JPH04290900A - 低温殺菌された鉄不含ヒトトランスフェリンの調製方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は低温殺菌された（ｐａｓ
ｔｅｕｒｉｚｅｄ）鉄不含ヒトトランスフェリンの調製
方法およびその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】トランスフェリンはヒトを含む脊椎動物
の血漿中の鉄分輸送タンパク質である。

【０００３】ヒトトランスフェリンは例えば遺伝子工学
において哺乳動物細胞を増殖させるために細胞培養用増
殖因子として、また無トランスフェリン貧血の希症例に
おける治療薬として主に用いられる。

【０００４】血清または血漿からヒトトランスフェリン
を調製するための様々な方法が報告されているが、それ
らは広範囲にわたる様々な分画原理を用い、そして例え
ば、エタノール／水混合物を冷時使用する段階的沈殿に
より（これによってトランスフェリンが結晶の形で得ら
れる）、カルシウムおよび亜鉛イオンの存在下にエチル
アルコールを用いる沈殿により、そして不純物をカルボ
キシメチル−およびＤＥＡＥ−セルロースに吸着するこ
とにより（これによって治療的に用いることのできる低
温殺菌された鉄飽和トランスフェリンが得られる）、硫
酸アンモニウムを用いる分別塩析およびＲｉｖａｎｏｌ
／アルコール組合せ法を用いる水性媒質中水酸化アルミ
ニウムへの不純物吸着により（その場合には少くとも８
５％純度のヒトトランスフェリンが単離され、次いで純
粋な形で収率よく容易に結晶化させることができた）、
そしてＲｉｖａｎｏｌおよび硫酸アンモニウムによる沈
殿段階の組合せと水酸化アルミニウムへの不純物吸着に
より、工業規模で行うことができる。

【０００５】ヒトトランスフェリンの工業的単離に適し
たこれら精製方法のほか、文献には研究目的の少量のト
ランスフェリンの調製に適した他の様々な方法が記載さ
れている。

【０００６】ヒトトランスフェリンは今日すべての血漿
製品と同様ＨＢｓＡｇ−陰性および抗−ＨＩＶ−陰性血
漿から専らに調製されており、またその調製方法に基づ
いておよび何年もの臨床使用の後ウイルス病伝達の点で
は低リスク製品群の範疇に入れることができるが、ウイ
ルス混入のリスクが残ることを排除できない。それ故に
既存のウイルス排除のほかに、現在可能な最高の安全性
確保を得るために付加的な効率的ウイルス失活段階を調
製過程と組み合わせるのが望ましいのではないかと思わ
れた。

【０００７】血漿タンパク質の滅菌には本質的に三種類
の方法が知られている。すなわち、液体または乾燥状態
での熱処理、β−プロピオラクトンとＵＶ光照射による
組合せ処理およびエーテルまたはトリ−ｎ−ブチルホス
フェートと洗剤との組合せによる処理である。

【０００８】鉄飽和トランスフェリンは溶液中６０℃で
１０時間低温殺菌でき、一方アポトランスフェリンはこ
れらの条件下では変性してしまう。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】これらすべての方法に
は、鉄不含トランスフェリン製品の調製に関し、滅菌の
後に、添加されたまたは天然にトランスフェリンに結合
した鉄を錯化剤（通常ＥＤＴＡ）を用いて除去するため
の別段階を行う必要があるという欠点がある。

【００１０】本発明の目的は６０℃で１０時間加熱する
過程でトランスフェリン結合鉄の除去、錯化および形成
アポトランスフェリンの安定化を同時にできる方法を提
供することにある。

【００１１】錯化剤をＣ１不活性化剤、α１−抗トリプ
シンまたはある種の凝固因子の低温処理の際に安定化剤
として用いることは知られていたが、かかる化合物の存
在下に滅菌した場合にアポトランスフェリンの生物学的
活性も保持されようとは全く予測できないことであった
。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、錯化剤を含む
ヒトトランスフェリン溶液を低温殺菌することより成る
ヒトトランスフェリンの低温殺菌方法に関する。

