JP2587711B2

JP2587711B2 - 抗腫瘍剤

Info

Publication number: JP2587711B2
Application number: JP2120557A
Authority: JP
Inventors: 一吉河合; 康江小西; 哲中井; 嘉勝平井
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-05-09
Filing date: 1990-05-09
Publication date: 1997-03-05
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: DK0482213T3; EP0482213A4; AU7757491A; AU644877B2; DE69130099D1; ES2121782T3; WO1991016916A1; EP0482213B1; EP0482213A1; DE69130099T2; JPH0418033A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、医薬上有用なガンマー・インターフェロン
とインターロイキン−１との配合剤に関する。

従来の技術ガンマー・インターフェロンは、1965年にイー・エフ
・ウィーロック（E.F Wheelock;Science,149,310-311,1
965）が、ヒト白血球に誘導剤としてPHA（フィトヘムア
グルチニン）を加えて培養すると、pH2で失活するウィ
ルス抑制因子が産生されることを見出し、得られたもの
である。次いでアール・ファルコフ（R.Falcoff;J.Gen.
Virol.,16,251〜253,1972）はpH2で失活するウィルス抑
制因子の分子量が50000であると報告したが、その後ワ
イ・ケー・イップら（Y.K.Yip,et al;Science,215,411
〜413,1982）はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（SDS-PAGE）で処理するとガンマー・インターフェロ
ンが分子量25000の画分と20000の画分に分離し得ること
を報告した。一方、ガンマー・インターフェロンが抗ウ
ィルス活性のみならず抗腫瘍活性を有することは公知で
あり、ジェイ・エル・クレインら（J.L.Crane,L.A.Glas
gow,E.R.Kern,and J.S.Younger;J.Natl.Cancer Inst.,6
1,871〜874,1978）、ジェイ・イー・ブラロックら（J.
E.Blalock,J.A.Georgiades,M.P.Langford,and H.M.John
son;Cell Immunol.,49,390〜394,1980）は、アルファ・
インターフェロンやベーター・インターフェロンに比較
して、ガンマー・インターフェロンの抗腫瘍活性は20〜
100倍強いことを報告している。

他方、インターロイキン−１は特異抗原、リポポリサ
ッカライドなどにより活性化された単球あるいはマクロ
ファージなどから産生される分子量12000〜18000程度の
ポリペプチドである［エス・ビー・ミゼル（S.B.Mize
l）,Immunol.Rev.,63,51〜71,1982］。インターロイキ
ン−１はＴ細胞の活性化に関与するのみならず、生体内
ではきわめて多彩な作用を発揮している［シー・エー・
ディナレロ（C.A.Dinarello）;New Eng.J.Med.,311,141
3〜1418,1984］。たとえば、インターロイキン−１はＢ
細胞活性化因子（B cell activating factor）とも呼ば
れていたように、Ｂ細胞に作用し、Ｂ細胞分化因子（B
cell differentiation factor;BCDF）と共同して免疫グ
ロブリン産生を誘導する［アール・ジェイ・ファルコフ
ら（R.J.Falkof,A.Muraguchi,J.X.Hong,et al.）;J.Imm
unol.,131,801〜805,1983］。その他インターロイキン
−１は種々の細胞に働き、さまざまな生物活性を示し免
疫、炎症、造血、内分泌、脳神経など、ほとんどすべて
の生体反応に重要な役割をはたしている。さらにインタ
ーロイキン−１は種々の腫瘍細胞に対し直接的な増殖抑
制や、細胞致死活性を示す［ケー・オノザキら（K.Onoz
aki,K.Matsushima,B.B.Aggarwal,et al.）;J.Immunol.,
135,3962,1985］ことから抗腫瘍剤としての用途も考え
られている。

発明が解決しようとする課題ガンマー・インターフェロン及びインターロイキン−
１は両者ともに腫瘍細胞に対して増殖抑制効果を有して
いるが、これらのいずれか一方を有効成分とする抗腫瘍
剤を投与した臨床治験では、発熱、胃腸症状、全身倦
怠、低血圧、筋肉痛などの副作用を示すことが報告され
ている。［エイチ・エー・ハーヴェイら（H.A.Harvey,
A.Lipton,D.S.Wlite,et at.）;Proc.ASCO.24,46,198
3］。このため、ガンマー・インターフェロン及びイン
ターロイキン−１はいずれも、癌の治療に対して期待さ
れていたもののこのような副作用を有するために大量投
与などの試みを断念せざるを得ないのが現状である。

