JPH04258287A - ウミホタル・ルシフェラーゼの製造方法 - Google Patents
ウミホタル・ルシフェラーゼの製造方法Info
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- JPH04258287A JPH04258287A JP2004791A JP2004791A JPH04258287A JP H04258287 A JPH04258287 A JP H04258287A JP 2004791 A JP2004791 A JP 2004791A JP 2004791 A JP2004791 A JP 2004791A JP H04258287 A JPH04258287 A JP H04258287A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は海洋生物ウミホタル（Ｃ
ｙｐｒｉｄｉｎａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）のルシ
フェラーゼを、その遺伝子を組込んだ組換え体の培養液
から製造する方法に関する。
ｙｐｒｉｄｉｎａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）のルシ
フェラーゼを、その遺伝子を組込んだ組換え体の培養液
から製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ＤＮＡプローブ法が遺伝子レベル
での病因解明の為、特異性の高い、新しい診断法として
注目を集めているが、検出法に放射性同位元素が使用さ
れている為、作業者、施設、放射性廃棄物等の制約があ
り、広く普及するには至っていない。従って、ＤＮＡプ
ローブ法の普及には放射性同位元素を使わない方法の開
発が必要であるが、比色法や蛍光法等の検出系は感度が
低く、実用的でなく、これらに変わる新しい検出系の開
発が望まれている。
での病因解明の為、特異性の高い、新しい診断法として
注目を集めているが、検出法に放射性同位元素が使用さ
れている為、作業者、施設、放射性廃棄物等の制約があ
り、広く普及するには至っていない。従って、ＤＮＡプ
ローブ法の普及には放射性同位元素を使わない方法の開
発が必要であるが、比色法や蛍光法等の検出系は感度が
低く、実用的でなく、これらに変わる新しい検出系の開
発が望まれている。
【０００３】現在、生物発光法が、放射性同位元素を用
いる場合に匹敵する検出感度を持つことに着目した研究
が行われており、これまで、生物発光としてはホタルや
発光バクテリアのルシフェラーゼが利用されているが、
酵素自体が不安定なため、期待される程の感度は得られ
ていない。しかし、ウミホタル・ルシフェラーゼは安定
性が良く、発光強度も強く、生物発光を用いる高感度検
出系として、ＤＮＡプローブ法又は酵素免疫測定法等へ
の応用が期待されている。
いる場合に匹敵する検出感度を持つことに着目した研究
が行われており、これまで、生物発光としてはホタルや
発光バクテリアのルシフェラーゼが利用されているが、
酵素自体が不安定なため、期待される程の感度は得られ
ていない。しかし、ウミホタル・ルシフェラーゼは安定
性が良く、発光強度も強く、生物発光を用いる高感度検
出系として、ＤＮＡプローブ法又は酵素免疫測定法等へ
の応用が期待されている。
【０００４】ウミホタルは、日本沿岸に生息する２〜３
ｍｍの海産甲殻類で、昼間は海底の砂の中に住み、夜間
に死魚等の餌を求めて遊泳し、刺激を受けると海水中に
ルシフェリンとルシフェラーゼを放出する。海水中でル
シフェリンは酵素ルシフェラーゼと海水中の溶存酸素に
よって酸化され、発光する［後藤等：ファルマシア、３
，１２５（１９６７）］。この反応はホタルや発光バク
テリアのように、発光にＡＴＰなどの他の成分を必要と
しない非常に簡単な発光系である［Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒｏｇｒ ｅｓｓ，１１
５ｐ．（１９６６）Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖ．
Ｐｒｅｓｓ］。
ｍｍの海産甲殻類で、昼間は海底の砂の中に住み、夜間
に死魚等の餌を求めて遊泳し、刺激を受けると海水中に
ルシフェリンとルシフェラーゼを放出する。海水中でル
シフェリンは酵素ルシフェラーゼと海水中の溶存酸素に
よって酸化され、発光する［後藤等：ファルマシア、３
，１２５（１９６７）］。この反応はホタルや発光バク
テリアのように、発光にＡＴＰなどの他の成分を必要と
しない非常に簡単な発光系である［Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒｏｇｒ ｅｓｓ，１１
