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JPH05222088A - 末端３′−３′または５′−５′ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

末端３′−３′または５′−５′ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチド類似体

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JPH05222088A
JPH05222088A JP3188202A JP18820291A JPH05222088A JP H05222088 A JPH05222088 A JP H05222088A JP 3188202 A JP3188202 A JP 3188202A JP 18820291 A JP18820291 A JP 18820291A JP H05222088 A JPH05222088 A JP H05222088A
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oligonucleotide
formula
alkyl
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minutes
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JP3188202A
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ハンネローレ、レーシュ
Anja Froehlich
アンヤ、フレーリッヒ
Jose Flavio Ramalho-Ortigao
ジョゼ、フラビオ、ラマルホ‐オルティガオ
Matthias Montenarh
マティアス、モンテナール
Hartmut Seliger
ハルトムト、ゼリガー
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Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 次式のオリゴヌクレオチドその製法、医薬組
成物。 【効果】 これらの化合物はヌクレアーゼに対して安定
であり、核酸の生物学的機能を抑制する。ウイルス性疾
患、癌の治療に用いられる。〔式中Ｒ１は水素または式
IIIの基；Ｒ２は水素または式ＩＶの基；Ｂはアデニ
ン、チミン、シトシン、グアニン等の天然の塩基、また
はプリン、クーデアザアデニン等の人為的塩基あるいは
それらのプロドラツク型；Ｗ，Ｗ′は酸素または硫黄；
Ｚ，Ｚ′はＯ−，Ｓ−，Ｃ１〜１８−アルコキシ、Ｃ
１〜１８−アルキル、ＮＨＲ３，ＮＲ３Ｒ４；Ｒ３，Ｒ
４はＣ１〜１８−アルキル等又はそれらが結合する窒素
と一緒になって５〜６員の複素環を形成する；ＹはＯ−
Ｓｉ（Ｒ）２，ＯＣＨ２，ＣＯ−ＮＲ，ＯＣＨ２−ＣＯ
（但しＲはＣ１〜６−アルキル等）または−Ｐ（＝Ｗ）
（−Ｚ）−Ｏ−である。ｎは５〜６０の整数〕

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その
配列がメッセンジャーＲＮＡのコードまたはセンス配列
或いはＤＮＡのコード形成鎖(codogenic strand)に相補
的である核酸フラグメントとして定義される。この種の
オリゴヌクレオチドは、インビトロまたは細胞培養系に
おける遺伝子の発現を抑制するのに段々用いられるよう
になっている。このような物質の医療例えば抗ウイルス
剤として使用することについては広汎な研究が行われて
きた。生物学では、アンチセンスＲＮＡ配列は、原核生
物（ティー・ミズノ(T.Mizuno)、エム・ワイ・チュー
(M.-Y. Chou)およびエム・イノウエ(M. Inouye) 、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1966-1970(1984)）およ
び真核生物（エス・エム・ヘイウッド(S.M. Heywood)、
Nucleic Acids Res., 14, 6771- 6772 (1986) ）におい
ても遺伝子発現の天然に存在するレギュレーターとして
以前から知られている。それらは、適当なメッセンジャ
ーＲＮＡとハイブリダイズすることによって翻訳を抑制
する。この様なアンチセンスＲＮＡ配列は、細菌（エイ
・ヒラシマ(A. Hirashima)、エス・サワキ(S. Sawaki)
、ワイ・イノクチ(W. Inokuchi) およびエム・イノウ
エ(M. Inouye) 、PNAS USA, 83, 7726-7730 (1986)）ま
たは真核細胞（ジェイ・ジー・アイザント(J.G.Izant)
およびエイチ・ウエイントラウブ(H. Weintraub)、Cel
l, 36, 1007-1015(1984)）への挿入で遺伝子の発現を妨
害することもでき、且つ抗ウイルス（エル・ジェイ・チ
ャン(L.-J. Chang) およびシー・エム・シュトルツフス
(C.M. Stoltzfus)、J. Virology, 61, 921-924 (1987)
）および抗腫瘍形成作用（ジェイ・ティー・ホルト(J.
T. Holt) 、ティー・ブイ・ゴパル(T.V. Gopal)、エイ
・ディー・モウトン(A.D. Moutton)およびエイ・ダブリ
ュ・ニーンフィス(A.W. Nienhuis) 、PNAS USA, 83, 47
94-4798 (1986)）の両方を表すことが多くの実験で示さ
れている。このような研究のための生物学的アンチセン
スＲＮＡと比較して合成オリゴヌクレオチドの利点は、
安定性がより増し且つより容易に得られることである。
後者は最近になり大幅に改善された合成技術に関し、比
較的短いオリゴマー（例えば、１２〜３０塩基のもの）
が比較的容易に得られる（イー・ソンヴォー(E. Sonvea
ux) 、Bioorganic Chemistry, 14, 274-325 (1986)；オ
リゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンス
インヒビター(Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhi
bitors of Gene Expression)、ジェイ・エス・コーエン
(J.S. Cohen)監修、マクミラン・プレス(Macmillan Pre
ss) 、1989年、７頁以後）。このような短いオリゴマー
であっても発現の効果的なモジュレーターであることが
明らかになった。
【０００２】更にこのようなオリゴヌクレオチドは、Ｄ
ＮＡ二本鎖に結合して三重らせんを形成することもでき
るであろう。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレ
オチドと三重形成オリゴヌクレオチドの両者を生物学的
系で用いるためには、下記の要件に合致することが必要
である（オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のア
ンチセンスインヒビター(Oligodeoxynucleotides, Anti
sense Inhibitors ofGene Expression)、ジェイ・エス
・コーエン(J.S. Cohen)監修、マクミラン・プレス(Mac
millan Press) 、1989年、１頁以後）。 １． 一方において、それらは水に易溶性でなければな
らないが、他方において親油性細胞膜を容易に通過する
ものでなければならない。 ２． それらは細胞内での分解に対して十分に安定でな
ければならず、すなわちヌクレアーゼに対して安定でな
ければならない。 ３． それらは、生理学的温度において細胞内核酸と安
定なハイブリッドを形成しなければならない。 ４． ハイブリッド形成（hybridization)は選択的でな
ければならず、ミスペアを生じるオリゴヌクレオチドか
らの解離温度の差が、後者を特異的に洗い出すことがで
きるほど十分に大きくなければならない。
【０００３】１９７８年にザメツニク(Zamecznik) とス
テフェンソン(Stephenson)（ピー・シー・ザメツニク
(P.C. Zamecznik)およびエム・ステフェンソン(M. Step
henson) 、PNAS USA, 75, 280-284 および285-288 (197
8)）は、未修飾オリゴヌクレオチドがラウス肉腫ウイル
スの複製を抑制することができることを初めて示した。
しかしながら、オリゴヌクレオチドは極めて高濃度で用
いたのであり、更に実験はヌクレアーゼを不活性化する
ために、ほとんどが予め加熱した培地で行った。これら
の測定の必要性は、血清中および細胞中で異種核酸が受
ける迅速な酵素分解によって説明される。
【０００４】したがって、初期にはオリゴヌクレオチド
を構造的に修飾して、前記の要件によりよく合うよう
に、特に細胞内分解に対して一層良好に保護されるよう
にする目的で検討を行った。これらの検討は特にホスホ
ジエステルヌクレオチド間結合の修飾に集中したのであ
り、これは最終的分析では総てのヌクレアーゼによる攻
撃の点であるからである。構造的に修飾したヌクレオチ
ド間結合は、原則として次のように分割することができ
る。 ａ） 中心原子としてリンを有するヌクレオシド結合。 これらは順に、イオン性／キラル、イオン性／アキラ
ル、および中性／キラルである。 ｂ） 中性／アキラルのリン不含ヌクレオシド結合。
【０００５】チオホスフェートおよびジチオホスフェー
ト結合は構造的に修飾されたものであるが、イオン性の
ヌクレオシド間結合である。チオホスフェート修飾オリ
ゴヌクレオチド（オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子
発現のアンチセンスインヒビター(Oligodeoxy-nucleoti
des, Antisense Inhibitors of Gene Expression) 、ジ
ェイ・エス・コーエン(J.S. Cohen)監修、マクミラン・
プレス(Macmillan Press) 、1989年、９７頁以後）は広
く細胞培養物中の遺伝子発現について最も良好な抑制作
用を示すが、この抑制は特異配列によるものとは思われ
ず、これは抑制作用は唯１個の核酸単位からなるチオホ
スフェート修飾オリゴヌクレオチド、例えばオリゴシチ
ジレートのチオホスフェート類似体によっても示される
からである。チオホスフェート修飾オリゴヌクレオチド
の使用は、それらのキラリティーによって限定されたま
まである。
【０００６】しかしながら、ｎ個の塩基のオリゴヌクレ
オチドを調製すると、２ｎ−１個のジアステレオマーが
生じるので、チオホスフェート結合を含む生成物の中の
極僅かだけしか良好なハイブリッド形成性を持たない。
【０００７】キラリティーの問題は、ジチオホスフェー
トヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドでは
回避される（エイ・グランダス(A. Grandas)、ウィリア
ム・エス・マーシャル(William S. Marshall) 、ジョン
・ニールセン(John Nielsen)およびマーチン・エイチ・
カルーサーズ(Martin H. Caruthers) 、TetrahedronLet
t. 20, 543-546 (1989)；ジー・エム・ポリット(G.M. P
orritt)、シー・ビー・リーゼ(C.B. Reese)、Tetrahedr
on Lett. 30, 4713-4716 (1989)）。しかしながら、今
日までのところ、このような化合物は複雑な多段階合成
によってしか得られておらず、損失も大きい。これが、
今日までのところ、特に細胞培養物中でのハイブリッド
形成の挙動についての広汎な研究が行われていない理由
である。
【０００８】もう一つのクラスの化学的に修飾されたオ
リゴヌクレオチドは、非イオン性、すなわち中性のヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。こ
の種の修飾された構造は、ホスホトリエステルまたはメ
チルホスホネートヌクレオシド間結合を有するオリゴヌ
クレオチドを包含する（オリゴデオキシヌクレオチド、
遺伝子発現のアンチセンスインヒビター(Oligodeoxynuc
leotides, AntisenseInhibitors of Gene Expressio
n)、ジェイ・エス・コーエン(J.S. Cohen)監修、マクミ
ラン・プレス(Macmillan Press) 、1989年、７９頁以
後）。
【０００９】イオン化性ホスフェート残基が電荷を持た
ない基によって置換されることは両方のクラスの化合物
に共通である。この型の結合を導入すればこれらのオリ
ゴヌクレオチド類似体がヌクレアーゼ耐性になるが、水
性媒質における溶解度が低いという欠点を有する。
【００１０】中性／アキラルのヌクレオシド間結合を有
するオリゴヌクレオチドは、今日までのところヌクレオ
シド結合のリン原子を他の中心原子で置き換えることに
よってしか得ることができない。シロキサン結合はリン
エステル結合に似ている。シロキサンヌクレオシド間結
合を有するオリゴヌクレオチド（ケイ・ケイ・オジルビ
エ(K.K. Ogilvie)、ジェイ・エフ・コルミエール(J.F.
