JPH05271091A - 血球減少改善剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、ＩＬ−１α及びその誘導体から選ば
れる少なくとも１種を有効成分として含有することを特
徴とする血球減少改善剤を提供するものである。 【効果】本発明血球減少改善剤は、血球減少改善に著効
を奏し医薬品として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は血球減少改善剤に関す
る。

【０００２】

【従来技術とその課題】本発明者らは、従来よりインタ
ーロイキン−１（ＩＬ−１）につき、医薬分野での応用
のための薬理作用を主として、その遺伝子組換え技術に
従う誘導体の開発をも含めて、鋭意検討を重ねてきた結
果、上記ＩＬ−１αがその本来の生物活性であるＬＡＦ
活性や、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）等のサイトカイン（cytokine）類の産生促
進活性等に基づいて、免疫刺激剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤
等の医薬品として有用であるに加えて、血小板減少症治
療剤（特開平２−１３８２２４号公報）、ＩＬ−６産生
誘導剤（特開平３−１９７４３３号公報）、肝炎予防及
び治療剤（特願昭２−２１２９４１号）等としても有効
であることを見出した。

【０００３】之等ＩＬ−１αの医薬用途は、いずれもＩ
Ｌ−１αに固有の生物活性に基づくものと考えられる
が、それら相互の関連性については、現在尚解明されて
いない現状にある。

【０００４】本発明者らは更に引き続き鋭意研究を重ね
た結果、上記ＩＬ−１αが、それに個有の各種造血因子
の産生誘導作用及び造血幹細胞刺激活性（分化初期段階
の造血前駆細胞を活性化して造血因子に対する反応性を
誘導する作用）に基づいて、血球減少の改善作用を発揮
するという新しい事実を見出した。本発明はこの事実の
発見に基づき完成されたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明はＩＬ−１
α及びその誘導体から選ばれる少なくとも１種を有効成
分として含有することを特徴とする血球減少改善剤に係
わる。

【０００６】本発明の血球減少改善剤は、上記の通りＩ
Ｌ−１α及びその誘導体を有効成分とすることを必須の
要件とし、これに基いて顕著な血球減少改善作用を発揮
し、かくして血球減少改善剤として医薬分野で非常に有
効である。

【０００７】しかして、従来ＩＬ−１α及びその誘導体
がＬＡＦ活性；腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）；
ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、イ
ンターロイキン３（ＩＬ−３）等の種々のサイトカイン
類の産生促進活性；抗炎症活性；放射線障害防止作用等
を有することは知られているが、之等が血球減少の改善
効果を有することは報告がなく、勿論この血球減少改善
効果と上記公知の各種作用との関連性についても何ら報
告はない。

【０００８】本発明改善剤の有効成分とするＩＬ−１α
とは、ＬＡＦ（Lymphocyte Activating Factor）活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列から
同定された１５９個のアミノ酸配列を有するＩＬ−１α
（Proc. Natl. Acad. Sci.,Vol. 81,7907-7911 (198
4)；Nature, Vol.315, 641 (1985) ；Nucleic Acid Res
earch, Vol.13, (16) 5869 (1985) 等参照）を意味す
る。これはその産生細胞から通常の方法により抽出、単
離される天然型であってもよく、また遺伝子工学的手法
により得られる組換え型であってもよい。

【０００９】また上記ＩＬ−１αの誘導体には、各種の
ものが含まれ、その代表例としては本願人らの先の出願
に係わる各種のアミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘導体
が包含される（特開平２−１６７２９８号公報、欧州特
許公開１８７９９１号等参照）。

【００１０】上記ＩＬ−１α誘導体としては、より詳し
くは１５９個のアミノ酸配列からなる天然型ＩＬ−１α
の該アミノ酸配列の３６位Asn 及び１４１位Cys の少な
くとも一つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他の
アミノ酸残基で置換されている改変されたアミノ酸配列
を有する誘導体を例示できる。該ＩＬ−１α誘導体に
は、上記改変されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１α誘
導体アミノ酸配列を更に改変して、その１６位Arg が欠
失されていること、該１６位Arg が他のアミノ酸残基で
置換されていること、１位Ser から１４位Phe に至るア
ミノ酸配列が欠失されていること及び１位Ser から１５
位Met に至るアミノ酸配列が欠失されていることから選
ばれる条件の少なくとも１つを充足させたアミノ酸配列
を有する誘導体が包含される。

【００１１】上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸
及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢによる命名法又は規則における略号乃至当該分
野で慣用されている略号による表示法に従うものとす
る。

