点でYB2／3.0.Ag.20
に実質上類似するが、ある種の変わつた性質を有
する種々のセルラインを得ることを可能にし、融
合に使用するための親セルラインとしての最初の
使用に加えて、セルラインの第二の使用はその様
な変異種の製法にある。この様な変異株は自然発
生的に生じ、インビトロでの継代、しばしばこれ
に続くクローニングまたは特に直接クローニング
することによつて、もとのYB2／3.0.Ag.20のバ
ルクから選定される。このクローニングは例えば
軟質寒天上で行なわれる。しかしながらこの様な
工程はむしろ単調であつて、多数のクローンの研
究を含み、変異株の生産は、後述するごとく変異
株の生産にセルラインの細胞を適応（adaption）
させる条件、特に細胞の継代における使用によ
り、しばしばより好適に達成される。 変異種は都合のよいことにはハイブリドーマの
生産におけるその使用に関連するセルライン
YB2／3.0.Ag.20の一ないしそれ以上の性質にお
ける変化を示す。この様な性質は融合特性および
増殖特性を含み、後者はハイブリドーマの増殖特
性に関係をもつている点で特に興味深い。特に興
味のある変異株はこの様な一種ないしそれ以上の
性質の向上を示すものであり、ある種の特に興味
ある特殊なタイプの変異株については後述する。
従つて、本発明はさらにセルラインYB2／3.0.
Ag.20から誘導される親骨髄腫セルライン、特に
上述の変異株に関するものである。 セルラインYB2／3.0.Ag.20および本発明に従
う他の親セルライン特有の価値は単クローン性抗
体の調製用に使用し得るハイブリツド・セルライ
ンの製造にある。この目的に使用される方法は
種々の親セルライン、即ちYB2／3.0.Ag.20それ
自体のみでなくY3−Ag1.2.3から誘導される免疫
グロブリン鎖を発現しないゼロ・セルラインおよ
びYB2／3.0.Ag.20の変異株に対し広い範囲で類
似しているが、便宜上特にYB2／3.0.Ag.20に言
及して記載する。親セルラインからハイブリツ
ド・セルラインを製造する方法は脾臓、リンパ線
または他のセルラインの細胞で免疫原に感作した
免疫細胞（即ち免疫学的に適応性を有する細胞）
を融合する工程を含む。この感作した免疫細胞は
種々のソースから採取してもよいが、最良の結果
はラツトの細胞を用いて得られ、これが他のホス
ト、即ちマウスや人から得られたものより好まし
いことがわかつた。YB2／3.0.Ag.20セルライン
はLouおよびAOラツトの両方に対して標識を有
しているので、後続のインビボ増殖によるハイブ
リドーマからの抗体の生産を意図しているときは
免疫細胞を生産するために使用するラツトはAO
またはLouラツトのいずれかであるのが好まし
い。本発明に従う他の親セルラインは後述するご
とく広く選択できる。免疫細胞の感作は正常に発
生してよく、自然発生的な免疫化によつて、しか
し好ましくは直接免疫化によつて感作させる。必
要な免疫原を免疫化工程でホスト動物に積極的に
投与する。 セルラインの細胞と適当な免疫細胞の融合は融
合を促進する試薬を含む適当な培地での混合を必
要とする。即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.
Ag.20の細胞と免疫細胞、例えばマウスまたは特
に人、就中、ラツトからの脾臓細胞を該細胞の融
合を促進する試薬を含む栄養培地で融合するシス
テムを含む。この様な培地は好適には合成物であ
つてもよいが、もちろん、所望ならば天然源から
得られる成分を含んでいてもよい。しかしなが
ら、この場合以上のごとき可能性は少ない。この
様な培地の例はイーグルの最小必須培地
（Eagle's minimum essential medium）、そのダ
ルベツコ変性培地（Dulbecco modification）、
RPMI1640および細胞培養に一般に使用され、当
該技術文献に記載された他の種々の培地であり、
細胞の培養には上述したごとく、抗菌性助剤がし
ばしば用いられる。種々の融合試剤を用いてもよ
く、例えばセンダイ・ウイルス（Sendai uirus）
のごときウイルス、ポリエチレングリコール、例
えばPEG1500が好ましい。これらの試薬での細
胞の融合は文献に記載され、本件実施例に説明さ
れているが、ガイダンスとしてはポリエチレング
リコールの約40から約55％（ｖ／ｖ）がしばしば
使用され、その最適濃度は分子量により、例えば
PEG1500では約50％（ｖ／ｖ）である。所望な
らばジメチルスルホキシドをポリエチレングリコ
ールに加えてもよい。ハイブリドーマ単離を好適
にはもとの培地を、親セルラインに対しては毒性
であるがハイブリツド・ラインに対しては一般に
毒性のないHAT培地と置き換えることによつて
補助してもよい。これに続いてクローニングとサ
ブ・クローニングを用い、抗体生産用試験に照ら
して適当なハイブリツドを選ぶ。 上に示したごとく、要求される免疫原に感作さ
れた免疫細胞は別の方法によつて得ることもでき
る。即ち、該細胞は要請される型の自然発生免疫
細胞を選択することによつて、あるいは一連の投
与量で免疫原をフロインド・アジユバンドのごと
きアジユバンド（ここでは適当である）と共に動
物（ここでは人を含む）に投与し次いで脾臓また
は他の免疫細胞を採取することを含む当該既述に
おいて記載された方法によつてうまく得られる。 免疫細胞の自然発生法の採用は人の免疫細胞に
関して特に興味深く、ここでは免疫原の投与はあ
まり魅力的ではなく、患者の感染した病気から自
然に生産された免疫細胞がもつと適当である。自
然の免疫細胞に関し特に興味のある領域は自動抗
体（auto antibody）の生産である。 本発明は蛋白質と糖蛋白、オリゴおよびポリサ
ツカライド、リポサツカライド、パプテンおよび
類似物、例えばペプチド、神経伝達物質およびホ
ルモン類のごとき抗原を含む拡範囲の免疫原に対
して感作された直接または自然に感作された動物
からの免疫細胞に適用できる。表面標識であつ
て、腫瘍性の物質、特に充実性腫瘍（Solid
tumour）から誘導される免疫原はかなり興味深
いが、本発明は細菌性およびウイルス性抗原に対
しおよび原生類および菌類から誘導される免疫原
に適用してもよい。 即ち、本発明は更にラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20または前述した本発明の他の親
セルラインと動物、例えばマウス、特に人、就中
ラツトからの免疫原に感作した脾臓または免疫細
胞間のハイブリツドである細胞を含む。 ハイブリツド・セルは親YB2／3.0.Ag.20細胞
と、および前述のものと同じ一般的な型の培地で
の培養によつて維持してもよい。 本発明のセルラインによる抗体の製法はそれ用
のインビトロまたはインビボ培地いずれかでセル
ラインを培養することによつて行なつてもよい。
即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.Ag.20また
は本発明に従つた他の親セルラインから誘導され
るハイブリツド・セルをインビトロまたはインビ
ボ培地で培養し、その後該培地から抗体を単離す
る工程を含む抗体の生産方法を提供する。 インビトロとインビボの選定は種々の因子によ
る。即ち、インビトロ培養は、抗体が必要とされ
る用途が化学的な性質よりむしろ免疫学的であ
り、かつラツト中でのインビボ増殖からのラツト
免疫グロブリン汚染物の存在が望ましくないとこ
ろで必要とされる。インビトロ増殖はまた免疫細
胞が得られるラツトの素質（strain）は重要でな
いと云う利点を有する（インビボ増殖では重要で
ある）。さらにハイブリドーマ・セルはインビボ
では増殖しない場合がある。しかしながら、イン
ビボ培養はインビトロ培地と比較してml当り著し
く高い抗体のレベルが一般に得られる（血清およ
び／または腹水中）。インビボ培養は好ましくは
ラツト中で行ない、セルラインYB2／3.0.Ag.20
の場合には（これは前述のごとくラツトのAOま
たはLou種からの免疫細胞とうまく融合し、そこ
では得られた抗体生産用ハイブリドーマのインビ
ボ培養が意図されている）ラツトは好ましくは
Lou×AOハイブリツドである（ラツトのAOまた
はLou純潔種においては増殖の容易さが劣る場合
がある）。加えて、放射線照射および／または免
疫抑制剤の使用によつてラツトの不適合種中でハ
イブリドーマの生育を達成することも可能であろ
う。 ラツトの単一種、例えばラインY3−Ag1.2.3の
場合における種Louから親骨髄腫セルラインが誘
導されるときは、ハイブリドーマを生産する親セ
ルラインと融合する免疫細胞を供給するためラツ
トのどの純潔種を使用してもよく、また親セルラ
インと免疫細胞の誘導に相当する株のハイブリツ
ド中でハイブリドーマの易インビボ増殖が起るで
あろうと云う利点がある。従つて前に言及したご
とくセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株の典形
はセルラインがラツトの純潔種、特にAOまたは
Lou（後者の場合、AO標識が失われているかマス
クされたもの）中での増殖に適応（adapt）され
たものである。この方法でセルラインYB2／3.0.