従って、本発明は、ガンマー・インターフェロン又は
インターロイキン−１の抗腫瘍活性を増強し、これによ
りこれらの投与量を低減させ、上記副作用の軽減が可能
な抗腫瘍剤を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ね
る過程で、ガンマー・インターフェロン又はインターロ
イキン−１のいずれかの抗腫瘍活性を増強する物質の検
索を行ったが、良好な結果を得るには至らなかった。と
ころが、ガンマー・インターフェロンおよびインターロ
イキン−１を併用すると、予想外にも、それぞれの抗腫
瘍活性が相互に著しく増強され、それぞれ単独では抗腫
瘍効果が発揮されないような低い投与量においても腫瘍
細胞の増殖抑制効果が得られ、その結果、両者の投与量
を大幅に低減することが可能となることを見出した。本
発明は、この新知見に基づき完成されたものである。

すなわち、本発明は、ガンマー・インターフェロンと
インターロイキン−１とを有効成分とする抗腫瘍剤を提
供するものである。

本発明の抗腫瘍剤に用いるガンマー・インターフェロ
ンは、インターフェロン活性を有するものであれば、天
然、あるいは組換えのガンマー・インターフェロンでも
よい。一般にガンマー・インターフェロンの製造は、天
然型の場合はヒト白血球を採取するか、または、通常の
ヒト細胞を培養する方法によって株化Ｔ細胞を培養し、
これに誘導剤としてPHA,ConA等を用いて誘導産生する方
法が取られている〔イラナナサン（Ilana Nathan）
ら、Nature,292,842、1981マサコマツヤマ（Masako M
atsuyama）ら、The Journal of Immunology,129,450,19
82〕。この方法によって細胞を大量に得るには技術面、
コスト面で困難な点が多く、より安価に細胞を増殖させ
る方法として、ハムスター法が開発されている（特公昭
63-1296号及び特公昭56-54158号）。該方法の概要は次
の通りである。即ち、あらかじめ免疫抑制剤を投与した
幼若ハムスターの背部皮下に株化Ｔ細胞を移植すること
によってＴ細胞を増殖せしめると、ハムスターの背部に
腫瘍塊が出来る。これが一定の大きさになったところで
この腫瘍塊を取り出し、裁断後、破砕して細胞を分散さ
せて細胞浮遊液を調製する。このようにして調製された
Ｔ細胞にPHAを用いてガンマー・インターフェロンを誘
導産生する方法である。本方法によって得られるガンマ
ー・インターフェロンは天然型と同一の糖鎖を有してい
ることを特徴とする。この他、ガンマー・インターフェ
ロンを安定に、安価に製造するために遺伝子組換え技術
によって作成されたヒトのガンマー・インターフェロン
遺伝子を組み込まれた微生物を培養することにより、産
生することもできる〔パトリックダブリューグレイ
（Patrik W.Gray）ら、Nature,295,501,1982〕。但し、
該方法によって得られるガンマー・インターフェロンは
糖鎖を有していない〔エルンストリンデルクネヒト
（Ernst Rinderknecht）ら、The Journal of Biologica
l Chemistry 259,6790,1984〕。

これらガンマー・インターフェロンのうちでも、特
に、上記ハムスター法により製造されるもの等が好まし
く使用できる。

一方、本発明で使用されるインターロイキン−１とし
ては、インターロイキン−１活性を有するかぎりにおい
て、天然型あるいは遺伝子組換えにより産生されたイン
ターロイキン−１が包含される。天然型のインターロイ
キン−１の製造法は特開昭62-174022号に詳述されてい
る方法によって得ることが可能である。さらに遺伝子の
組換えによって得られるインターロイキン−１は特開昭
63-152398号に詳述されている方法によって種々のイン
ターロイキン−１誘導体を得ることが可能である。