５ｐ．（１９６６）Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖ．
Ｐｒｅｓｓ］。
【０００５】ウミホタルからルシフェラーゼを分離する
方法としては、ウミホタルを凍結乾燥し、微粉砕して、
緩衝液にて抽出した後、溶媒沈殿及び硫安沈殿を行い、
透析後、弱イオン交換クロマトグラフィー及び電気泳動
で精製する方法［Ｆ．Ｉ．Ｔｓｕｊｉ等、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５７，３６４〜３７２（１９
７８）］が行われてきた。しかし、天然のウミホタルか
らルシフェラーゼを工業的に製造する為には、ウミホタ
ルを大量に必要とするが、海洋の汚染等によるウミホタ
ルの減少もあり、その原料を確保する事は非常に困難で
ある。
方法としては、ウミホタルを凍結乾燥し、微粉砕して、
緩衝液にて抽出した後、溶媒沈殿及び硫安沈殿を行い、
透析後、弱イオン交換クロマトグラフィー及び電気泳動
で精製する方法［Ｆ．Ｉ．Ｔｓｕｊｉ等、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５７，３６４〜３７２（１９
７８）］が行われてきた。しかし、天然のウミホタルか
らルシフェラーゼを工業的に製造する為には、ウミホタ
ルを大量に必要とするが、海洋の汚染等によるウミホタ
ルの減少もあり、その原料を確保する事は非常に困難で
ある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、高純度ウミ
ホタル・ルシフェラーゼの工業的製造方法を提供するこ
とを目的とする。
ホタル・ルシフェラーゼの工業的製造方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等はウミホタル
・ルシフェラーゼの工業的な製造方法について、鋭意研
究した結果、ウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を組み
込んだ組換え体の培養液中に分泌されたルシフェラーゼ
が、１種又は複数のクロマトグラフィーの組み合わせに
より高純度に精製されることを発見し、本発明を完成さ
せた。すなわち本発明は、ウミホタル・ルシフェラーゼ
遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え体の培養液を、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーおよ
びアフィニティークロマトグラフィーの１種以上のクロ
マトグラフィーにより精製することを特徴とするウミホ
タル・ルシフェラーゼの製造方法である。
・ルシフェラーゼの工業的な製造方法について、鋭意研
究した結果、ウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を組み
込んだ組換え体の培養液中に分泌されたルシフェラーゼ
が、１種又は複数のクロマトグラフィーの組み合わせに
より高純度に精製されることを発見し、本発明を完成さ
せた。すなわち本発明は、ウミホタル・ルシフェラーゼ
遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え体の培養液を、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーおよ
びアフィニティークロマトグラフィーの１種以上のクロ
マトグラフィーにより精製することを特徴とするウミホ
タル・ルシフェラーゼの製造方法である。
【０００８】本発明のウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝
子を組み込んだ遺伝子組換え体は、例えばＷＯ９０／０
１５４２に記載の方法により作製することができる。す
なわち、ウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を各種宿主
細胞中で発現可能なベクターに連結して得られる組換え
ベクターにより、細胞を形質転換することにより作製す
ることができる。宿主としては特に限定されないが、酵
母が好ましく用いられる。次に、該組換え体を培養し、
培養液から例えば遠心分離等により組換え体を除去した
上澄液を本発明のクロマトグラフィーにより精製するこ
とにより、高純度のウミホタル・ルシフェラーゼを製造
することができる。
子を組み込んだ遺伝子組換え体は、例えばＷＯ９０／０
１５４２に記載の方法により作製することができる。す
なわち、ウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を各種宿主
細胞中で発現可能なベクターに連結して得られる組換え
ベクターにより、細胞を形質転換することにより作製す
ることができる。宿主としては特に限定されないが、酵
母が好ましく用いられる。次に、該組換え体を培養し、
