JPH04210700A - 組換ヒトトロンボモジュリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１３

【産業上の利用分野］本発明は、組換ヒトトロンボモジ
ュリン誘導体に関するものである。さらに詳しくは、コ
ンドロイチナーゼＡＢＣで切断されるグルコサミノグリ
カンによって修飾されないようにアミノ酸配列を変更す
ることにより血中半減期が延長された組換ヒトトロンボ
モジュリン誘導体、その発現ベクター及びその形質転換
細胞に関するものである。 ［０００２］ 【発明の背景】　トロンボモジュリンは血管内皮細胞の
膜上に存在する糖蛋白の一つであり、トロンビンと結合
してトロンビンの持つフィブリン凝固活性、第■因子や
第ＶＩＩＩ因子の活性化あるいは血小板活性化に対して
阻害作用を示し、またトロンビンによるプロティンＣの
活性化を促進する（実験医学６．　（１４）、　１３９
６−１３９８　（１９８８）；　Ｐｒ。 ｇ、Ｈｅｍｏｓｔ、Ｔｈｒｏｍｂ、、　９．２９−５５
　（１９８９乃。これらのトロンボモジュリンの生理活
性はトロンボモジュリンが抗凝固薬として有用であるこ
とを示している。ヒトトロンボモジュリンのｃＤＮＡは
既に報告され（ＥＭＢＯＪ、、　６．１８９１−１８９
７（１９８７）：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２６
．　４３５０−４３５７　（１９８７））、また染色体
上の遺伝子のＤＮＡについてもヒトトロンボモジュリン
遺伝子はイントロンを持っていないことが判明している
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　
　８４．６４２５−６４２９（１９８７）：　Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、１０３，２８１〜２８５　（１９８８）
）　、　５ｕｚｕｋｉら０、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２
６４．４８７２−４８７６　（１９８９））はこのヒト
トロンボモジュリンを遺伝子組換により動物培養細胞で
生産させているが、その構造に関しては詳細な検討は行
われていない。 ［０００３］明らかにされたＤＮＡ配列によるとヒトト
ロンボモジュリンは５５７個のアミノ酸から成立ってい
ると推定される。ヒトトロンボモジュリンは、機能的に
は、アミノ末端領域、ＥＧＦ様構造領域、０−グリコシ
ル化部位領域、細胞膜貫通領域および細胞質内領域の５
つの領域に分けられ、その内、ＥＧＦ様構造領域が、ト
ロンビンに作用してそのプロティンＣ活性化能を促進す
る領域であることが報告されている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、、　　２６４、４８７２−４８７６　（１９８
９）　）　　。また、アミノ末端領域、ＥＧＦ様構造領
域およびＯ−グリコシル化部位領域は細胞膜外に存在す
る部分であり、これらの部分だけで構成されるヒトトロ
ンボモジュリンは細胞膜に結合できず、可溶化された形
で存在する０、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６４．４８
７２−４８７６（１９８９）　　；　Ｂｌｏｏｄ、互、
　１３９６−１３９９　（１９９０）　）。 ［０００４］本発明者らはこれら３つの領域（アミノ末
端領域、ＥＧＦ様構造領域および０−グリコシル化部位
領域）に着目して、これら３つの領域のみから成る組換
ヒトトロンボモジュリンの生産を試みた。ヒトトロンボ
モジュリン遺伝子を改変し、発現ベクターを作成、さら
にこれを動物培養細胞（ＣＨＯ−Ｋｌ細胞）に導入した
発現細胞株を培養したところ、その培養液中に硫酸化グ
ルコサミノグリカンを持った組換ヒトトロンボモジュリ
ンを見出すことができた（特願平１−２６９１９４．　
国際出願ＰＣＴ／Ｊ　Ｐ２Ｏ，１０１３４２）。この硫
酸化グルコサミノグリカン構造はコンドロイチン−４−
硫酸を主要構造とするものであり、ヒトトロボモジュリ
ンでは従来知られていない構造のものであった。しかし
、この硫酸化グルコサミノグリカンを有する組換ヒトト
ロンボモジュリンの血中半減期をラットにおいて調べた
ところ、約２０分と短いものであった。 ［０００５］

【発明が解決しようとする課題】医薬品を疾病の治療に
使用する際、投与された医薬品の血中濃度が有効濃度を
長時間にわたって維持することは極めて重要である。１
なわちその期待される薬効を発揮するためには医薬品（
血中半減期が十分な長さをもっていなければならない。 この点は組換医薬品においても同様であり、血中半減其
を長くするためにさまざまな考案がなされている。 ［０００６］発明者らは、硫酸化グルコサミノグリ力〕
を有する組換ヒトトロンボモジュリンの血中半減期力唄
い原因として、硫酸化グルコサミノグリカンの存在に１
目し、この組換ヒトトロンボモジュリンをコンドロイラ
ナーゼＡＢＣで処理したところ、ラットにおける血中斗
減期は７．７時間まで延長していた。このことは、組部
ヒトトロンボモジュリンに付加している硫酸化グルコづ
ミノグリカンを除去すれば、血中半減期の長い組換ヒト
トロンボモジュリンが得られることを示している。 ［０００７］そこで、発明者らは、前記出願で得られｈ
組換ヒトトロンボモジュリンの硫酸化グルコサミノグリ
カン付加部位を調べた。すなわち、組換ヒトトロンボモ
ジュリンを還元後遊離のＳＨ基をカルボキシアミドメチ
ル化し、これをトリプシンで完全消化した後、Ｄｏｗｅ
ｘ　Ｉ　Ｘ２によるイオン交換クロマトグラフィー及び
アルコール沈澱操作を行い、硫酸化グルコサミノグリカ
ンを含むペプチド断片を分離した。得られたペプチド断
片のＮ末娼アミノ酸配列を調べたところ、硫酸化グルコ
サミノグリカンの付加部位はＶａｌ　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅ　ｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏであった（Ｖａｌ：バリ
ン、Ａｓｐ：アスパラギン酸、ＧＩＹニゲリシン、Ｓｅ
ｒ：セリン、Ｇｌｕ：グルタミン酸、Ｐｒｏニブロリン
、Ｘ：特定できず）。この配列はヒトトロンボモジュリ
ンの４６７番目のバリン以降の配列と一致していた。 ［０００８］一方、グルコサミノグリカンのペプチド鎖
への結合部位周辺のアミノ酸配列に関しては、Ｓｅｔ”
　−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙ或いは、Ｇｌｙ−５ｅｔ”
−Ｇｌｙとその近傍の酸性アミノ酸の存在が重要である
ことが提唱されている（Ｘａａ：任意のアミノ酸、Ｓｅ
ｔ”　ニグルコサミノグリカンが結合するセリン）　　
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　
８４．　３１９４−３１９８　（１９８７）＋　Ｊ、　
Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　用シ１５４７−１５５６　（
１９８９））　、またヒトトロンボモジュリンでは知ら
れていないが、ウサギトロンボモジュリンの一部は、コ
ンドロイチン硫酸様／デルマタン硫酸様グルコサミノグ
リカンで修飾されており、そのグルコサミノグリカン部
分を介してアンチトロンビンＩＩＩ依存性の抗トロンビ
ン活性を示すことや、硫酸化グルコサミノグリカンの結
合位置はＯ−グリコシル化部位領域にあるセリン・グリ
シン・セリン・グリシンの配列部分であることが推定さ
れている　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６３．８
０４４−８０５２　（１９８８）；　Ｔｈｒ　ｏｍｂ、
　Ｒｅｓ、、　５３．２７−３９（１９８９）　）。 ［０００９］これらのことから、本発明者らは、組換ヒ
トトロンボモジュリンの硫酸化グルコサミノグリカン付
加部位を４７２番目から４７６番目の５ｅｒ−Ｇｌｙ−
８ｅｒ−Ｇｌｙ−ＧＩｕを含む領域であると予想し、こ
の部位のアミノ酸配列を改変したところ、硫酸化グルコ
サミノグリカンで修飾されていない組換ヒトトロンボモ
ジュリン誘導体を作成することができた。またその血中
半減期は、ラットにおいて７時間と延長されていた。本
発明はこの知見に基づきなされたものであり、血中半減
期が長く、抗凝固薬として有用な新規構造の組換ヒトト
ロンボモジュリンを提供することを目的とする。 ［００１０１

