KR100696897B1

KR100696897B1 - 바이러스의 불활성화 방법

Info

Publication number: KR100696897B1
Application number: KR1020000026657A
Authority: KR
Inventors: 쉴러엑크하르트; 쿰페게르하르트; 노박토마스
Original assignee: 쳇엘베 베링 게엠베하
Priority date: 1999-05-19
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: DE19923027C2; EP1053754A1; ES2232345T3; JP2001000179A; AU772669B2; CA2308904C; AU3537100A; ATE285255T1; US6468778B1; EP1053754B1; KR20010069197A; DE50008992D1; JP4629831B2; DE19923027A1; CA2308904A1

Abstract

알칼리성 pH에서 암모늄 염을 첨가함으로써 혈장 단백질 용액으로부터의 외피(envelope)를 갖는 바이러스 및/또는 외피를 갖지않는 바이러스를 불활성화하고/하거나 제거하는 방법이 기재되어 있는데, 당해 방법에서는, 크로마토크래피로 예비 정제된 혈장 단백질 용액을 13 내지 22중량%의 암모늄 염 농도하에 실온에서 항온처리하고, 침전물을 분리하고 암모늄 염을 제거하여 암모늄 염의 잔여량이 0.5mol/L 미만으로 되도록 한 후에, 약 60℃에서 수 시간 동안 저온살균(pasteurizing)한 다음, 가공하여 치료학적으로 적용 가능한 혈장 단백질 제제를 수득한다.

바이러스의 불활성화 방법, 암모늄 염 농도, 혈장 단백질 용액, 감염성 전이, 혈액 응고 인자, 저온살균

Description

바이러스의 불활성화 방법{Process for the inactivation of viruses}

본 발명은 혈장 단백질 용액으로부터의 외피(envelope)를 갖는 바이러스 및/또는 외피를 갖지않는 바이러스를 불활성화하고/하거나 제거하는 방법에 관한 것이다.

공지되어 있는 바와 같이, 사람 혈장은 많은 현대 치료학의 원료이다. 이들은 알부민, 면역글로블린 및 혈액 응고 인자 그룹을 포함한다.

각각의 응고 인자가 선천적으로 부족한 환자는 이들 인자를 대체해야만 생존할 수 있기 때문에, 혈액 응고 인자가 필요하게 된다. 그러나, 또한, 후천성 혈액 응고 인자 결핍도 있으며, 이 역시 이들 인자의 대체를 필요로 한다.

비록 초기에는 혈장 단백질을 대체하는 것이 환자에게 위험하지 않은 것으로 생각되었으나, 이런 유형의 제제로 치료한 결과, 혈장 공여체로부터 감염성 질병이 전달될 수 있으며, 많은 경우, 이들은 질병-유발 바이러스의 감염에 의한 것으로 나타났다. 그러므로, 이러한 유형의 바이러스를 불활성화하고/하거나 제거함으로써, 바이러스 감염의 위험 없이 환자에게 사용할 수 있는 고도로 정제된 혈장 제제 및 혈액 응고 인자 제제를 사용가능하게 하는 것이 목적이었다. 이를 위해, 이미 다양한 방법이 제시되어 왔다.

이리하여, 유럽 특허 제0 124 506호에는, 혈액 속에 존재하는 혈장 효소, 응고 인자, 면역글로블린 또는 다른 단백질을 함유하는 제제에서 증식성 항원을 불활성화하는 방법이 기재되어 있는데, 여기서 암모늄 설페이트를 첨가하여 당해 제제의 염 농도가 0.5M 초과로 되도록 하고, 열처리한 다음, 제제로부터 염을 제거한다. 이러한 공정에 있어서, 단백질 함량이 30% 이하인 제제에 농도가 2 내지 4M로 될 때까지 암모늄 설페이트를 첨가한다. 이어서, 40 내지 121℃의 온도에서 최대 100시간까지 열처리를 수행한다.

물론, 이러한 유형의 공정에 있어서, 사용되는 염과 열처리에서 바이러스가 불활성화되고/되거나 제거될 뿐만 아니라, 이러한 경우, 제제 속에 함유된 혈장 단백질의 생물학적 활성이 가능한 한 높게 유지되어야 한다는 사실에 주의를 기울여야 한다. 그러므로, 혈장 단백질 용액으로부터의 바이러스를 불활성화하고/하거나 제거하는 공정에서는, 이러한 유형의 혈장 제제에 의한 바이러스의 감염성 전이를 완전히 배제해야 할 뿐만 아니라, 더욱이 공정이 아주 온화하여 혈장 단백질, 특히 혈액 응고 인자의 생물학적 활성에 역효과를 주지 않아야 할 필요성 또한 존재한다.