培養液から例えば遠心分離等により組換え体を除去した
上澄液を本発明のクロマトグラフィーにより精製するこ
とにより、高純度のウミホタル・ルシフェラーゼを製造
することができる。
【０００９】本発明のイオン交換クロマトグラフィーは
、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類あ
るいは、ポリビニルなどの合成ポリマーに各種官能基を
導入したイオン交換体が使用されるが、ルシフェラーゼ
の等電点がｐＨ４〜５にあること、およびｐＨ６以下で
不安定であることなどから、好ましくはこれらイオン交
換体のうち、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン
交換体等の弱塩基性陰イオン交換体が使用される。ルシ
フェラーゼの吸着は、透析あるいはゲルろ過などで脱塩
し、イオン強度を下げ望ましくはｐＨ７〜８で行なう。 イオン交換体からの溶出は、イオン強度を段階的にある
いは勾配をもたせて増加させ、望ましくはｐＨ７〜８で
行なう。
、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類あ
るいは、ポリビニルなどの合成ポリマーに各種官能基を
導入したイオン交換体が使用されるが、ルシフェラーゼ
の等電点がｐＨ４〜５にあること、およびｐＨ６以下で
不安定であることなどから、好ましくはこれらイオン交
換体のうち、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン
交換体等の弱塩基性陰イオン交換体が使用される。ルシ
フェラーゼの吸着は、透析あるいはゲルろ過などで脱塩
し、イオン強度を下げ望ましくはｐＨ７〜８で行なう。 イオン交換体からの溶出は、イオン強度を段階的にある
いは勾配をもたせて増加させ、望ましくはｐＨ７〜８で
行なう。
【００１０】本発明の疎水クロマトグラフィーは、セル
ロース、アガロース、デキストラン等の多糖類あるいは
、ポリビニルなどの合成ポリマーにリガンドとして、フ
ェニル基あるいはブチル基などの疎水性基を導入した担
体が使用される。ルシフェラーゼの吸着は疎水結合が生
じやすい条件たとえば硫酸アンモニウムを１〜３Ｍ添加
して、イオン強度を高くして行なう。疎水性担体からの
溶出は、好ましくは塩濃度を段階的にあるいは勾配を持
たせて下げていく方法が用いられる。上記の操作はいず
れもｐＨ７〜８で行なうことが好ましい。
ロース、アガロース、デキストラン等の多糖類あるいは
、ポリビニルなどの合成ポリマーにリガンドとして、フ
ェニル基あるいはブチル基などの疎水性基を導入した担
体が使用される。ルシフェラーゼの吸着は疎水結合が生
じやすい条件たとえば硫酸アンモニウムを１〜３Ｍ添加
して、イオン強度を高くして行なう。疎水性担体からの
溶出は、好ましくは塩濃度を段階的にあるいは勾配を持
たせて下げていく方法が用いられる。上記の操作はいず
れもｐＨ７〜８で行なうことが好ましい。
【００１１】本発明のアフィニティクロマトグラフィー
は、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類
あるいは、ポリビニルなどの合成ポリマーに官能基を介
して、リガンドを結合させた担体が使用される。これら
のうち好ましくはヘパリンアフィニティー担体あるいは
金属キレートアフィニティー担体が使用される。金属キ
レートアフィニティー担体に結合させる金属としては、
好ましくは銅イオンが用いられる。ヘパリンアフィニテ
ィー担体の吸着条件としては、透析あるいはゲルろ過な
どで脱塩し、イオン強度を下げて行ない、一方、溶出は
イオン強度を段階的あるいは勾配を持たせて上げていく
方法で行なうことが好ましい。上記の操作はいずれも、
ｐＨ７〜８で行なうことが好ましい。銅キレートアフィ
ニティー担体への吸着条件としては、ｐＨ７〜８で透析
あるいはゲルろ過などで脱塩し、イオン強度を下げて行
ない、一方、溶出はイオン強度を段階的あるいは勾配を
持たせて上げていく方法が望ましい。
は、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類
あるいは、ポリビニルなどの合成ポリマーに官能基を介
して、リガンドを結合させた担体が使用される。これら
のうち好ましくはヘパリンアフィニティー担体あるいは
金属キレートアフィニティー担体が使用される。金属キ
レートアフィニティー担体に結合させる金属としては、
好ましくは銅イオンが用いられる。ヘパリンアフィニテ
ィー担体の吸着条件としては、透析あるいはゲルろ過な
どで脱塩し、イオン強度を下げて行ない、一方、溶出は
イオン強度を段階的あるいは勾配を持たせて上げていく
方法で行なうことが好ましい。上記の操作はいずれも、
ｐＨ７〜８で行なうことが好ましい。銅キレートアフィ