【課題を達成するための手段］本発明の目的は、硫酸化
グルコサミノグリカンの付加部位であると予想される部
位（０−グリコシル化部位領域中にある４７２番目から
４７６番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グ
ルタミン酸周辺）のアミノ酸配列を、アミノ酸の除去・
付加或いは置換により変更した組換ヒトトロンボモジュ
リン誘導体により達成される。 ［００１１１この組換ヒトトロンボモジュリン誘導体は
、ヒトトロンボモジュリン遺伝子のＤＮＡに部位特異的
変異の手法を用いて、アミノ酸４７２番目から４７６番
目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミン
酸部分及びその周辺の連続したアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ配列を、除去・付加あるいは置換することによ
り変更したヒトトロンボモジュリン誘導体遺伝子を作成
し、これを用いて製造することができる。 ［００１２］　ヒトトロンボモジュリンの遺伝子は、文
献（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　、　１０３．２８１
〜２８５　（１９８８）　）記載のＤＮＡ配列に基づい
て作成できるプローブを用いてヒト染色体遺伝子より入
手する。この遺伝子は完全長であってもよいし、また実
施例で述べるような、アミン末端領域、ＥＧＦ様構造領
域および０−グリコシル化部位領域の３つの領域のペプ
チドをコードする部分長ＤＮＡでもよい。すなわちヒト
トロンボモジュリンの生理活性を損なわず、かつ硫酸化
グルコサミノグリカンで修飾される部位が存在する最少
限の部分（おそらくはＥＧＦ様構造領域とＯ−グリコシ
ル化部位領域の４７２番目から４７６番目のセリン・グ
リシン・セリン・グリシン・グルタミン酸部分周辺のア
ミノ酸配列が必要と思われる）をコードする範囲の長さ
のＤＮＡであればよい。得られたヒトトロンボモジュリ
ン誘導体の遺伝子は適当なプロモータ、ターミネータ、
シグナル配列等、さらに必要に応じて適当なマーカー遺
伝子を付けて適当なベクターに組込まれる。ベクターは
動物培養細胞で機能するものであればどのような種類の
ものでもよい。たとえばＳＶ４０ベクター、Ｒ３Ｙ　（
ラウス肉腫ウィルス）ベクター、ＭＭＴＶ　（マウス乳
がんウィルス）ベクターあるいはＣＭＶ　（サイトメガ
ロウィルス）ベクターなどである。また宿主培養細胞と
して使用されるものは、とくに限定されないが、ＣＨＯ
細胞やＣＯ３細胞はとくに適している。 ［００１３ｌ以上のヒトトロンボモジュリン遺伝子の入
手、発現ベクターの構築、細胞内発現等は全て慣用技術
で行なうことができる（参考［遺伝子操作マニュアル」
高木康敬編著、講談社（１９８２）　；　Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ　、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ　ａｌ
”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ　ｂ
ｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）；　Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ　２ｎｄ　Ｅｄ、”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８
９））。 ［００１４］ 【実施例１】ヒトトロンボモジュリン遺伝子の取得ａ）
　プローブの作成 文献（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０３．２８１〜２８５　
（１９８８））記載のＤＮＡ配列に基づいて合成したＤ
ＮＡオリゴマーを用いてプローブを作成した。即ち、Ｐ
ｒ−ＴＭ−０１：およびこれと部分的に相補鎖を形成す
るＰｒ−ＴＶ−０２：を合成した。これはヒトトロンボ
モジュリン遺伝子の終止コドンの１３塩基下流側に相当
する部分である。これら二本の合成りＮＡオリゴマーを
アニールさせ部分的二本鎖を形成させた後、ｄＮＴＰｓ
存在下Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理により完全二本鎖
とした。このＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼで５′末端をリン酸化したのち、ＨｉｎｃＩＩで切断
したｐＵｃ１１９　（市販）とＴ４　ＤＮＡリガーゼで
結合させたところ前者が３個同方向に繰返し挿入された
プラスミドｐＵＣｐ　ｒ　ＴＭ９を得た。このｐＵＣｐ
　ｒ　ＴＭ９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断
して合成オリゴマー由来の部分を分離し、ニックトラン
スレーション法により３２ｐでラベルし、ヒトトロンボ
モジュリン遺伝子取得用のプローブとして使用した。 ［００１５］ｂ）ヒトトロンボモジュリン遺伝子のクロ
ーニング ヒト染色体ＤＮＡをＡｌｕ　ＩおよびＨａｅｌＩＩで部
分消化してヒト遺伝子ライブラリー（ベクターはＣｈａ
ｒｏｎ　４Ａ）を作成し、このライブラリーから、ａ）
に述べた方法で作成したプローブを用いてプラークハイ
ブリダイゼーションを行いヒトトロンボモジュリン遺伝
子をスクリーニングした（参考「遺伝子操作マニュアル
」高木康敬編著　講談社（１９８２））。その結果、ヒ
トトロンボモジュリン遺伝子の全長を保持するファージ
クローン（ｐｈａｇｅ　Ｎｏ、　７）のＤＮＡを得た。 このＤＮＡをＳａｃ　Ｉで切断しヒトトロンボモジュリ
ン遺伝子を含む６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離した。 このＤＮＡ断片をｐＵｃ１１９のＳａｃ　Ｉ部位に挿入
し図１上段に示すプラスミドｐ７ＴＭ−５ａｃ　Ｉを得
た。図中、ＴＭがヒトトロンボモジュリン遺伝子領域を
示す。このｐ７ＴＭ−５ａｃ　ＩをＸｂｏ　ＩおよびＮ
ｃｏＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを用いて平
滑末端としたのちヒトトロンボモジュリン遺伝子を含む
２、　ＩＫｂｐのＤＮＡ断片を分離してｐＵｃ１１９の
ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入することにより、ヒトトロンボ
モジュリン遺伝子の５′側がｐＵｃ１１９のＨｉｎｄＩ
ＩＩ側にくる方向に挿入されたプラスミドｐ７ＴＭＯ１
を得た（図１下段）。このプラスミドの一本鎖ＤＮＡを
調製しｄｉｄｅｏｘｙ法によりＤＮＡ塩基配列を調べて
文献（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０３．２８１〜２８５
　（１９８８））記載のヒトトロンボモジュリン遺伝子
のＤＮＡ配列と一致することを確認した。 ［００１６］