これらインターロイキン−１のうちでも、本発明で
は、特に、IL-1βそのもの又は上記特開昭63-152398号
に記載されているインターロイキン−１β誘導体、例え
ば、下記に記載のものを例示できる。

IL-1β自体〔Gly⁴〕IL-1β（４位ArgをGlyに置換したIL-1β）〔Ala⁸〕IL-1β（８位CysをAlaに置換したIL-1β）〔Ala⁷¹〕IL-1β（71位CysをAlaに置換したIL-1β）〔Leu⁹³〕IL-1β（93位LysをLeuに置換したIL-1β）〔Arg¹²⁰〕IL-1β（120位TrpをArgに置換したIL-1
β）〔Tyr³⁰〕IL-1β（30位HisをTyrに置換したIL-1β）〔Ala⁸Ala⁷¹〕IL-1β（８位Cys及び71位Cysを８位Ala
及び71位Alaに置換したIL-1β） IL-1β−（4-153）ポリペプチド（１位Alaから３位Va
lに至るアミノ酸配列を欠失させたIL-1β） IL-1β−（1-150）ポリペプチド（151位以降を欠失さ
せたIL-1β）本発明の抗腫瘍剤は、ガンマー・インターフェロンと
インターロイキン−１とが単一の製剤中に含まれるよう
に調製して投与してもよく、或いは、ガンマー・インタ
ーフェロンとインターロイキン−１とのそれぞれを別個
の製剤として調製し、これら２つの製剤を投与しても良
い。いずれの場合も、ガンマー・インターフェロンとイ
ンターロイキン−１とは、相互に一方が他方の腫瘍細胞
増殖抑制作用を増強するため、両者の使用割合は、極め
て広い範囲から適宜選択できる。

本発明の抗腫瘍剤を臨床上使用するに際し、成人に対
する一日当たりの有効量に関しては、広い範囲から選択
でき、ガンマー・インターフェロンは、通常一日当たり
4.2μg/body〜4.2mg/body程度の範囲で使用すれば良
く、一方、インターロイキン−１は、一般に一日当たり
0.08〜８μg/body程度の範囲で使用するのが望ましい。
本発明では、既述のごとく、ガンマー・インターフェロ
ンとインターロイキン−１とは、相互に一方が他方の腫
瘍細胞増殖抑制作用を増強するため、たとえば、ガンマ
ー・インターフェロンをこの分野で通常採用されている
臨床投与量で使用する場合は、インターロイキン−１の
通常採用されている臨床投与量を1/100倍〜9/10倍程度
に減少させることができる。同様に、インターロイキン
−１を一般にこの分野で採用されている臨床投与量で使
用する場合は、ガンマー・インターフェロンの通常採用
されている臨床投与量を1/100倍〜9/10倍程度に減少さ
せることができる。前記副作用を回避する観点から、本
発明では、ガンマー・インターフェロンとインターロイ
キン−１のいずれか一方を上記有効量範囲内の低い目の
投与量で使用するのが望ましい。

本発明の抗腫瘍剤は、その使用目的に応じ、この分野
で慣用されている各種の投与形態で使用される。特に、
本発明では、上記製剤を製造する際に、人血清アルブミ
ン及び／又は糖類と界面活性剤を使用することにより、
有効成分、就中インターロイキン−１の安定性を向上さ
せることもできる。

上記において糖としては特に限定はなく、例えばグル
コース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、
マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アル
コール類、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキ
ストラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多糖類等を
使用でき、之等は一種単独でも二種以上混合しても用い
得る。之等の中で特にショ糖、マルトース、マンニトー
ル、イノシトール、デキストラン等が好ましい。

界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び非
イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、就中、ポリオ
キシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル
系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタ
ンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面
活性剤を好ましく利用できる。

上記糖類の添加量は、インターロイキン−１そのもの
又はその前記誘導体（以下「IL-1活性物」という）１μ
ｇ当たり約0.1mg程度以上、好ましくは約１〜100mg程度
の範囲とするのが適当であり、界面活性剤の添加量は、
IL-1活性物１μｇ当たり約0.0001mg程度以上、好ましく
は約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが適当である。ま
た人血清アルブミンの添加量はIL-1活性物１μｇ当たり
約0.001mg程度以上、好ましくは約0.01〜10mg程度の範
囲とするのが適当である。