ニティー担体への吸着条件としては、ｐＨ７〜８で透析
あるいはゲルろ過などで脱塩し、イオン強度を下げて行
ない、一方、溶出はイオン強度を段階的あるいは勾配を
持たせて上げていく方法が望ましい。
【００１２】本発明のクロマトグラフィーは、一種でも
良いが、二種以上組合せて使用しても良い。以下に、そ
の組み合わせの中から、好ましい例をを挙げて説明する
が、これに限定されない。ウミホタル・ルシフェラーゼ
遺伝子を組み込んだ組換え体を除去した培養液を、ｐＨ
５〜１０、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液で平衡化した
弱塩基性陰イオン交換担体に吸着させ、緩衝液のイオン
強度を上げて、ルシフェラーゼを溶出させる。溶出活性
画分にルシフェラーゼが沈殿しない程度の硫安、望まし
くは３０〜４０％飽和濃度の硫安を添加し、これを１〜
３Ｍ硫安を含むｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜８の
緩衝液で平衡化した疎水性担体に吸着させ、緩衝液の硫
安濃度を下げて、ルシフェラーゼを溶出させる。次いで
、活性画分を透析またはゲル濾過担体を用いて脱塩し、
金属キレートアフィニティー担体、又はヘパリンアフィ
ニテイー担体を用いてクロマトグラフィーを行うことに
より、高純度の遺伝子組換えウミホタル・ルシフェラー
ゼを得る。
良いが、二種以上組合せて使用しても良い。以下に、そ
の組み合わせの中から、好ましい例をを挙げて説明する
が、これに限定されない。ウミホタル・ルシフェラーゼ
遺伝子を組み込んだ組換え体を除去した培養液を、ｐＨ
５〜１０、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液で平衡化した
弱塩基性陰イオン交換担体に吸着させ、緩衝液のイオン
強度を上げて、ルシフェラーゼを溶出させる。溶出活性
画分にルシフェラーゼが沈殿しない程度の硫安、望まし
くは３０〜４０％飽和濃度の硫安を添加し、これを１〜
３Ｍ硫安を含むｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜８の
緩衝液で平衡化した疎水性担体に吸着させ、緩衝液の硫
安濃度を下げて、ルシフェラーゼを溶出させる。次いで
、活性画分を透析またはゲル濾過担体を用いて脱塩し、
金属キレートアフィニティー担体、又はヘパリンアフィ
ニテイー担体を用いてクロマトグラフィーを行うことに
より、高純度の遺伝子組換えウミホタル・ルシフェラー
ゼを得る。
【００１３】ルシフェラーゼ活性の測定は、合成ウミホ
タル・ルシフェリンを基質にして、ルシフェラーゼによ
る発光をルミノメーターで測定する事により行われる。 ルミノメーターで測定された発光量をｃｐｓで表示し、
ルシフェラーゼ活性とする。該製造方法で得られる遺伝
子組換えウミホタル・ルシフェラーゼは、還元下ＳＤＳ
電気泳動で単一バンドであり、比活性が１ｘ１０１３ｃ
ｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと非常に高純度の製品で
ある。又、還元下ＳＤＳ電気泳動での分子量は約６０，
０００を示す。
タル・ルシフェリンを基質にして、ルシフェラーゼによ
る発光をルミノメーターで測定する事により行われる。 ルミノメーターで測定された発光量をｃｐｓで表示し、
ルシフェラーゼ活性とする。該製造方法で得られる遺伝
子組換えウミホタル・ルシフェラーゼは、還元下ＳＤＳ
電気泳動で単一バンドであり、比活性が１ｘ１０１３ｃ
ｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと非常に高純度の製品で
ある。又、還元下ＳＤＳ電気泳動での分子量は約６０，
０００を示す。
【００１４】
【実施例】以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。 実施例１ ＷＯ９０／０１５４２に記載の方法に従い作製したウミ
ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ酵母組換え
体（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＧＬ１）を３０Ｌ
培養槽で培養を行い、菌体を除去して上澄液２４Ｌを
得た。ルシフェラーゼ活性は全量で２．９ｘ１０１２
ｃｐｓ（比活性：１．５ｘ１０９ ｃｐｓ／ｍｇ・ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）であった。
れらに限定されるものではない。 実施例１ ＷＯ９０／０１５４２に記載の方法に従い作製したウミ
ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ酵母組換え