【実施例２】発現ベクターの構築 図２に示すように、プラスミドｐ７ＴＭＯ１を５ｐｈＩ
およびＰｖｕＩＩで切断し、ヒトトロンボモジュリン遺
伝子の開始コドンＡＴＧを含む４７０ｂｐのＤＮＡ断片
を分離した。この断片をＢａｎ　Ｉで切断後Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメントを用いて平滑末端とし、更にＢｇｌｌＩ
で切断し、　ＡＴＧコドンを含むｔｓｏｂｐのＤＮＡ断
片（断片Ａ）を分離した。一方プラスミドｐ７ＴＭ０１
を５ｐｈＩで切断後マングビーンヌクレアーゼを用いて
平滑末端化し、ＢｇｌＩＩで切断して、ベクタ一部分を
含む４、８ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離した。このＤＮＡ
断片と上記の断片ＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させ、プラスミドｐ７ＴＭ１７を作製した。これはｐ７
ＴＭＯ１よりヒトトロンボモジュリン遺伝子の５゛非コ
ード領域をほぼ取除いたものである。なお５′側のＨｉ
ｎｄｌｌ１部位までの間に残っている非コード領域は約
３０ｂｐである。 （００１７１次にこの全長ヒトトロンボモジュリン遺伝
子にターミネータ配列を結合した。ターミネータ配列に
はプラスミドｐｓＶ２−ｇｐｔ　（市販）のＳＶ２ター
ミネータを用いた。図３に示すように、ｐｓＶ２−ｇｐ
　ｔをＡｐａ　ＩおよびＢａｍＨＩで切断した後Ｋｌｅ
ｎｏｗフラグメントで平滑末端とし、ＳＶ２転写終了領
域を含む８５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。この断片
を、Ｓａｔ　Ｉで切断後Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平
滑末端化したベクターｐＵｃ１９に挿入した。転写終了
領域の５′側がｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ側になっている
方向に挿入されたプラスミドをとり、ｐｓＶＴＯｌとし
た。プラスミドｐｓＶＴＯ１をＢａｍＨＩおよ■１ｎｄ
ｌｌＩで切断後マングビーンヌクレアーゼで平滑末端と
し、転写終了領域を含む８５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離
した。ＢｓｔＸＩおよびＸｂａ　Ｉで切断後マングビー
ンヌクレアーゼで平滑末端化したｐ７ＴＭｉ７に上記転
写終了領域の断片を挿入した。ヒトトロンボモジュリン
遺伝子と転写終了領域が同方向になっているプラスミド
をとりｐ７ＴＭ１９とした。 ［００１８１次に部分長ヒトトロンボモジュリンＤＮＡ
のベクターを作成した。図４に示すように、プラスミド
ｐ７ＴＭ１９をＮｒｕ　Ｉで切断後Ｂａ１３１Ｓ処理し
、更にＸｂａ　Ｉを作用させた後Ｋｌｅｎｏｗフラグメ
ントで末端平滑化した。これをＴ４ＤＮＡリガーゼでセ
ルフライゲーションさせることによりプラスミドｐＴＭ
ｓ０７を得た。ｌ）ＴＭｓ０７の保持する遺伝子によっ
てコードされるヒトトロンボモジュリンは、１番目のア
ラニンから４９１番目のアラニンまでである（アミノ酸
の番号は文献ＥＭＢＯＪ、、　６．１８９１−１８９７
　（１９８７）による）。 ［００１９］次にマーカー遺伝子のプロモータ領域を構
築した（図５〜７）。ＳＶ２プロモータ及びＳＶ２ター
ミネータを有するプラスミドＳＶ２−ｇｐｔ　をＥｃｏ
ＲＩおよびＰｖｕｌｌで切断後Ｋｌｅｎｏｗフラグメン
トで平滑末端とし、キサンチン−グアニン・フォスフォ
リポシル・トランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子を含む
２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片をとり、これをｐＵｃ１３の
ＨｉｎｃｌＩ部位に挿入した。ＳＶ２プロモータがｐＵ
ｃ１３のＥｃｏＲＩ側に挿入されたプラスミドをとりｐ
ＤＡ　Ｉ　−ｇｐｔとしく図５）　、　ＨｉｎｄＩＩＩ
側に挿入されたものをｐＮＡＮ−ｇ　ｐ　ｔとした（図
７）。プラスミドｐｓＶ２−ｇｐ　ｔをＥｃｏＲＩおよ
びＰｖｕｌＩで切断後ｇｐｔを含む２．９ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を分離し、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉで切断し
たｐＵｃ１３と結合させた。得られたプラスミドをｐＴ
ＥＮ−ｇｐ　ｔとした（図６）。ｐＤＡＩ−ｇｐｔをＨ
ｉｎｄＩＩＩで切断後Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑
末端としだ後ＳＶ２プロモータを含む３．０ｋｂｐ　（
７）ＤＮＡ断片（断片Ｂ）ヲ分離した。ｐＤＡＩ−ｇｌ
）ｔをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後Ｋｌｅｎｏ
ｗフラグメントで平滑末端としだ後ｇｐｔｍ域を含むＤ
ＮＡ断片（１，８ｋｂｐ）を分離し、断片Ｂと結合させ
た。ｇｐｔ遺伝子が発現される方向に結合したプラスミ
ドをとりｐＤ−ｇｐ　ｔＢ−８４とじた（図５）　、　
ｐＤ−ｇｐｔＢ−８４をＸｂａ　ＩおよびＥｃｏＲＶで
切断しＳＶ２プロモーターを含む０．８ｋｂｐのＤＮＡ
断片を分離し、Ｘｂａ　ＩおよびＥｃｏＲＶで切断して
ＳＶ２プロモータを含む部分を取除いたｐＴＥＮ−ｇｐ
　ｔに挿入した。得られたプラスミドをｐＴ−ｇｐ　ｔ
Ｂ−２３とした（図６）。このｐＴ−ｇｐ　ｔＢ−２３
をＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲＶで切断しＳＶ２プロ
モータを含む０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断してＳＶ２プロモー
タ部分を取除いたｐＮＡＮ−ｇｐｔに挿入した。 得られたプラスミドをｐＮ−ｇｐ　ｔＢ−１６とした（
図７）。 （００２０１マーカー遺伝子としてはネオマイシン耐性
遺伝子（ｎｅｏｒ）を用いた。図８に示すように、プラ
スミドｐＳＶ２−ｎｅｏ　（市販）をＢｇｌＩＩおよび
ＢａｍＨＩで切断しネオマイシン耐性遺伝子を含む２．
３ｋｂｐのＤＮＡ断片（断片Ｃ）を分離した。ｐＮ−ｇ
ｐ　ｔＢ−１６をＢｇｌｌＩおよびＢａｍＨＩで切断後
ＳＶ２プロモータおよびアンピシリン耐性遺伝子（ＡＩ
ｎｐｒ）を含むＤＮＡ断片を分離して、断片Ｃと結合さ
せプラスミドｐＢ−ｎｅｏを得た。 ［００２１］　ｐＢ−ｎｅｏをＸｂａ　ＩとＢａｍＨＩ
およびＳｃａ　Ｉで切断後マングビーンヌクレアーゼで
平滑末端とした後、ネオマイシン耐性遺伝子を含む２．
７ｋｂｌ）のＤＮＡ断片を分離した（図９）。このＤＮ
Ａ断片を、ＢａｍＨＩで切断後ＫＩｅｎＯＷ７ラグメン
トで平滑末端としたｐＴＭｓ０７と結合させ、ヒトトロ
ンボモジュリン遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子が同方
向に挿入されたプラスミドｐＴＭｓ０７−ｎｅｏを得た
。一方。 ｐＯ−ｇａｌ　（文献ＤＮＡ、　８，１２７〜１３３（
１９８９））をＨｉｎｄｌＩＩで切断しＲ５Ｖプロモー
タを含む０．５ｋｂｐのＤＮＡを分離し、この０、５ｋ
ｂｐ断片をＨｉｎｄｌｌｌで切断したｐＴＭｓ０７−ｎ
ｅｏと結合させた。プロモータがヒトトロンボモジュリ
ン遺伝子を発現させられる方向に挿入されたプラスミド
を選び、ｐＲＳ７ＴＭｎｅｏとした。このプラスミドｐ
ＲＳ７ＴＭ−ｎｅｏを有するＥ、　ｃｏｌ　ｉＲ５７Ｔ
Ｍ−ｎｅｏは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている（受託番号：微工研条奇第２６０９号、ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−２６０９、寄託口：　１９８９年９月２５日
）。 ［００２２］

【実施例３】発現細胞株の樹立 ｐＲ３７ＴＭ−ｎｅｏ　２０　μｇを水４４０　μｌに
加えた後２ＭＣａＣｌ２溶液６０μｍ添加して１液とし
た。ＸＺＨＢＳ液（ＨＥＰＥ５２．５ｇ、　ＮａＣ１３
，２ｇ／２００ｍ１；　ｐＨ７゜１）　５００　μｌに
×１００リン酸溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４１，２５３ｇ、　
ＮａＨ２ＰＯ４０，５４６ｇ／１００ｍ１）　１０　ｌ
Ｌｌ加えたものを２液とした。２液に少量づつ１液を加
えながら撹拌し、室温に３０分間放置した。一方、１０
％ＦＢＳを添加したダルベツコ変法イーグル培地「ニッ
スイ」■（日本製薬、以下ＤＭＥ■培地という）で１〜
２　Ｘ１０５個のＣＨＯ−に１細胞（大日本製薬（株）
カタログ番号：０３−４０２．原ＡＴＣＣＮｏ　：　Ｃ
ＣＬ−６１）を７５ｃｍ２　のカルチャーボトル中で一
晩培養した。新鮮な同培地１０ｍ１と交換してから４時
間後上記プラスミド懸濁液を加え、１８時間培養した。 １ｇ／ｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤＭＥ■
培地１６ｍ１と交換し培養を継続した。３〜４日毎に培
地を交換しながら１０日間培養した後、限界希釈法によ
って形質転換株を選出することによりヒトトロンボモジ
ュリン生産株ＣＨＯ−ＫＩＲ８７ＴＭｎｅｏ　Ｎｏ、２
−９ｂ−２９（以下Ｎｏ、　２−９ｂ−２９と略す）を
得た。 ［００２３］