Cormier)、Tetrahedron Lett., 26, 4159 (1985)；エイ
チ・セリジャー(H. Seliger)、ジー・フェージャー(G.
Feger)、Nucl. Nucl., 6 (182), 483-484 (1987)）が合
成されており、ヌクレアーゼに対して安定である。
【００１１】カーボネート、アセタールまたはカルボキ
サミドヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド
は、エム・マテウチ(M. Matteucci)、Tetrahedron Let
t,31, 2385-2388 (1990)；ジェイ・アール・ティテンサ
ー(J.R. Tittensor)、J.Chem. Soc. C, 1971, 2656；お
よびジェイ・クール(J. Coull)ら、TetrahedronLett, 2
8, 745 に開示されている。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌ
クレオチド類似体もホスホジエステルヌクレオシド間結
合を修飾することなく配置の変った糖残基を用いること
によって得られている。これは、核塩基(nucleobases)
がα−グリコシド結合（α-glycosidically)が攻撃され
るオリゴヌクレオチド類似体を合成することによって生
じる（オリゴデオキシヌクレオチド、遺伝子発現のアン
チセンスインヒビター(Oligodeoxynucleotides, Antise
nse Inhibitors of Gene Expression)、ジェイ・エス・
コーエン(J.S. Cohen)監修、マクミラン・プレス(Macmi
llan Press) 、1989年、１１９頁以後）。しかしなが
ら、この種のオリゴヌクレオチド類似体は、糖と塩基と
から出発して合成されなければならないので、予備的に
得ることは困難である。更に、幾つかの場合には、それ
らはハイブリッド形成の方向に関して異常な挙動を示
す。
【００１２】本発明は、式I またはIIのオリゴヌクレオ
チド
【化４】 ［式中、Ｒ１は、水素または式III
【化５】 の基であり、Ｒ２は、水素または式IV
【化６】 の基であり、但し基Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは
式III またはIVの基であり、Ｂは、塩基、例えばアデニ
ン、チミン、シトシン、グアニンのような天然の塩基、
または例えばプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デ
アザアデニン、７−デアザグアニンまたはＮ４，Ｎ４−
エテノシトシンのような人為的塩基、またはそれらのプ
ロドラッグ型であり、ＷおよびＷ′は、互いに独立に、
酸素または硫黄であり、ＺおよびＺ′は、互いに独立
に、Ｏ- 、Ｓ- 、Ｃ１〜Ｃ18−アルコキシ、好ましくは
Ｃ１〜Ｃ８−アルコキシ、特に好ましくはＣ１〜Ｃ３−
アルコキシ、特にメトキシ、Ｃ１〜Ｃ18−アルキル、好
ましくはＣ１〜Ｃ８−アルキル、特に好ましくはＣ１〜
Ｃ３−アルキル、特にメチル、ＮＨＲ３（但し、Ｒ３は
好ましくはＣ１〜Ｃ18−アルキル、特に好ましくはＣ１
〜Ｃ８−アルキル、特にＣ１〜Ｃ４−アルキル、または
Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、好ま
しくはメトキシエチルである）、ＮＲ３Ｒ４（但し、Ｒ
３は前記に定義の通りであり、Ｒ４は好ましくはＣ１〜
Ｃ18−アルキル、特に好ましくはＣ１〜Ｃ８−アルキ
ル、特にＣ１〜Ｃ４−アルキルであるか、またはＲ３と
Ｒ４とがそれらを有する窒素原子と一緒になって５〜６
員の複素環であって更にＯ、Ｓ、Ｎからなる組から他の
ヘテロ原子を含むことができるものであって、例えばモ
ルホリンを形成する）であり、Ｙは、Ｏ−Ｓｉ
（Ｒ）２、ＯＣＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲまたはＯ−ＣＨ２−
Ｃ（Ｏ）（但し、ＲはＣ１〜Ｃ６−アルキル、アリール
またはＣ５−またはＣ６−シクロアルキル）であり、ｎ
は、５〜６０、好ましくは１０〜４０、特に好ましくは
１５〜２５の整数である］、および生理学的に許容され
るその塩に関する。
【００１３】これに関して、アリールとは、例えばフェ
ニル、Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシ
および／またはハロゲンで（１〜３回）置換されたフェ
ニルを意味する。
【００１４】式Ｉのオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００１５】更に、Ｒ２が式IVの基であってＲ１が水素
であるか、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ式III およびIVの
基であるか、またはＲ２が水素であってＲ１が式III の
基（但し、後者の場合にはＷまたはＺは酸素ではない）
である式I のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００１６】更に、Ｗが酸素であるか、またはＺとＷと
が両方とも酸素である、式I を有するオリゴヌクレオチ
ドが特に挙げられる。
【００１７】特に好ましい式I を有するオリゴヌクレオ
チドは、Ｒ２が式IVの基であり、Ｒ１が水素であるもの
である。
【００１８】更に、細胞内吸収に有利であり、インビド
ロまたは生体内でリポーター基として作用する基、およ
び／または生物学的ＤＮＡまたはＲＮＡとのオリゴヌク
レオチドのハイブリッド形成の際にこのＤＮＡまたはＲ
ＮＡ分子を攻撃して結合を形成しまたは開裂する基によ
って更に置換されている、式I およびIIのオリゴヌクレ
オチドが挙げられる。
【００１９】細胞内吸収に有利な基の例は、例えば１８
個までの炭素原子を有するアルキル基またはコレステリ
ルのような親油性基、或いは天然のキャリヤー系例えば
胆汁酸または適当なレセプターのためのペプチド（例え
ば、レセプター媒介エンドサイトーシス）を用いる抱合
体である。リポーター基の例は螢光基（例えば、アクリ
ジニル、ダンシル、フルオレッセイニル）またはアクリ
ジニウムエステル基のような化学ルミネセンス基であ
る。
【００２０】核酸と結合しおよび／またはこれを開裂す
るオリゴヌクレオチド包合体は、アクリジン（エヌ・ツ
ォング(N. Thuong) ら、Tetrahedron Lett.29, 5905,19
88）、プソラレン（psoralen, ユー・ピーレス(U. Piel
es) ら、Nucleic Acid Res.17, 285, 1989)またはクロ
ロエチルアミノアリール抱合体（オリゴデオキシヌクレ
オチド、遺伝子発現のアンチセンスインヒビター(Oligo
deoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Exp
ression)、ジェイ・エス・コーエン(J.S. Cohen)監修、
マクミラン・プレス(Macmillan Press) 、1989年、１７
３頁以後）を含む。
【００２１】これらのオリゴヌクレオチドの特徴的な構
造の修飾は、鎖の両端におけるヌクレオチド結合を変更
すること、すなわち生物学的３′−５′結合の代わりに
３′−３′または５′−５′結合である。このような化
合物をヌクレアーゼによる分解に対して安定化させるに
は、この最少限の構造の修飾で十分であることを、意外
にも見出した。
【００２２】以後に記載するように、構造を若干修飾す
ることによって、ハイブリッド形成挙動は生物学的オリ
ゴヌクレオチドのそれとほとんど同じになる。これによ
って、これらの化合物を細胞培養中での遺伝子発現のイ
ンヒビタターとして広く用いることができるようにもな
る。
【００２３】現在までのところ、鎖の両端に３′−３′
および５′−５′ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌ
クレオチド類似体の調製およびこれらのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドとしての使用については、文献には記
載されていない。３′−３′または５′−５′結合を含
むジヌクレオシドホスフェートの類似体は、適当な縮合
の主生成物（エイ・マイルス(A. Myles)、ダブリュ・フ
ッツェンラウブ(W.Hutzenlaub) 、ジー・ライツ(G. Rei
tz)およびダブリュ・プフライデラー(W.Pfleiderer)、C
hem. Ber., 108, 2857-2871 (1975) ；エイチ・ロコス
(H.Rokos)、エイ・マイルス(A. Myles)、ダブリュ・フ
ッツェンラウブ(W.Hutzenlaub) およびダブリュ・プフ
ァイデラー(W.Pfeiderer) 、Chem. Ber.,108, 2872-287
7 (1975) ；ジェイ・トマズ(J. Tomasz) 、Nucl. Nuc
l., 2 (1),51-61 (1983)；エム・ネーマー(M. Nemer)、
エヌ・テリアウルト(Theriault) 、エイ・シフマン(A.
