JP3508149B2 - ヒト血清アルブミンおよびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子操作により得ら
れる、新規な性状を有するヒト血清アルブミンおよびそ
のヒト血清アルブミンを得るための一手法であるヒト血
清アルブミンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また、種々の血清
分子のキャリアーとしての機能を持っている。

【０００３】ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与
される。例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に
戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善
させる。低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者
にもＨＳＡによる治療を必要とすることがある。

【０００４】したがって、ＨＳＡを投与する基本的な治
療上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こ
す低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失
がある様な状態を治療する点に存する。

【０００５】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。したがって、Ｈ
ＳＡの代替の原料を開発することが有益となろう。

【０００６】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、微生物による多種のポリペプチドの生産が可能とな
った。ＨＳＡにおいても、遺伝子操作の技術によって大
量生産され、それを高度精製する技術が確立されつつあ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら遺伝子操
作においては、産生宿主の培養時、ＨＳＡの精製時など
に、培地中の或種の成分、微生物の分泌・産生物などが
遊離状態または他の成分との結合状態で、ＨＳＡ含有画
分中に夾雑物質として存在することになる。これらの夾
雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡには夾雑してこなかっ
た成分であり、かかる成分の除去は遺伝子操作により得
られるＨＳＡに独特の課題であり、この課題を解決する
ための新たな精製手段が要求される。

【０００８】したがって、本発明が解決すべき課題は、
遺伝子操作により得られ、かつ産生宿主関連あるいはそ
の他の夾雑物質を除去したＨＳＡを提供することにあ
る。本発明が解決すべき他の課題は、上記ＨＳＡの製造
方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情下に鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得られ
るＨＳＡを回収するに際して、当該ＨＳＡの精製工程に
おいて、ヒト血清アルブミンをホウ酸またはその塩にて
処理することによって、さらに特定の分画分子量の限外
濾過膜を用いて処理することによって、夾雑物質が充分
に除去された高純度のＨＳＡを提供できることを見出
し、本発明を完成した。なお、本発明にかかる製造方法
によって得られる高純度のＨＳＡは新規物質である。ま
た、フェノール硫酸法で検出可能な非抗原性の遊離の夾
雑物質が充分に除去されることは、これら夾雑物質に起
因する各種副作用を回避し、安全なＨＳＡ製剤を提供す
ることに意義を有するものである。

【００１０】すなわち、本発明にかかるヒト血清アルブ
ミンは、遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン
であって、ヒト血清アルブミン２５０mg当たり、 宿主由来の抗原性を有する夾雑物質が０．１ng未満
であり、 フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離
の夾雑物質が１μｇ以下であり、かつ パイロジェンが０．１ＥＵ未満であることを特徴と
する。

【００１１】また、本発明にかかるヒト血清アルブミン
の製造方法は、遺伝子操作により得られるヒト血清アル
ブミンをホウ酸またはその塩にて処理することにより夾
雑物質を除去する工程を含むことを特徴とする。

【００１２】特に、夾雑物質を除去する工程を経た後、
分画分子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理する工程
を含むことを特徴とする。

【００１３】（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ 本発明において用いられる遺伝子操作により得られるＨ
ＳＡは、遺伝子操作によって得られるものであれば、そ
の由来に特に制限はない。したがって、当該ＨＳＡを産
生させるためのＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調
製されたものであれば特に限定されず、公知文献記載の
ものの他、今後開発されるものであっても適宜利用する
ことができる。当該宿主としては、具体的には遺伝子操
作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵
母、枯草菌など）、動物細胞などが挙げられる。特に、
本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマ
イセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Sa
ccharomyces cerevisiae)〕、もしくはピキア属〔例え
ば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris ）〕を使用
して得られたＨＳＡが好ましい。また、栄養要求性株や
抗生物質感受性株を使用して得られたＨＳＡであっても
よい。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ
２２株（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリ
スＧＴＳ１１５株 (his 4)などを使用して得られたＨＳ
Ａが好適に用いられる。