【実施例４】活性型プロティンＣの活性測定によるヒト
トロンボモジュリンの定量（ＡＰＣ法）３３μｌのゼラ
チンバッファー（０，１％ゼラチン（ＳＩＧＭＡ社製、
カタログ番号Ｇ−２５００）　、　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ＳＩＧＭＡ社製）、　０．１Ｍ　ＮａＣ１
，０，０２％ＮａＮ　３　；　１）Ｈ７，５）と、５０
　ｍＭ　ＣａＣ１ｚ６μｌ、３μＭヒトプロティンＣ（
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉ　ａｇｎｏｓｔｉｃａｌｎＣ６
製）１０μｍおよび測定試料１μＩを混合して３７℃で
２０分間静置した。これに３．５Ｕ／ｍｌ　のウシトロ
ンビン（持出製薬製；　５ｍＭ　ＭＥＳ、　０．１Ｍ　
ＮａＣ１，０，０２％ＮａＮ３．　ｐＨ６，０に溶解）
１０μｌ添加した後３７℃で１０分間静置後、２０μｌ
のアンチトロンビンＩＩＩ　　（ノイアート５００倍（
ミドリ十字製）を２０ｍ１の生理食塩水で溶解したもの
）および２０μｌのヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製、カタロ
グ番号Ｈ−３１２５；　１０．０００ｕを２５ｍ１のゼ
ラチンバッファーで溶解したもの）を加える。充分に混
合した後１０μｌを別の容器に移し、９０μｌのＳ−２
３６６（第一化学；ゼラチンバッファーで溶解し０．１
１鋼としたもの）を加えＶｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｄｅｖｉｃ　ｅｓ社製）を用いて、ここで生成した活
性型プロティンＣによって起る単位時間当りの４０５ｎ
ｍでの吸光度の変化を測定することにより測定試料中の
ヒトトロンボモジュリンを定量する。 ［００２４］

【実施例５】実施例３で得られたヒトトロンボモジュリ
ン生産ＣＨＯ細胞株Ｎｏ、　２−９ｂ−２９を１本当り
２Ｘ１０７個、η１８（Ｉｇ／ｌ）およびアプロチニン
（５０Ｕ／ｍｌ）を含むＧＩＴ培地（日本製薬製）　　
２００ｍ１の入ったローラーボトルに接種し、０．３〜
０．５ｒｐｍで培養を行った。２日目に上記培地で培地
交換を行った。４日目に上記培地より６４１８を除いた
培地と交換した。以降毎日７日目まで培地を交換し、５
．６および７日目に回収した培養液を合せ生産物回収の
材料とした。 ［００２５］

【実施例６】実施例５で得られた培養液（８８０ｍｌ）
から遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）および濾過
（０，８μｎ＋メンブランフィルタ−使用）処理によっ
て固形夾雑物を取除いた後、１．ＯＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　緩衝液（ｐＨ７，５）を添加しｐＨを７．５に調整
した。この液を、０．１５ＭＮａＣｌ　を含む２０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）で予め平衡化
したＱ−セファロースファーストフロー（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）充填カラム（中２゜５Ｘ１２ｃｍ）に流速
２００ｍ１／時で通した。カラム流量２０ｍ１／時の前
記緩衝液３００ｍ　ｌで洗った後流量１００１１１１／
’時の２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）
中で０．１５Ｍから１．２０Ｍの直線塩化ナトリウム濃
度勾配を用いて溶出した（総溶出緩衝液量は１００１０
０Ｏ。溶出液を１９ｍ　ｌづつ分画し各フラクションを
ＡＰＣ法により活性を調べた。その結果、フラクション
Ｎ００８〜１５と２２〜３２の二つの活性ピークが検出
された（図１０参照）。後者のピーク画分を集め画分Ａ
とした。また前者の両分は画分Ｂとした。 ［００２６］

【実施例７】さらに各両分Ａ、　Ｂをアフィニティクロ
マトグラフィで精製した。予め０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　
を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５
）で平衡化した抗ヒトトロンボモジュリンＩｇＧ結合セ
ルロファイン（ホルミルセルロファイン（チッソ社製）
に抗ヒトトロンボモジュリンＩｇＧを約５■／ｍｌゲル
の割合で結合させたもの）充填カラム（φ１．５Ｘ６ｃ
ｍ）に、２倍量の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（
ｐＨ７，５）で希釈した画分Ａ（又はＢ）を流量２０ｍ
　ｌ　／時で通した。 このカラムを流量３０ｍ１／時で０．３５Ｍ　ＮａＣ１
を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，
５）で洗浄した後流量３０ｍ１／時の３．０Ｍチオシア
ン酸カリウムを含む２０ｍ１ｉｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩
衝液（ｐＨ７、５）　１５０ｍ１で溶出した。この溶出
液を集め限外濾過膜（ダイアフローメンブレンＹＭ３０
、φ７６ｍｍ）を装着した限外濾過装置で約５ｍｌに濃
縮した。これに１００ｍ　ｌの０．１５ＭのＮａＣｌを
含む２０ｍ１ｉｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　緩衝液（ｐＨ７
，５）を加えて再度同様に約５ｍｌに濃縮した。この操
作を更に二度繰返したのち、φ４３ｍｍのＹＭ３０を用
いて最終的に１　ｍｌに濃縮した。 ［００２７］こうして得た画分Ａからの活性物質をＴＭ
−β、画分Ｂからの活性物質をＴＭ−αとした。各試料
について逆相ＨＰＬＣを行なった。 溶出条件は以下の通りである。 結果を図１１に示す。ＴＭ−αはシングルピークを示し
た（図１１　（Ａ）　）が、ＴＭ−βはこのような酸性
の溶出条件では溶出されなかった（図１１　（Ｂ）　）
。 ［００２８］そこで溶出条件を下記のようなアルカリ条
件に変えて）ｔＰＬｃ分析を行なった。 図１２に示すようにこの条件下では保持時間１３．０分
でシングルピークとして溶出され、１−βを純化するこ
とができた。精製されたＴＭ−α及びＴＭ−βは何れも
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で単一バンドを示
していた。 ［００２ｇ１　　ＴＭ−α及びＴＭ−βについて、その
Ｎ末端側のアミノ酸配列をペプチドシーケンサ−（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、４７０Ａ型）
を用いて５番目まで調べたところ、いずれもＡｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−６１ｕ−Ｐｒｏ　であった。これは文献
（ＥＭＢＯＪ、、６．１８９１〜１８９７　（１９８７
）　）記載のヒトトロンボモジュリンのＮ末端アミノ酸
配列と一致する。ＴＭ−αとＴＭ〜βのＨＰＬＣでの挙
動の違いから、耐−βは酸性糖鎖が付加したものである
と推測された。 ［００３０１なお図１３はＴＭ−βのイオン交換クロマ
トの溶出パターンである。その溶出条件は下記の通りで
ある。 ［００３１］

【実施例８］　　Ｔａ１ｌ−のコンドロイチナーゼＡＢ
Ｃ処理ヒトトロンボモジュリンでは知られていないが、
ウサギトロンボモジュリンの一部は、コンドロイチン硫
酸様／デルマタン硫酸様グルコサミノグリカンで修飾さ
れており、そのグルコサミノグリカン部分を介してアン
チトロンビンＩＩＩ依存性の抗トロンビン活性を示すこ
とが報告されており、硫酸化グルコサミノグリカンの重
要性が示されている（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２
６３．８０４４〜８０５２　（１９８８）：Ｔｈｒｏｍ
ｂ、Ｒｅｓ、、５４．２７〜３９　（１９８９）　）　
、そこで酸性物質であるＴＭ−βについて硫酸化グルコ
サミノグリカンの有無を調べた。まずコンドロイチン硫
酸やデルマタン硫酸を特異的に分解して硫酸化不飽和三
糖を生成するコンドロイチナーゼＡＢＣでＴＭ−βを処
理した。コンドロイチナーゼＡＢＣ（プロテアーゼフリ
ー、ＩＵ／バイアル；生化学工業製）凍結乾燥粉末の入
ったバイアルに６２０μｌの０．１ＭＮａｃｌ　を含む
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，０）と３
０μｌの１．０Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を加え酵素を溶
解した。これに、３５０μｌのＴＭ−β溶液（３，４ｍ
ｇ／ｍｌ、　０．　ＬＭ　ＮａＣ１−２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）　）を加えよく撹拌し
た後３７℃で１６時間反応させた。なおＴＭ−βの定量
は、ＴＭ−αの凍結乾燥粉末を標準試料にして、ＥＬＩ
ＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−１１ｎｋｅ　ｄ　１ｎｕａｕｎＯ
５Ｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ法）により行なった。この
ときの重量換算は、５ＤＳ−電気泳動の泳動度から、Ｔ
Ｍ−αの分子量を７０ｋＤ、　　ＴＭ−βの分子量を８
５ｋＤとして行なった。 ［００３２］ 【実施例９］　　ＨＰＬＣ装置（ＬＣ−６ＡＤ、高滓製
作所製）に装着したＴＳＫｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ　５Ｐ
Ｗ　ＲＰ　（φ４．６　Ｘ　７５ｍｍ　；東ソー社製）
をあらかじめ流量１．０ｍｌ／分の条件下で１０％ＣＨ
３ＣＮを含む１ｍＭＮＨ４ＯＨ溶液で平衡化しておき、
この条件下で連続的に通液中のカラムに実施例８で得た
反応液を注入した。この操作により大部分の蛋白質はカ
ラムに吸着されるが、反応生成物である不飽和三糖は吸
着されないで通過する。この通過画分を回収し凍結乾燥
し、その凍結乾燥粉末を１．０ｍｌの水に溶解しＨＰＬ
Ｃによる同定の試料とした。 ［００３３］ 【実施例１０】　実施例９で得られた試料を下記の条件
でＨＰＬＣによる分析を行った。 この本条件下で試料中の主要ピークの保持時間は２４．
７分であった（図１４）。このピークを示す不飽和三糖
を便宜上ΔＤｉ−ＸＳとして図面に示す。この保持時間
は市販の標準２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ
−３−０−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−４−ｅｎｅｐｙｒａ
ｎｏｓｙｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）−４−０−ｓｕｌｆ
ｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ　　（以下ΔＤｉ−４Ｓと
略す；生化学工業社製）の保持時間と一致した。 さらに、本試料（ΔＤｉ−ＸＳ）とΔＤ　１−４Ｓを混
合して上記条件下で分析を行うと、試料中の主要ピーク
（保持時間２４．７分）に相応の増加が見られた（図１
５）。ΔＤｉ−４５はコンドロイチン−４−硫酸やデル
マタン硫酸をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した場合
の分解産物として知られているものであり、ＴＭ−βの
主要修飾糖鎖はコンドロイチン−４−硫酸又はデルマタ
ン硫酸であると推測できた。 なお図１４．１５における保持時間１６．１分のピーク
は試料中に混在する５ＣＮ−イオン（実施例７の操作に
より混入）によるピークである。 ［００３４］

