JPH04258288A

JPH04258288A - ウミホタル・ルシフェラーゼの製造法

Info

Publication number: JPH04258288A
Application number: JP2004991A
Authority: JP
Inventors: Hajime Kono; 源河野; Shunji Kojima; 俊二小島
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1991-02-13
Filing date: 1991-02-13
Publication date: 1992-09-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は海洋生物ウミホタル（Ｃ
ｙｐｒｉｄｉｎａ　　ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）から、
高純度のルシフェラーゼを高収率で製造する方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、ＤＮＡプローブ法が遺伝子レベル
での病因解明の為、特異性の高い、新しい診断法として
注目を集めているが、検出法に放射性同位元素が使用さ
れている為、作業者、施設、放射性廃棄物等の制約があ
り、広く普及するには至っていない。従って、ＤＮＡプ
ローブ法の普及には放射性同位元素を使わない方法の開
発が必要であるが、比色法や蛍光法等の検出系は感度が
低く、実用的でなく、これらに変わる新しい検出系の開
発が望まれている。

【０００３】現在、生物発光法が、放射性同位元素を用
いる場合に匹敵する検出感度を持つことに着目した研究
が行われており、これまで、生物発光としてはホタルや
発光バクテリアのルシフェラーゼが利用されているが、
酵素自体が不安定なため、期待される程の感度は得られ
ていない。しかし、ウミホタル・ルシフェラーゼは安定
性が良く、発光強度も強く、生物発光を用いる高感度検
出系として、ＤＮＡプローブ法又は酵素免疫測定法等へ
の応用が期待されている。

【０００４】ウミホタルは、日本沿岸に生息する２〜３
ｍｍの海産甲殻類で、昼間は海底の砂の中に住み、夜間
に死魚等の餌を求めて遊泳し、刺激を受けると海水中に
ルシフェリンとルシフェラーゼを放出する。海水中でル
シフェリンは酵素ルシフェラーゼと海水中の溶存酸素に
よって酸化され、発光する［後藤等：ファルマシア、３
，１２５（１９６７）］。この反応はホタルや発光バク
テリアのように、発光にＡＴＰなどの他の成分を必要と
しない非常に簡単な発光系である［Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ　　ｉｎ　　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１１５ｐ
．（１９６６）Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　　Ｕｎｉｖ．　　
Ｐｒｅｓｓ］。

【０００５】ウミホタルからルシフェラーゼを分離する
方法としては、ウミホタルを凍結乾燥し、微粉砕して、
緩衝液にて抽出した後、溶媒沈殿及び硫安沈殿を行い、
透析後、弱イオン交換クロマトグラフィー及び電気泳動
で精製する方法［Ｆ．Ｉ．Ｔｓｕｊｉ等、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５７，３６４〜３７２（１９
７８）］が行われてきた。しかし、これら従来の方法で
は、ウミホタルを粉砕又は擂り潰すしたりするので、ウ
ミホタル由来の種々のタンパク質が混入してくるため、
精製度を上げる為には、収率を犠牲にして、純度の高い
分画だけを集める必要がある。又、操作も繁雑であり、
大量に、高純度のルシフェラーゼを工業的に製造する事
は困難である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウミホタル
から、高純度のルシフェラーゼを高収率で製造する方法
を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等はウミホタル
からのルシフェラーゼの製造方法について、鋭意研究し
た結果、ウミホタルを粉砕又は擂り潰したりする事なく
、単にウミホタルを塩溶液中に放置するだけで、容易に
浸透圧によりルシフェラーゼがウミホタルから抽出され
てくる事を発見し、本発明を完成させた。すなわち本発
明は、ウミホタルを、塩を含有する蒸留水又は緩衝液中
に浸積し、ルシフェラーゼを抽出させることを特徴とす
るウミホタル・ルシフェラーゼの製造法である。さらに
本発明は、ウミホタルから得られた抽出液をクロマトグ
ラフィーで精製することを特徴とするウミホタル・ルシ
フェラーゼの製造法である。

【０００８】本発明のウミホタル・ルシフェラーゼを得
るための原料としては、海岸で採取された新鮮な状態、
又は凍結保存されたウミホタルを使用するが、実用的に
は凍結保存された原料が用いられる。採取したウミホタ
ルを、０．５〜５．０Ｍ、好ましくは０．５〜２．０Ｍ
の塩を含有する蒸留水又は緩衝液に、０〜３０℃、好ま
しくは０〜１０℃で、１〜４８時間、好ましくは１０〜
２４時間浸積させる。塩としては、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、硫酸アンモニウム等が用いられるが、好ま
しくは塩化ナトリウムが用いられる。緩衝液としては特
に限定されないが、通常のトリス緩衝液、リン酸緩衝液
等が用いられる。緩衝液は好ましくはｐＨ５〜１０、さ
らに好ましくはｐＨ７〜８にして用いる。