本発明の抗腫瘍剤は、通常のこの種医薬組成物と同様
のものとすることができ、他の薬理的有効成分や製剤上
の慣用成分等を任意に配合してもよい。

特に、本発明抗腫瘍剤に配合できる他の成分として
は、IL-1活性物の安定化を更に増加させる面より、通常
の含硫還元剤が好ましい。該含硫還元剤としては、具体
的にはシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオ
クト酸、チオグリコール酸及び之等の塩類、チオエタノ
ールアミン、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、
チオ乳酸、ジチオスレイトール、グルタチオン等の比較
的温和な還元剤等を好ましく例示でき、之等は一種単独
でも利用でき、２種以上併用することもできる。之等の
添加量は特に制限されないが、IL-1β活性物１μｇ当た
り約0.001mg程度以上、好ましくは0.01〜10mg程度（２
種以上を併用する場合はそれらの合計量）とするのが適
当である。

本発明の抗腫瘍剤は、また、緩衝液で等張化して安定
な等張化製剤とされるのが適当である。ここで用いられ
る緩衝液としては、例えば代表的には、クエン酸−クエ
ン酸ナトリウム、クエン酸−リン酸ナトリウム、酢酸−
酢酸ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のpH4〜８程度、
好ましくはpH5〜６程度の各種緩衝液を例示できる。

本発明抗腫瘍剤は、例えば通常薬理有効量のガンマー
・インターフェロン、IL-1活性物及び前記特定の配合成
分と共に、適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の
形態に調製される。該製剤担体としては使用形態に応じ
た製剤の調製に通常慣用される充填剤、増量剤、結合
剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃至稀釈剤をいずれも使
用できる。製剤組成物の形態は、これが有効成分を効果
的に含有する状態であれば特に限定はなく、錠剤、粉末
剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であってもよく、液剤、懸濁
剤、乳剤等の注射剤形態であってもよい。またこれは使
用前に適当な担体の添加により液状となし得る乾燥品と
することもできる。之等の製剤組成物はいずれも常法に
従い調製され得る。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適
当な投与経路、例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈
内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投与さ
れ、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得
る。該投与は、一日１回であってもよく、また一日３〜
４回に分けることもできる。

発明の効果本発明によれば、ガンマー・インターフェロンとイン
ターロイキン−１とを併用することにより、それぞれの
抗腫瘍活性が相互に著しく増強され、それぞれ単独では
抗腫瘍効果が発揮されないような低い投与量においても
腫瘍細胞の増殖抑制効果が得られる。その結果、両者の
投与量の大幅な低減および前記副作用の軽減が可能とな
る。

実施例参考例1.ガンマー・インターフェロンの調製ガンマー・インターフェロンは特公昭63-1296号（198
8,1,12）に従って以下の方法により調製された。

（１）細胞の増殖 BALL-1細胞をFCS（ウシ胎児血清）20％を含むRPMI-16
40培地（pH7.2）中、37℃で培養した。得られた細胞を
血清無添加のRPMI-1640培地（pH7.2）で洗浄し、次いで
同培地に約１×10⁶個/mlになるように懸濁した。

あらかじめ、ウサギ抗血清を投与して免疫反応を抑制
した新生児ハムスターの皮下に、上記で調製したBALL-1
細胞を移植し、約３週間通常の飼育を行った。次いで皮
下に増殖したBALL-1細胞の主要塊を摘出し細切した後、
トリプシン含有の生理食塩水に懸濁して細胞を分散させ
た。

得られた細胞を血清無添加のRPMI-1640培地で洗浄
し、10％FCSを含む同培地に約１×10⁶個/mlになるよう
に懸濁し、以降のガンマー・インターフェロンの産生に
供した。

（２）ガンマー・インターフェロンの産生上記（１）の方法で得られた10％FCSに懸濁したBALL-
1細胞に、誘導剤としてリポポリサッカライド（LPS）を
100ng添加して37℃で３日間培養し、ガンマー・インタ
ーフェロンを誘導産生させた。

培養後、遠心分離を行って細胞を除去し、限外過に
より濃縮した。濃縮液をモノクローナル抗体カラムを用
いて精製を行った。本標品の比活性は7.35×10⁶IU/mg p
roteinであった。