Schifman) およびケイ・ケイ・オジルビエ(K.K. Ogilvi
e)、第６回国際円卓、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよ
びそれらの生物学的応用(VIth International Round Ta
ble,Nucleosides, Nucleotides and their biological
Applications) 、ラ・グランデ・モット(La Grande Mot
te) 監修、ジェイ・エル・インバック(J.L. Imbach) 、
94-96 (1984)）または副産物（アール・レッチンガー
(R. Letsinger)、ケイ・ケイ・オジルビエ(K.K. Ogilvi
e)、J. Amer.Chem. Soc. 89, 4801-4802 (1967)）とし
て得られており、研究されてきた。しかしながら、この
種の二量体は融点が低すぎて、細胞の核酸と安定なハイ
ブリッド形成を行うことは原則として出来ない。一端に
のみ５′−５′結合を有するオリゴヌクレオチドは、遺
伝子プローブにリポーター基の結合点を導入するために
合成されている（エス・アグラワル(S. Agrawal)、シー
・クリストドウロウ(C.Christodoulou)、エム・ジェイ
・ガイト(M.J. Gait) 、Nucleic Acids Res 14,6227-62
45 (1986)。しかしながら、そのハイブリッド形成の挙
動については、今日までのところは研究されていない。
分子の中間に単一の３′−３′または５′−５′結合を
有する自己相補性オリゴヌクレオチドが生物物理学的研
究のために調製されている（ジェイ・エイチ・バン・ド
ゥ・サンド(J.H. van de Sande) 、エヌ・ビー・ラムシ
ング(N.B. Ramsing)、エム・ダブリュ・ジャーマン(M.
W. Germann)、ダブリュ・エルホルスト(W. Elhorst)、
ビー・ダブリュ・カリッシュ(B.W.Kalisch)、イー・ヴ
ィ・キッツィング(E.V. Kitzing)、アール・ティー・ポ
ン(R.T. Pon)、アール・シー・クレグ(R.C. Clegg)、テ
ィー・エム・ジョヴィン(T.M. Jovin)、Science 241, 5
51-557 (1988) ）。
【００２４】逆方向末端３′−３′および５′−５′結
合を有するオリゴヌクレオチドの調製は、溶液または好
ましくは固相での生物学的オリゴヌクレオチドの合成と
同様の方法で、場合によっては自動合成装置を用いて行
う。
【００２５】それ故、本発明は、 ａ） ３′−または５′−末端リン（ＩＩＩ）またはリ
ン（Ｖ）基を有するヌクレオチド単位またはその活性化
誘導体を遊離の３′−または５′−末端ヒドロキシル基
を有するもう一つのヌクレオチド単位と反応させ、また
は ｂ） 同様な方法でフラグメントによってオリゴヌクレ
オチドを合成し、適当な場合には他の機能を保護するた
めに（ａ）または（ｂ）と同じようにして得られるオリ
ゴヌクレオチド中に一時的に導入された１個またはそれ
以上の保護基を取り除き、且つ適当な場合には、この方
法で得られた式Ｉのオリゴヌクレオチドを生理学的に許
容し得る塩に転換することを特徴とする、式Ｉのオリゴ
ヌクレオチドの製造法にも関する。
【００２６】固相合成に用いる出発成分は、第一のヌク
レオシドモノマーを５′−ＯＨ基を介して結合させる支
持樹脂である。この成分の調製に用いられるのは、文献
既知の方法（ティー・アトキンソン(T. Atkinson) 、エ
ム・スミス(M. Smith)、オリゴヌクレオチド合成(Oligo
nucleotide Synthesis) 、エム・ジェイ・ガイト(M.J.
Gait) 監修、35-49 (1984)）によって調製される支持体
樹脂、好ましくはシリカゲルまたは調整された有孔ガラ
スであってアミノ基で官能化したものである。これを核
塩基および３′−ＯＨ基上で保護され且つ予め５′−
（ｐ−ニトロフェニルスクシネート）に転換したヌクレ
オシド誘導体と反応させる。塩基に好ましく用いられる
保護基はアシル基、例えばベンゾイル、イソブチリルま
たはフェノキシアセチルである。３′−位は、エム・デ
ィー・マテウチ(M.D.Matteucci)、エム・エイチ・カル
ーサーズ(M.H. Caruthers)、TetrahedronLetters 21 (1
980), 3243-3246に記載の方法で導入することができる
ジメトキシトリチル保護基によって好ましく保護され
る。最後から２番目の鎖構成員までのオリゴヌクレオチ
ド鎖の合成は、文献既知の方法によって、好ましくは
５′−ＯＨ基がジメトキシトリチル基によって保護され
たヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトまたはヌクレ
オシド３′−Ｈ−ホスホネートを用いて行われる。最後
の鎖構成員として用いられるのは、これもまた３′−Ｏ
Ｈ基が好ましくはジメトキシトリチルで保護されたヌク
レオシド５′−ホスホルアミダイトまたはヌクレオシド
Ｈ−ホスホネートである。逆方向末端ヌクレオチド間結
合を有するこの種のオリゴヌクレオチド鎖の調製を、以
下に図式的に示す（末端に３′−３′または５′−５′
結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのホス
ホルアミダイトサイクル）。３′−３′または５′−
５′結合を有するオリゴヌクレオチドは、これにしたが
って調製される。
【化７】
【００２７】構造および配列分析は、３′−３′および
５′−５′末端を有する合成されたオリゴヌクレオチド
を最初の末端標識によって行う。これは、好ましくは
５′−γ−32Ｐ−ＡＴＰ／ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて放射能標識することによって行う。この放射能標
識は、遊離の５′−ＯＨ基、すなわち生物学的３′−
５′結合のみを有するオリゴヌクレオチドと比較したヌ
クレオチド鎖の反対側の末端で起こる。次に、引き続い
て、文献既知の方法によって、好ましくはマクサム(Max
am）とギルバート(Gilbert) によって記載された塩基特
異的ランダム開裂によって行う（エイ・エム・マクサム
(A.M. Maxam)およびダブリュ・ギルバート(W. Gilber
t)、酵素学の方法(Methods in Enzymology)65, 499-560
(1980)）。放射能標識は分子の「反対側の」末端である
ので、配列の読取りも生物学的３′−５′結合を有する
オリゴヌクレオチドと比較して反対方向で起こる。試験
の詳細な説明は、例６で行う。
【００２８】式I およびIIのオリゴヌクレオチドを二本
鎖または一本鎖核酸に結合することに基づく化学的ハイ
ブリダイゼーション法、核酸の生物学的機能の調節およ
び抑制、ウイルスゲノム機能の発現の選択的抑制、ウイ
ルス性疾患の予防および治療、腫瘍形成遺伝子機能の抑
制および癌の治療に用いられる。
【００２９】本発明によって合成され、血清中に溶解さ
れる式I およびIIのオリゴヌクレオチドの挙動は、生体
内での安定性の尺度と見なすことができる。一般的試験
は例７に記載され、蛇毒ホスホジエステラーゼの溶液を
用いる対応するインビトロでの試験は例８に示す。本発
明によるオリゴヌクレオチドは３′−５′オリゴヌクレ
オチドよりもかなりゆっくり分解される。
【００３０】例１１では、末端の逆方向３′−３′結合
を有するオリゴヌクレオチドの血清安定性を示す。
【００３１】ハイブリッド形成挙動は例９に記載のモデ
ル実験から明らかであり、ここで本発明により調製した
それぞれ３′−３′および５′−５′末端を有する多数
のＳＶ４０特異配列はＳＶ４０ＤＮＡの適当な対向鎖と
のハイブリダイゼーションの際に、本発明により合成さ
れない対応配列、すなわち３′−３′および５′−５′
末端を持たないものとのハイブリダイゼーションの際に
測定される融点よりも極僅かしか低くならない融解点を
示す。
【００３２】遺伝子発現の抑制剤として末端３′−３′
および５′−５′結合を有する本発明によって提供され
るオリゴヌクレオチドの活性は、ウイルスＳＶ４０の成
長の抑制から明らかである。
【００３３】
【実施例】例１ ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−デオキシリボヌクレオシド５′−
（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル）ホスホ
ルアミダイト ４の合成 塩基保護ヌクレオシドから出発する反応図式を下記に示
す。
【化８】 ａ： Ｂ＝チミン、ＤＭＴｒ＝４，４′−ジメトキシト
リチル、 ｂ： Ｂ＝Ｎ５−ベンゾイルアデニン、 ｃ： Ｂ＝Ｎ４−ベンゾイルシトシン、 ｄ： Ｂ＝Ｎ２−イソブチリルグアニン。 Ａ） ３′，５′−Ｏ−ビス−ＤＭＴｒ−デオキシリボ
ヌクレオシド２の調製 混合物： ｄＴ、ｄＡbz、ｄＣbzまたはｄＧibu ６ミリモル、 ＤＭＴｒ−Ｃｌ １４．４ミリモル、 無水ＴＥＡ １４．０ミリモル。 デオキシリボヌクレオシド１を無水ピリジン５０ｍｌに