【００１４】本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方
法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物から
のＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準
じた手法を採用することによって実施される。例えば、
ＨＳＡ産生宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法とし
ては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる
方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５
号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なヒト血
清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９
８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグ
ナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公
報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開
平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色
体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿
主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公
報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、
変異型ＡＯＸ₂ プロモーターを用いる方法（特願平３−
６３５９８号、同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌
によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公
報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８
７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の
各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−
１０４２９０号公報）などが例示される。

【００１５】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は、具体的には以下のようにして行われ
る。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵
母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−
１５８５１）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ
₁ プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニット
を有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開
平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体は
メタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質
転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさ
せ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノー
ル濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示され
る。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養
条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例
示される。

【００１６】また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわ
ち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号公報）、培地中に脂肪
酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−
８１７１９号公報）などが例示される。

【００１７】さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上
記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロ
テアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、
陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群よ
り選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分と
を分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１
９８号公報）などが例示される。

【００１８】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが好適に使用され、培養条
件は一般的な常法に準じて実施される。培地は合成培
地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。
例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖
類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、
微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの
他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、
Ｃｏ、Ｃｕなどが使用される。ＹＮＢ液体培地〔０．７
％イーストナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２
％グルコース〕などが挙げられる。また、天然培地とし
ては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト
（Difco 社製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、
２％グルコース〕が例示される。培地のｐＨは中性また
は弱塩基性、弱酸性でよい。また、メタノール資化性宿
主の場合は、メタノール含有培地を用いることができ
る。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度であ
る。

【００１９】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。

【００２０】なお、当該培養に先立って前培養を行うこ
とが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液
体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条
件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０〜１０
０時間、温度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が
好ましい。培養終了後、ＨＳＡは培養濾液、菌体、細胞
などからそれぞれ公知の分離手段により採取される。

【００２１】（２）ＨＳＡの精製 ＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマト
グラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾
過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用
される。

【００２２】当該精製工程としては、例えば以下の〜
を含む工程が好適に挙げられる。 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、および１０００〜５万の限外濾過
膜を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃
度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する。そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。

【００２３】また、前記工程の代わりに、ｐＨ６〜
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程の代わり
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件
下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩
濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには
前記工程との間、との間、またはの後に、ｐ
Ｈ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、
沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよ
い。

【００２４】（３）ＨＳＡの脱色 ＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、特に好ま
しくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有す
るキレート樹脂とＨＳＡとを接触させることにより行わ
れる。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体で
あることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼ
ンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体な
どが挙げられる。

【００２５】一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミ
ン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレ
ンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基
（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキ
レンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙
げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート
樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンと
ジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガ
ンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、DIAI
ON CR20 （リガンド部；−ＮＨ(CH ₂ CH ₂ NH)_n Ｈ、三
菱化成製）、LEWATIT TP214 （リガンド部；−ＮＨＣＳ
ＮＨ₂ 、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００など
が好適に使用される。

【００２６】当該キレート樹脂による処理条件は、好適
には次の通りである。 ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐ
Ｈ４〜７) 時間：１時間以上、好ましくは６時間以上 イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍ
ｍｈｏ 混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００
ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）

【００２７】（４）ホウ酸またはその塩による処理 上記工程（〜およびキレート樹脂処理を含む）を経
て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で検出
可能な非抗原性の夾雑物質が充分に除去されていない。

【００２８】そこで、これらの処理終了後に得られるＨ
ＳＡを、ホウ酸またはその塩で処理することによって、
宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫酸法
により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質、およびパ
イロジェン（発熱性物質）を除去することができる。

【００２９】使用されるホウ酸としては、例えばオルト
ホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。また
その塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリ
ウム塩など）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩な
ど）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウ
ムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で
０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程
度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９
〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１０時間
程度が例示される。処理時の電導度は低電導度であるこ
とが好ましい。具体的には１ｍＳ以下が例示される。さ
らに、ＨＳＡ濃度は低濃度であることが好ましく、具体
的には５％以下、好ましくは０．１〜３％程度が例示さ
れる。

【００３０】ここにフェノール硫酸法とは、一般的には
糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液に
フェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振
盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成さ
れるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を
比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検
出可能な非抗原性の夾雑物質としては、例えば中性糖
（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オ
リゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などが
例示され、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体
反応を起こさない夾雑物質を言う。