参考例2.インターロイキン−１の調製特開昭63-152398号の実施例１に記載の方法に従い、7
1位CysをSerに置換したインターロイキン−１βを調製
し、単離、精製した。

以下、上記参考例１で得たガンマー・インターフェロ
ン及び上記参考例２で得たインターロイキン−１を種々
の使用割合で使用し、腫瘍細胞の増殖抑制効果を測定し
た。その結果を、下記の実施例１（１）〜（３）に示
す。

実施例1.ヒト腫瘍細胞株の増殖に対する併用効果（１）Colo 205細胞に対する効果 Colo 205細胞（ヒト結腸腺癌細胞、Cancer Res.,38,1
345,1978）をムーア（Moore）らの方法（J.Am.Med.Asso
c.,199,519,1967）に従って培養し、得られた細胞を、P
BS（−）溶液（日水製薬社製、リン酸緩衝生理食塩水）
で２回洗浄し、0.05％トリプシン（フロー・ラボラトリ
ース社製）で細胞をはがした後、ピペッテングによりRP
MI-1640培地（ギブコ社製）に細胞を懸濁した。25℃、1
200rpmで５分間遠心洗浄（日立製作所製、05PR-22型）
した細胞を再び同培地に懸濁し、最終濃度が10％となる
ようにFBS（ウシ胎児血清、ギブコ社製）を加えた。生
細胞数はトリパンブルー溶液（和光純薬社製）にて染色
して、光学顕微鏡下で計測した。

即ち、12穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴に6.3×10²個/mlから２×10⁴個/mlの希釈系列にし
た細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％ CO₂下、37℃で９日
間培養（ナプコ社製CO₂インキュベーター）し、細胞濃
度と培養時間の予備検討を行った。ついでマイクロプレ
ートの各穴に最終濃度が０、0.014、0.14、1.4、14、14
0ng/ml（即ち、０、0.1、１、10、100及び1000u/ml）の
参考例１のガンマー・インターフェロン（以下、「IFN
−γ」という）または０、0.01、0.1、１、10、100ng/m
lの参考例２のインターロイキン−１β（以下「IL-1
β」という）をそれぞれ組み合わせて0.025mlずつ添加
し、さらに予備検討の結果に合わせて細胞濃度を1.3×1
0³個/mlに希釈調整した細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％
CO₂下、37℃で８日間培養した。培養後、各穴の細胞はP
BS（＋）溶液（日水製薬社製）で洗浄し、メタノール
（和光純薬社製）固定した。風乾後、ギムザ染色（メル
ク社製）を行い、オートマティックパーティクルカウン
ター（CP-2000、白井松器械社製）または実体顕微鏡（S
ZH、オリンパス社製）下でコロニー数を計測した。各群
の細胞増殖率を、ガンマー・インターフェロンおよびイ
ンターロイキン−１βの代わりに培養液のみを添加した
群を対照として算出した。結果を第１表に示す。

この結果、第１表に示すように、Colo 205細胞に対し
てインターロイキン−１βは該細胞に対する単独の増殖
抑制効果は弱く、1ng/mlから100ng/mlまでの添加で、増
殖抑制効果は弱く、100ng/mlで35％前後の増殖抑制効果
しか示さなかった。またガンマー・インターフェロンの
みでは0.14ng/ml添加群で65％の増殖抑制効果を示し
た。

これに対して、1FN−γ単独処置群では、1FN−γのED
₅₀値（Probit法による、以下同じ）が0.18ng/mlである
のに比較して、0.01ng/mlのIL-1βを併用した群では、1
FN−γのED₅₀値が0.042ng/ml、0.1ng/mlのIL-1β併用群
では、0.007ng/mlとなり、実に4.3〜25.7倍もの増殖抑
制活性の増強が認められた。