【０００９】残渣を除去して得られた抽出液に、ルシフ
ェラーゼが沈殿しない濃度の硫安、望ましくは３０〜４
０％飽和濃度の硫安を添加し、高分子の不純物および不
溶性残渣等を遠心分離などで沈殿除去する。次いで、得
られた清澄液をクロマトグラフィーで精製する。本発明
で好ましく用いられるクロマトグラフィーは、疎水クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およ
びアフイニティークロマトグラフィーの１種以上である
。

【００１０】本発明の疎水クロマトグラフィーは、セル
ロース、アガロース、デキストラン等の多糖類あるいは
、ポリビニルなどの合成ポリマーにリガンドとして、フ
ェニル基あるいはブチル基などの疎水性基を導入した担
体が使用される。ルシフェラーゼの吸着は疎水結合が生
じやすい条件たとえば硫酸アンモニウムを１〜３Ｍ添加
して、イオン強度を高くして行なう。疎水性担体からの
溶出は、好ましくは塩濃度を段階的にあるいは勾配を持
たせて下げていく方法が用いられる。上記の操作はいず
れもｐＨ７〜８で行なうことが好ましい。

【００１１】本発明のイオン交換クロマトグラフィーは
、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類あ
るいは、ポリビニルなどの合成ポリマーに各種官能基を
導入したイオン交換体が使用されるが、ルシフェラーゼ
の等電点がｐＨ４〜５にあること、およびｐＨ６以下で
不安定であることなどから、好ましくはこれらイオン交
換体のうち、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン
交換体等の弱塩基性陰イオン交換体が使用される。ルシ
フェラーゼの吸着は、透析あるいはゲルろ過などで脱塩
し、イオン強度を下げ望ましくはｐＨ７〜８で行なう。イオン交換体からの溶出は、イオン強度を段階的にある
いは勾配をもたせて増加させ、望ましくはｐＨ７〜８で
行なう。

【００１２】本発明のアフィニティクロマトグラフィー
は、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類
あるいは、ポリビニルなどの合成ポリマーに官能基を介
して、リガンドを結合させた担体が使用される。これら
のうち好ましくはヘパリンアフィニティー担体あるいは
金属キレートアフィニティー担体が使用される。金属キ
レートアフィニティー担体に結合させる金属としては、
好ましくは銅イオンが用いられる。ヘパリンアフィニテ
ィー担体の吸着条件としては、透析あるいはゲルろ過な
どで脱塩し、イオン強度を下げて行ない、一方、溶出は
イオン強度を段階的あるいは勾配を持たせて上げていく
方法で行なうことが好ましい。上記の操作はいずれも、
ｐＨ７〜８で行なうことが好ましい。銅キレートアフィ
ニティー担体への吸着条件としては、ｐＨ７〜８で透析
あるいはゲルろ過などで脱塩し、イオン強度を下げて行
ない、一方、溶出はイオン強度を段階的あるいは勾配を
持たせて上げていく方法が望ましい。

【００１３】クロマトマトグラフィーは、一種でも良い
が、二種以上組合せて使用するのが好ましい。以下に好
ましい例を挙げるがこれに限定されない。ウミホタルか
ら得られた抽出液は、不溶性物質を除去した後、１〜３
Ｍ硫安を含むｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜８の緩
衝液で平衡化した疎水性担体を用いてクロマトグラフィ
ーを行う。次に、ルシフェラーゼ活性を含む画分を集め
、透析またはゲル濾過クロマトグラフィーで脱塩後、ｐ
Ｈ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液で平衡化し
たイオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニテイー
クロマトグラフィーの中から、１種又は複数のクロマト
グラフィーを組み合わせて精製を行う。

【００１４】ルシフェラーゼ活性の測定は、合成ウミホ
タル・ルシフェリンを基質にして、ルシフェラーゼによ
る発光をルミノメーターで測定することにより行われる
。ルミノメーターで測定された発光量をｃｐｓで表示し
、ルシフェラーゼ活性とする。該製造方法で得られるウ
ミホタルルシフェラーゼは還元下ＳＤＳ電気泳動で、単
一バンドであり、比活性２．４ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ
・ｐｒｏｔｅｉｎと非常に高純度の製品である。又、還
元下ＳＤＳ電気泳動での分子量は約６８，０００を示す
。