Ag.20を適応するための好ましい方法はラインが
それに適応されるべき種である多数のラツト（例
えば少なくとも５匹、特に約10匹）を通してそれ
を継代することである。この方法ではセルライン
によつて誘発された腫瘍の明らかな退行が生じて
いる一連の二、三の速いラツトに最初にみられる
増殖のモードから、退行なしに容易に増殖する一
連の遅いラツトにみられるモードにセルラインを
適応することが可能である。最後のラツトから単
離された腫瘍細胞を次いで培養し、所望ならばク
ローンし、変異株と融合するための免疫細胞を提
供するために都合よく使用されるラツトの種類の
ある範囲に関して高められた性質を示すべく適応
されるセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株を提
供する。この形の種々の適応されたセルラインを
調製してもよく、好ましい例はYB2／3.0.Ag.20
の融合特性の保持または改良に対して選ばれる。 インビトロの系の場合は用いられる培地は細胞
培養システムに関連して上記したものと同じであ
つてもよいが、血清レベルはできるだけ低く、例
えば５％（ｖ／ｖ）ないしそれ以下、好ましくは
約2.5％（ｖ／ｖ）より多くなく、好適には0.5％
（ｖ／ｖ）程度であるのが好ましい。アイソコブ
血清（Isocove）−微変性を使用してもよい。この
細胞は都合のよいことには対数相を越えてうまく
増殖させることができ、これによつて最終生存度
を犠牲にして最大最終濃度を達成できる。細胞の
定常相（stationary phase）における短期間の生
育は、抗体の最終収量を改良するので好ましい。
抗体生産の適当な組織培養法の例は紡すい状容器
（spinner container）中での塊状増殖（massive
grawth）および当該技術分野においてよく知ら
れた大量培養法である。インビボ法は好ましくは
ラツトに接種して充実または腹水腫瘍を生産する
方法を含む。接種に先立つてラツトを免疫抑制す
るかおよび／または腹水の分泌をうながすプリス
タン（Pristane）のごとき薬剤で処理してもよ
い。腫瘍を適当な期間増殖させた後、動物を殺
し、抗体単離のために腹水および／または血清を
集め、腹水腫瘍の場合はその期間後生きた動物か
ら腹水を集めてもよい。即ち腹水腫瘍はより多量
の液を生産する能力を有するが、この技術の価値
は腹水および／または血清中に存在する抗体の濃
度にある。インビトロまたはインビボ法いずれか
からの抗体の単離は、沈澱、透析、免疫−吸着剤
（immunoabsorbent）の使用を含むクロマトグラ
フイー、および膜濾過を含む当該技術において記
載された方法によつてうまく達成できる。 即ち、本発明は動物、特にラツトに本発明に従
うYB2／3.0.Ag.20または他の親セルラインから
誘導されるハイブリツド・セルを接種し、充実性
または腹水腫瘍をラツト中に増殖させ、次いでラ
ツトの血清および／または腹水から抗体を単離す
る工程を含む単クローン性抗体の生産法を含む。 本発明は本発明に従うセルラインYB2／3.0.
Ag.20または他の親セルラインから誘導されるハ
イブリツド・セルを用いて調整される抗体にも及
ぶ。この様に抗体は治療および特に診断、および
親和クロマトグラフイー（affinity
chromatography）等の種々の用途を有する。生
産される単クローン性抗体の一例は人の細胞の亜
個体群（sub−population）を認知する種々の人
原発生腫瘍細胞に対する抗体であり、これは血液
学的診断に有用である。他の形の用途として自然
に発生する物質、例えばこの物質の精製用蛋白質
に対する抗体の使用が例示される。 本発明を以下の実施例で説明する。 実施例 １ ハイブリツド・セルラインYB2／3HLからの
セルラインYB2／3.0.Ag.20の調整 セルラインY3−Ag1.2.3から誘導されるハイブ
リツド・セルラインYB2／3HLの細胞をダルベ
ツコ変性イーグルス培地にもとづく培地（これは
DMMと同じであり、DMMはダルベツコ変性イ
ーグルス培地にある種の添加物を加えた市販調整
品であり、以下の成分を含む： 500mlダルベツコMEM（4500mgグルコース／
を含みピルビン酸Naは含まない）−ジブコ−バイ
オカルト・カタログNo.320−1965， ５mlピルビン酸Na MEM（100mM）−ジブコ・
カタログNo.320−1360 10mlペニシリン／ストレプトマイシン（5000単
位ペニシリン／500mcgストレプトマイシン／ml） 培地はNaHCO3含量3700mg／、pH7.2〜7.5
である）に牛の胎児血清［FCS；異なつたバツチ
から選ぶ（セラーラブ・カタログNo.5−000−
1a）10％（ｖ／ｖ）を補給した培地から得、本
質的にコツトンらによりヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジー、1973、3136に記載され
たごとき軟質寒天中でクローンした。総計116の
ランダム・クローンを培養し、この培養上澄液
を、塩化クロムと結合した羊の赤血球（SRBC）
の羊中に生じた抗ラツトｇに対する間接凝集に
より、ラツトｇの生産に対してスクリーンする
（ケーラーら、ヨーロピアン、ジヤーナル・オ
ブ・イムノロジー、1976，６，292）。各ケースに
おいて、上澄液をSRBCと混合し、10分間静置
後、遊離抗ラツトｇを加えると上澄液中にラツ
トｇの存在するものは凝集する。116クローン
からラツト免疫グロブリン生産に関し陰性である
かごく弱い陽性を示す３クローンが選択され、こ
れらの３クローンはP1.F11、P2.G11およびP.