혈장 단백질 용액을 13 내지 22중량%의 암모늄 염 농도(=25 내지 39% 암모늄 설페이트 포화도)하에 실온과 알칼리성 pH에서 항온처리하고, 침전물을 분리하고 암모늄 염을 제거하여 암모늄 염의 잔여량이 0.5mol/L 미만으로 되도록 한 후에, 약 60℃에서 수 시간 동안 저온살균(pasteurizing)한 다음, 가공하여 치료학적으로 적용 가능한 혈장 단백질 제제를 수득한다면, 위와 같은 요구는 혈장 단백질 용액으로부터의 외피를 갖는 바이러스 및/또는 외피를 갖지않는 바이러스를 불활성화하고/하거나 제거하는 공정에 의해 우수한 방법으로 실현될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 의미에 포함되는 혈장 단백질은 천연의 활성 단백질 그 자체 뿐만 아니라 이의 전구체이다. 혈장 단백질은 혈장 또는 다른 체액으로부터 얻을 수 있다.

이러한 방법을 위해, 바람직하게는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 미리 정제된 혈장 단백질 용액을 사용하고, pH 8 내지 11에서 공정을 수행한다. 바이러스 감소는 제거로 수행하거나(예를 들면, 개의 파르보바이러스(CPV)의 경우, 25±1℃의 온도가 아주 특히 바람직함), 제거와 불활성화를 조합하여(예를 들면, 소 바이러스 설사 바이러스(BVDV) 또는 HIV의 경우) 수행한다.

13 내지 22중량%의 암모늄 염 농도(=25 내지 39% 암모늄 설페이트 포화도)로 항온처리하고, 원심분리 또는 여과로 불순물을 제거 및 침전시킨 후, 다시 암모늄 염을 첨가하여 농도를 24 내지 27중량%(=44.4 내지 50% 암모늄 설페이트 포화도)로 증가시킴으로써, 본 발명에 따르는 공정에서의 또다른 개선점이 달성될 수 있다. 이러한 제2 침전에 있어서, 혈장 단백질은 순수한 형태로 침전되고, 이어서 암모늄 염의 잔여량이 0.5mol/L 미만이 되도록 암모늄 염을 제거한 후에 약 60℃에서 수 시간 동안 저온살균한다. 이어서, 침전물을 가공하여 치료학적으로 적용 가능한 혈장 단백질 제제를 수득할 수 있다.

제1 항온처리와 제2 항온처리 모두 2 내지 4시간을 사용해야 한다. 사용되는 암모늄 염은 암모늄 설페이트가 바람직하다.

혈장 단백질의 잔여 활성을 가능한 한 높게 하기 위해, 안정화제의 존재하에 저온살균을 수행하는 것이 권장된다. 적절한 안정화제는 수크로스(1000g/l)와 글리신(150g/l)과의 혼합물인 것으로 판명되었다. 또한, 안정화제로서 수크로스와 아세트산칼륨이 존재하면 혈장 단백질의 보다 높은 잔여 활성을 얻을 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따르는 방법은 혈액으로부터 얻은 혈장 단백질로 수행하며, (항트롬빈 III을 기준으로 하여) 95% 이하의 잔여 활성을 얻을 수 있다. 그러나, 단세포 유기체 또는 특히 형질전환 동물로부터 수득된, 생물공학적으로 제조된 재조합 또는 형질전환 혈장 단백질에 대해서도 또한 위의 방법을 사용할 수 있다.

또한, 알칼리성 pH를 유지하는 것이 본 발명에 따르는 방법에서 특히 중요하다. 이 외의 동일한 조건하에서 pH가 상승하면, 침전 반응에 의해 얻어지는 단백질 정제시 pH가 증가함에 따라 바이러스의 불활성화가 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 바이러스 감소의 증가는 외피를 갖는 바이러스와 외피를 갖지않는 바이러스 모두에서 발견될 수 있으며, 이는 암모늄 염과 알칼리성 pH의 복합적 영향에 따른 것이다.

그러므로, 본 발명에 따르는 방법의 특징은 2단계의 바이러스 감소 공정 단계, 즉 수용액에서의 저온살균(60℃에서 10시간)과 암모늄 설페이트 침전을 포함한다는 것이다. 바이러스 불활성화의 2단계 모두 바이러스 감소에 있어서 높은 감소율을 포함한다. 외피를 갖지않는 바이러스에서조차 두 단계 모두의 효과가 아주 중요하다.