【００３１】ホウ酸またはその塩による処理終了後、例
えば遠心分離、濾過などにより沈殿を除去し、上清を回
収して濃縮脱塩する。

【００３２】（５）限外濾過処理 本発明にかかるヒト血清アルブミンの製造方法において
は、回収されたＨＳＡを限外濾過処理することが望まし
く、分画分子量約１０万の限外濾過膜が好適に使用され
る。

【００３３】 （６）精製された遺伝子操作由来のＨＳＡの性状 本発明にかかるＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点
４．６〜５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは、単量
体のみからなり、二量体、重合体または分解物を実質的
に含まない。具体的には、二量体、重合体および分解物
の全含有量は０．０１％以下程度である。また、産生宿
主に由来する夾雑成分（例えば、蛋白質、多糖成分な
ど）を実質的に含まない。より詳細には（正確には）産
生宿主由来の夾雑成分のうち、抗原性を有するものを実
質的に含まない。具体的には、本発明のＨＳＡとして
は、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、夾雑成分が１ｎｇ／ｍ
ｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下のものが例示
される。また、本発明にかかるＨＳＡとしては、多糖成
分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以
下のものが例示される。結果的にＨＳＡの純度としては
９９．９９９９９９％以上、好ましくは９９．９９９９
９９９％以上のものが例示される。当該ＨＳＡの着色度
としてはＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ₃₅₀ ／Ａ₂₈₀ が
０．０１〜０．０５、Ａ₄₅₀ ／Ａ₂₈₀ が０．００１〜
０．０２、Ａ₅₀₀ ／Ａ₂₈₀ が０．００１〜０．００５程
度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪酸量
がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．１分
子以下のものが例示される。

【００３４】特に本発明にかかるＨＳＡは、ヒト血清ア
ルブミン２５０mg当たり、 宿主由来の抗原性を有する夾雑物質が０．１ng未満
であり、 フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離
の夾雑物質が１μｇ以下であり、かつ パイロジェンが０．１ＥＵ未満であることを特徴と
する。

【００３５】

【発明の効果】本発明にかかるＨＳＡは、上記夾雑物質
などに由来する各種副作用を回避することができる。し
たがって、安全なＨＳＡ製剤を提供することができる。
また、本発明にかかるヒト血清アルブミンの製造方法に
よれば、遺伝子操作により得られるＨＳＡにおいて、培
地中の或種の夾雑物質、微生物（産生宿主）が含有また
は分泌する物質などのＨＳＡ含有画分中に存在する夾雑
物質、特に宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノ
ール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物
質、およびパイロジェン（発熱性物質）を充分に除去す
ることができる。したがって、本発明方法により得られ
るＨＳＡは極めて高純度であり、特に本発明にかかるＨ
ＳＡを得ることができるという効果を奏する。

【００３６】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。

【００３７】参考例１ (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に記載の方法により、ピ
キアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１５（ｈｉ
ｓ４）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に、ＡＯＸ₁ プロモーター
支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプラスミ
ドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換して、Ｐ
Ｃ４１３０が得られる。この株はＡＯＸ ₁ 遺伝子が存在
しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能
が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

【００３８】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０⁷ cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ（メタノール）−Ｙ
ＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイト
ロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタ
ノール、１．５％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養
してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継
代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プ
レートから２０個のコロニーが生じた。このプレートで
はＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育
できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じる
ということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に
変換した株が得られたことを示している。生じたコロニ
ーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−
ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げ、シングルコロニ
ーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。

【００３９】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。

【００４０】

【表１】

【００４１】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。

【００４２】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧を０．５kg／c
m² 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。

【００４３】

【表２】

【００４４】

【表３】

【００４５】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型、天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号公報）。参
考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡ
を産生させた。

【００４６】参考例３ [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１ないしは参考例２で得られた培養液約８００Ｌ
を圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を
分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、
分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌ
に濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間
の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナト
リウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニ
ジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速
に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度
分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜
分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過
膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換
した。

【００４７】[ii] 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。

【００４８】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。

【００４９】[iv] 陰イオン交換体処理 疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったア
ルブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平
衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添
加した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着することなく、カラムを通過した。