【００１２】上記改変を行ない得る他のアミノ酸残基と
しては、特に好ましくは、例えば１６位Arg の場合はGl
y を、３６位Asn の場合はAsp を、１４１位置Cys の場
合はSer をそれぞれ例示できる。

【００１３】本発明改善剤において有効成分とする各種
のＩＬ−１α誘導体は、前記した各公報等に記載される
ように公知であり、一般的な遺伝子工学的手法により、
即ち、前記特定のポリペプチドをコードする遺伝子（以
下「目的遺伝子」という）を利用して、該目的遺伝子が
宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡを作成し、
これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体の
培養によって、上記目的遺伝子を複製、転写、翻訳、発
現させることにより製造できる。

【００１４】該製造法において用いられる遺伝子は、例
えばホスファイト トリエステル法（Nature, 310, 105
(1984) ）等の常法に従い、核酸の化学合成により全合
成することもできるが、ＩＬ−１もしくはその前駆体を
コードする遺伝子を利用して合成するのが簡便であり、
例えば該遺伝子より上記化学合成手段を含む常法に従
い、前記特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列に改
変すること等により容易に製造できる。ＩＬ−１α又は
その前駆体をコードする遺伝子としては公知のものをい
ずれも利用できる（例えば特開昭６２−１７４０２２号
公報参照）。上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方
法に従えばよく、目的とするポリペプチドのアミノ酸配
列に応じて実施される（遺伝子工学的手法としては、例
えばMolecular Cloning Cold Spring Harbor Laborator
y (1982)参照）。

【００１５】上記形質転換体の創製に当り、宿主細胞と
しては、真核生物及び原核生物のいずれをも利用でき、
該真核生物の細胞には脊椎動物、酵母等の細胞が含ま
れ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣ
ＯＳ細胞（Y. Gluzman, Cell,23, 175-182 (1981)）や
チヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダ
クターゼ欠損株（G. Urlaub and L. A. Chasin, Proc.
Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216-4220 (1980)）等
がよく用いられるがこれらに限定はされない。脊椎動物
細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺
伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライ
ス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有
するものを使用でき、これは更に必要により複製起源を
保有していてもよい。該発現ベクターの例としては、Ｓ
Ｖ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr（S.
Subramani, R. Mulligan and P. Berg, Mol. Cell. Bi
ol.,1, (9), 854-864(1981)）等を例示できるがこれに
限定されない。また、真核微生物としては酵母が一般に
よく用いられ、その中でもサッカロミセス属酵母を有利
に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターと
しては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロ
モーターを持つｐＡＭ８２（A. Miyanohara etal., Pro
c. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 1-5 (1983)）等を
好ましく利用できる。

【００１６】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられ、例えば該宿主菌中で複製可能な
プラスミドベクターを用い、このベクター中に目的遺伝
子が発現できるように、該遺伝子の上流にプロモーター
及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、
更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラス
ミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌としては
エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia coli ）Ｋ１２株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２
がよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各種
の菌株及びベクターをいずれも利用できる。プロモータ
ーとしては、例えばトリプトファン・プロモーター、Ｐ
_L プロモーター、lac プロモーター、lpp プロモーター
等を使用でき、いずれの場合にも目的遺伝子を発現させ
得る。

【００１７】発現ベクターの宿主細胞への導入及びこれ
による形質転換の方法としては、一般に用いられている
方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、Ｃ
ａＣｌ₂ 処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態に
して、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。上記
方法においては、通常知られているように形質転換の効
率を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂ やＲｂＣｌを培地
に更に共存させることもできる。また、宿主細胞をスフ
エロプラスト又はプロトプラスト化後に形質転換させる
方法も採用できる。

【００１８】所望の形質転換株は、常法に従い培養で
き、該培養により所望のポリペプチドが生産、蓄積され
る。該培養に用いられる培地は、通常の細胞培養に慣用
される各種の培地のいずれでもよく、その具体例として
は、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常
知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン
類等を添加した培地を例示できる。尚、上記トリプトフ
ァン・プロモーターを用いた場合には、一般に該プロモ
ーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加した、
例えばＭ９最小培地を用いて培養することができ、該培
地中には培養の適当な時期にインドールアクリル酸等の
トリプトファン・プロモーターの働きを強めるための薬
剤を添加することもできる。

【００１９】かくして得られる活性物を含有する培養物
からの目的ポリペプチド、即ち前記特定のＩＬ−１α誘
導体の精製、単離は常法に従い行ない得る。尚、該ポリ
ペプチドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透圧
ショック法等の温和な条件を採用するのがその高次構造
保持の面からより好ましい。