【実施例１１】　実施例９で得られた試料について実施
例１０とは異なる下記の条件でＨＰＬＣによる分析を行
った。 この条件下でも試料中の主要ピークの保持時間（２１，
３分）は予想分解産物ΔＤｉ−４５の保持時間と一致し
ていた（図示せず）。 ［００３５］

【実施例１２】次にＴＭ−β修飾糖鎖がコンドロイチン
−４−硫酸であるのかデルマタン硫酸であるのか明らか
にするため、コンドロイチナーゼＡＣＩフラボ（コンド
ロイチン−４−硫酸を特異的に分解して硫酸化不飽和三
糖を生成するが、デルマタン硫酸は分解できない）でＴ
Ｍ−βを処理した。５０μｌのＴＭ−β溶液（３，４ｍ
ｇ／ｍｌ、　ｏ、　１５Ｍ　ＮａＣｌ２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）　）に５０μｌの０．
４Ｍ　ＴｒｉＳ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）　と５０
μｍの０．４Ｍ酢酸ナトリウム溶液と５０μｌの０．１
％ＢＳＡ溶液および２００μｌの水を加え、更にこれに
予め０．１％ＢＳＡ溶液にＩＵ、’ｍｌ　の濃度で溶か
した市販コンドロイチナーゼＡＣＩフラボ（１，６Ｕ／
バイアル：生化学工業製）溶液１００ＬＬｌを添加した
後よく撹拌し３７℃で６時間反応させた。得られた反応
液から、実施例９と同様にして不飽和三糖画分を集め、
実施例１０．１１と同様の条件でＨＰＬＣにかけたとこ
ろ、いずれも実施例１０，１１と同様に予想分解産物Δ
Ｄｉ−４５と同じ保持時間を持つピークが観察された。 図１６は実施例１０と同一条件下でのＨＰＬＣ溶出パタ
ーンである。従ってＴＭ−βの修飾糖鎖はコンドロイチ
ン−４−硫酸であると推測できた。 ［００３６］

【実施例１３】さらにＴＭ−βの修飾糖鎖はコンドロイ
チン−４−硫酸であることの確証を得るため、ＴＭ−β
の予想分解産物ΔＤｉ−４５に特異的に作用し脱硫酸す
るコンドロー４−スルファターゼでΔＤｉ−ＸＳを処理
した。実施例９で得られた試料５０μｍに１０μｌの０
．４Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）　と１
０μｌの０．４Ｍ酢酸ナトリウム溶液と１０μｍの０．
１％ＢＳＡ溶液および１０μｌの水を加え、これに２μ
ｌの市販コンドロー４−スルファターゼ（ＩＵ／ｍｌ　
Ｏ，１％ＢＳＡ：生化学工業製）を添加しよく撹拌した
後３７℃で１時間反応させた。１００℃２分間加熱して
反応を停止させた後ただちに実施例１０に述べた条件に
よりＨＰＬＣを用いた分析を行った。その結果、保持時
間２４．７分のピークが減少し、新たに保持時間１５．
６分のピークが観察された（図１７（Ｃ）　”）　、こ
の保持時間は市販の標準２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−
ｄｅｏｘｙ−３−０−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−４−ｅｎ
ｅｐｙｒａｎｏｓｙｌ　ｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）−Ｄ
−ｇａｌａｃｔｏｓｅ　　（以下ΔＤｉ−Ｏ８と略す）
と一致した（図１７（Ａ）　）　、さらに市販のΔＤｉ
−４５と２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−３
−０−（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−４−ｅｎｅｐｙｒａｎｏ
ｓｙｌｕｒ　ｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）−６−０−ｓｕｌｆ
ｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ　　（以下ΔＤｉ−６５と
略す：生化学工業製）を各２．５μｇづつコンドロー４
−スルファターゼで処理し同様の条件でＨＰＬＣによる
分析を行った。その結果ΔＤｉ−４３では保持時間がΔ
Ｄｉ−ＯＳと等しいピークを生じた（図１７　（Ｂ）　
）。しかしコンドロイチン−６−硫酸の分解産物として
知られているΔＤｉ−６Ｓではコンドロー４−スルファ
ターゼ処理によるピークの移動は観察されなかった（図
１７（Ｄ））。以上の結果から本発明の組換ヒトトロン
ボモジュリン（ＴＭ−β）はコンドロイチン−４−硫酸
を基本とする硫酸化グルコサミノグリカンを有すること
が判明した。なおΔＤｉ−４５生成量をＨＰＬＣでのピ
ーク面積から換算した結果、組換ヒトトロンボモジュリ
ンからその１分子当り平均２０〜２５分子の上記ΔＤｉ
−４５がコンドロイチナーゼ処理により生成するものと
推測できた。 ［００３７］

【実施例１４］ＴＶ−の抗凝固活性の測定５４ｎＭウシ
トロンビン（表１中ではＴと略す）の生理食塩水溶液（
持出製薬製）１００μｌ、ウシフィブリノーゲン（タイ
プ２；　３ｍｇ／’ｍｌ、　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ、　　０．１５Ｍ　ＮａＣＬｐＨ７゜５　；第−化学
薬品製）　　１００μｌおよび０．９％ＮａＣ１，１ｍ
ｇ／ｍ１ＢＳＡ、　０．１％ルブロールｐｘに溶解した
０１５４．１０８あるいは１６２ｎＭのＴＭ−β１００
μｍを混合して反応を開始し、凝固までの時間を測定し
た。測定は血液凝固自動測定器クロチックＩＩ　（メテ
ク社製）を使用して行った。その結果は次の通りである
。数値の単位は秒で示しである。 ［００３８］ 【表１】 ［００３９１表に示すように硫酸化グリコサミノグリカ
ン鎖を有するヒトトロンボモジュリン、ＴＭ−βはトロ
ンビンの凝固活性を抑制していた。 ［００４０１