体（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐＧＬ１）を３０Ｌ
培養槽で培養を行い、菌体を除去して上澄液２４Ｌを
得た。ルシフェラーゼ活性は全量で２．９ｘ１０１２
ｃｐｓ（比活性：１．５ｘ１０９ ｃｐｓ／ｍｇ・ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）であった。
【００１５】この上澄液を、予め２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したＤＥＡＥ・セルロファ
インＡ５００（担体：１，０００ｍｌ、生化学工業社製
）に吸着させた。カラムを平衡化の緩衝液で洗浄し、０
Ｍから０．３ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配でルシフェ
ラーゼを溶出させた。１．６ｘ１０１２ｃｐｓ（比活性
：２．２ｘ１０１０ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
のルシフェラーゼが回収され、活性回収率は５５％
であった。
衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したＤＥＡＥ・セルロファ
インＡ５００（担体：１，０００ｍｌ、生化学工業社製
）に吸着させた。カラムを平衡化の緩衝液で洗浄し、０
Ｍから０．３ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配でルシフェ
ラーゼを溶出させた。１．６ｘ１０１２ｃｐｓ（比活性
：２．２ｘ１０１０ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
のルシフェラーゼが回収され、活性回収率は５５％
であった。
【００１６】活性画分６００ｍｌに、３０％飽和硫安を
添加し、これを１Ｍ硫安含有２０ｍＭトリス 塩酸緩
衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したブチルトヨパール６５
０Ｍ（担体：２００ｍｌ 東ソー社製）に吸着させた
。カラムを平衡化と同じ緩衝液（１Ｍ硫安含有）で洗浄
し、１Ｍから０Ｍへの硫安の直線濃度勾配でルシフェラ
ーゼを溶出させた。１．３ｘ１０１２ｃｐｓ（比活性：
１．７ｘ１０１１ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の
ルシフェラーゼが回収され、活性回収率は８１％（全回
収率：４５％）であった。
添加し、これを１Ｍ硫安含有２０ｍＭトリス 塩酸緩
衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したブチルトヨパール６５
０Ｍ（担体：２００ｍｌ 東ソー社製）に吸着させた
。カラムを平衡化と同じ緩衝液（１Ｍ硫安含有）で洗浄
し、１Ｍから０Ｍへの硫安の直線濃度勾配でルシフェラ
ーゼを溶出させた。１．３ｘ１０１２ｃｐｓ（比活性：
１．７ｘ１０１１ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の
ルシフェラーゼが回収され、活性回収率は８１％（全回
収率：４５％）であった。
【００１７】活性画分１００ｍｌを、２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．１）を展開液として、セファデック
スＧー２５（担体：５，０００ｍｌ、ファルマシア社製
）で脱塩した。これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．１）で平衡化したヘパリンセルロファイン カラ
ム（担体：５０ｍｌ、生化学工業社製）に吸着させた。
酸緩衝液（ｐＨ７．１）を展開液として、セファデック
スＧー２５（担体：５，０００ｍｌ、ファルマシア社製
）で脱塩した。これを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．１）で平衡化したヘパリンセルロファイン カラ
ム（担体：５０ｍｌ、生化学工業社製）に吸着させた。
【００１８】次に、平衡化に使用した同じ緩衝液でカラ
ムを洗浄し、０Ｍから１ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配
でルシフェラーゼを溶出させた。８．５ｘ１０１１ｃｐ
ｓ（比活性：１ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）のルシフェラーゼが回収され、活性回収率は６５
％（全回収率：２９％）であった。この精製画分は還元
下ＳＤＳ電気泳動で単一バンドを示し、高純度のルシフ
ェラーゼであることが確認された。
ムを洗浄し、０Ｍから１ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配