【００１３】このために、既知の方法により予備精製さ
れそして１リットルあたり１０〜１００ｇ、好ましくは
４０〜６０ｇのトランスフェリンを含む溶液に十分な錯
化剤、好ましくは可溶性クエン酸塩またはエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、を少なくとも０．４モル
／リットルの濃度、好ましくは１．２Ｍクエン酸ナトリ
ウムまたは０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、となるように添加し、
ｐＨを好ましくはクエン酸を用いて７〜８に調整しそし
てその混合物を６０℃に１０時間保つことができる。

【００１４】形成されたアポトランスフェリンはこれら
の条件下に熱失活から守られるのに対し、この方法にお
いて実験的に添加されたウイルスモデルはほんの短いイ
ンキュベーション時間の後に失活される。

【００１５】証明として、ヒトトランスフェリン（１．
２Ｍクエン酸塩ｐＨ７．５中に５％）の検体を１０：１
の割合でＨＳＶ−１、ポリオウイルス・タイプ１または
ワクシニアウイルスと混合した。これらの検体を１０時
間までの時間間隔をおいて温度調節水浴中６０℃で加熱
した。検体を３０分、１、２、４、６、８および１０時
間後に取り出しそしてそれらのウイルス含量の力価を測
定した。ヘルペスシンプレックスウイルスおよびワクシ
ニアウイルスの力価測定はベロ（ｖｅｒｏ）細胞に対し
て行い、そしてポリオウイルスのそれはＨＥＰ−２細胞
に対して行い、またそれぞれについて１ウイルス希釈段
階あたり並行的に８つの培養を行った。このタイプの力
価測定（検出下限１．５ｌｏｇ　ＩＤ５０／ｍｌ）にお
いて感染ウイルスが全く検出されない場合に、もとの検
出の１ｍｌに相当する量を２回別の培養ビン中でテスト
した。それらテスト培養すべてが陰性のままのとき、ウ
イルス力価は１０　ＩＤ５０／ｍｌ以下とした。力価は
ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの方法により計算した。

【００１６】結果：（すべての力価はｌｏｇ　１０　Ｉ
Ｄ５０／ｍｌとして記した） ＨＳＶ−１：失活前のトランスフェリン／ウイルス混合
物中のウイルス力価は６．４。１時間の失活時間後感染
ウイルスは全く検出できなかった。 ポリオウイルス：トランスフェリン／ウイルス混合物中
のウイルス力価は５．７。３０分後の失活時間後感染ウ
イルスは全く検出できなかった。 ワクシニアウイルス：トランスフェリン／ウイルス混合
物中のウイルス力価は６．５。２時間の失活時間後、残
留感染ウイルスは全く検出できなかった。

【００１７】前記三種類のウイルスモデルの完全な失活
のために十分である短かい失活時間から、裸ウイルス、
エンベロープ被包ウイルスおよび複合（ｃｏｍｐｌｅｘ
）ウイルスの極めて効率的な失活がトランスフェリンの
低温殺菌により可能であることがわかる。ＨＳＶ−１は
脂質含有エンベロープで被包された大きなウイルス群の
モデルとしてみることができ、そしてこの群においては
比較的高い安定性をもつ点で際立っている。ＨＩＶウイ
ルスのようなレトロウイルスは今日まで調べたすべての
例においてＨＳＶよりも速かに失活される。ポリオウイ
ルスおよびワクシニアウイルスは相当に高い熱安定性を
有することが知られている裸ウイルスの代表例である。 高い安定性があるにもかかわらず、これら二種類のウイ
ルスモデルでさえも予想外に速かに失活される。従って
トランスフェリンの低温殺菌は様々な種のエンベロープ
被包ウイルスおよび裸ウイルスの失活に対し極めて効率
的な方法である。