溶解し、０℃でトリチルエチルアミンとジメトキシトリ
チルクロリドを加える。次に、混合物を室温で２４時間
撹拌した後、薄層クロマトグラフィによって反応を行う
（移動相：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９：１）。メタノ
ールを加えて反応を停止して、溶媒を除去し、残渣をジ
クロロメタンに吸収させる。有機相を１ＭＮＨ４ＨＣＯ
３溶液とＨ２Ｏで数回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥
し、ロータリーエバポレーターで濃縮する。３′，５′
−ジトリチル化生成物２を過剰のトリタノールおよび
５′−ＤＭＴｒ−ｄＮからカラムクロマトグラフィによ
って精製することができる（カラム材料：シリカゲル６
０Ｈ、溶離剤：ＣＨ２Ｃｌ２でメタノール含量を増加さ
せると、１〜１．５％ＭｅＯＨでジトリチル化デオキシ
ヌクレオシドが溶出する）。 収率：理論値の７３〜８５％。 Ｂ） ５′−ジメトキシトリチル基の特異的除去 文献： エム・ディー・マテウチ(M.D. Matteucci)およ
びエム・エイチ・カルーサーズ(M.H. Caruthers)、Tetr
ahedron Lett. 21, 3243-3246 (1980)。 混合物： ３′，５′−Ｏ−ビス−ＤＭＴｒ−ｄＮ ２ ３ミリモル、 ＺｎＢｒ２ １５ミリモル、 無水ニトロメタン ２００ミリモル。 ３′，５′−Ｏ−ビス−ＤＭＴｒ−ｄＮ２をニトロメタ
ン１００ｍｌに溶解したものを、臭化亜鉛を更に１００
ｍｌのニトロメタンに懸濁させたものに０℃で加える。
保護されたデオキシアデノシンの場合には、冷却しなが
ら反応を継続し、脱プリンを回避する。それにもかかわ
らず、このヌクレオシドは６０分後で完全に除去され、
これは薄層クロマトグラフィによって確認することがで
きる。チミジンおよびデオキシグアノシンの場合には、
この反応は同様に室温で６０分後には完了するが、ビス
−ＤＭＴｒ−デオキシシチジンの５′−脱トリチル化は
不完全にしか起きない。この場合には、反応は３時間後
に停止して、３′−ジメトキシトリチル基の除去も回避
された。反応は１ＭＮＨ４Ａｃ溶液２００ｍｌを加えて
停止し、生成物３をＣＨ２Ｃｌ２２００ｍｌで抽出し、
有機相を飽和ＮａＣｌ溶液とＨ２Ｏとで再度洗浄し、Ｎ
ａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空で留去する。トリタ
ノールは、粗生成物をｎ−ヘキサン約５００ｍｌ中で−
１５℃で沈澱させることによってほとんど除去すること
ができる。次に、シリカゲル６０Ｈ上で溶離剤としてメ
タノール含量を増加するジクロロメタンを用いてクロマ
トグラフィを行うことによって精製を行う。３′−ＤＭ
Ｔｒ−デオキシリボヌクレオシドのＲｆ値は、下記の方
法での対応する５′−トリチル化モノマーとは異なる
（移動相：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝２４：１）。 ３′−ＤＭＴｒ−ｄＮ ５′−ＤＭＴｒ−ｄＮ ｄＴ ０．２８ ０．２１ ｄＡbz ０．５５ ０．２９ ｄＣbz ０．５３ ０．３１ ｄＧibu ０．３２ ０．１４ 収率：理論値の４８〜６５％。 Ｃ） ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−デオキシリボヌクレオシド
５′−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル）
ホスホルアミダイト４の調製 文献： エイチ・ケスター(H. Koester)、Nucleic Acid
s Res. 12, 4539-4557(1984) 。 混合物： ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−デオキシリボヌクレオシド ３ １ミリモル、 クロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシホス フィン １．５ミリモル、 ジイソプロピルアミン ４ミリモル。 ホスフィチル化反応は、ケスター(Koester) らによって
記載された方法（２８）に類似の方法で行い、５′−Ｏ
−ＤＭＴｒ−デオキシリボヌクレオシド３′−ホスホル
アミダイトを調製した。アルゴン下にて、ジイソプロピ
ルアミンの次にホスフィチル化試薬を、保護されたヌク
レオシドを無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解したものに加えた。
３０分後に酢酸エチル３０ｍｌを加えて反応を停止し、
溶液を３×飽和ＮａＣｌ溶液で抽出し、有機相をＮａ２
ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空で留去した。粗生成物を
カラムクロマトグラフィ（カラム材料：シリカゲル６０
Ｈ、溶離剤：石油エーテル／ジクロロメタン／トリエチ
ルアミン＝４５：４５：１０）によって精製した。 ４ａの収率：理論値の９３％。
【００３４】例２ ３′−３′ホスホジエステル結合を有するチミジリル−
チミジンの調製 二量体ブロックを調製する反応経路を下記に示す。
【化９】 Ａ） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン５ 混合物：チミジン ２０ミリモル（４．８４ｇ） ４，４′−ジメトキシトリチルクロリド ２４ミリモル（８．２ｇ） ジメチルアミンピリジン １ミリモル（１２２ｍｇ） 無水トリエチルアミン ２８ミリモル（３．８ｍｌ） ５ の調製は、アール・エイ・ジョーンズ(R.A. Jones)の方
法によって行った（ジー・エス・タイ(G.S. Ti) 、ビー
・エル・ガフネイ(B.L. Gaffney)およびアール・エイ・
ジョーンズ(R.A. Jones)、J. Amer. Chem. Soc. 104, 1
316-1319(1982) ）。チミジンは、無水ピリジンをそれ
ぞれ５０ｍｌずつ用いて３回共蒸発によって乾燥し、ピ
リジン１００ｍｌに吸収させ、氷中で冷却しながら４，
４′−ＤＭＴｒ−ＣｌおよびＤＭＡＰを触媒として加え
た。反応は薄層クロマトグラフィ（移動相：ＣＨ２Ｃｌ
２／ＭｅＯＨ＝９：１）によって監視し、４時間後に水
１００ｍｌを加えて反応を停止することが可能であっ
た。溶液をエーテル（×３）で抽出し、有機相を乾燥し
て、ロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣をベンゼ
ンで再結晶することによって精製した。 収率：ＤＭＴｒ−ｄＴ９．６８ｇ（８９％）。 Ｂ） ５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン３′−Ｏ
−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル）ホス
ホルアミダイト ６の調製 ６の調製および精製は、３′−Ｏ−ＤＭＴｒ５′−ホス
ホルアミダイト４の合成について記載したのと同じ方法
で行った（例１、Ｃ）。 Ｃ） ５′−Ｏ−アセチルチミジン８の調製 混合物： ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＴ ３ａ ２．０ミリモル（１．１ｇ） ジメチルアミノピリジン ０．１ミリモル（１２．２ｍｇ） 無水酢酸 ４ｍｌ 文献： エイ・エム・ミッチェルソン(A.M. Michelson)
およびエイ・アール・トッド(A.R. Todd) 、J. Org. Ch
em., 1955, 2632-2638（変法）。 Ａｃ２Ｏを、３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＴとＤＭＡＰを氷
中で冷却した無水ピリジン２０ｍｌに溶解したものに滴
下して加えた。３時間反応した後、転換を完了した（Ｔ
ＬＣチェック；移動相：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝２
４：１）。生成物７を氷水４００ｍｌ中で沈澱させ、白
色沈澱を吸引濾別し、氷水で洗浄し、乾燥した。 収率：３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−５′−Ｏ−Ａｃ−ｄＴ
１．０２ｇ（８８％）。 ４，４′−ジメトキシトリチル基を除去するために、７
を８０％強度の酢酸１０ｍｌ中で室温で撹拌した。３時
間後に、氷水１００ｍｌを加えて反応を停止した結果、
４，４′−ジメトキシトリタノールが白色沈澱として析
出した。これを吸引濾別して、水性濾液をロータリーエ
バポレーター中で濃縮した。油性残渣を少量のＣＨ２Ｃ
ｌ２に吸収させ、ｎ−ヘキサン２００ｍｌ中で−１５℃
で沈澱させた。 収率：５′−Ｏ−アセチルチミジン４５５ｍｇ（９４