【実施例１５］ＴＭ−βによるトロンビンのプロティン
Ｃ活性化の促進 １ｍｌ当り２０．１５．８．６．４．２及び］［ｇのＴ
Ｍ−β溶液を作り、これを測定試料として実施例４の方
法で活性化プロティンＣを生成させた。生成した活性化
プロティンＣによって起こる１分間当りの吸光度（ＯＤ
４　ｏ　＝　）変化を図１８に示す。図に示すように、
硫酸化グルコサミノグリカン鎖を有するヒトトロンボモ
ジュリン、ＴＭ−βはトロンビンによるプロティンＣ活
性化を促進していた。 ［００４１］ 【実施例１６】コンドロイチナーゼＡＢＣ処理したＴＭ
−βの血中濃度半減期 ＴＭ−βを実施例８と同様な方法でコンドロイチナーゼ
ＡＢＣ処理し、実施例９と同様にＨＰＬＣカラムに注入
し、カラムをよく洗浄して反応生成物である不飽和三糖
を除去した。次に、カラムに吸着保持されたコンドロイ
チナーゼＡＢＣ処理ＴＭ−βを１ｍＭ　ＮＨ４０Ｈ−ア
セトニトリル（５−６５％の直線濃度勾配）で溶出し、
これを集めて凍結乾燥した。この凍結乾燥標品を０．９
％ＮａＣ１，０，１％ルブロールＰＸ、　１■／ｍｌ　
ＢＳＡに溶解して、以下の実験に用いた。 ［００４２１ウイスター系雄性ラツト（静岡実験動物）
１１週令をベンドパルビタール（商品名、ネンブタール
：大日本製薬製）麻酔下で、コンドロイチナーゼＡＢＣ
処理ＴＭ−βを０．２■／ｋｇの用量で大腿静脈から投
与した。投与後、５．１０．３０．６０．１２０．３０
０分にクエン酸加血（３，１３％クエン酸ナトリウム・
２水塩：血液＝ｌ：９）を採取し、遠心操作（３，００
０ｒｐｍ、　１０分）により血漿を得た。この血漿をＰ
ＢＳ　（０，０２％ルブロールｐｘ含有）で１００倍希
釈して、ＥＬＩＳＡで血中のコンドロイチナーゼＡＢＣ
処理１−β量を定量した。ＴＭ−β量の換算は実施例８
と同様ＴＭ−α凍結乾燥粉末を標準試料として行った。 ［００４３１図１９に示すように、コンドロイチナーゼ
ＡＢＣ処理ＴＭ−β（−・−）の血中濃度半減期は７．
７時間であり、未処理ＴＭ−βの場合（−〇−）の血中
濃度半減期約２０分に比べ、著しく延長していた。なお
、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理ＴＭ−βは、トロンビ
ンによるプロティンＣ活性化の促進作用を失うことはな
かった。従って、硫酸化グルコサミノグリカン鎖で修飾
されないヒトトロンボモジュリン誘導体を作ることがで
きれば、ＴＭ−βよりも血中半減期の長い組換ヒトトロ
ンボモジュリンとすることが期待できる。 ［００４４１

【実施例１７］ヒトトロンボモジュリン誘導体遺伝子の
作成とその発現ベクターの構築 部分長ヒトトンボモジュリン遺伝子を有するプラスミド
ｐＴＭｓ０７を、Ｂｓ５ＨＩＩおよびＮｈｅＩで切断後
Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端とし、ｓｅｌｆ−
１ｉｇａｔｉｏｎ　させ、約１．３ｋｂｐのＢｓ５ＨＩ
　Ｉ−ＮｈｅＩ断片が除去されたプラスミドｐＴＭＤｓ
０７を得た（図２０上段）。別途ＤＮＡオリゴマーＭｕ
ｔ−ＴＭＳＧ−２：（５’　）　ＧＣＴＣＧＣＣＡＧＡ
ＧＴＣＧＣＣＡＣＣＧ（３”）　　を合成し、Ｋｕｎｋ
ｅ　Ｉ法（文献：　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　
：　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ　ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　Ｅｄ
、”　Ｖｏｌ、２．　　ｐ１５．７４．　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ　（１９８９））　により部位特異的変異の手法を
用いてｐＴＭＤｓ０７に変異を導入した。実験に当たっ
ては部位特異的変異実験キットｒＭｕｔａｎ”−Ｋ」（
宝酒造製）を使用した。即ち概略を述べると以下の通り
である（図２０．２１）。 ［００４５１１）ｄＵを含む５ｓＤＮＡの取得ｐＴＭＤ
ｓ０７をＥ、ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４　に保持させ、こ
の菌を２×ＹＴ培地（１０，＋１ｇ／ｍｌのテトラサイ
クリン、３０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）
で前培養した。この培養液３０μｌを２ＸＹＴ培地（１
５０μｇ／ｍ　ｌのアンピシリンを含む）　３ｍｌ　に
接種し、ファージＭ１３ＫＯ７をｍ、　ｏ、　ｉ、　＝
　２〜１０で感染させ、３７℃３０分静置後７０μｇ／
ｍ　ｌとなるようにカナマイシンを加えて一夜３７℃で
振盪培養した。遠心分離で上清を集め０．２２μｍのメ
ンブランフィルタ−で濾過した後、この上清２０μｌと
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＷ３１３の培養液８０μｌを混合し３
７℃１０分間静置後適当量をＬＢ−プレート（１５０μ
ｇ／ｍ　ｌのアンピシリンを含む）にひろげ３７℃でコ
ロニーを形成させた。シングルコロニーを２ＸＹＴ培地
（１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）で前培養し
、この培養液１ｍｌを２ＸＹＴ培地（１５０μｇ／ｍｌ
のアンピシリンを含む）１００ｍｌ　に接種しファージ
Ｍ１３ＫＯ７をｍ、ｏ、ｉ、＝２〜１０で感染させた。 ３７℃３０分静置後７０μｇ／ｍ　ｌとなるようにカナ
マイシンを加えて一夜３７℃で振盪培養した。遠心分離
で上清を回収した。上清に２０％ＰＥＧ６０００　／２
．５Ｍ　ＮａＣ１溶液２５ｍ　ｌを加え撹拌し、室温で
１０分放置後遠心分離で沈澱を集めた。ＴＥ緩衝液５ｕ
＋ｌに溶かし等量の中和フェノールを加えて撹拌後１０
分静置した。遠心分離で水層を回収し、等量の中和フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：
　２４　：　１　）を加えて撹拌後１０分静置した。遠
心分離で水層を回収し、等量のクロロホルム：イソアミ
ルアルコール（２４：１）を加えて撹拌後１０分静置し
た。遠心分離後水層を回収し、３Ｍ酢酸アンモニウム、
ｐＨ８，０を５００ｕｌ、イソプロピルアルコール５ｍ
ｌを加えて撹拌後、遠心分離して沈澱を集めた。沈澱を
７０％エタノールで洗い、減圧乾燥した後５０μｍのＴ
Ｅ緩衝液に溶解した。 ［００４６］　ｉｆ）部位特異的変異の導入１０ｐｍｏ
　ｌの上記合成オリゴマーＭｕｔ−ＴＭＳＧ−２をＡＴ
Ｐ存在下Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって５′末
端をリン酸化（反応溶液の最終容量は１０μｌ）した。 この溶液１μｌとｉ）で得た５ｓＤＮＡ溶液（０，２ｐ
ｍｏｌ　／１０μｌアニール緩衝液）１μｌを混合し６
５℃１５分、３７℃静置することによりハイブリダイズ
させた。これにｄＮＴＰｓ存在下Ｅ、ｃｏｌｔＤＮＡリ
ガーゼ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを加え（反応溶液２
７μ１）２５℃２時間静置後、３μｌの０．２Ｍ　ＥＤ
ＴＡ、　ｐＨ８、０を加え６５℃５分静置し反応を停止
させた。この反応液３μｌをＥ、　ｃｏｔ　ｉ　ＢＭＨ
７１−１８ｍｕｔＳ　コンピテントセルに混合し０℃３
０分、４２℃４５秒、０℃１〜２分静置した後、ＳＯＣ
培地３００μｌを加え、３７℃１時間振盪培養した。こ
れにＭ１３ＫＯ７フアージを感染させ３７℃３０分静置
し、２ＸＹＴ培地（１５０μｇ／’ｍｌのアンピシリン
、７０μｇ／ｍ　ｌのカナマイシンを含む）１ｍｌを加
え３７℃で一夜振盪培養した。遠心分離で回収した上清
２０μｍをＥ、ｃｏｌｉ　ＭＶ１１８４培養液８０μｍ
を混合し、３７℃１０分静置後ＬＢ−プレート（１５０
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）にひろげ３７℃でコ
ロニーを生育させた。これより部分特異性変異の導入さ
れたプラスミドｐＭ２ＴＭＤＯ７を得た（図２０下段）
。 ［００４７］　ｐＭ２ＴＭＤＯ７をＮｈｅｌ及び５ａｌ
Ｉで切断後変異導入部位を含む約２６０ｂｐのＤＮＡ断
片を分離した。この断片をｐＲＳ７ＴＭ−ｎｅｏをＮｈ
ｅｌ及び５ａｌＩで切断後分離したプロモーターを含む
ＤＮＡ断片と結合させ、欠損変異ヒトトロンボモジュリ
ン遺伝子と発現させるためのベクターｐＲ３７Ｍ２ＴＭ
−ｎｅｏを作成した（図２１）。このプラスミド・ベク
ターｐＲＳ７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏを有するＥ、ｃｏｌｉ　
Ｒ５７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏは工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている（受託番号：微工研条寄第３１７
７号）。 ［００４８］ 【実施例１８】実施例３と同様の方法で、ｐＲＳ７Ｍ２
ＴＭ−ｎｅｏを用いてＣＨＯ−Ｋｌ細胞を形質転換し、
組換え欠損変異ヒトトロンボモジュリン誘導体（以下Ｍ
ＴＭＩＯと称する）の発現細胞株ＣＨＯ−ＫＩＲ３７Ｍ
２ＴＭ　ｎｅｏ　Ｎｏ、　１４−５０　　（以下Ｎｏ、
　１４−５０と略す）を得た。 ［００４９１