【００１８】錯化剤の存在下に加熱すると、トランスフ
ェリン中に天然に存在しそして例えば限外濾過による以
後の精製中に洗浄除去され得る鉄の錯化も同時に生じる
。

【００１９】最終精製段階の前の調製過程に低温殺菌を
取り込むのが有益であることがわかった。この後処理段
階において、トランスフェリンは既に十分高い純度を有
し、そしてこの手順は、加熱過程の際に通常変性する残
留量のタンパク質不純物を次いで例えば水酸化アルミニ
ウムに吸着させることにより、より容易に除去できると
いう長所を有する。少量の凝集トランスフェリンも同様
にその吸着により除去される。

【００２０】トランスフェリンに対して知られた精製法
との組合せで、前記方法によりＣｏｈｎフラクションＩ
Ｖから少くとも９８％の免疫化学的純度を有する低温殺
菌鉄不含ヒトトランスフェリンを得ることができる。得
られた低温殺菌鉄不含トランスフェリン溶液は次いで既
知の方法による精製および濃縮、濾過による滅菌および
凍結乾燥を受けることができる。凝集体（二量体）の量
は約２〜５％であるがこれは凍結乾燥、未低温殺菌製品
の場合と同じオーダーである。

【００２１】低温殺菌トランスフェリンの鉄結合能は完
全に保持される。低温殺菌法後の鉄不含および鉄飽和ト
ランスフェリンの結晶化は、エチルアルコールまたはポ
リエチレングリコールを用いて、未低温殺菌トランスフ
ェリンの場合と同じ容易さおよび同じ結晶形態で行われ
る。最後に、細胞培養において増殖因子として働くとい
う低温処理トランスフェリンの性質も同じく完全に保持
される。

【００２２】

【実施例】実施例１ 既知の方法により予備精製され、そして約９０％の免疫
学的純度および５５０μｇ／ｇ（タンパク質）の鉄含量
を有する１，０００ｇの粗製トランスフェリン乾燥物質
を蒸留水に溶解し、そして１．２Ｍクエン酸三ナトリウ
ムを含有する約５％強度タンパク質溶液２０リットルを
与えるのに十分なクエン酸三ナトリウムを添加する。そ
の溶液のｐＨを１Ｍクエン酸で７．５に調整する。

【００２３】その粗製トランスフェリン溶液を連続撹拌
しながら水浴中６０℃に加熱しそして６０℃に１０時間
保つ。室温まで冷却後、加熱過程の際に生じたわずかな
濁りを清澄化するための濾過により除去する。

【００２４】クエン酸ナトリウムおよびそれに結合した
鉄を限外濾過（膜排除限界＝１０ＫＤ）により蒸留水で
タンパク質溶液から洗浄除去する。この時点でトランス
フェリン溶液の鉄含量は２０μｇ／ｇ（タンパク質）よ
り低くなっている。

【００２５】ここで行われる鉄不含トランスフェリンの
最終精製は既知の方法、例えば残留不純物の水酸化アル
ミニウムへの吸着または陰イオン交換体でのクロマトグ
ラフィーによって行われる。

【００２６】実施例２ 最初の手順は実施例１と同様とするが、クエン酸三ナト
リウムに代えてエチレンジニトリロ四酢酸二ナトリウム
塩を０．５Ｍの濃度で用いる。

【００２７】溶液のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム溶液で
ｐＨ７．５に調節する。以後の処理は実施例１に記載の
如く行われる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　錯化剤を含有するヒトトランスフェリ
   ン溶液を低温処理することより成るヒトトランスフェリ
   ンの後処理方法。
2. 【請求項２】　　可溶性クエン酸塩またはエチレンジア
   ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が錯化剤として用いられる請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　錯化剤が結合した鉄と共にトランスフ
   ェリンから除去される請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】　　請求項３に記載の如く得ることのでき
   る低温殺菌された鉄不含ヒトトランスフェリン。
5. 【請求項５】　　医薬としての請求項４記載のヒトトラ
   ンスフェリン。
6. 【請求項６】　　請求項４記載のヒトトランスフェリン
   の増殖因子としての使用。