でルシフェラーゼを溶出させた。８．５ｘ１０１１ｃｐ
ｓ（比活性：１ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）のルシフェラーゼが回収され、活性回収率は６５
％（全回収率：２９％）であった。この精製画分は還元
下ＳＤＳ電気泳動で単一バンドを示し、高純度のルシフ
ェラーゼであることが確認された。
【００１９】実施例２
実施例１の組換え体酵母を４００Ｌ培養槽で培養し、菌
体を遠心分離で除去して上澄液１９５Ｌを得た。ルシフ
ェラーゼ活性は全量で２．７ｘ１０１３ｃｐｓ（比活性
：１．３ｘ１０９ ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
であった。この上澄液を、予め２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．１）で平衡化したＤＥＡＥセルロファイン
Ａ５００（担体：５．５Ｌ、生化学工業社製）吸着させ
た。カラムを平衡化の緩衝液で洗浄し、次いで０Ｍから
０．３ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配でルシフェラーゼ
を溶出させた。１．７ｘ１０１３ｃｐｓ（比活性：１．
６ｘ１０１０ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）のルシ
フェラーゼが回収され、活性回収率は約５９％であった
。
体を遠心分離で除去して上澄液１９５Ｌを得た。ルシフ
ェラーゼ活性は全量で２．７ｘ１０１３ｃｐｓ（比活性
：１．３ｘ１０９ ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
であった。この上澄液を、予め２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．１）で平衡化したＤＥＡＥセルロファイン
Ａ５００（担体：５．５Ｌ、生化学工業社製）吸着させ
た。カラムを平衡化の緩衝液で洗浄し、次いで０Ｍから
０．３ＭへのＮａＣｌの直線濃度勾配でルシフェラーゼ
を溶出させた。１．７ｘ１０１３ｃｐｓ（比活性：１．
６ｘ１０１０ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）のルシ
フェラーゼが回収され、活性回収率は約５９％であった
。
【００２０】活性画分３．５Ｌに３０％飽和硫安を添加
し、これを１Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス 塩酸緩衝
液（ｐＨ７．１）で平衡化したブチルトヨパール６５０
Ｍ（担体：１．０Ｌ）に吸着させた。このカラムを平衡
化に使用した緩衝液（１Ｍ硫安含有）で洗浄し、１Ｍか
ら０Ｍへの硫安の直線濃度勾配でルシフェラーゼを溶出
させた。１．５ｘ１０１３ｃｐｓ（比活性：１．７ｘ１
０１１ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）のルシフェラ
ーゼが回収された。活性回収率は約８８％（全収率：約
５６％）であった。
し、これを１Ｍ硫安を含む２０ｍＭトリス 塩酸緩衝
液（ｐＨ７．１）で平衡化したブチルトヨパール６５０
Ｍ（担体：１．０Ｌ）に吸着させた。このカラムを平衡
化に使用した緩衝液（１Ｍ硫安含有）で洗浄し、１Ｍか
ら０Ｍへの硫安の直線濃度勾配でルシフェラーゼを溶出
させた。１．５ｘ１０１３ｃｐｓ（比活性：１．７ｘ１
０１１ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）のルシフェラ
ーゼが回収された。活性回収率は約８８％（全収率：約
５６％）であった。
【００２１】得られた活性画分５５０ｍｌを、１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）を展開液として
、セファデックスＧ−２５（担体：５．０Ｌ、ファルマ
シァ社製）で脱塩と緩衝液置換を行った後、０．５Ｍと
なるようにＮａＣｌを添加した。これを０．５ＭＮａＣ
ｌ含有の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１
）で平衡化した銅キレートセファロースカラム（担体：
１２０ｍｌ、ファルマシァ社製）に吸着させた後、平衡
化と同じ緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ含有）で洗浄した。 次に、０Ｍから０．３ＭへのＮＨ４ Ｃｌの直線濃度勾
配でルシフェラーゼを溶出させた。１．３ｘ１０１３ｃ
ｐｓ（比活性：１．０ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）のルシフェラーゼが回収された。活性回収
率は約８７％（全収率：約４８％）であった。この精製