％）。 Ｄ） チミジリル−（３′−３′）チミジン １０の調製 混合物：５′−Ｏ−ＤＭＴｒ−チミジン３′−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプ ロピル−β−シアノエチル）ホスホルアミダイト ６ １．０ミリモル（７０５．８ｍｇ） ５′−Ｏ−アセチルチミジン８ ０．９ミリモル（２５３ｍｇ） テトラゾール ２．６ミリモル（１８２ｍｇ） Ｉ２ ９．０ミリモル（１．１４ｇ） ケスター(Koester) によって記載された方法（エイチ・
ケスター(H. Koester)、Nucleic Acids Res., 12, 4539
-4557 (1984)）によって二量体ブロック１０を合成し
て、３′−５′−ヌクレオシド二量体を調製することが
可能であった。５′−Ｏ−アセチルチミジンとテトラゾ
ールの混合物を無水ＣＨ３ＣＮ３０ｍｌに溶解し、アル
ゴン下でホスホルアミダイトに加えた。混合物を一晩撹
拌した後、Ｉ２９ミリモルをアセトニトリル／ピリジン
／水（２４：５：１）３０ｍｌに溶解したものを加え、
更に１５分後に、過剰量のヨウ素を４０％強度のＨ２Ｓ
Ｏ３溶液５ｍｌによって還元した。次に溶液を濃縮し、
残渣をＣＨ２Ｃｌ２に吸収させ、飽和のＮａＨＣＯ３溶
液（×２）で洗浄した後、溶媒を留去した。粗生成物を
カラムクロマトグラフィ（カラム材料：シリカゲル６０
Ｈ；溶離剤：酢酸エチル／ジクロロメタン＝５０：５
０）によって精製することが可能であった。 収率：６６５ｍｇ（７５％）。 アセチルおよびβ−シアノエチル基を除去するため、二
量体を濃ＮＨ３５ｍｌで室温で１時間処理したところ、
４．４′−ジメトキシトリチル基を８０％強度の酢酸で
除去することが可能であった。
【００３５】例３ ５′−５′−ホスホジエステル結合を有するチミジリル
−チミジン １４の調製 下記の図式に１４の調製を示す。
【化１０】 中間体の合成の個々の反応工程は、例２に記載の方法に
よって行った。ＦＡＢマススペクトルと 1Ｈ核磁気共鳴
スペクトル分析法によって２種類の二量体ブロックの構
造を確認することが可能であった。
【００３６】例４ ＣＰＧ１０−１４００支持材料の３′−Ｏ−ジメトキシ
トリチルデオキシリボヌクレオシド５′−Ｏ−スクシネ
ートの配合 ＣＧＰ支持体はアトキンソンおよびスミス（T.Atkinso
n,M.Smith,Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait 監修,
35-49(1984)の方法によって３−アミノプロピル鎖を官
能化された。 Ａ） ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−デオキシリボヌクレオシド
５′−Ｏ−スクシネート１５の調製 混合物： ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＮ ３ １．０ミリモル 無水コハク酸 ０．８ミリモル（８０ｍｇ） ジメチルアミノピリジン ０．５ミリモル（６１ｍｇ） 無水コハク酸とデオキシリボヌクレオシドの５′−ＯＨ
基との反応は、それぞれの場合に無水ピリジン５ｍｌ中
でＤＭＡＰを触媒として用いて室温で一晩行った。転換
が完了した後、溶液を濃縮し、ピリジンを３倍量のトル
エンとの共沸蒸留によって３回留去した。残渣をジクロ
ロメタンに吸収させ、有機相を１０％強度の氷冷クエン
酸溶液とＨ２Ｏで洗浄し、真空で濃縮した。粗生成物を
トルエン約３ｍｌに溶解し、ｎ−ヘキサン２００ｍｌ中
で沈澱させた。 収率：７９〜８４％。 Ｂ） ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−デオキシリボヌクレオシド
５′−（ｐ−ニトロフェニルスクシネート）１６および
支持体配合物の調製（下図式参照）
【化１１】 混合物： ３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＮ ５′−Ｏ−スクシネート １５ ０．８ミリモル ｐ−ニトロフェノール ０．８ミリモル（１１２ｍｇ） ジシクロヘキシルカルボジイミド ２．０ミリモル（４１２ｍｇ） 官能化ＣＰＧ１０−１４００ ３ｇ 保護されたスクシニル化デオキシリボヌクレオシドを、
ｐ−ニトロフェノールを無水ジオキサン５ｍｌとピリジ
ン０．２ｍｌとに溶解したものに加えた後、ＤＣＣｌを
縮合剤として加えた。極めて短時間の後に、ジシクロヘ
キシル尿素が析出し、３時間後のＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２
／ＭｅＯＨ＝９：１）は転換が完了していることを示し
た。沈澱をアルゴン下で吸引濾別し、濾液を直ちに官能
化支持体材料を無水ＤＭＦ１５ｍｌに懸濁させたものに
加えた。トリエチルアミン０．８ｍｌを加え、混合物を
一晩振盪した。次に、配合した支持体を吸引濾別し、メ
タノールとエーテルとで洗浄し、デシケーター上で乾燥
した。支持体の配合は分光測定によって決定した。支持
体（約２ｍｇ）のサンプルを０．１Ｎｐ−トルエンスル
ホン酸のアセトニトリル溶液１０ｍｌで処理して、４，
４′−ジメトキシトリチルカチオンを除去し、支持体の
配合は４９８ｎｍでの溶液の吸収を測定し、式ＯＤ498
／ｍｌ×１０ｍｌ×１４．３（定数）／支持体での溶液
ｍｇ数を用いてμモル／ｇで計算することができる。 結果： ３′−ＤＭＴｒ−ｄＴ−支持体 ２３μモル／ｇ ３′−ＤＭＴｒ−ｄＧibu −支持体 ２１μモル／ｇ ３′−ＤＭＴｒ−ｄＡbz−支持体 ２１μモル／ｇ ３′−ＤＭＴｒ−ｄＣbz−支持体 １５μモル／ｇ 未反応のアミノ基をブロックするため、配合支持体を無
水酢酸１ｍｌとジメチルアミノピリジン５０ｍｇを無水
ピリジン１５ｍｌに溶解したものと共に室温で１時間振
盪した後、吸引濾別し、メタノールとエーテルで洗浄
し、乾燥した。
【００３７】例５ ａ）末端３′−３′および５′−５′結合を有するオリ
ゴヌクレオチドの合成 合成は、アプライド・バイオシステムス(Applied Biosy
stems)、フォルスター(Forster) の３８１Ａ型ＤＮＡ合
成装置で、総ての縮合工程に対して ０．２μモル標準
プログラムを用いて行った。合成サイクルを上記に示
す。用いた支持体材料は、例４に記載のＣＰＧ１０−１
４００であった。縮合は通常のヌクレオシド３′−ホス
ファイトを用いて行い、最後の反応サイクルでは例１に
記載の３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシド５′−（Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチル）ホスホルアミ
ダイトを用いた。支持体から、オリゴヌクレオチドを濃
ＮＨ３で除去し、溶液をアンモニア中で６０℃で一晩加
熱することによって総てのホスフェートと塩基保護基を
除去した後、試料をエタノール中で沈澱することによっ
て脱塩し、標的配列をポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって短いフラグメントから精製した。研究のため
に、３′−５結合のみを有するエイコサチミジレートと
末端３′−３′および５′−５′結合を有するものを合
成した。ＳＶ４０ゲノムからの配列も選択した。下記の
オリゴヌクレオチドを合成した。ｄＴ20；ｄＴ20（３′
−３′，５′−５′）； ＳＶ４０ＴＳ１７： １７−マー、５１５９〜５１７６
位のＳＶ４０ゲノムからのセンス配列； ５′−ＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡ−３′ ＳＶ４０ＴＡＳ１７： １７−マー(mer) 、ＳＶ４０Ｔ
Ｓ１７に対するアンチセンス配列； ５′−ＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴ−３′ ＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−３′，５′−５′）： １
７−マー、末端に３′−３′および５′−５′結合を有
するＳＶ４０ＴＳ１７に対するアンチセンス配列； ３′−Ｔ（５′−５′）ＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
Ｃ（３′−３′）Ｔ−５′ ＳＶ４０ＴＳ３５： ３５−マー、５１４２〜５１７６
位のＳＶ４０ゲノムからのセンス配列； ５′−ＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧ
ＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＡＧ−３′ ＳＶ４０ＴＡＳ３５： ３５−マー、ＳＶ４０ＴＳ３５
に対するアンチセンス配列； ５′−ＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡ
ＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴ−３′ ＳＶ４０ＴＡＳ３５（３′−３′，５′−５′）； ３
５−マー、末端に３′−３′および５′−５′結合を有
するＳＶ４０ＴＳ３５に対するアンチセンス配列；