H12として同定される。この３個のクローンによ
る細胞外および細胞内［14Ｃ］−リジン取込みを、
通常のリジン含量の培地を［14Ｃ］−リジンで置
き替えたDMM−５％FCS（使用されるFCSは透
析されたもの）中でインキユベートすることによ
り研究した。上澄液をケーラーおよびミルスタイ
ンのヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・イムノロ
ジー、1976、６、511に記載されているごとく、
総減数（total reduction）後、ドデシルサルフ
エートNa塩／ポリアクリルアミド電気泳動
（SDS−PAGE）を用いて分析した。 得られた結果を表に示す。 【表】 この３個のクローンを更に研究するため、フル
オレツセン・イソチオシアネートラビツト抗ラツ
トｇ（ブラツドストツクらジヤーナル・オブ・
ナシヨナル・カンサー・インスチチユート、65、
No.7，81）を用いる内部細胞蛍光顕微鏡法によ
りスクリーンし、ゼロ・セルラインの単離に対し
最も有望なものとしてクローンP2.G11が現われ、
これは40％の強い陽性に対しほぼ60％の陰性の個
体数を示した。 従つてクローンYB2／3HL P2.G11を軟質寒天
でクローンし、得られた43クローンを内部細胞蛍
光顕微鏡法でスクリーンし、22の明らかな陰性体
が９の明らかな陽性体および12の明瞭でないクロ
ーンまたは混合クローンと共に見出された。内部
細胞蛍光顕微鏡法によるスクリーニングにおいて
陰性であるこの22個のクローンをさらにスクリー
ンし、継続するSDS−PAGE分析によつて、クロ
ーンYB2／3HL P2.G11.16（０）が内部細胞［14
Ｃ］−リジン取込み上にチエーンを有さないもの
として選択された。これらの細胞は30μｇ／mlの
８−アザグアニンに対し抵抗性であることは既に
見出されているので、この細胞を８−アザグアニ
ンに対し適応させる必要はない。これらの細胞、
即ちYB2／3HL.P2.G11.16（０）Agを８−アザグ
アニン30μｇ／mlの存在下に軟質寒天中でクロー
ンし、このクローンをクローンが密に増殖した基
体上で選定する。さらにクローンYB2／3HL・
P2.G11.16（０）Ag.20をその増殖速度の速さの観
点で選定し、試料をHAT感受性に対して試験し
た。 即ちYB2／3HL.P2.G11.16（０）細胞はハイブ
リドーマを生産する単クローン性抗体に導く融合
において親骨髄腫細胞として使用し、セルライン
YB2／3.0.Ag.20を構成するのに適した性質を示
す。この細胞を観点から採取し、20％（ｖ／ｖ）
FCS含有DMM培地を加えたリンブロ・プレート
（Linbro plate）の２mlの穴に入れた。この細胞
を増殖し、徐々により大きな容器で増殖し、かつ
培養器に供給する代替培地の血清レベルを減少さ
せる通常の方法によつて低い血清レベルに条件づ
けした（培養は37℃、C0210％（ｖ／ｖ）／空気
90％（ｖ／ｖ），雰囲気下）。この方法で、細胞は
［2.5％（ｖ／ｖ）FCS／2.5％（ｖ／ｖ）熱で不活
性化した馬の血清］、次いで［５％（ｖ／ｖ）
FCS］および最後に［2.5％（ｖ／ｖ）FCS］中
で増殖するよう条件づけられ、最終的に１紡錘
状フラスコ中、37℃、10％（ｖ／ｖ）CO2／90％
（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下および95％湿度で培養
した。 セルラインの凍結試料（カルチユアー・コレク
シヨンに寄託したものを含めて）を５×105／ml
の細胞数を越えない段階で指数的に増殖する細胞
から調製した。１×107より多い細胞を含む培地
を７分間で600ｇの割合で遠心分離した。細胞ペ
レツトを４℃に冷却し、これを90％（ｖ／ｖ）
FCS−10％ジメチルスルホキシドに懸濁して濃度
５％106（細胞）／mlにした。この懸濁液１ml（４
℃）をアンプルに入れ、シールして、４℃から１
℃／時間の割合で冷却して凍結した。細胞が−50
℃に達したとき液体窒素中に浸漬した。この様な
凍結アンプルから細胞を再生するにはアンプルの
内容物を急速に４℃にし、次いで迅速に冷（４
℃）DMM−10％（ｖ／ｖ）FCSで20mlの容積ま
で稀釈した。次いで細胞を７分間で600ｇの割合
で遠心し、２ml培地中に各１／２、１／４、１／
８、１／16および１／32ペレツト化細胞を含むよ
う再懸濁した。その後、培地を37℃、10％（ｖ／
ｖ）CO2／90％（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下で増殖
させ、さらに凍結前の細胞に対して記載したのと
同様に増殖させる。新しい凍結株を調製するため
には解凍後最少１週間、最大３週間の間に得られ
た培養物を増殖する必要がある。その間に細胞は
24時間の培化時間で指数的に増殖する。 ハイブリツド・セルラインYB2／3HL源 YB2／3HLセルを以下のごとく調製した。イ
ヌリン（ブリテイシユ・ドラツグ・ハウシズ）の
りん酸塩バツフア・ザリーン（100mg／ml）懸濁
液を１分間超音波処理し、次いで懸濁液0.5mlを
正常な人の血清（エチレングリコールビス（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，N′−テトラ酢酸
（EGTA）10mMおよびMgCl2でMg7mMにした
もの）10mlで37℃で15分間処理し、イヌリンに対
するC3の固定および補体経路（complement
pathway）のいずれかを活性化させる。懸濁液を
生理食塩水、2MNaClおよび再び生理食塩水で遠
心分離して正常し、生理食塩水で原容量１mlとす
る。 ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ペニシ
リン500単位−ストレプトマイシン500mcｇ／ml）
250μ、正常なラツトの血清50μをフロインド
完全アジユバンド（CFA）約１ml中に加えた液
で抗原補体１mlを乳化して最終容量2.4mlとした。
この調製品0.1mlを２匹のAOラツトそれぞれに各
４箇所（合計ラツト１匹に0.4ml）筋肉注射した。
３週間後、各ラツトにCFAを含まないがビー・
ペルツシス５×109を含む類似の抗原調製物0.5ml
を骨膜内（intraperistoneal）注射する。４週間
後、いかなる形態のアジユバンドも有さない抗原
調製品0.5mlを静脈注射し次の月の間にさらに５
回類似の静脈注射を行なつた。 最後に静脈注射３日後にラツトを殺した。各ラ
ツトにつき、滅菌条件下で脾臓を除去し、補給血
清を含まない新しく調製したDMM培地５mlを入
れた氷冷した小さなペトリ皿に置いた。脾臓を切
つた後、前述の血清を含まないDMM培地４mlを
含む10mlプラスチツク製丸底チユーブに移し、う
まく適合しない（２mmのクリアランス）テフロン
製乳棒で潰した。得られた混合物を１分間氷の上
に放置し、上層3.5mlをプラスチツク製の普通の
チユーブに移した。潰した脾臓の残りをDMM5
mlで洗い、混合物を１分間立てて、大部分の破片
を沈殿させた。上澄液を破片から傾瀉し、チユー
ブ中の細胞に加えた。このチユーブをDMMで満
たし、ベンチ遠心機を用い600rpmで７分間回転
した。次いで上澄液を傾瀉し、細胞をDMM中に
再分散した。細胞108を含むこの懸濁液の１アリ
コートをケンブリツジにあるアム・アール・シー
ズ・ラボラトリー・オブ・モレキユーラ・バイオ
ロジーに保存されている株から得られる洗浄した
Y3−Ag1.2.3細胞107と50ml円錐遠心管中で混合
した。次いでDMM培地を細胞混合物に加え全体
を遠心分離した。 液を切つた細胞ペレツトを含むチユーブを37℃
に水浴中に置き軽くたたいた。ポリエチレングリ
コール（PEG）1500のDMM50％（ｗ／ｖ）溶液
0.8mlを37℃において、１分間かけて該細胞中に
加え、ピペツトを用いてゆるくかき混ぜた。ゆる
やかな攪拌をさらに１分間続け、DMM培地２ml
を２分間にわたつて加え、次いで３分間かけて
DMM9mlを加え、さらにDMM10mlを滴下した。
この細胞を回転し、次いで別のバツチ（セルーラ
ボ カタログNo.５−000−1a）からの牛の胎児血
清（FCS）20％（ｖ／ｖ）を補給しておいた予備
加温（37℃）DMM培地に初めはその２、３滴中
に次いでその25mlにゆつくりと再懸濁させた。容
積を予め加温した同じ培地で50mlにした（この段
階および以下のインキユベーシヨン中に使用され
たFCSを56℃で30分間熱不活性化処理した）。 二匹のラツトから得られた細胞含有培地をリン
ブロ・プレートの２mlの穴96個に分配し、同じ培
地１ml中に約１×105個の洗浄脾臓細胞を含む液
を各穴にフイーダー（feeder）として加え、全体
を37℃でインキユベイトした。次の日、培地２ml
のうち１mlを各穴から除き、20％FCSおよび
HAT（リトルフイールド、サイエンス、9764、
145，709）を含むDMM培地１mlで置換する。イ
ンキユベイシヨンを37℃で２週間続け、その培地
の半分を最初の置換後２日目およびその後は２〜
３日間隔を置てHAT培地で同様に置換した。 ２週間後に80個の穴に活性な増殖が観察され、
この増殖はハイブリツド骨髄腫の存在を示した。
80個の培養基それぞれの使用済みの培地を以下の
ごとき間接的な結合アツセイにより抗体生産用に
試験した。複合体をラツクマンおよびホバート、
1978、コンプリメント・テクノロジー、ザ・ハン
ドブツク・オブ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー、著者デイー・エム・ワイヤー（ブラツクウ
エル・サイエンテイフイツク・パプリケイシヨ
ン）の方法に本質的に従つて、37℃で酵母処理し
た人の血清（R3）でエリスロサイト（EA）を有
する羊の抗体を処理し次いで洗浄することによつ
て製造する。複合体（EACと云う）のこの中間
物はC3b，C3biおよびある種のC3dをその表面に
有するが、C5は有さないか或はその上の後の成
分はR3として“非反応”（mom−reactor）血清
から得られた。EAとEACの両者は各穴からの使
用済培地の稀釈液で処理し、洗浄し、［125Ｉ］ラ
ベル化抗ラツト免疫グロブリン抗体とインキユベ
ートした。さらに洗浄した後細胞の放射能を測定
した。この間接結合アツセイで測定したときこの
80培養基のうちわずか３列が明瞭な抗体生産活性
を示し、２匹のラツトの１匹から誘導されたこれ
らの培養基の一つがハイブリツド骨髄腫YB2／