【００２０】上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチ
ドの物理、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い
実施できる（例えば「生化学データーブックII」pp1175
-1259 、第１版第１刷、1980年 6月23日、株式会社東京
化学同人発行参照）。該方法としては具体的には例えば
通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいク
ロマトグラフィー（ゲル濾過）、液体クロマトグラフィ
ー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフ
ィー、透析法、之等の組合等を採用できる。

【００２１】本発明の血球減少改善剤は、ＩＬ−１α及
びその誘導体を有効成分として含有させることを必須と
し、他は通常の医薬組成物と同様とすることができ、他
に薬理的有効成分や製剤上の慣用成分等を任意に配合
し、常法に従いその適用に適した薬理組成物形態に調製
される。

【００２２】上記薬理組成物に配合できる他の成分とし
ては、特にＩＬ−１α活性物の安定化の面より、例えば
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等のアルブミン類や通常
のＬ−型アミノ酸、好ましくはシステイン、グリシン等
を例示できる。之等の添加量は、特に制限されるもので
はないが、ＩＬ−１α活性物１μｇ当りアルブミン類で
は約０．０１〜１０ｍｇ程度、アミノ酸は約０．００１
〜１０ｍｇ程度（２種以上のアミノ酸を併用する場合は
それらの合計量）とするのが適当である。また上記薬理
組成物には、更に必要に応じて、糖類例えばグルコー
ス、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン
ニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコー
ル類、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキスト
ラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多糖等、好まし
くはショ糖、マルトース、マンニトール、イノシトー
ル、デキストラン等や、イオン性及び非イオン性界面活
性剤、就中ポリオキシエチレングリコールソルビタンア
ルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
ル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセ
リド系等の界面活性剤を配合することもできる。上記糖
類はＩＬ−１α活性物１μｇ当り約０．１ｍｇ程度以
上、好ましくは約１〜１００ｍｇ程度の範囲、界面活性
剤は同活性物１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度以上、
好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲で添加
されるのが適当である。

【００２３】本発明改善剤の調製方法につき詳述すれ
ば、該改善剤は、一般に薬理有効量のＩＬ−１活性物
（ＩＬ−１α及びその誘導体）及び必要に応じ配合され
得る上記成分と共に、適当な医薬製剤担体を配合して製
剤組成物の形態に調製される。該製剤担体としては使用
形態に応じた製剤の調製に通常慣用される充填剤、増量
剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃至希釈剤をい
ずれも使用できる。製剤組成物の形態は、これが有効成
分であるＩＬ−１活性物を効果的に含有する状態であれ
ば特に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤
等の固剤であってもよく、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射
剤形態であってもよい。またこれは使用前に適当な担体
の添加により液状となし得る乾燥品とすることもでき
る。之等の製剤組成物はいずれも常法に従い調製され得
る。

【００２４】尚、上記において担体として採用し得る緩
衝液としては、特に限定されるものではないが、例えば
クエン酸−リン酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナト
リウム、酢酸−酢酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム−
リン酸一ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のｐＨ４〜
８、より好ましくはｐＨ５〜６の各緩衝液を例示するこ
とができる。

【００２５】得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投
与され、固剤形態の医薬製剤は経口乃至は経腸投与され
得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量
は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用
される患者の症状等に応じて適宜選択され一定ではない
が、通常有効成分を約０．００００１〜８０重量％程度
含有する製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有さ
れる有効成分量が１日成人１人当り約０．０１μｇ〜１
０ｍｇ程度となる範囲で投与するのが望ましい。該投与
は１日１回である必要はなく１日３〜４回に分けること
もできる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明する。尚、各例において生理活性は、特開平２−１６
７２９８号公報記載の方法により測定したものである。

【００２７】また、ＩＬ−１α誘導体としては、ヨーロ
ッパ特許公開第２３７０７３号公報記載のプラスミドp
trp ＩＬ−１α−３６Ｄ・１４１Ｓ（これを保有する大
腸菌ＨＢ１０１株は、微工研に「Escherichia coli HB1
01/ IL-1α-36D 141S 」なる名称で微工研条寄第１２９
５号（ＦＥＲＭ ＢＰ１２９５）として寄託されてい
る）を利用して、同公開公報記載の方法により得られた
もの（以下「ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］」とい
う）を用いた。