（２）KPK-1細胞に対する効果 KPK-1細胞（ヒト腎癌細胞）をムーア（Moore）らの方
法（J.Am.Med.Assoc.,199,519,1967）に従って培養し、
得られた細胞を、PBS（−）溶液（日水製薬社製）で２
回洗浄し、0.05％トリプシン（フロー・ラボラトリース
社製）で細胞をはがした後、ピペッテングによりRPMI-1
640培地（ギブコ社製）に細胞を懸濁した。25℃、1200r
pmで５分間遠心洗浄（日立製作所製、05PR-22型）した
細胞を再び同培地に懸濁し、最終濃度が10％となるよう
にFBS（ウシ胎児血清、ギブコ社製）を加えた。生細胞
数はトリパンブルー溶液（和光純薬社製）にて染色し
て、光学顕微鏡下で計測した。

即ち、12穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴に6.3×10²個/mlから２×10⁴個/mlの希釈系列にし
た細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％ CO₂下、37℃で６日
間培養（ナプコ社製CO₂インキュベーター）し、細胞濃
度と培養時間の予備検討を行った。ついでマイクロプレ
ートの各穴に、最終濃度が０、0.014、0.14、1.4、14、
140ng/ml（即ち、０、0.1、１、10、100、1000u/ml）の
参考例１のガンマー・インターフェロンまたは０、0.0
1、0.1、１、10、100ng/mlの参考例２のインターロイキ
ン−１βをそれぞれ組み合わせて0.025mlずつ添加し、
さらに予備検討の結果に合わせて細胞濃度を２×10⁴個/
mlに希釈調整した細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％CO
₂下、37℃で７日間培養した。培養後、各穴の細胞はPBS
（＋）溶液（日水製薬社製）で洗浄し、メタノール（和
光純薬社製）固定した。風乾後、ギムザ染色（メルク社
製）を行い、オートマティックパーティクルカウンター
（CP-2000、白井松器械社製）または実体顕微鏡（SZH、
オリンパス社製）下でコロニー数を計測した。各群の細
胞増殖率を、ガンマー・インターフェロンおよびインタ
ーロイキン−１βの代わりに培養液のみを添加した群を
対照として算出した。結果を第２表に示す。

第２表から明らかなように、KPK-1細胞に対してイン
ターロイキン−１βは非常に弱い増殖抑制効果しか示さ
ず、100ng/mlでも15％程度の抑制であった。ガンマー・
インターフェロンは14ng/mlで57％の増殖抑制効果を示
した。これに比較し、1FN−γ単独処置群では、1FN−γ
のED₅₀値が11.301ng/mlであるのに比較して、0.1ng/ml
のIL-1βを併用した群では、1FN-γのED₅₀値が1.862ng/
ml、1ng/mlのIL-1β併用群では、0.255ng/mlとなり、実
に6.1〜44.3倍もの増殖抑制活性の増強が認められた。

（３）各種細胞に対する効果 SW48細胞（ヒト結腸腺癌細胞、Cancer Res.,36,4562,
1976）を、レイボヴィッツ（Leibovitz）らの方法（Am.
J.Hyg.,78,173,1963）に従って培養し、得られた細胞
を、PBS（−）溶液（日水製薬社製）で２回洗浄し、0.0
5％トリプシン（フロー・ラボラトリース社製）で細胞
をはがした後、ピペッテングによりL-15培地（フロー・
ラボラトリーズ社製）に細胞を懸濁した。25℃、1200rp
mで５分間遠心洗浄（日立製作所製、05PR-22型）した細
胞を再び同培地に懸濁し、最終濃度が10％となるように
FBS（ウシ胎児血清、ギブコ社製）を加えた。生細胞数
はトリパンブルー溶液（和光純製薬社製）にて染色し
て、光学顕微鏡下で計測した。

即ち、12穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴に6.3×10²個/mlから２×10⁴個/mlの希釈系列にし
た細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％ CO₂下、37℃で８日
間培養（ナプコ社製CO₂インキュベーター）し、細胞濃
度と培養時間の予備検討を行った。ついでマイクロプレ
ートの各穴に、最終濃度が０もしくは1.4ng/mlの参考例
１のガンマー・インターフェロンまたは０もしくは1.0n
g/mlの参考例２のインターロイキン−１βをそれぞれ単
独、又は組み合わせて0.025mlずつ添加し、さらに予備
検討の結果に合わせて細胞濃度を2.5×10³個/mlに希釈
調整した細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％CO₂下、37℃で
12日間培養した。培養後、各穴の細胞はPBS（＋）（日
水製薬社製）で洗浄し、メタノール（和光純薬社製）固
定した。