39を含んでいた。 ハイブリツド骨髄腫YB2／39を上記コツトン
らの文献に記載されたのと本質的に同じ方法を用
いて軟質寒天中でクローンした。クローニングを
数種の細胞濃度において実施し、クローンを最低
クローン濃度から選んだ。この最初のクローニン
グ段階でのクローニング効果は約10％であつたが
最初に単離された活性クローンの率は100％
（21／21）であつた。クローン39−11を選択し、
軟質寒天中でクローンして、４／４陽性クローン
を得、そこからクローン39−11−１−７を選び、
軟質寒天中でクローンしてセルラインYB2／
3HLを構成するクローン39−11−１−７を得た。
この細胞を低いクローン／プレート数（≪100）
を含む寒天プレートから採取した。クローン当り
の細胞の数は約100であつた。FCS20％（ｖ／ｖ）
含有DMM1mlを加えたリンブロ・プレートの２
mlの穴に細胞を移した。次いで細胞を20％（ｖ／
ｖ）FCS含有DMM中で増殖し、培養基を補給す
るために用いる培地の血清濃度を10％（ｖ／ｖ）
に薄めた。より大きい培養基を種々の大きさの平
底組織培養容器に移すことにより作り、空気中に
10％（ｖ／ｖ）CO2を含む雰囲気を封ずるため、
容器を気密にシールし、細胞を37℃、懸濁培養基
として、通常の方法で増殖した。 実施例 ２ セルラインYB2／3.0.Ag.20とイースト・チユ
ーブリン（yeast tubulin）で高度免疫化された
ラツトからの脾臓細胞との融合によるハイブリド
ーマの製造： ラツトのLou株を次のスケジユールに従つて免
疫化した： 第１日目：フロインド完全アジユバンド中の
20μｇイースト・チユーブリンを腹膜内（i.p.）注
射する、 第22日目：フロインド不完全アジユバンド中の
20μｇイースト・チユーブリンを腹膜内注射す
る、 第53日目：22日目と同じ、 第85日目：イースト・チユーブリン20μｇを静
脈内（i.v.）する。 89日目にラツトを殺し、その脾臓を滅菌条件下
に除き、２％（ｖ／ｖ）FCS血清補剤を含む
DMM培地を用いて融合を行ない、最終品を満た
して600r.p.mで７分間まわし、血清補剤を含まな
いDMNで再懸濁した。108個の細胞を含む再懸
濁脾臓細胞の１アリコートを同じ培地中でセルラ
インYB2／3.0.Ag.20の６×107個の細胞と混合し
た。この混合物を50mlプラスチツク製円錘チユー
ブ中で600ｇで７分間遠心にかけ、次いで上澄液
を除去し、細胞ペレツトをチユーブの底をゆるく
かき混ぜて粉砕した。さらに操作を約37℃で行な
つた。DMM培地（PH7.6−7.8：フエノール・レ
ツドで指示）中にポリエチレングリコール
（PEG）1500（新たに調製し暗所に保存）50％を
含む液１mlを用いて、この液を１分間かけて加え
ながら、細胞をゆつくりと懸濁させた。この懸濁
液を37℃で１分間保持し、DMM培地１mlをさら
に１分間かけて加えた。DMM培地を更に20ml、
５分間かけて加え、この細胞を遠心分離しFCS20
％（ｖ／ｖ）含有DMM培地中にゆるやかに再懸
濁し、総容積25mlとした。 この懸濁液を２ml穴48個を有するリンブロ
BCL−5041トレイ中に0.5ml中に以下のごとく分
配した。もとの容積25mlのうち18mlを36個の穴に
分配し、残りの７mlを14mlに稀釈した（この、お
よび後の稀釈を20％（ｖ／ｖ）FCS含有DMM培
地で行なつた）。14mlのうち６mlを12の穴に分配
し、残りの８mlを16mlに稀釈した。16mlのうち６
mlを12の穴に分配し、残りの10mlを20mlに稀釈し
た。20mlのうち18mlを36の穴に分配し残り２mlを
捨てた。96の穴それぞれを、20％（ｖ／ｖ）FCS
含有DMMで容積２mlにした。この細胞を培養
し、24時間後に培地の1/2を20％（ｖ／ｖ）FCS
およびHAT（リトルフイールド、サイエンス、
1964145709）含有DMM培地で置き換える。この
操作を２日後およびその後２日毎に繰り返した。 15〜20日後に穴中で激しい増殖がみられ、これ
はハイブリツド・クローンの成功を示す。合計52
の穴がハイブリツド増殖を示した（稀釈が増す順
に36／36，６／12，３／12及び９／36）。 ２の段階でもとのおよび非稀釈の培養基の分析
を行ない、高率の36の増殖培養基をSDS−PAGE
によつて分析した（技術上の理由から全ての培養
基の分析はできなかつた。分析した28培養基の培
養基当りのハイブリツド・クローンの平均数は１
であり、ハイブリツドの90％はIgヘビー・チエー
ンを分泌（secrete）していた。（詳細な分析は、
ヘビー・チエーンなし；３，μヘビー・チエーン
のみ；24，δヘビー・チエーンのみ；１，μおよ
びδヘビー・チエーン；０であつた）。 各ハイブリツド培養基の使用済み培地は以下の
方法うを用いて結合アツセイにも試験される（イ
エンセンおよびウイリアムス、ヨーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・イムノロジー、1974、４，91）。
イースト・チユーブリン溶液（50μｇ／ml）25μ
をステリリン平底96穴微量滴定プレートの穴に
入れ４℃で一晩保持した。イースト・チユーブリ
ンを除去し、各穴にPH7.2の0.1Mヘペス
（Hepes）、0.15MNaCl，0.8％（ｖ／ｖ）ボビン
血清アルブミンおよび0.1％（ｗ／ｖ）ナトリウ
ムアジドを含むPH7.5の0.5Mりん酸カリウム塩バ
ツフアー100μを加え、次いでこのプレートを
室温で１時間放置した。穴を同じバツフアー溶液
（２倍）100μで洗浄し、使用済み培地25μを
加えプレートを４℃で１時間維持した。穴をさら
にりん酸塩バツフアー・ザリーン（３倍）、次い
で2NNaOH水溶液100mlで洗浄した。放射能レベ
ルをカウントし、［125Ｉ］−活性度が陽性反応を
示す穴を取りあげた。この試験で52の穴のうち６
個が陽性を示した。 この６個の陽性培養基のうち４個のYOL1／
５，YOL1／19，YOL1／34およびYOL1／38
（YOL1／34はチユーブリンに対し特に高い親和
性を有する）と命名し、これらを上記コツトンら
によつて記載されたのと本質的に同じ方法を用い
て軟質寒天上でクローンした。各ケースにおいて
得られた１またはそれ以上のクローンを再び軟質
寒天上でクローンした。このクローンを第１およ
び第２クローニング後、予め使用されたものに類
似のアツセイによつてイースト・チユーブリン・
バインデイングを測定した。結果は以下の通りで
ある。 【表】 【表】 培養基YOL1／34の場合1δ3個の陽性クローン
の一種（YOL1／34，10）を再びクローンし、12
個の陽性のクローン（YOL1／34.10.1から
YOL1／34.10.12）を得た。陽性の抗体生産に関
する培養基の最初の不安定性は、第１のクローニ
ングの結果で示したごとく、第２のクローニング
で克服されたことがわかる。クローンYOL1／
34.10.1からYOL1／34.10.12の全てはもとの培養
基と同様、チユーブリンに対し非常に高い結果親
和性を有する抗体を生産した。 注記： 同じ脾臓細胞を用いた正確な比較試験において
は親ラツト骨髄腫セルラインY3−Ag1.2.3はハイ
ブリツド増殖に対し陽であるより高いレベルの穴
を与えるのみでなく、直接血球凝集アツセイで陽
性である同じ数の穴を与え、これによつて
YB2／3.0.Ag.20に対しより高い効果を予測させ
る。 実施例３：セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒト
の脾臓細胞との融合によるハイブリ
ドーマの製造 正常なヒトの脾臓細胞を実施例２に記載のよう
にして融合用に調製し、血清補液（supplement）
が存在しないDMM培地内の脾臓細胞108個のア
リクオートを同一の培地内のセルラインYB2／
3.0.Ag.20の細胞６×107個と混合した。次いでこ
の細胞混合物を実施例２に記載の手順によつて処
理してその融合をおこない、実施例２に記載のよ
うに類似の20％ｖ／vFCS含有DMM内細胞懸濁
液25mlを得た。 この懸濁液をLinbroBCL−5041トレイの48個
のくぼみの中へ0.5mlずつ分配し、各くぼみ内の
液は20％ｖ／vFCS含有DMM培地を用いて２ml
に埋合せた。次いで細胞を培養し、24時間後に培
地の半分を20％ｖ／vFCSおよびHAT｛リトルフ
イールド・サイエンス（Littlefield science）、第
145巻、第709頁（1964年）｝を含有するDMM培
地で置き換えた。この操作をその後２日おきにお
こなつた。 15〜20日後にくぼみ内では活発な増殖がみら
れ、好結果のハイブリツド・クローンが示され48
個のすべてのくぼみにおいてハイブリツド増殖が
示されることが認められた。各ハイブリツド培養
に使用された培地はシープの赤血球凝集反応の抑
制に依存する方法において試験した。使用された
細胞はヒトのガンマグロブリンを用いて被覆し、
単クローン性抗ヒユーマンカツプIgおよび単クロ
ーン性抗ヒユーマンガンマIgを用いる凝集反応に
対して試験した。遊離のヒユーマンIgの存在は抗
体との結合を妨げ、このような妨害は48個のすべ
ての培養について発生し、このことはこれらがヒ
ユーマンIgに対して陽性であることを示すもので
ある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの脾臓細胞
を用いる融合方法は成功したが、この特別な方法
によつて得られたハイブリドーマは約２週間後に
は抗体産生能を失なつた。 実施例４：セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒト
の末梢血液リンパ細胞との融合によ
るハイブリドーマの生産 (A) Rh因子陽性（rhesus positive）細胞投与に
よつてさらに感作された生まれつきRh因子陰
性（抗−Ｄ陽性）患者からのヒトの末梢血液リ
ンパ細胞によつて正常なヒトの脾臓細胞を置き
かえる以外は実施例３の手順に従つた。
LinbroBCL−5041トレイを用いて全体で96個
の培養をおこなつたところ、このうちの34個は
ハイブリツド・クローンの存在を示す活発な増
殖を呈した。34個のハイブリツドのいずれも抗
−Ｄ陽性ではなかつたが、実施例３に記載の試
験におけるヒユーマンカツパIgに対して陽性の
ものが１つ認められた。 抗−ヒユーマンカツパIgを生産するハイブリ
ドーマを、初期濃度20％（ｖ／ｖ）から最終濃
度2.5％（ｖ／ｖ）まで減少するレベルでFCS