【００１５】

【実施例】以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。実施例１凍結保存されたウミホタル３００ｇに１ＭＮａＣｌを含
有した２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）を３，
０００ｍｌ加えて、４℃にて抽出を行った。一夜放置で
ウミホタルから約９５％のルシフェラーゼが抽出された
。上記抽出により、ウミホタル３００ｇから約８ｘ１０
１４ｃｐｓ（約３３ｍｇ）のルシフェラーゼが得られた
。抽出液の比活性は約３ｘ１０１１ｃｐｓ／ｍｇであり
、不純タンパク質の溶出を低減することができた。

【００１６】実施例２実施例１で得られた抽出液に３０％飽和硫安を添加し、
生じた沈殿を遠心分離で除去した後、上清液３，１００
ｍｌを、１Ｍ硫安を含有した２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．１）で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｍ
カラム（担体１，０００ｍｌ、東ソー社製）に吸着させ
た。このカラムを１Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．１）で洗浄し、１Ｍから０Ｍへの硫安の
直線濃度勾配でルシフェラーゼを溶出させた。得られた
活性画分１，８００ｍｌを、１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．１）を展開液として、セファデックス
Ｇ２５（担体　　５，０００ｍｌ、ファルマシア社製）
で脱塩及び緩衝液置換を行った後、０．５Ｍとなるよう
にＮａＣｌを添加した。

【００１７】これを０．５ＭＮａＣｌ含有の１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で平衡化した銅キ
レートセファロースカラム（担体　　５００ｍｌ、ファ
ルマシア社製）に吸着させた。次に、０．５ＭＮａＣｌ
含有の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）
でカラムを洗浄し、０Ｍから１．０ＭへのＮＨ４　Ｃｌ
の直線濃度勾配でルシフェラーゼを溶出させた。ルシフ
ェラーゼ活性の全工程回収率は約４０％であった。還元
下ＳＤＳ電気泳動で単一バンドであり、比活性は２．４
ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ・ｐｒｏｔｅｉｎであった。

【００１８】実施例３実施例２と同様にして得られたブチルトヨパール６５０
Ｍカラムの溶出液１，８００ｍｌを、２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．１）を展開液として、セファデック
スＧ２５で脱塩した後、これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．１）で平衡化したヘパリンセルロファイン
（担体　　５００ｍｌ、生化学工業社製）に吸着させた
。

【００１９】カラムを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．１）で洗浄後、０Ｍから１ＭへのＮａＣｌ（２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．１）の直線濃度勾配でル
シフェラーゼを溶出したルシフェラーゼの全工程回収率
は約４２％であった。還元下ＳＤＳ電気泳動で単一のバ
ンドであり、比活性は２．４ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ・
ｐｒｏｔｅｉｎであった。

【００２０】実施例４実施例２で得られた精製ルシフェラーゼを濃縮するため
に、銅キレートカラムの溶出画分１，０５０ｍｌをセフ
ァデックス・Ｇー２５を用いてゲル濾過を行い脱塩した
。脱塩した液を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥセルロファインＡー８００（担体　　５０ｍｌ
、生化学工業社製）に吸着させ、平衡化と同じ緩衝液で
洗浄後、０Ｍから０．５ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配
により溶出させた。ルシフェラーゼ活性はほぼ１００％
の回収率で約１０倍に濃縮できた。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、従来工業的製造が困難
であったウミホタル・ルシフェラーゼを、簡便な方法で
、高純度にかつ高収率で製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ウミホタルを、塩を含有する蒸留水又
は緩衝液中に浸積し、ルシフェラーゼを抽出させること
を特徴とするウミホタル・ルシフェラーゼの製造法。
【請求項２】　　ウミホタルからの抽出液をクロマトグ
ラフィーで精製することを特徴とする請求項１記載のウ
ミホタル・ルシフェラーゼの製造法。
【請求項３】　　クロマトグラフィーが、疎水クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフ
イニティークロマトグラフィーの１種以上である請求項
２記載のウミホタル・ルシフェラーゼの製造法。
【請求項４】　　ａ．ウミホタルからの抽出液に硫安を
加え、不溶性物質を遠心分離で除去する工程、ｂ．得ら
れた清澄液を疎水クロマトグラフィーで精製する工程、
およびｃ．イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィ
ニティークロマトグラフイーの１種以上により精製する
工程からなる請求項１記載のウミホタル・ルシフェラー
ゼの製造法。