【００５０】[v] 脱色処理 ２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ ＣＲＢ
０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキ
レート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イ
オン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌し
た。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして
回収した。

【００５１】実施例１ 参考例１（または参考例２）および参考例３を経て調製
された酵母由来ＨＳＡ含有水溶液をＨＳＡ濃度２．５％
に調製し、溶液の電導度を１ｍＳ以下とした。四ホウ酸
カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、
ｐＨを９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈
殿を除去し、上清を回収して濃縮脱塩した。

【００５２】実施例２ 実施例１により回収されたＨＳＡ含有水溶液を、分画分
子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理した。

【００５３】実施例３ 実施例１において、四ホウ酸カルシウムを終濃度が１０
０ｍＭになるように添加する代わりに、四ホウ酸ナトリ
ウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加した後、さ
らに塩化カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように
添加する以外は、実施例１と同様にして処理した。

【００５４】実験例 参考例２および参考例３を経て調製された酵母由来ＨＳ
Ａ含有水溶液（検体１）をＨＳＡ濃度２５ｗ／ｖ％に調
製し、溶液の電導度を１ｍＳ以下とする。四ホウ酸カル
シウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ｐＨ
を９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈殿を
除去し、上清を回収して濃縮脱塩した（検体２）。さら
に分画分子量１０万の限外濾過膜を用いてＨＳＡ含有水
溶液を処理した（検体３）。各検体１〜３について下記
の項目の測定を行い、その結果を表４に記載した。

【００５５】 ＨＳＡの回収率 ２８０ｎｍの吸光度測定またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳
動によりＨＳＡ量を測定し、回収率を算定した。

【００５６】 ＥＩＡ法による夾雑物質量の測定 ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を実施例２と同様の方法で
粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用
いて各検体１〜３の精製ＨＳＡ溶液中に存在する酵母由
来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ）で行った。検体はＨＳＡ濃度として２５ｗ／ｖ％
（２５０mg／ml）に調整したものを用いて測定した。

【００５７】検体１では１０ng／mlであり、検体２およ
び３では０．１ng／mlの検出限界において酵母由来成分
は検出されなかった。

【００５８】 フェノール硫酸法による遊離の夾雑物質量の測定 各検体のＨＳＡ中の遊離の夾雑物質量を、公知の手法に
従ってフェノール硫酸法で測定した。まず、各ＨＳＡを
直接フェノール硫酸法で測定して、夾雑物質の総量（す
なわち、遊離状態のものおよび非遊離状態のものの合計
量）を算出した。一方、同じく各ＨＳＡをＣｏｎＡ−セ
ファロース（ファルマシア社製）で処理して、パス画分
であるＨＳＡをフェノール硫酸法で測定し、夾雑物質量
（非遊離状態のもの）を算出した。両者の測定量の差
が、遊離状態の夾雑物質量を意味する。標準曲線はマン
ナンを標準品として用いて作成した。以上の結果を表４
に示す。

【００５９】 パイロジェンの測定 生化学工業のエンドスペシーを用いて測定した。

【００６０】

【表４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 野田 宗宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 藤原 永年 大阪市都島区都島中通３丁目５番44号 株式会社ミドリ十字都島工場内 (72)発明者 大村 孝男 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−31687（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，1988, Ｖｏｌ．432，ｐ．137−151 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1992, Ｖｏｌ．204，Ｎｏ．１，ｐ．103−106 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/02 ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子操作により得られるヒト血清アル
   ブミンをホウ酸またはその塩にて処理することによりヒ
   ト血清アルブミンを上清として回収し、夾雑物質を沈殿
   として除去する工程を含むことを特徴とするヒト血清ア
   ルブミンの製造方法。
2. 【請求項２】 ホウ酸またはその塩にて処理する際の、
   ホウ酸またはその塩の添加量が０．０１〜１Ｍであり、
   処理ｐＨが８〜１１である請求項１記載のヒト血清アル
   ブミンの製造方法。
3. 【請求項３】 ホウ酸またはその塩にて処理する工程を
   経た後、分画分子量約１０万の限外濾過膜を用いて処理
   する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の
   ヒト血清アルブミンの製造方法。