を含有するDMM培地内で２カ月間培養し、次
いで実施例１に記載の手順により軟アガール内
でクローンした。得られた20個のクローンのう
ち、18個のヒユーマンカツパIgに対して陽性
で、これらのクローンは８−アザグアニンに適
応させると（生産されたクローンはHATにも
感作性がある）18個のうちの12個は陽性を保持
した。これらの12個のうちの１つを、初期濃度
20％（ｖ／ｖ）から最終濃度2.5％（ｖ／ｖ）
まで減少するレベルでFCSを含有するDMM培
地内でのスピナー培養において６カ月間保持し
ても陽性が保たれた。 (B) 上記手順の変形法においては融合に先だち、
イムノグロブリン生産を高める物質であるアメ
リカやまごぼうミトゲン（poke weed
mitogen）を用いて末梢血液リンパ細胞を刺激
した。(A)において用いられたリンパ細胞の同一
試料のフラクシヨンに適用されたこの手順によ
つて全体で37個のハイブリツドを生産したとこ
ろ、このうちの23個が蛋白質Ａで被覆されたシ
ープ赤血球の使用に基づくブロードスペクトル
試験におけるヒユーマンIgに対して陽性であつ
た。これらの細胞はラビツト抗−ヒユーマン
Ig、次いで培養培地上澄みを用いて培養し、続
いてヒユーマンIgが該上澄みによつて系内へ導
入されたなら赤血球を溶解させるモルモツト補
体を用いて処理した。しかしながら37個のうち
23個が陽性となつたが、これらのハイブリドー
マのいずれも１カ月以上にわたつてその抗体生
産能を維持しなかつた。 実施例５：酵母チユーブリンに対する単クロー
ン性抗体の生体内生産 実施例２に記載のようにして生産された
YOL1／34.10.1セルをF1ハイブリツド（lou×
AO）ラツト内で腫瘍として増殖させた。この手
順は最初は一匹のラツトを用いるが、次いでこの
ラツトから得られた腫瘍を他のラツトに移植さ
せ、そこから得られた腫瘍をさらに２回移植させ
て、全体で４世代のラツトを使用した。 全体で４世代を結びつけたラツトをそれぞれ17
匹、19匹および９匹使用する３つの別々の実験に
おいては、細胞（５×107）を皮下注射によつて
投与した。各ラツトにおいては約10日後に注射し
た部分に充実性の腫瘍がみられ、ラツトが苦痛の
徴候を示しはじめたら全身麻酔した後、動脈から
全身出血させることによつて殺した（上述のよう
にある場合には腫瘍細胞の一部は次の世代のラツ
トへの移植用に使用した）。補集された血液は37
℃で30分間凝固させ、血清は遠心分離によつて澄
ませた。３つの実験において補集された血液量は
17匹のラツトからは135ml、19匹のラツトから169
ml、９匹のラツトからは100mlであつた（血清の
収量はこれらの量の約2/3であつた）。 第４の実験においては全体で４世代を結びつけ
た11匹のラツトを用いて腫瘍は腹水腫瘍として増
殖させた。細胞（５×107）は腹腔内注射によつ
て投与し、次いで約２週間以前にプリスタン0.5
mlを腹腔内注射し、殺して腹腔内を切り開いて抗
体源として血液と含水液を補集した。補集された
血液と腹水液の全収量は271mlであつた。 ラツト１匹あたりの抗体含有液体の収量は腹腔
内に注射された腹水腫瘍ラツトに対しては高い
が、抗体力価はこれらの動物からの液体において
は一般に低く、典型的な力価は皮下注射された充
実性腫瘍ラツトに対しては５×105〜106である
が、腹水腫瘍ラツトによる力価のほんのわずかの
もののみがこれと同じぐらいの高い値を示すにす
ぎなかつた。充実性腫瘍ラツトに対するIgG含量
は典型的には10〜15mg／mlであるが、腹水腫瘍ラ
ツトに対してはしばしば８mg／ml以下となつた。 得られた血清または血清腹水液は当該技術分野
で既知の手段例えば実施例６に記載の方法を用い
ることによつてそれらの使用目的に適した程度に
までさらに精製してもよい。 実施例６：単クローン性抗体の生体外生産 ハイブリドーマセル、例えば実施例２で生産さ
れたものを最小量の血清（0.5％ｖ／ｖ）の存在
下で増殖させた。これらの細胞は、胎児性子牛血
清0.5％（ｖ／ｖ）で補充されたDMM培地を含
む５スピナーフラスコ内においてCO210％、空
気90％の雰囲気下で増殖させた。細胞は、懸濁液
が典型的には１mlあたり抗体10〜50μｇ含有す る定常相(1)に達するまで増殖する。 抗体調製品を精製するには硫酸アンモニウムを
懸濁に添加して50％飽和溶液とし、得られた沈殿
を補集する。沈殿を最小容量の燐酸塩バツフアー
サーリンに溶解させ、この溶液を同一媒体に対す
る透析に付して精製された抗体調整品を得る。 (1) 第２の変形法では細胞を最小の血清濃度を用
いて対数相（logarithmic phase）で増殖さ
せ、次いで血清を含まないがイスコブ
（Iscove）によつて推奨されているような増殖
添加剤を含有する媒体で直接希釈する。 (2) 第３の変形法では精製手順をDEAEクロマト
グラフイーまたは免疫吸着剤、例えば抗−ラツ
トイムノグロブリンを用いて続けるか、膜フイ
ルターの使用でこの手順を置きかえる。 実施例７：セルラインYB2／3.0.Ag.20の適応
生産 標準的なサーリン中のYB2／3.0.Ag.20セル108
〜109個を皮下注射によつてラウラツト（Lou
rat）に投与したところ注射した場所に充実性腫
瘍が徐々に発現した。腫瘍退化の第１の徴候がみ
られた時点でラツトを殺して腫瘍を剔出した。腫
瘍を粉砕し、標準サーリン中の腫瘍細胞108〜109
個を皮下注射によつて第２のラウラツトに投与し
た。全体で10匹のラウラツト内において細胞が増
殖するまでこの手順をくり返した。腫瘍退化の徴
候が最初の数匹において検出されたが、このよう
な徴候はセルラインがラウラツト内での増殖によ
りよく適応するようになるとその後のラツトでは
みられなかつた。これらのその後のラツトは苦痛
の徴候を示しはじめたら殺した。腫瘍の増殖が
徐々に容易になることは、最初の数匹の後の各ラ
ツト内における増殖期間が短くなることによつて
示される。10匹のラツトに注射をおこなつた日付
は次の通りである：９月９日、10月16日、10月28
日、11月12日、11月20日、11月28日、12月６日、
12月15日、12月22日および12月31日。 10匹のラツトからの腫瘍細胞は10％（ｖ／ｖ）
FCS含有DMM内へ入れ、プランジヤーを用いて
微細なナイロン網を押し通すことによつて粉砕し
て細胞懸濁液を得た。この懸濁液を種々の希釈度
で20％ｖ／vFCS含有DMM内に分配させ、培地
内のFCS濃度が徐々に減少するLinbroプレート
内でくり返して二次培養した。 ３週間後、2.5％（ｖ／ｖ）FCS含有DMM内で
の二次培養増殖物（YBO）を得た。このセルラ
インをYB2／3.0.Ag.20自体に関する実施例１に
記載の手順と同様にしてDMM／2.5％（ｖ／ｖ）
FCS内でのスピナー培養に付した。セルライン
YBOの特性は実質上はYB2／3.0.Ag.20の特性と
同様であるが、ハイブリツドLou×AOラツトに
おけると同様に純粋なLouにおける増殖にも容易
に適応し、AOマーカーはこのセルラインにおい
ては明らかに失われているか、完全に抑制されて
いる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ８−アザグアニンに対し抵抗性であり、ヒポ
キサンチン／アミノプテリン／チミジンを含む培
地中で死に、免疫グロブリン鎖を発現する能力を
欠くラツト骨髄腫セルラインYB2／3.0.Ag.20、
またはそれを継代することにより得られかつ上記
特性を有するその特異株を免疫原で感作された免
疫細胞と細胞融合させ、得られたヒポキサンチ
ン／アミノプテリン／チミジンを含む培地中で死
なないハイブリツド骨髄腫セルラインの細胞を、
それ用のインビトロまたはインビボ培地中で培養
し、次いでこの培地から抗体を単離することを特
徴とするモノクローナル抗体の生産方法。 ２ 免疫細胞が脾臓細胞である第１項記載のモノ
クローナル抗体の生産方法。 ３ 免疫細胞が免疫原の投与により免疫原に感作
された動物から得られたものである第１項または
第２項記載のモノクローナル抗体の生産方法。 ４ セルラインYB2／3.0.Ag.20の細胞と免疫原
に感作された動物からの免疫細胞とを細胞融合さ
せることによりハイブリツド骨髄腫細胞を得、こ
のハイブリツドをインビトロまたはインビボのそ
れ用の培地で培養して、感作免疫原に対する抗体
を得る第１〜３項いずれかに記載のモノクローナ
ル抗体の生産方法。 ５ 免疫細胞がラツトの細胞である第１〜４項い
ずれかに記載のモノクローナル抗体の生産方法。 ６ ハイブリツド骨髄腫セルラインの細胞を、ラ
ツトにハイブリツドを接種することにより培養
し、充実性または腹水腫瘍を生産し、次いで該ラ
ツトの血清および／または腹水から抗体を単離す
る第１〜５項いずれかに記載のモノクローナル抗
体の生産方法。
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| US4634666A (en) * | 1984-01-06 | 1987-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Human-murine hybridoma fusion partner |
| US4562003A (en) * | 1984-10-26 | 1985-12-31 | California Biotechnology, Inc. | Monoclonal antibodies against alveolar surfactant protein |
| JP2532858B2 (ja) * | 1985-04-01 | 1996-09-11 | セルテツク リミテツド | 形質転換したミエロ―マ細胞系 |
| US5981216A (en) * | 1985-04-01 | 1999-11-09 | Alusuisse Holdings A.G. | Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same |
| US4808532A (en) * | 1985-07-01 | 1989-02-28 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Continuous human cell lines and method of making same |