３′−Ｔ（５′−５′）ＣＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＣＴ
ＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣ（３′−
３′）Ｔ−５′ ｂ） 末端３′−３′結合を有するオリゴヌクレオチド
の合成 用いた支持体材料は例４に記載のＣＰＧ１０−１４００
であった。縮合は通常のヌクレオシド３′−ホスファイ
トを用いて行った。支持体から、オリゴヌクレオチドを
濃ＮＨ３で除去し、溶液をアンモニア中で６０℃で一晩
加熱することによって総てのホスフェートと塩基保護基
を除去した後、試料をエタノール中で沈澱することによ
って脱塩し、標的配列をポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって短いフラグメントから精製した。下記のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。 ＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−３′）： １７−マー、末
端に３′−３′結合を有するＳＶ４０ＴＳ１７に対する
アンチセンス配列； ３′−ＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣ（３′−
３′）Ｔ−５′ ｃ） 末端５′−５′結合と２つの末端チオホスフェー
ト残基を有するオリゴヌクレオチドの合成 用いた支持体材料は、３′−ヒドロキシル基を介して結
合した５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンを含む市
販のＣＰＧ材料であった。縮合は通常のヌクレオシド ３′−ホスファイトを用いて行い、最後の反応サイクル
のみでは例１に記載の３′−Ｏ−ＤＭＴｒ−ヌクレオシ
ド５′−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチ
ル）ホスホルアミダイトを用いた。最初の２つの反応サ
イクルでは、ヨウ素を用いる通常の酸化を元素状硫黄を
用いる酸化に代えた（ダブリュー・ステック(W. Stec)
ら、J.A.C.S. 106, 6077,1984参照）。濃ＮＨ３を用い
て支持体からオリゴヌクレオチドを除去し、溶液をアン
モニア中で６０℃で一晩加熱することによって総てのホ
スフェートと塩基保護基を除去した後、試料をエタノー
ル中で沈澱することによって脱塩し、標的配列をポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって短いフラグメントか
ら精製した。下記のオリゴヌクレオチドを合成した。 ＳＶ４０ＴＡＳ１７（５′−５′）： １７−マー、
５′末端に５′−５′結合と３′末端に２個のチオホス
フェートのヌクレオチド間結合を有するＳＶ４０ＴＳ１
７に対するアンチセンス配列： ３′−Ｔ（５′−５′）ＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
（Ｐs ）Ｃ（Ｐs ）Ｔ−３′
【００３８】例６ 末端３′−３′および５′−５′結合を有するオリゴヌ
クレオチドの構造および配列の分析 オリゴヌクレオチドをマクサム(Maxam) とギルバート(G
ilbert) の方法によって配列決定した（エム・マクサム
(M. Maxam)およびダブリュ・ギルバート(W.Gilbert)、
酵素学の方法(Methods in Enzymology) 、65, 499-560
(1980)参照）。それぞれの場合に、試料１００ピコモル
を（γ−32Ｐ）−ＡＴＰ／Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼの存在下にて５′−ＯＨ基で放射能標識した後、下記
の塩基特異性反応を行った。 （Ａ＋Ｇ）反応： ギ酸による塩基のプロトン付加、 Ｇ反応： ジメチルスルフェートとの反応、 （Ｔ＋Ｇ）反応： ヒドラジン分解、 Ｃ反応： ５モルＮａＣｌの存在下におけるヒ
ドラジンによる反応。 オリゴヌクレオチド鎖を１Ｍピペリジンで９５℃で処理
することによって修飾した部位で開裂させ、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（２０％アクリルアミド、７Ｍ尿
素）によってフラグメントを分画化し、それらをオート
ラジオグラフィによって検出することができた。図１に
ＳＶ４０ＴＳ１７、ＳＶ４０ＴＡＳ１７およびＳＶ４０
ＴＡＳ１７（３′−３′，５′−５′）の配列のオート
ラジオグラムを示す（オリゴヌクレオチドの記載につい
ては、例５を参照されたい）。鎖は５′−ＯＨ基で標識
したので、３′−５′結合のみがあるときには３′−
５′方向で塩基配列を読み取ることができる。しかしな
がら、３′−３′末端の結果として、オリゴヌクレオチ
ドＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−３′，５′−５′）はそ
の３′末端に放射能標識した５′−ＯＨ基を有し、これ
は配列の読取りの方向を逆転させる（図１）。これも、
酵素ポリヌクレオチドキナーゼによってホスホリル化す
ることができない遊離３′−ＯＨ基を有する鎖の５′末
端における５′−５′ホスホジエステル結合の証拠であ
る。
【００３９】例７ 血清試験における３′−３′および５′−５′末端を有
するオリゴヌクレオチドの安定性の検討 Ａ） ３′−３′および５′−５′末端を有するエイコ
サチミジレートのキナーゼ処理(kinasing) 文献：ティー・ミズノ(T. Mizuno) 、エム・ワイ・チョ
ウ(M.Y. Chou) およびエム・イノウエ(M. Inouye) 、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 81,1966-1970(1984) 。混合物： オリゴヌクレオチド（ＯＤ260 ０．０１） １μｌ、 １０×キナーゼ緩衝液 １μｌ、 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ、 γ−32Ｐ−ｄＡＴＰ（比活性：６０００Ｃｉ／ミリモル）１μｌ、 Ｈ２Ｏ ６μｌ。 混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした後、
Ｈ２Ｏ ９０μｌを加えて反応を停止し、セファデック
スＧ５０カラムで分画化する。生成物画分を纏めて、凍
結乾燥する。 Ｂ） 血清試験 文献：エス・エム・ヘイウッド(S.M. Heywood)、Nuclei
c Acids Res., 14, 6771-6772 (1986)。 混合物： 対照(reference) の放射能ホスホリル化オリ
ゴヌクレオチド０．０１ＯＤ260 ０．０１ ＯＤ260 Ｔ20、実験には３′−３′および
５′−５′結合末端を有する０．０１ ＯＤ260 Ｔ20、 新鮮なヒト血清５０μｌ。 血清をそれぞれの試料に加えて、手で軽く振りまぜる。
次いで、直ちに３μｌをピペットで採取して０値用とし
て、ホルムアミド配合緩衝液３μｌに加えて、酵素活性
を停止する。次いで、試料を３７℃でインキュベーショ
ンする。速度論用に、３μｌを所定の時間間隔で採取
し、前記のようにして停止する。対照：５分、８分、１
１分、１５分、３０分。 実験：５分、８分、１１分、１５分、３０分、９０分。
試料を２０％ポリアクリルアミドゲル上にのせ、ゲル電
気泳動によって分離した後、オートラジオグラフィ分析
を行う。左から新鮮なヒト血清を用いる開裂のオートラ
ジオグラム（図２参照）。 対照：０値、５分、８分、１１分、１５分、３０分。 実験値：０値、５分、８分、１１分、１５分、３０分、
９０分。天然のオリゴヌクレオチドの分解は５分後には
開始していることは明らかである。開裂は経時的に増加
する。９０分間インキュベーションした後でも、修飾オ
リゴヌクレオチドは実質的に変化がない。総ての速度論
的値で見られる弱いバンドは、血清中に存在するエンド
ヌクレアーゼの活性によるものである。開裂はこれらの
オリゴヌクレオチドの治療用に重要であり、且つこの活
性物質の分解を遅くするので、これらの物質の体内での
蓄積が起こらないようにする上で望ましい。
【００４０】例８ 蛇毒ホスホジエステラーゼに対する末端３′−３′およ
び５′−５′結合を有するオリゴヌクレオチドの挙動の
研究 Ａ） ３′−３′及び５′−５′末端を有するエイコサ
チミジレートのキナーゼ処理（例７参照） Ｂ） ３′−３′および５′−５′末端を有するエイコ
サチミジレートの蛇毒ホスホジエステラーゼを用いた加
水分解 文献： エイ・ヒラシマ(A. Hirashima)、エス・サワキ
(S. Sawaki) 、ワイ・イノクチ(Y. Inokuchi) およびエ
ム・イノウエ(M. Inouye) 、PNAS USA, 83, 7726-7730
(1986)。 混合物： ＲＮＡキャリヤー ５μｌ、 ＳＱ緩衝液 ５０μｌ、 ＳＶｐｄＥ（１．５ｕ／μｌ） １μｌ。 放射能ホスホリル化した試料（対照：Ｔ20、実験：末端