画分は還元下ＳＤＳ電気泳動で単一バンドであり、高純
度ルシフェラーゼである事が確認された。
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）を展開液として
、セファデックスＧ−２５（担体：５．０Ｌ、ファルマ
シァ社製）で脱塩と緩衝液置換を行った後、０．５Ｍと
なるようにＮａＣｌを添加した。これを０．５ＭＮａＣ
ｌ含有の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１
）で平衡化した銅キレートセファロースカラム（担体：
１２０ｍｌ、ファルマシァ社製）に吸着させた後、平衡
化と同じ緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ含有）で洗浄した。 次に、０Ｍから０．３ＭへのＮＨ４ Ｃｌの直線濃度勾
配でルシフェラーゼを溶出させた。１．３ｘ１０１３ｃ
ｐｓ（比活性：１．０ｘ１０１３ｃｐｓ／ｍｇ ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）のルシフェラーゼが回収された。活性回収
率は約８７％（全収率：約４８％）であった。この精製
画分は還元下ＳＤＳ電気泳動で単一バンドであり、高純
度ルシフェラーゼである事が確認された。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、従来工業的製造が困難
であったウミホタル・ルシフェラーゼを、高純度にかつ
効率良く製造することができる。
であったウミホタル・ルシフェラーゼを、高純度にかつ
効率良く製造することができる。
Claims (1)
- 【請求項１】 ウミホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を
組み込んだ遺伝子組換え体の培養液を、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水クロマトグラフィーおよびアフィ
ニティークロマトグラフィーの１種以上のクロマトグラ
フィーにより精製することを特徴とするウミホタル・ル
シフェラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004791A JPH04258287A (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | ウミホタル・ルシフェラーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004791A JPH04258287A (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | ウミホタル・ルシフェラーゼの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258287A true JPH04258287A (ja) | 1992-09-14 |
Family
ID=12016149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004791A Pending JPH04258287A (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | ウミホタル・ルシフェラーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04258287A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015152018A1 (ja) * | 2014-04-03 | 2015-10-08 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ウミホタルルシフェラーゼ生産法 |
-
1991
- 1991-02-13 JP JP2004791A patent/JPH04258287A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015152018A1 (ja) * | 2014-04-03 | 2015-10-08 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ウミホタルルシフェラーゼ生産法 |
| JPWO2015152018A1 (ja) * | 2014-04-03 | 2017-04-13 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | ウミホタルルシフェラーゼ生産法 |
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