| US5292636A (en) * | 1986-03-31 | 1994-03-08 | T Cell Diagnostics, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods using soluble T cell surface molecules |
| JPS63180059U (ja) * | 1987-05-11 | 1988-11-21 | ||
| EP0329184A3 (en) * | 1988-02-19 | 1990-05-23 | Neorx Corporation | Antimers and antimeric conjugation |
| DE68928124T2 (de) | 1988-09-02 | 1997-10-16 | Chiron Corp., Emeryville, Calif. | Makrophagenabgeleiteter entzündungsmediator(mip-2) |
| CA2002067A1 (en) * | 1988-11-09 | 1990-05-09 | Tamotsu Fukuda | Parent cell line for producing human hybridomas |
| JPH0727946Y2 (ja) * | 1989-03-14 | 1995-06-28 | トーコー衛材株式会社 | 簡易マスク |
| US5567594A (en) * | 1991-04-26 | 1996-10-22 | Enteron, L.P. | Methods and compositions for the detection and treatment of diseases associated with antigens of microorganisms |
| US6190864B1 (en) * | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
| EP1421951A3 (en) | 1993-05-12 | 2005-10-05 | Chiron Corporation | Conserved motif of hepatitis C virus E2/NS1 region |
| US6471956B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
| US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
| US6124448A (en) * | 1994-08-17 | 2000-09-26 | The Rockfeller University | Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene |
| US6124439A (en) * | 1994-08-17 | 2000-09-26 | The Rockefeller University | OB polypeptide antibodies and method of making |
| US6350730B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-02-26 | The Rockefeller University | OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight |
| US6048837A (en) * | 1994-08-17 | 2000-04-11 | The Rockefeller University | OB polypeptides as modulators of body weight |
| US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US5759776A (en) * | 1995-06-05 | 1998-06-02 | California Pacific Medical Center | Targets for breast cancer diagnosis and treatment |
| US5776683A (en) * | 1996-07-11 | 1998-07-07 | California Pacific Medical Center | Methods for identifying genes amplified in cancer cells |
| US6893636B2 (en) * | 1997-02-20 | 2005-05-17 | Biogen Idec Ma Inc. | Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics |
| US7314711B2 (en) | 1997-05-23 | 2008-01-01 | Bioveris Corporation | Assays employing electrochemiluminescent labels and electrochemiluminescence quenchers |
| US7541151B2 (en) | 1997-06-05 | 2009-06-02 | Duke University | Single-cell biosensor for the measurement of GPCR ligands in a test sample |
| US6528271B1 (en) | 1997-06-05 | 2003-03-04 | Duke University | Inhibition of βarrestin mediated effects prolongs and potentiates opioid receptor-mediated analgesia |
| US5891646A (en) * | 1997-06-05 | 1999-04-06 | Duke University | Methods of assaying receptor activity and constructs useful in such methods |
| NZ505008A (en) | 1997-12-11 | 2003-07-25 | Univ Saskatchewan | Porcine circovirus (PCV) isolates from pigs displaying postweaning multisystemic wasting syndrome virus |
| EP1816200B1 (en) | 1997-12-11 | 2016-03-09 | Merial | Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs |
| US6087128A (en) | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
| US6369201B1 (en) | 1998-02-19 | 2002-04-09 | Metamorphix International, Inc. | Myostatin multimers |
| AU766492B2 (en) * | 1998-09-18 | 2003-10-16 | Dynavax Technologies Corporation | Methods of treating IgE-associated disorders and compositions for use therein |
| US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
| US6773911B1 (en) * | 1998-11-23 | 2004-08-10 | Amgen Canada Inc. | Apoptosis-inducing factor |
| US6156514A (en) * | 1998-12-03 | 2000-12-05 | Sunol Molecular Corporation | Methods for making recombinant cells |
| EP2275133A1 (en) | 1999-02-26 | 2011-01-19 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Use of bioadhesives and adjuvants for the mucosal delivery of antigens |
| US6399759B1 (en) | 1999-05-27 | 2002-06-04 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Ant proteases and methods of inhibition |
| US6262265B1 (en) | 1999-06-18 | 2001-07-17 | Microgenics Corporation | Non-hydrolyzable analogs of heroin metabolites suitable for use in immunoassay |
| EP1903107A1 (en) | 1999-09-24 | 2008-03-26 | Cybios LLC | Pluripotent embryonic-like stem cells, compositions, methods and uses thereof |
| DE19957065B4 (de) | 1999-11-26 | 2005-01-05 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Screening-Verfahren für Arzneistoffe |
| WO2001051649A2 (en) * | 2000-01-11 | 2001-07-19 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Identification of virulence determinants |
| AU2016204535C1 (en) * | 2000-04-12 | 2017-02-23 | Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Anti-D monoclonal antibodies |