３′−３′および５′−５′結合を有するＴ20）を凍結
乾燥し、ＲＮＡキャリヤーとＳＱ緩衝液をこれに加え
る。それぞれの場合に、この混合物からピペットで５μ
ｌを採取して０値用にし、溶液の残りを酵素と混合し、
３７℃でインキュベーションする。５μｌ試料を対照速
度論用に５分、１５分および３０分後に採取し、３′−
３′および５′−５′末端を有するエイコサチミジレー
トの速度論用に５分、３０分、４５分、６０分および９
０分後に５μｌ試料を採取する。酵素を不活性化するた
め、試料を採取した直後に９５℃の水浴中で２分間加熱
する。試料を凍結乾燥し、分析用２０％ポリアクリルア
ミドゲルにのせる。オートラジオグラフィは、ゲル電気
泳動による分画化の後に行う。 ＳＶｐｄＥ開裂のオートラジオグラム（図３参照）：左
から：Ｔ20（対照）、末端３′−３′および５′−５′
結合を有するＴ20、実験の速度論：５分、１５分、３０
分、４５分、６０分、９０分後、０分／１５分の混合
物、０分／３０分の混合物、対照速度論：５分、１５
分、３０分、４５分後。５′−５′結合は、既に記載し
たように直ちに開裂する。その後の開裂は対照と比較し
て極めてゆっくりとしか起こらないことは、この構造を
明確に示している。５′−５′−ホスホジエステル結合
の開裂によって、開裂部位に５′−ヒドロキシル基を有
する分子を生じる。この分子は、他端が５′−ホスホリ
ル化している。蛇毒ホスホジエステラーゼによる攻撃
は、両端では不可能である。遅いが極めて明確なその後
の分解は、恐らく、製造業者によって記載されており
（ジェイ・ジー・イザント(J.G. Izant)およびエイチ・
ワイントラウブ(H. Weintraub)、Cell, 36, 1007-1015
(1984)）、スーパーコイルＰＭ２ＤＮＡを開放型に転換
する一本鎖特異的エンドヌクレアーゼの存在によるもの
であろう。配列の長さを読み取ることは容易である。し
かしながら、５′−５′−ホスホジエステル結合が５分
後の最初の速度論値で既に開裂してしまっているので１
９個のバンドしか読み取ることができない。
【００４１】例９末端３′−３′および５′−５′末端を有するオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーションの挙動の研究 ハイブリダイゼーションの挙動を検討するため、融解プ
ロットを記録した。それぞれの場合に、等モル量（５．
２３ナノモル）のＳＶ４０ＴＳ１７およびＳＶ４０ＴＡ
Ｓ１７（３′−３′，５′−５′）（オリゴヌクレオチ
ドの説明については例５を参照されたい）を１０ｍＭナ
トリウムカコジレート／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液（Ｐ
Ｈ７．０）１ｍｌに溶解し、７０℃に加熱し、溶液の吸
収を測定することによって徐冷（１°／分）したときの
再結合の過程を計測した。対照プロットは、同量のＳＶ
４０ＴＳ１７およびＳＶ４０ＴＡＳ１７を用いて記録し
た。それぞれの場合にＳＶ４０ＴＳ３５およびＳＶ４０
ＴＡＳ３５またはＳＶ４０ＴＳ３５およびＳＶ４０ＴＡ
Ｓ３５（３′−３′，５′−５′）４．７５ナノモルを
同様に緩衝液に混合し、９０℃に加熱し、冷却時の吸収
を測定した。生成する融解プロットが下記のＴｍ値を得
た。 ＳＶ４０ＴＳ１７・ＳＶ４０ＴＡＳ１７ ５４．１℃ ＳＶ４０ＴＳ１７・ＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−３′，５′−５′）５３．３℃ ＳＶ４０ＴＳ３５・ＳＶ４０ＴＡＳ３５ ６５．５℃ ＳＶ４０ＴＳ３５・ＳＶ４０ＴＡＳ３５（３′−３′，５′−５′）６４．２℃ 非生物学的結合は、したがって１７マーについては０．
６°、３５マーについては１．３°までしか融解温度を
低下させない。
【００４２】例１０ 末端３′−３′および５′−５′結合を有するオリゴヌ
クレオチドによるＳＶ４０Ｔ抗原の生合成の抑制 Ａ） 細胞培養 ＣＯＳ１細胞を、１０％胎児子牛血清を有するダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。組織培
養皿を３７℃および７．５％ＣＯ２でインキュベーショ
ンした。 Ｂ） 放射能標識および細胞崩壊 約４×１０４個の細胞を単層として組織培養皿で培養し
た。集密的(confluent) 細胞群(lawn)をメチオニン不含
ＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで35Ｓ−メチオニン１００
μＣｉで標識した。アンチセンス調整実験のために、細
胞をオリゴヌクレオチドＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−
３′，５′−５′）および放射性メチオニンと共に３７
℃で３０分間インキュベーションした。次に、細胞を１
０％胎児子牛血清を含むＤＭＥＭで２回洗浄し、この培
地中に更に３０分間放置した。細胞を崩壊させるため
に、これらを氷冷ホスフェート−緩衝食塩水（ＰＢＳ）
で処理し、皿の内容をかき取り、４００ｇで２分間遠心
分離した。次に、細胞ペレットを、３×１０６個の細胞
当たり０．４ｍｌの崩壊緩衝液（０．５％ノニデットＰ
４０、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．１
ＭＮａＣｌ）で氷上で４５分間溶解した。タンパク質分
解を防止するため、１％トラシロールとフェニルメチル
スルホニルフルオリドを最終濃度が崩壊緩衝液１ｍｌ当
たり０．２５ｍｇとなるまで加えた。次いで溶解液を超
遠心分離機（１０５，０００ｇ）中で４℃で３０分間遠
心分離して、透明にした。１０μｌの試料を採取してロ
ーリー法によってタンパク質含量を測定した。同量の総
タンパク質を免疫沈降に用いた。 Ｃ） 免疫沈降 モノクローナル抗体ＰＡｂ１０８を、細胞質に局在する
ＳＶ４０野生型Ｔ抗原および突然変異Ｔ抗原の免疫沈降
に用いた。抗体をプロテインＡ−セファロース上でクロ
マトグラフィによってハイブリドーマ上澄から精製し
た。細胞抽出液をスタフィロコッカス・アウレウス(Sta
phylococcus aureus) 株（コワン１(Cowan1))の熱不活
性化およびホルムアルデヒド固定細菌の１０％強度懸濁
液１００μｌを用いて４℃で一晩予備沈降させた。次
に、細菌を遠心分離によって除去し、上澄をモノクロー
ナル抗体と共に４℃で少なくとも２時間インキュベーシ
ョンしたところ、スタフィロコッカス・アウレウス(S.
aureus) を加えることによって特異性の高い免疫複合体
を形成した。この手続きを３回まで繰り返して、沈澱を
完全にした。次いで、免疫沈降を次のようにして洗浄し
た。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ
ＬｉＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％トラシ
ロールで３回；５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、
０．１５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１％ノニデット
Ｐ４０で２回；および５０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３で１回。
次いで、これらを溶出緩衝液（５０ｍＭＮＨ４ＨＣ
Ｏ３、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール）２
００μｌで４℃で４５分間溶出し、凍結乾燥し、試料緩
衝液（６５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５％β−
メルカプトエタノール、１％グリセロール、０．０１％
ブロモフェノールブルー）２０μｌ中で１０分間煮沸す
ることによって溶解し、３％ポリアクリルアミドゲル
（１０％ＳＤＳ）上にのせた。タンパク質を不連続ゲル
電気泳動によって分画化したところ、Ｘ線フィルム（コ
ダックＸ−ＡＲ）上でフルオログラフィによってバンド
を位置確認することができた。ウイルス成長の７０％抑
制は、本発明によって調製したオリゴヌクレオチドを用
いて記録したところ、それらは３０μモルの細胞外濃度
を用いたときにはＴ抗原の翻訳開始にまで及んだ。これ
は、本発明によって合成されなかった対応する配列、す
なわち３′−３′および５′−５′結合を持たない配列
の活性と対照的である。この場合には、同じ濃度を用い
た時、抑制は検出されなかった。図４は、細胞を３０μ
モルのＳＶ４０ＴＡＳ（３′−３′，５′−５′）で処
理したときの、Ｔ Ａｇの生合成の明らかな抑制を示し
ている。
【００４３】例１１ ３′−３′または５′−５′反転ホスホジエステル結合
により一端のみが修飾されたオリゴヌクレオチドの安定
性の検討 オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによって主として
３′−末端から分解される（ジェイ・ピー・シャウ(J.