【実施例１９］実施例５と同様の方法で、ＭＴＭＩＯ生
産細胞株Ｎｏ、　１４−５０をローラーボトルで培養し
、５．６及び７日目に回収した培養液を合わせ生産物回
収の材料とした。 ［００５０３ 【実施例２０】実施例１９で得られた培養液（４Ｌ）か
ら遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分）および濾過（
０，４５μｍメンブランフィルタ−使用）処理によって
固形夾雑物を取り除いた後、１．ＯＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　緩衝液（ｐＨ７，５）を添加しＩ）Ｈを７゜５に調
整した。この液を０．１５ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ　
Ｔｒ　１ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）で予め平衡化
したＱ−セファロースファーストフロー（Ｐｈａｒｍａ
ｃ　ｉａ社製）充填カラム（φ５×１０ｃｍ）に流速３
０ｍ１／分で通した。カラム流量２０ｍ１／分の前記緩
衝液２００ｍ１　で洗った後流量２０ｍ　ｌ　／分の０
．５ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　緩
衝液（ｐＨ７，５）　６００ｍ１で溶出した。 溶出画分中のＭＴＭＩＯをＥＬＩＳＡ法（二種類の坑ヒ
トトロンボモジュリン・モノクロナル抗体を用いたサン
ドイツチ法）で定量したところ、回収率は９９％であっ
た。 ［００５１１

【実施例２１］実施例２０の活性画分をアフィニティク
ロマトグラフィで精製した。予め０．１５Ｍ　ＮａＣ１
を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５で
平衡化した抗ヒトトロンボモジュリンＩｇＧ結合セルロ
ファイン（ホルミルセルロファイン（チッソ社製）に抗
ヒトトロンポモジュリンエｇＧを約５■／ｍｌゲルの割
合で結合させたもの）充填カラム（中２゜５　Ｘ９ｃｍ
　）に活性画分を流量６０ｍ　ｌ　／時で通した。この
カラムを流量６０ｍ　ｌ　／時で０．３５Ｍ　ＮａＣ１
を含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）
で洗浄した後６０ｍ１／時のチオシアン酸ナトリウムを
含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７゜５）
４００ｍｌで溶出した。この溶出液を集め限外濾過膜（
ダイアフローメンブレンＹＭ３０、φ７６ｍｍ）を装着
した限外濾過装置で約５ｍｌに濃縮した。これに１００
ｍ１の０．１５Ｍ　ＮａＣ１含有２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　緩衝液（ｐＨ７，５）を加えて再度同様に約５
ｍｌに濃縮した。この操作を更に三鷹繰り返した後、φ
４３ｍｍの限外濾過膜ＹＭ３０を用いて最終的に２２ｍ
１に濃縮した。 ［００５２］ 【実施例２２】実施例２１のようにして得られた合計５
０ット分のＭＴＭＩＯ画分を合わせて（合計容量約１０
０ｍ１　）ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。予め
ＰＢＳ　（ｌｌ中にＫＣＩ　を２００■、ＫＨ２ＰＯ４
を２００ｍｇ　、　ＮａＣｌを８ｇ、　Ｎａ２ＰＯ４・
７Ｈ２０を２．１６ｇ含有している）で平衡化したセフ
ァクリルＳ−３５−３００ＨＲ（Ｐｈａｒ　ｉａ　社製
）充填カラム（中５゜ＯＸ９５ｃｍ）にＭＴＭＩＯ画分
を流量５ｍｌ／分で通した。カラム流量５ｍ１Ｚ分のＰ
ＢＳで溶出させ、溶出液を１５ｍ１づつ分画した。 ４１番目から４７番目までのフラクションを集め、４０
ｍ１に濃縮した。こうして得たＭＴＭＩＯの精製物につ
いて、実施例７と同様の方法で逆相ＨＰＬＣを行った。 溶出条件は以下の通りである。 結果は図２２に示ように、ＭＴＭＩＯはシングルビーク
を示した。ＭＴＭＩＯについて、そのＮ末端側のアミノ
酸配列をペプチドシーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、４７０Ａ型）を用いて５番目ま
で調べたところ、主なものはＡｌａ・Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏであった。これは文献（Ｅ！１ｌＢＯＪ
、、　６゜１８９１−１８９７　（１９８７））記載の
ヒトトロンボモジュリンのＮ末端アミノ酸配列と一致す
る。 ［００５３］

【実施例２３］ＭＴＭＩＯのコンドロイチナーゼＡＢＣ
処理ＭＴＭＩＯがコンドロイチン硫酸を保持しているか
どうかを調べた。　コンドロイチナーゼＡＢＣ（プロテ
アーゼフリー、ＩＵ／バイアル；生化学工業製）凍結乾
燥粉末の入ったバイアルに６２０μｌの１．０ＭＮａＣ
１を含む５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８
，０）と３０μｍのＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を加
え酵素を溶解した。これに、３５０μＩのＭＴＭＩＯ溶
液（５，０ｍｇ／ｎ＋ｌ、　０．１Ｍ　ＮａＣＮａＣ１
−２ＯＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　緩衝液（ｐＨ７，５）　）
を加えよく撹拌した後３７℃で１６時間反応させた。反
応生成物と未反応のＭＴＭＩＯとを、実施例７と同様の
条件で逆相ＨＰＬＣを行なったところ、両者の保持時間
は一致していた（図示せず）。このことはＭＴＭＩＯは
ＴＭ−βと異なりコンドロイチナーゼＡＢＣで切断され
るグルコサミノグリカンで修飾されていないことを示し
ている。 ［００５４］ 【実施例２４］　ＭＴＭＩＯの血中半減期９−１０週令
のウィスター系ラット（雄、２５０ｇ前後）にベンドパ
ルビタールで麻酔後、ＭＴＭＩＯを投与量１■、・′驕
で大腿静脈から投与した。経時的に採血し、実施例１６
と同様にＥＬＩ　ＳＡ法で血中残存量を測定した。その
結果ＭＴＭＩＯの血中半減期は約７時間であった（図２
３）。 以上のように、ＴＭ−βを修飾しているコンドロイチン
硫酸が結合していると予想される部位のアミノ酸配列を
変更することにより作製した誘導体ＭＴＭＩＯは、コン
ドロイチナーゼＡＢＣで切断されるような硫酸化グルコ
サミノグリカンで修飾されていないため、血中半減期が
長いものと考えられる。 ［００５５］ 【実施例２５］’ＭＴＭＩＯによるトロンビンのプロテ
ィンＣ活性化促進能 ４０．２０．１５．１０および５　ｎＭのＭＴＭＩＯ溶
液を作り、これを測定試料とした。この測定試料６μｍ
を、３２μｌの緩衝液Ａ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，５
％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ａ−４３７８
）　；Ｉ）Ｈ７，４）　、５０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　６　
μｍ　、３　μＭヒトプロティンＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　ＤｉａｇｎＯ３ｔｉｃａ　Ｉｎｃ、　　製）１０μｌ
に混合した。これに１００ｎｌｉｌヒトトロンビン（Ｓ
ＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｔ−３０１０；緩衝液Ａに
溶解）６μｌを添加後３７℃で１５分静置し、２０μｌ
のアンチトロンビンＩＩＩ　　（ノイアート５００倍（
ミドリ十字製）を２０ｍ１の生理食塩水で溶解後、更に
緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ＳＩＧＭＡ
社製）　、０．１Ｍ　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＣａＣｌ２；
ｐＨ８，０）で２．５倍希釈したもの）および２０μｌ
のヘパリン溶液（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｈ−３
１２５：　４００ｕ／ｍ１となるようゼラチンバッファ
ー（０，１％ゼラチン（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号
Ｇ−２５００）　、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、０．
ＩＭ　ＮａＣ１，０，０２％ＮａＮ３：　ｐＨ７，５）
で濃度を調整したもの）を加えた。　充分に混合した後
１００μｌのＳ−２３６６（第−化学二ゼラチンバッフ
ァーで２．０ｍＭに調整した後緩衝液Ｂで０．４ｍＭと
したもの）を加えＶｍａｘ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄ
ｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて、ここで生成した活性型プ
ロティンＣによって起こる単位時間当たりの４０５ｎｍ
での吸光度の変化を測定することにより測定試料中のＭ
ＴＭＩＯの補酵素活性を調べた。生成した活性化プロテ
ィンＣによって起こる１分間当たりの吸光度（○Ｄ４０
５）の変化を図２４に示す。図に示すように、ＭＴＭＩ
ＯはトロンビンによるプロティンＣ活性化を促進してい
た。 ［００５６］ 【実施例２６］　ＭＴＭＩＯの抗凝固活性の測定５４ｎ
Ｍウシトロンビン（表２中でＴと略す）の生理食塩水溶
液（持出製薬製）１００μ！、ウシフィブリノーゲン（
タイプ２　：　３ｍｇ／１１１１．２０ｍ１ｉｌ　Ｔｒ
ｉｓ−ＭＣＩ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５：第
−化学薬品製）１００μｌおよび０．９％ＮａＣｌ、１
ｍｇ／’ｍｌ　ＢＳＡ、０．１％ルブロールＰＸに溶解
した０、５４，１０８あるいは１６２ｎＭのＭＴＭＩＯ
溶液１００μｍを混合して反応を開始し、凝固までの時
間を測定した。測定は血液凝固自動測定器クロチックＩ
Ｉ　（メテク社製）を使用して行った。その結果は次の
通りである。数値の単位は秒で示しである。 ［００５７］ 【表２】 ［００５８１表に示すように、ＭＴＭＩＯはトロンビン
の凝固活性を抑制していた。 ［００５９］