본 발명에 따르는 방법은 항트롬빈 III(AT III)을 예로 들어 다음과 같은 방법으로 설명할 수 있다:

원심분리에 의한 저온 침전(cryoprecipitation) 후, 미립의 혈장 성분으로 분리되는 공여 혈액으로부터 사람 항트롬빈 III을 분리한다. 콘 분별화(Cohn fractionation)로 수득한 8% 에탄올 상등액을 헤파린 프락토겔(Fractogel) 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 예비 정제한다. 이 공정에서, AT III을 칼럼상에 농축시킨다. 칼럼에 부착된 헤파린은 AT III 및 몇몇의 다른 혈장 단백질 모두에 결합한다. 약하게 결합된 혈장 단백질의 대부분을 저농도의 NaCl을 함유하는 완충 용액으로 세척 분리하는 반면, 이어서 AT III을 2M NaCl, 50mM NaH₂PO₄ 및 pH 7.5로 이루어진 완충 용액을 사용하여 용출시킨다. 위의 특정한 친화성 크로마토그래피로 이미 달성된 AT III의 높은 순도는 오염된 단백질을 암모늄 설페이트 침전물 단편으로 제거함으로써 보다 향상된다. 이어서, 고형 암모늄 설페이트를 용출물에 첨가함으로써 31.3%의 암모늄 설페이트 포화 농도가 설정된다. 실온에서(25℃±1) 3시간 동안 항온처리하는 동안, 침전물이 형성되며, 이는 원심분리 또는 여과에 의해 분리되고 제거된다. 항온처리하는 동안 아주 격렬한 교반은 피해야 하는데, 이는 그렇지 않으면 침전물이 너무 미세하게 되어 필터를 막기 때문이다. 항온처리하는 동안 pH는 9.0을 유지한다. 이어서, 암모늄 설페이트의 잔여량이 0.5mol/L 미만이 되도록 투석하여 암모늄 설페이트 농도를 감소시키고, 수크로스(1000g/l)와 글리신(150g/l)을 안정화제로서 첨가한다. 이어서, 안정화된 AT III 수용액을 60℃에서 10시간 동안 저온살균한다.

최종 생성물의 높은 순도는 부분 전기영동(zone electrophoresis)과 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 확인한다.

바이러스 감소를 조사하기 위해, 암모늄 설페이트를 처리(0.05용적부)하기 전에 바이러스를 첨가한다. 이러한 경우, 바이러스 감소에 대한 다음의 수치를 발견하였다:

바이러스	바이러스 감소율(log₁₀)
HIV	≥7.8
HAV(A형 간염 바이러스)	≥6.1
PRV(가성광견병 바이러스)	≥7.7
BVDV(소 바이러스 설사 바이러스)	≥7.1
CPV(개 파르보바이러스)	≥8.1

고형 암모늄 설페이트의 첨가에 의해 최종 농도 45.9% 암모늄 설페이트 포화도로 농도가 조절된 제2 암모늄 설페이트 침전은 바람직하게는 제1 암모늄 설페이트 침전을 따르게 할 수 있다. 실온에서 3시간 동안 침전시킨 후, 침전된 AT III을 분리 제거한다. 이어서, 이렇게 하여 수득한 침전물을 용해시키고 투석하여 0.8%(중량/용적) NaCl과 0.8%(중량/용적) 암모늄 설페이트의 완충액으로 조정한다.

저온살균에 의한 바이러스 불활성화를 조사하기 위해, 감염성 바이러스를 저온살균하기 전에 즉시 생성물에 첨가한 후, 시료를 60℃에서 열처리하였다. 조사한 모든 바이러스(CPV 제외)는 6시간 미만의 열처리 후에 완전히 불활성화되었다.
특허 의약품에 대한 위원회{the Committee for Proprietary Medicinal Products(CPMP)}가 발간한 유럽 연합에 대한 지침에서는 사람 혈장 단백질 제조 공정을 통한 바이러스 제거/불활성화의 단계적 조사를 요구하고 있다. 이들 지침에 따르면, 세 종류 이상의 바이러스, 즉 관련 위험 바이러스인 HIV, 상세히 외피를 갖는 바이러스 및 외피를 갖지않는 바이러스가 이런 유형의 조사에 사용되어야 한다. 위의 표로부터, 본 발명에 따르는 방법을 사용함으로써 매우 다양한 유형의 바이러스에 대해 탁월한 감소율이 달성된 것을 알 수 있다.