Calu-3細胞（ヒト肺癌細胞、J.Nat.Cancer Inst.,58,
209,1977）を、イーグル・エイチ（Eagle,H.）らの方法
（Science,130,432,1959）に従って培養し、得られた細
胞をPBS（−）溶液（日水製薬社製）で２回洗浄し、0.0
5％トリプシン（フロー・ラボラトリーズ社製）＋10％N
EAA（Non essential amino acid,フロー・ラボラトリー
ズ社製）に1mlのピルビン酸ナトリウムを含む培地に細
胞を懸濁した。25℃、1200rpmで５分間遠心洗浄（日立
製作所製、05PR-22型）した細胞を再び同培地に懸濁
し、最終濃度が10％となるようにFCS（ウシ胎児血清、
ギブコ社製）を加えた。生細胞数はトリパンブルー溶液
（和光純薬社製）にて染色して、光学顕微鏡下で計測し
た。

これを12穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴6.3×10²個/mlから２×10⁴個/mlの希釈系列にした
細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％ CO₂下、37℃で９日間
培養（ナプコ社製、CO₂インキュベーター）し、細胞濃
度と培養時間の予備検討を行った。次いでマイクロプレ
ートの各穴に、最終濃度が０もしくは1.4ng/mlの参考例
１のガンマー・インターフェロン、または０もしくは1.
0ng/mlの参考例２のインターロイキン−１βをそれぞれ
単独、または組み合わせて0.025mlずつ添加し、さらに
予備検討の結果に合わせて細胞濃度を2.5×10³個/mlに
希釈調整した細胞溶液を0.5mlずつ加えて５％ CO₂下、
37℃で12日間培養した。培養後、各穴の細胞はPBS
（＋）溶液（日水製薬社製）で洗浄し、メタノール（和
光純薬社製）固定した。

Colo 205細胞は実施例１（１）に示した方法により、
KPK-1細胞は実施例１（２）に示した方法により、それ
ぞれ準備して参考例１のガンマー・インターフェロン０
もしくは1.4ng/ml、あるいは参考例２のインターロイキ
ン−１βを０もしくは1.0ng/mlの単独、あるいは両者を
併用して各細胞に対する増殖抑制効果を調べた。

この結果、第３表に示すようにSW 48細胞に対してイ
ンターロイキン−１βもガンマー・インターフェロンも
夫々単独では増殖抑制効果を示さないが、両者を併用す
ることにより、その増殖を実に90％以上抑制した。Calu
-3細胞に対してはインターロイキン−１βもガンマー・
インターフェロンも夫々単独では使用した濃度では完全
に抑制しなかった。しかし、両者を併用することにより
Calu-3細胞の増殖を実質上完全に抑制した。KPK-1及びC
olo 205細胞に対しても、第１表及び第２表に示した結
果と同様に、これらの細胞の増殖抑制効果はインターロ
イキン−１βとガンマー・インターフェロンの併用によ
り著しく上昇した。

製剤例１インターロイキン−１β 0.8μg/ml ガンマー・インターフェロン 42μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15mg/ml システイン 0.1mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明抗腫瘍剤を調製
した。

該製剤は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解して利
用される。

製剤例２インターロイキン−１β 0.08μg/ml ガンマー・インターフェロン 420μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15mg/ml システイン 0.1mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明抗腫瘍剤を調製
した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者平井嘉勝徳島県板野郡北島町新喜来字江古川15― 49 (56)参考文献特開昭61−280432（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−277628（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−95220（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−226820（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ガンマー・インターフェロンとインターロ
イキン−１とを有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項２】ガンマー・インターフェロンが、天然型の
ガンマー・インターフェロンまたは遺伝子組換え法によ
り産生されたガンマー・インターフェロンもしくはガン
マー・インターフェロン活性を有するガンマー・インタ
ーフェロン誘導体である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】インターロイキン−１が、天然型のインタ
ーロイキン−１βまたは遺伝子組換え法により産生され
たインターロイキン−１βもしくはインターロイキン−
１β活性を有するインターロイキン−１β誘導体である
請求項１に記載の抗腫瘍剤。