| FR2807767B1 (fr) | 2000-04-12 | 2005-01-14 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps monoclonaux anti-d |
| US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
| AU2000261978B2 (en) | 2000-05-10 | 2006-07-06 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Human igm antibodies with the capability of inducing remyelination, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system |
| US7250294B2 (en) | 2000-05-17 | 2007-07-31 | Geron Corporation | Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells |
| EP1734050A3 (en) | 2000-06-12 | 2012-12-05 | University Of Saskatchewan | Immunization of dairy cattle with GapC protein against streptococcus infection |
| US7163800B2 (en) * | 2000-11-03 | 2007-01-16 | Molecular Devices Corporation | Methods of screening compositions for G protein-coupled receptor desensitization inhibitory activity |
| US20050136431A1 (en) * | 2000-11-03 | 2005-06-23 | Oakley Robert H. | Methods of screening compositions for G protein-coupled receptor desensitization inhibitory activity |
| US7018812B2 (en) * | 2000-11-03 | 2006-03-28 | Duke University | Modified G-protein coupled receptors |
| FR2817875B1 (fr) * | 2000-12-07 | 2005-03-18 | Technopharm | Procede de preparation d'un anticorps monoclonal humain, de fragments de celui-ci ou d'anticorps comprenant de tels fragments, les anticorps ainsi obtenus et leur utilisation |
| US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
| US20110313230A1 (en) | 2001-05-11 | 2011-12-22 | Terrance Grant Johns | Specific binding proteins and uses thereof |
| EP1392359B2 (en) | 2001-05-11 | 2013-03-13 | Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. | Specific binding proteins and uses thereof |
| WO2002099069A2 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | The Regents Of The University Of California | Modulating neuronal outgrowth via the major histocompatibility complex class i (mhc i) molecule |
| US20090324612A1 (en) * | 2001-06-05 | 2009-12-31 | Kaufman Daniel L | Modulating neuronal outgrowth via the major histocompatibility complex class i (mhc i) molecule |
| EP1978108A3 (en) | 2002-01-08 | 2009-01-07 | Siemens Healthcare Diagnostics GmbH | Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy |
| US20030182669A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Rockman Howard A. | Phosphoinositide 3-kinase mediated inhibition of GPCRs |
| AU2003228348A1 (en) * | 2002-03-20 | 2003-10-08 | John T. Fassett | Induction of hepatocyte proliferation in vitro by inhibition of cell cycle inhibitors |
| US7290215B2 (en) * | 2002-06-03 | 2007-10-30 | Microsoft Corporation | Dynamic wizard interface system and method |
| US7514233B2 (en) | 2002-09-26 | 2009-04-07 | K.U. Leuven Research & Development | Integrase cofactor |
| AU2002953431A0 (en) * | 2002-12-19 | 2003-01-09 | Murdoch University | BmpB Novel Nucleotide and Amino Acid Sequences and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof |
| WO2004067717A2 (en) * | 2003-01-24 | 2004-08-12 | Duke University | Modified trafficking patterns for arrestin and g-protein-coupled receptors via arrestin-ubiquitin chimera |
| AU2004247021A1 (en) * | 2003-05-16 | 2004-12-23 | Acorda Therapeutics | Compositions and methods including a recombinant human MAB that promotes CNS remyelination |
| US20060035242A1 (en) | 2004-08-13 | 2006-02-16 | Michelitsch Melissa D | Prion-specific peptide reagents |
| US7767792B2 (en) | 2004-02-20 | 2010-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Antibodies to EGF receptor epitope peptides |
| US7138504B2 (en) * | 2004-08-12 | 2006-11-21 | Microgenics Corporation | Reagents and methods for mycophenolic acid immunoassay |
| US20060240496A1 (en) * | 2005-04-21 | 2006-10-26 | Lakshmi Anne | Immunogens, derivatives and immunoassay for ethyl glucuronide |
| EP2224008A3 (en) | 2005-05-12 | 2010-12-01 | Murdoch University | Genes and proteins of brachyspira hyodysenteriae and use of same for diagnosis and therapy |
| US9062289B2 (en) | 2005-06-22 | 2015-06-23 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Differentiation of primate pluripotent stem cells to cardiomyocyte-lineage cells |
| US7780969B2 (en) * | 2005-07-15 | 2010-08-24 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Trypanosoma cruzi proteome compositions and methods |
| US20090214528A1 (en) * | 2005-08-31 | 2009-08-27 | Haimanti Dorai | Host cell lines for production of antibody constant region with enhanced effector function |
| CN101627111A (zh) * | 2005-08-31 | 2010-01-13 | 森托科尔公司 | 用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系 |