바이러스 안정화를 조사하기 위해, 본 발명에 따르는 방법으로 수득한 AT III 제제를 임상 연구에 적용하였다. 이전에 혈액 수혈이나 혈액 유도체를 공급받지 않았으며, 간 질환 내역이 존재하지 않았던 13명의 건강한 남성 피검체를 본 연구에 참여시켰다. 7명의 피검체는 B형 간염에 대해 접종되었으므로, 항 HBs 유형의 보호 항체를 지녔다. 다른 6명의 참가자들은 B형 간염 혈청 마커에 대해서는 음성이었다. 그러므로, B형 간염에 대한 안정성은 단지 이들 6명의 피검체에서만 관측할 수 있었던 반면, C형 간염 및 HIV 감염에 대해서는 13명의 모든 환자에게서 평가할 수 있었다. 이 연구에서 각각의 참가자에게 임의 기준으로 저온살균된 AT III 농축액을 2개의 다른 뱃치로 공급하고, 2개의 상이한 투여량, 즉 8명에게는 체중 1kg당 1000단위의 고정 투여량을 투여하는 반면, 다른 5명 각각에게는 체중 1kg당 50단위를 투여했다. 평균, 후자 그룹에 투여된 AT III의 양은 사람 1인당 약 3600단위였다. 처음 6개월 동안은 2주 간격으로 모든 피검체에게서 트랜스아미나아제에 대해 조사한 후, 이어서 4주 간격으로 행했다. 2번의 연속 조사에서 혈청 트랜스아미나제의 농도가 정상 역치의 최고 값의 2.5배를 초과하고 다른 모든 간염 바이러스가 배제된다면, 비-A형 비-B형 간염 바이러스의 전이가 확인된 것으로 간주하였다. 이후에, 각 피검체의 혈청 시료를 항-HCV 및 항-HIV-2 항체에 대해 조사했다. B형 간염 바이러스 혈청 마커(HBsAg, 항-HBc, 항-HBs)와 항-HIV-1을 2개월 간격으로 실험했다.

12개월 동안 관찰한 후, 13명의 피검체 모두에게서 혈청 트랜스아미나제 활성의 증가가 관찰되지 않았으며, 아무도 항-HIV 또는 항-HCV에 양성 반응을 나타내지 않았다. 더욱이, B형 간염 백신을 접종하지 않은 6명의 피검체는 아무도 양성 HIV 마커를 발현시키지 않았다.

트롬보시스 및 헤모스타시스 국제 위원회(ICTH)의 권장사항에 따라 행해진 이러한 임상 연구와 본 발명에 따르는 방법으로 수득한 AT III 농축액으로 처리한 피검체의 소급적 분석을 기초로, 본 발명에 따르는 방법으로 제조한 AT III 제제는 HBV, HCV 또는 HIV 오염으로 영향을 받지 않는다는 결론을 얻을 수 있었다.

조사된 AT III 제제를 사용하여 얻은 실험 데이타로부터, 바이러스가 제조 공정의 다양한 단계에서 효과적으로 제거되고 불활성화되기 때문에, 형성된 저온살균 AT III 제제가 거의 균일한 상태로 정제되어, 이러한 생성물은 높은 안전성 여유(margin)를 갖는다는 것을 알 수 있다. 침전 반응 및 저온살균을 조합함으로써, 이렇게 하여 수득한 혈장 단백질 제제가 극도로 높은 안전성 표준을 보장받게 될 경우, 바이러스 감소가 이루어진다.

동시에, 본 발명에 따르는 방법은 침전 반응에 의해 정제된 단백질 용액으로부터 암모늄 염을 제거하여 암모늄 염의 잔여량이 0.5mol/L 미만으로 되도록 하기 때문에 특히 온화하다는 것이 강조되며, 혈장 단백질의 특히 높은 잔여 활성이 후속의 저온살균에서도 유지된다는 것이 보장된다.

표 2에 언급된 혈장 단백질의 경우, 본 발명에 따르는 방법은 본 명세서에서 언급한 잔여 활성이 높아지도록 한다.