P. Shaw) 、ケイ・ケント(K. Kent) 、ジェイ・バード
(J. Bird) 、ジェイ・フィッシュバッハ(J. Fischbac
h)、ビー・フレーラー(B. Froeler)、Nucleic Acids Re
s., 19, 747-750 (1991)）。下記の検討は、３′−３′
−末端ホスホジエステル結合だけでも血清中のオリゴヌ
クレオチドの急速な分解に対して安定化するのに十分で
あることを示した。32Ｐ−標識ホスフェート残基を血清
中でホスファターゼで長時間処理して外し、フルオレセ
イン標識を検出に用いた。Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌｅｖｉｓ
からの下記のオリゴヌクレオチド配列を合成して、それ
らの安定性を検討した。 Ｘｅｌｅｖ １：３′−Ａ（５′５′）ＧＣＣＴＣＡＡ
ＡＣ＊ＡＴＧＴＧＴＧＡＣＧ３′ Ｘｅｌｅｖ ２：５′ ＡＧＣＣＴＣＡＡＡＣ＊ＡＴ
ＧＴＧＴＧＡＣ（３′３′）Ｇ５′ オリゴヌクレオチドの合成は、例５において１０回目の
カップリング反応において、塩基修飾シチジンホスホル
アミダイトＣ＊を用いて続いてフルオレセイン標識の共
有結合を行わせたこと以外は、例５に記載のように行っ
た。フルオレセインの導入は販売業者のプロトコール
（ファルマシア・エル・ケイ・ビー・バイオテクノロジ
ー(Pharmacia LKB Biotechnology) 、オート・プライマ
ー(Auto PrimerTM) 合成キット説明書；ＸＹＡ−０２３
−００−０１）にしたがって行った。修飾オリゴヌクレ
オチドは、ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動によって
精製した。 血清分析： １０ｐモル オリゴヌクレオチド、１４０
μｌ ヒト血清。試料を３７℃でインキュベーションし
た。１５、３０、４５および６０分、８時間および７２
時間後に、２０μｌの試料を採取して、フェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、
ｖ：ｖ：ｖ）で２回抽出し、最後にオリゴヌクレオチド
をアルコールで沈澱させた。開裂生成物を１６％ポリア
クリルアミドゲル上で自動配列装置ＡＬＦ（ファルマシ
ア、フライブルク）によって分離した。図５から判るよ
うに、５′末端に１つだけ反転したホスフォジエステル
結合を有するＸｅｌｅｖ１の安定性はやや低く、血清で
処理してから１５分後には開裂生成物が見られ、６０分
後にはオリゴヌクレオチドはほとんど完全に分解してい
る。反対に、１つの３′３′ホスフェートジエステル結
合をこの末端に有するオリゴヌクレオチドＸｅｌｅｖ２
は７２時間処理した後でも部分的な分解が見られるだけ
である。
【００４４】例１２ インビトロ翻訳系でのｐ５３遺伝子発現の抑制 修飾オリゴヌクレオチドによる無細胞系でのタンパク質
の生合成の抑制を定量するため、ｐ５３ ｍＲＮＡ
（(E. Reihsaus) 、エム・コーラー(M. Kohler) 、エス
・クライス(S. Kreiss) 、エム・オーレン(M. Oren) 、
エム・モンテナール(M. Montenarh)、Oncogene, 5, 137
-144 (1990) ）の翻訳に対する影響を検討した。ｐ５３
−ｍＲＮＡの翻訳開始領域に対する下記のアンチセンス
オリゴヌクレオチドを合成した。 ５′Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）６ｐＴＡＡＴＣＡＧＴＣＧＴＴＧ
ＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴ（３′３′）Ｔ コントロールとしては、下記のセンス配列を用いた。 ５′Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）６ｐＡＡＡＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣ
ＡＡＣＧＡＣＴＧＡＴＴ（３′３′）Ａ 下記の条件で、ｐ５３のタンパク質生合成を検討した。 １． オリゴヌクレオチドを添加せずに、 ２． ３０μＭセンスオリゴヌクレオチド（コントロー
ル）を添加した後、 ３． １μＭアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加し
た後、 ４． １０μＭアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加
した後。 定量は、タンパク質ゲル上の染色タンパク質バンドをデ
ンシトメーターによって測定して行った。図６は、イン
ビトロでタンパク質生合成系にアンチセンスオリゴヌク
レオチド１０μＭを添加すると７０％抑制が起こり、１
μＭしか添加しないときには、抑制はほとんど検出され
なかった。ｐ５３ｍＲＮＡに結合しないセンスオリゴヌ
クレオチドを添加しても、３０μＭ程度の濃度でもｐ５
３生合成は抑制されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＶ４０ＴＳ１７、ＳＶ４０ＴＡＳ１７および
ＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−３′，５′−５′）の配列
のオートラジオグラムを示すＸ線写真である。
【図２】ｄＴ20およびｄＴ20（３′−３′，５′−
５′）の新鮮なヒト血清による開裂のオートラジオグラ
ムを示すＸ線写真である。左から ｄＴ20：０、５、８、１１、１５および３０分後の反
応、 ｄＴ20（３′−３′，５′−５′）：０、５、８、１
１、２５、３０および９０分後の反応である。
【図３】ＳＶｐｄＥ開裂のオートラジオグラムを示すＸ
線写真である。左からｄＴ20、ｄＴ20（３′−３′，
５′−５′）、５，１５，３０，４５，６０，９０分後
のｄＴ20（３′−３′，５′−５′）の開裂、０分／１
５分の混合物、０分／３０分の混合物、５、１５，３
０，４５分後のｄＴ20の開裂を表わす。
【図４】アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＴ−Ａ
ｇの発現の調整を示すフルオログラフィによるＸ線写真
である。 ライン１：３０μＭのＳＶ４０ＴＡＳ１７（３′−
３′，５′−５′）による抑制後の細胞溶解物であり、 ライン２：抑制のない細胞溶解物である。 Ｍ：尺度
【図５】オリゴヌクレオチドＸｅｌｅｖ１（クローン６
および７）およびＸｅｌｅｖ２（クローン８および１
０）の血清安定性を示す。
【図６】は、腫瘍形成タンパク質ｐ５３のアンチセンス
−ＩＮＶ−オリゴヌクレオチドによる生合成の抑制を示
す。ａはオリゴヌクレオチドなしであり、ｂは３０μＭ
の「センス」２５マーであり、ｃは１μＭの「アンチセ
ンス」２５マーであり、ｄは１０μＭの「アンチセン
ス」２５マーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/00 8931−4Ｂ (72)発明者 ジョゼ、フラビオ、ラマルホ‐オルティガ オ ドイツ連邦共和国ウルム、ハスラッハーウ ェーク、17 (72)発明者 マティアス、モンテナール ドイツ連邦共和国ゼンデン‐アイ、パルク シュトラーセ、７ (72)発明者 ハルトムト、ゼリガー ドイツ連邦共和国エルヒンゲン‐タールフ ィンゲン、ハーゼンウェーク、１

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式I またはIIのオリゴヌクレオチド 【化１】 ［式中、Ｒ１は、水素または式III 【化２】 の基であり、Ｒ２は、水素または式IV 【化３】 の基であり、但し基Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つは
    式III またはIVの基であり、 Ｂは、塩基、例えばアデニン、チミン、シトシン、グア
    ニンのような天然の塩基、または例えばプリン、２，６
    −ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグ
    アニンまたはＮ４，Ｎ４−エテノシトシンのような人為
    的塩基、またはそれらのプロドラッグ型であり、 ＷおよびＷ′は、互いに独立に、酸素または硫黄であ
    り、ＺおよびＺ′は、互いに独立に、Ｏ- 、Ｓ- 、Ｃ１
    〜Ｃ18−アルコキシ、好ましくはＣ１〜Ｃ８−アルコキ
    シ、特に好ましくはＣ１〜Ｃ３−アルコキシ、特にメト
    キシ、Ｃ１〜Ｃ18−アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ８−
    アルキル、特に好ましくはＣ１〜Ｃ３−アルキル、特に
    メチル、ＮＨＲ３（但し、Ｒ３は好ましくはＣ１〜Ｃ18
    −アルキル、特に好ましくはＣ１〜Ｃ８−アルキル、特
    にＣ１〜Ｃ４−アルキル、またはＣ１〜Ｃ４−アルコキ
    シ−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、好ましくはメトキシエチル
    である）、ＮＲ３Ｒ４（但し、Ｒ３は前記に定義の通り
    であり、Ｒ４は好ましくはＣ１〜Ｃ18−アルキル、特に
    好ましくはＣ１〜Ｃ８−アルキル、特にＣ１〜Ｃ４−ア
    ルキルであるか、またはＲ３とＲ４とがそれらを有する
    窒素原子と一緒になって５〜６員の複素環であって更に
    Ｏ、Ｓ、Ｎからなる組からの他のヘテロ原子を含むこと
    ができるものであって、例えばモルホリンを形成する）
    であり、 Ｙは、Ｏ−Ｓｉ（Ｒ）２、ＯＣＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲまた
    はＯ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）（但し、ＲはＣ１〜Ｃ６−アル
    キル、アリールまたはＣ５−またはＣ６−シクロアルキ
    ル）であり、 ｎは、５〜６０、好ましくは１０〜４０、特に好ましく
    は１５〜２５の整数である］および生理学的に許容され
    るその塩。
  2. 【請求項２】Ｒ２が式IVの基であってＲ１が水素である
    か、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ式III およびIVの基であ
    るか、またはＲ２が水素であってＲ１が式III の基（但
    し、ＷまたはＺは酸素ではない）である、請求項１に記
    載の式I のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】Ｗが酸素であるかまたはＺおよびＷの両方
    とも酸素である、請求項１または２に記載の式I のオリ
    ゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】Ｒ２が式IVの基であり、Ｒ１が水素であ
    る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式I のオリゴ
    ヌクレオチド。
  5. 【請求項５】細胞内吸収に有利であり、インビトロまた
    は生体内でリポーター基として作用する基、および／ま
    たは生物学的ＤＮＡまたはＲＮＡとのオリゴヌクレオチ
    ドのハイブリッド形成の際にこのＤＮＡまたはＲＮＡ分
    子を攻撃して結合を形成しまたは開裂する基によって更
    に置換されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載
    の式I またはIIのオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】ａ） ３′−または５′−末端リン（III
    ）またはリン（V ）基を有するヌクレオチド単位また
    はその活性化誘導体を遊離の３′−または５′−末端ヒ
    ドロキシル基を有するもう一つのヌクレオチド単位と反
    応させ、または ｂ） 同様な方法でフラグメントによってオリゴヌクレ
    オチドを合成し、適当な場合には他の機能を保護するた
    めに（ａ）または（ｂ）と同様にして得られるオリゴヌ
    クレオチド中に一時的に導入された１個またはそれ以上
    の保護基を取り除き、且つ適当な場合には、この方法で
    得られた式I のオリゴヌクレオチドを生理学的に許容し
    得る塩に転換することを特徴とする、請求項１〜５のい
    ずれか１項に記載の式I のオリゴヌクレオチドの製造
    法。
  7. 【請求項７】核酸の生物学的機能の調節または抑制、ウ
    イルスゲノム機能の発現の選択的抑制、ウイルス性疾患
    の予防および治療、腫瘍形成遺伝子の機能の抑制、およ
    び癌の治療を目的とする、二本鎖または一本鎖核酸に結
    合することに基づく、化学的ハイブリダイゼーション法
    に用いるための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    式I またはIIのオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】適当な場合には、生理学的に許容し得る補
    助剤および／または賦形剤と一緒に請求項１〜５に記載
    の化合物の１種類又はそれ以上を含む、好ましくは静脈
    内または局所投与のための医薬。
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