| EP3167900B1 (en) | 2006-03-29 | 2018-11-21 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| EP2881468B1 (en) | 2006-04-21 | 2017-04-12 | Intervet International B.V. | Pestivirus species |
| EP2764874A1 (en) | 2007-07-17 | 2014-08-13 | The General Hospital Corporation | Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic stem cells and uses thereof |
| KR20140120946A (ko) | 2007-08-03 | 2014-10-14 | 베링거 인겔하임 베트메디카 게엠베하 | 브라키스피라 하이오디센테리애의 유전자와 단백질 및 이의 용도 |
| EP2363407A1 (en) | 2008-02-28 | 2011-09-07 | Murdoch University | Novel sequences of Brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof |
| EP3293255A1 (en) | 2008-03-27 | 2018-03-14 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Differentiation of primate pluripotent stem cells to hematopoietic lineage cells |
| WO2009117773A1 (en) | 2008-03-27 | 2009-10-01 | Murdoch University | Novel sequences of brachyspira, immunogenic compositions, methods for preparation and use thereof |
| EP2419121B1 (en) | 2009-04-17 | 2018-07-18 | New York University | Peptides targeting tnf family receptors and antagonizing tnf action, compositions, methods and uses thereof |
| US20110076232A1 (en) | 2009-09-29 | 2011-03-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Specific binding proteins and uses thereof |
| US9005579B2 (en) | 2010-01-05 | 2015-04-14 | Contrafect Corporation | Methods and compositions for enhanced immunological therapy and targeting of gram-positive bacteria |
| WO2011113118A1 (en) | 2010-03-19 | 2011-09-22 | Katholieke Universiteit Leuven | Drug tolerance/persistence of fungal biofilms |
| EP2808344A1 (en) | 2010-06-01 | 2014-12-03 | Monash University | Antibodies directed to the receptor tyrosine kinase c-Met |
| WO2012064286A1 (en) | 2010-11-11 | 2012-05-18 | Agency For Science, Technology And Research | Targeting metabolic enzymes in human cancer |
| US20140329314A1 (en) | 2011-03-29 | 2014-11-06 | Christopher O'Sullivan | Enriched populations of cardiomyocyte lineage cells from pluripotent stem cells |
| GB201107467D0 (en) | 2011-05-05 | 2011-06-15 | Univ Leuven Kath | Novel treatment of pain |
| AU2012385228B2 (en) | 2012-07-12 | 2016-10-06 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd | Conjugates of cell binding molecules with cytotoxic agents |
| EP2922818B1 (en) | 2012-11-24 | 2018-09-05 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd | Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules |
| EP3013857B1 (en) | 2013-06-28 | 2021-06-23 | Singapore Health Services Pte Ltd | Trpm4 channel inhibitors for stroke treatment |
| CN107074879B (zh) | 2013-09-02 | 2022-04-15 | 杭州多禧生物科技有限公司 | 应用于细胞结合分子-药物共轭体的新型细胞毒性分子 |
| SG11201707615YA (en) | 2013-09-19 | 2017-10-30 | Univ Leland Stanford Junior | Methods and compositions for producing hepatocyte-like cells |
| EP3122757B1 (en) | 2014-02-28 | 2023-09-06 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd | Charged linkers and their uses for conjugation |
| US9958464B2 (en) | 2015-03-03 | 2018-05-01 | Ark Diagnostics, Inc. | Pregabalin immunoassays |
| JP6759326B2 (ja) | 2015-07-12 | 2020-09-23 | ハンジョウ ディーエーシー バイオテック シーオー．，エルティディ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｄａｃ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． | 細胞結合分子の共役のための架橋連結体 |
| US9839687B2 (en) | 2015-07-15 | 2017-12-12 | Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. | Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule |
| AU2016429272A1 (en) | 2016-11-14 | 2019-05-02 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. | Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers |
| US11578140B2 (en) | 2019-03-26 | 2023-02-14 | Microgenics Corporation | Immunoassay for mitragynine |
| KR20220029725A (ko) | 2019-06-29 | 2022-03-08 | 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 | 세포-결합 분자-튜불리신 유도체 접합체 및 이의 제조 방법 |
| CA3167027A1 (en) | 2020-02-05 | 2021-08-12 | Larimar Therapeutics, Inc. | Tat peptide binding proteins and uses thereof |
| EP3862023A1 (en) | 2020-02-05 | 2021-08-11 | Hangzhou DAC Biotech Co, Ltd | Conjugates of cell-binding molecules with cytotoxic agents |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1142466A (en) * | 1979-01-09 | 1983-03-08 | Cesar Milstein | Cell lines |
-
1981
- 1981-07-03 EP EP81303055A patent/EP0043718B1/en not_active Expired
- 1981-07-03 DE DE8181303055T patent/DE3167442D1/de not_active Expired
- 1981-07-06 CA CA000381131A patent/CA1173379A/en not_active Expired
- 1981-07-07 US US06/281,038 patent/US4472500A/en not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| EP0043718A2 (en) | 1982-01-13 |
| DE3167442D1 (en) | 1985-01-10 |
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