활성 화합물	% 암모늄 설페이트 포화도로 표현된 침전 범위	%(중량/용적) 암모늄 설페이트로 표현된 침전 범위	% 암모늄 설페이트 포화도로 표현된 적정 침전 농도	%(중량/용적) 암모늄 설페이트로 표현된 적정 침전 농도	잔여 활성 (침전 후)
항트롬빈 III	24.1-38.9%	13-21%	31.5%	17%	>90%
CI 불활성화제	29.6-38.9%	16-21%	35.2%	19%	>90%
트롬빈 또는 프로트롬빈	29.6-38.9%	16-21%	35.2%	19%	70-80%
인자 V, 인자 VII, 인자 X	29.6-38.9%	16-21%	35.2%	19%	70-80%
인자 IX	29.6-44.4%	16-24%	40.7%	22%	70-80%
API	20.4-35.2%	11-19%	24.1%	13%	70-80%

표 2에 따라, 항트롬빈 III의 침전 조건을 활성 화합물 C1 불활성화제, 트롬빈 및 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII 및 인자 X에도 또한 적용한다. 인자 IX의 경우, 적정 침전 농도는 22%(중량/용적) 암모늄 설페이트 또는 40.7% 암모늄 설페이트 포화도이다.

α₁-항트립신에 대한 적정 침전 농도는 13%(중량/용적) 암모늄 설페이트 또 는 24.1% 암모늄 설페이트 포화도이다.

치료학적으로 적용할 수 있는 혈장 단백질 제제를 제조하기 위해, 본 발명에 따르는 방법에서 수득한 단백질 침전물을 단백질 침전물이 강화된 혈장 단편의 형태로 무수 물질로서 주입 바이알로 도입한다. 사용하는 부형제는 아미노아세트산, 염화나트륨 및 시트르산나트륨이다. 발열원(pyrogen)이 없는 주입용 물을 10ml 함유하는 앰플을 주입 바이알에 첨가한다.

혈장 단백질 용액을 암모늄 염 농도가 13 내지 22중량%(=25 내지 39% 암모늄 설페이트 포화도)인 알칼리성 pH하에 실온에서 항온처리하고, 침전물을 분리하고 암모늄 염을 제거하여 암모늄 염의 잔여량이 0.5mol/L 미만으로 되도록 한 후에, 약 60℃에서 수 시간 동안 저온살균한 다음, 가공하여 치료학적으로 적용 가능한 혈장 단백질 제제를 수득함으로써 혈장 제제에 의한 바이러스의 감염성 전이를 완전히 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 혈장 단백질, 특히 혈액 응고 인자의 생물학적 활성에 역효과를 주지 않을 정도로 공정을 온화하게 할 수 있으며, 이러한 방법은 혈장 단백질 용액으로부터의 외피를 갖는 바이러스 및/또는 외피를 갖지않는 바이러스 모두의 불활성화에 유효하다.

Claims

혈장 단백질 용액을 13 내지 22중량%의 암모늄 설페이트 농도하에 실온에서 항온처리하고, 침전물을 분리하고 투석에 의해 암모늄 설페이트를 제거하여 암모늄 설페이트의 잔여량이 0.5mol/L 미만으로 되도록 한 후에 60℃ ±1℃에서 10 시간 동안 저온살균(pasteurizing)한 다음, 가공하여 치료학적으로 적용 가능한 혈장 단백질 제제를 수득함을 포함하여, 암모늄 설페이트를 알칼리성 pH에서 첨가하여 혈장 단백질 용액으로부터 외피(envelope) 갖는 바이러스, 외피를 갖지않는 바이러스, 또는 외피를 갖는 바이러스 및 외피를 갖지 않는 바이러스 둘 다를 불활성화하는 방법.
제1항에 있어서, 13 내지 22중량%의 암모늄 설페이트 농도에서 항온처리한 후, 암모늄 설페이트 농도를 24 내지 27중량%로 증가시키고, 혼합물을 다시 항온처리하며, 이러한 방법으로 생성된 바이러스 부재 침전물을, 투석에 의해 암모늄 설페이트를 제거함으로써 암모늄 설페이트의 잔여량이 0.5mol/L 미만으로 되도록 한 후에 60℃±1℃에서 10 시간 동안 저온살균한 다음, 가공하여 치료학적으로 적용 가능한 혈장 단백질 제제를 수득하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사용되는 혈장 단백질 용액이, 친화성 크로마토그래피에 의해 예비 정제되어 추가로 바이러스가 제거된 혈장 단백질 용액인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, pH 8 내지 11에서 수행하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 항온처리와 제2 항온처리를 각각 2 내지 4시간 동안 수행하는 방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 저온살균을 안정화제로서 수크로스 및 글리신의 존재하에 또는 수크로스 및 아세트산칼륨의 존재하에 수행하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 천연 혈장 단백질 또는 생물공학적으로 생산한 혈장 단백질을 사용하여 수행하는 방법.
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