【発明の効果】以上のように、本発明の組換ヒトトロン
ボモジュリン誘導体は、硫酸化グルコサミノグリカンが
付加しないようにアミノ酸配列を変更した新規構造の組
換ヒトトロンボモジュリン誘導体であり、ＤＮＡ配列を
改変しないで作られた従来の組換ヒトトロンボモジュリ
ンに比べ、血中半減期が長い。一方、従来の組換ヒトト
ロンボモジュリンと同様、トロンビンの凝固活性を抑制
する能力と、トロンビンによるプロティンＣ活性化に対
する促進能は失われていない。従って、本発明の組換ヒ
トトロンボモジュリン誘導体（ＭＴＭＩＯ）は、新たな
抗凝固薬として有用性が高い。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトトロンボモジュリン遺伝子を含んだプラス
ミドｐ７ＴＭＯ１の構築図である。

【図２】５′非コード領域をほぼ取除いた全長ヒトトロ
ンボモジュリン遺伝子を有するプラスミドｐ７ＴＭ１７
の構築図である。

【図３】全長ヒトトロンボモジュリン遺伝子にターミネ
ータ配列が結合されているプラスミドｐ７ＴＭ１９の構
築図である。

【図４】プラスミドｐ７ＴＭ１９より得た部分長ヒトト
ンボモジュリン遺伝子を有するプラスミドｐＴＭｓ０７
の構築図である。

【図５】プラスミドｐＤ−ｇｐ　ｔＢ−８４の構築説明
図である。

【図６】プラスミドｐＴＥＮ−ｇｐｔＢ−２３の構築説
明図である。

【図７】プラスミドｐＮ−ｇｐｔＢ−１６の構築説明図
である。

【図８】マーカー遺伝子であるｎｅｏ’を含むプラスミ
ドｐＢ−ｎｅｏの構築説明図である。

【図９】ヒトトロンボモジュリン発現ベクターｐＲＳ７
ＴＭ−ｎｅＯの構築説明図である。

【図１０】ヒトトロンボモジュリン生産細胞の培養液の
Ｑ−セファロース・カラムクロマトグラムの溶出パター
ン図である。

【図１１】組換ヒトトロンボモジュリンの活性物質ＴＭ
−α、ＴＭ−βの酸性条件下における逆相ＨＰＬＣによ
る溶出パターン図である。図中（Ａ）はＴＭ−αの、（
Ｂ）はＴＭ−βの溶出パターン図を示す。

【図１２］ＴＭ−βの弱アルカリ条件下における逆相Ｈ
ＰＬＣによる溶出パターン図である。 【図１３］ＴＭ−βのイオン交換クロマトグラムの溶出
パターン図である。 【図１４］ＴＭ−βをコンドロイチナーゼＡＢＣ処理し
て得た不飽和三糖（ΔＤｉ−ＸＳ）のＨＰＬＣ溶出パタ
ーン図である。 【図１５］ＴＭ−βをコンドロイチナーゼＡＢＣ処理し
て得た不飽和三糖（ΔＤｉ−ＸＳ）に、ΔＤｉ−４５を
混合して行なった？ＬＣ溶出パターン図である。 【図１６］ＴＭ−βをコンドロイチナーゼＡＣＩフラボ
処理して得た不飽和三糖のＨＰＬＣ溶出パターン図であ
る。 【図１７】ΔＤ　１−ＸＳ及び標準試料などをコンドロ
ー４−スルフアターゼ処理したもののＨＰＬＣ溶出パタ
ーン図である。

【図１８１ＴＭ−βによるトロンビンのプロティンＣ活
性化促進効果を示す図である。 【図１９】コンドロイチナーゼＡＢＣ処理したＴＭ−β
および未処理ＴＭ−βのラット血中濃度半減期を示す図
である。図中、−〇−は未処理ＴＭ−βの場合、−・−
はコンドロイチナーゼＡＢＣ処理ＴＭ−βの結果を示す
。

【図２０】部分長ヒトトンボモジュリン遺伝子部分に部
分的特異変異を導入したプラスミドｌ）Ｍ２ＴＭＤＯ７
の構築説明図である。

【図２１】ヒトトロンボモジュリン誘導体の発現ベクタ
ーｐＲ３７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏの構築説明図である。

【図２２】本発明による組換ヒトトロンボモジュリン誘
導体ＭＴＭＩＯの酸性条件下における逆相ＨＰＬＣによ
る溶出パターン図である。

【図２３】本発明による組換ヒトトロンボモジュリン誘
導体ＭＴＭＩＯのラット血中濃度半減期を示す図である
。投与３分後の血中濃度を１００％とした時の相対的残
余量で表わしである。

【図２４】本発明による組換ヒトトロンボモジュリン誘
導体ＭＴＭＩＯによるトロンビンのプロティンＣ活性化
促進効果を示す図である。

【図３】

【図５】

【図９】

【図１８】

【図２４】

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトトロンボモジュリンのアミノ酸４７２
   番目から４７６番目のセリン・グリシン・セリン・グリ
   シン・グルタミン酸部分及びその周辺の連続したアミノ
   酸配列が、アミノ酸を除去・付加或いは置換することに
   より変更され、コンドロイチナーゼＡＢＣで切断される
   硫酸化グルコサミノグリカンで修飾されなくされた組換
   ヒトトロンボモジュリン誘導体
2. 【請求項２】ヒトトロンボモジュリンを構成する領域の
   内、アミノ末端領域とＥＧＦ様領域およびＯ−グリコシ
   ル化部位領域より成り、且つアミノ酸４７２番目から４
   ７６番目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グル
   タミン酸部分及びその周辺の連続したアミノ酸配列が、
   アミノ酸を除去・付加或いは置換することにより変更さ
   れ、コンドロイチナーゼＡＢＣで切断される硫酸化グル
   コサミノグリカンで修飾されなくされた組換ヒトトロン
   ボモジュリン誘導体
3. 【請求項３】ヒトトロンボモジュリンを構成する領域の
   内、細胞膜貫通領域および細胞質内領域を欠失した領域
   からなり、且つアミノ酸４７２番目から４７６番目のセ
   リン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミン酸部分
   及びその周辺の連続したアミノ酸配列が、アミノ酸を除
   去・付加或いは置換することにより変更され、コンドロ
   イチナーゼＡＢＣで切断される硫酸化グルコサミノグリ
   カンで修飾されなくされた組換ヒトトロンボモジュリン
   誘導体
4. 【請求項４】ヒトトロンボモジュリンを構成する領域の
   内、Ｎ末端より１番目のアラニンより４９１番目のアラ
   ニンまでを含み、且つアミノ酸４７２番目から４７６番
   目のセリン・グリシン・セリン・グリシン・グルタミン
   酸部分及びその周辺の連続したアミノ酸配列が、アミノ
   酸を除去・付加或いは置換することにより変更され、コ
   ンドロイチナーゼＡＢＣで切断される硫酸化グルコサミ
   ノグリカンで修飾されなくされた組換ヒトトロンボモジ
   ュリン誘導体
5. 【請求項５】プラスミドｐＲＳ７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏ
6. 【請求項６】Ｅ．ｃｏｌｉ　ＲＳ７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏ
7. 【請求項７】プラスミドｐＲＳ７Ｍ２ＴＭ−ｎｅｏで形
   質転換された培養細胞