【００２８】

【実施例１】血球減少改善剤の調製 ＩＬ−１α誘導体（ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］）
の生理食塩水溶液（ＧＩＦ活性として１×１０⁶ 単位／
ｍｌ）に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を０．５％と
なるように添加して、濾過（０．２２μｍメンブランフ
ィルター使用）後、これを無菌的に１ｍｌずつバイアル
瓶に分注して、凍結乾燥し、注射用製剤を調整した。か
くして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水１ｍｌ
に溶解して利用される。

【００２９】

【実施例２】 汎血球減少症モデルマウスに対するＩＬ
−１α誘導体の薬理効果試験 この例は、本発明血球減少改善剤有効成分化合物として
のＩＬ−１α及びその誘導体の汎血球減少症モデルマウ
スに対する効果を試験したものである。

【００３０】ＢＡＬＢ／ｃマウスに、６００Rad.のＸ線
を全身照射して汎血球減少症モデルマウスを作成し、該
マウス（１群４匹）にＸ線照射の翌日より、ＩＬ−１α
誘導体の１０μｇ／ｋｇ／日を連日７日間皮下投与し
た。

【００３１】尚、対照としてＩＬ−１α誘導体投与に代
えて、従来より血球減少の改善作用を奏することが知ら
れているエリスロポエチン（ＥＰＯ、「エスポー」、三
共社製）の１００Ｕ／ｋｇ／日を連日１４日間皮下投与
した。

【００３２】Ｘ線照射後、経日的に下大静脈より採血
し、末梢血血球数を自動血球計測装置（コールター社
製）により測定し、また網状赤血球数を、血液塗抹標本
を作成後、ブリリアント・クレシルブルー染色して、顕
微鏡下で測定した。更に骨髄及び脾臓中のＣＦＵ−Ｅ数
を、血漿凝縮塊法により３日間培養後、ベンチジン−ヘ
マトキシリン染色により測定し、ＣＦＵ−ＧＭ数及びＣ
ＦＵ−Ｍｅｇ数を軟寒天培養後、アセチルコリンエステ
ラーゼ、ヘマトキシリン染色により測定した。

【００３３】コントロールとして溶媒投与群を作成し、
該群に対する有意差検定をｔ−検定により実施した
（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ
＜０．００１）。

【００３４】供試薬剤投与スケジュールと共に、得られ
た結果を、図１及び図２に示す。

【００３５】図１は経日的末梢血血球数変化を示す図
（縦軸：末梢血赤血球数、×１０⁶ ／ｍｍ³ 、横軸：Ｘ
線放射後日数、日）であり、図２は経日的網状赤血球数
変化を示す図（縦軸：網状赤血球数、％、横軸：Ｘ線放
射後日数、日）である。

【００３６】上記各図より、ＩＬ−１の投与によれば、
Ｘ線照射１５日目より投与量依存的に赤血球数の著しい
回復促進効果が認められることが明らかである。

【００３７】また、同時に調べられた大腿骨骨髄細胞及
び脾臓細胞中の有核細胞数とＣＦＵ−Ｅ数とから、上記
ＩＬ−１α誘導体投与による赤血球数の著しい増加は、
之等有核細胞数及びＣＦＵ−Ｅ数の増加に伴って認めら
れることが明らかとなった。之等の効果は、ＥＰＯの投
与に比べても遥かに有意であった。

【００３８】更に、上記試験において、ＩＬ−１α誘導
体の投与と、ＥＰＯ１００Ｕ／ｋｇ／日）投与とを組合
せた場合、ＩＬ−１α誘導体の単独投与の場合と同様の
結果が得られた。

【００３９】以上の結果より、ＥＰＯでは充分な貧血改
善が得られないような重篤な骨髄障害を誘発したマウス
モデルにおいては、ＩＬ−１α誘導体が、未分化な造血
前駆細胞の増殖、分化を促進することによって、赤血球
系細胞の回復を顕著に促進することが明らかとなった。

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、血球減少改善剤を提供
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２に従い行なわれた汎血球減少症モデル
マウスに対するＩＬ−１α誘導体の薬理効果試験におけ
る経日的末梢血血球数変化を示す。

【図２】実施例２に従い行なわれた汎血球減少症モデル
マウスに対するＩＬ−１α誘導体の薬理効果試験におけ
る経日的網状赤血球数変化を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】インターロイキン−１α及びその誘導体か
   ら選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有するこ
   とを特徴とする血球減少改善剤。
2. 【請求項２】インターロイキン−１α誘導体がヒト組換
   え型ＩＬ−１α［３６Ｄ・１４１Ｓ］である請求項１に
   記載の血球減少改善剤。