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KR20110114587A - 세린 프로테아제 유도체 및 혈액응고 장애의 치료 또는 예방의 용도 - Google Patents

세린 프로테아제 유도체 및 혈액응고 장애의 치료 또는 예방의 용도 Download PDF

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KR20110114587A
KR20110114587A KR1020117016908A KR20117016908A KR20110114587A KR 20110114587 A KR20110114587 A KR 20110114587A KR 1020117016908 A KR1020117016908 A KR 1020117016908A KR 20117016908 A KR20117016908 A KR 20117016908A KR 20110114587 A KR20110114587 A KR 20110114587A
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KR
South Korea
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seq
factor
protein
chimeric
substituted
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Ceased
Application number
KR1020117016908A
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English (en)
Inventor
올리비에 크리스토프
쎄실 드니스
지슬랜느 슈렐
뽈 그겡
Original Assignee
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
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Filing date
Publication date
Priority claimed from EP08305990A external-priority patent/EP2199387A1/en
Application filed by 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) filed Critical 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
Publication of KR20110114587A publication Critical patent/KR20110114587A/ko
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Abstract

본 발명은 제X 인자의 활성화 펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체에 관한 것으로서, 상기 유도체의 반감기를 개선시키기 위한 것이다. 바람직하게는, 상기 키메라 유도체는 단백질 C 및 제X 인자 유도체이다. 본 발명은 또한 혈액응고 장애의 치료 또는 예방을 위한 상기 유도체에 관한 것이다.

Description

세린 프로테아제 유도체 및 혈액응고 장애의 치료 또는 예방의 용도{SERINE PROTEASE DERIVATIVES AND USES IN THE PREVENTION OR THE TREATMENT OF BLOOD COAGULATION DISORDERS}
본 발명은 제X 인자의 활성화 펩티드, 및 세린 프로테아제 유도체, 특히 단백질 C, 제IX 인자 및 제X 인자 유도체의 반감기 및 회수를 개선하기 위한 이의 용도, 및 단백질 C, 제IX 인자 및 제X 인자 관련 장애, 특히 혈액응고 장애의 치료 또는 예방을 위한 상기 유도체의 용도에 관한 것이다.
혈액응고는 혈관 손상에 대응하여 발생하는 복합적이고 주요한 과정이다. 이는 출혈을 멈추고 손상된 혈관의 회복을 시작하는 혈전의 형성으로 이루어지며; 이의 벽은 혈전을 포함하는 피브린 및 혈소판에 의해 커버된다. 상기 과정은 손상 이후에 거의 즉시 시작된다.
혈액응고 과정에는 두 개 유형의 성분, 즉 혈소판으로 지칭되는 세포 성분과 응고 인자로 지칭되는 단백질 성분이 관여된다. 혈소판은 손상된 부위에서 즉시 플러그(plug)를 형성하며; 이는 일차적 지혈이라고 지칭된다. 이차적 지혈은 동시에 발생하며: 응고 인자 또는 응혈 인자라고 지칭되는 혈장 내 단백질이 복잡한 캐스케이드에서 반응하여, 혈소판 플러그를 강화시키는 피브린 스트랜드를 형성한다.
이차적 지혈의 응고 캐스케이드는 2개의 경로, 즉 접촉 활성화 경로라고도 불리우는 내재성 경로 및 조직 인자 경로라고도 불리우는 외인성 경로로 나뉘어진다. 다수의 응고 인자들이 관여될 뿐만 아니라, 보조인자와 조절인자가 과정을 정확하게 유지하기 위해 관여된다.
예를 들어, 단백질 C는 "항응고 경로"라고 지칭되는 응고 조절의 주요 메카니즘의 필수적인 인자이다. 단백질 C의 활성 형태(활성화 단백질 C)는 세린 프로테아제이며, 이는 다른 보조인자(단백질 S)와 연관될 때 트롬빈의 대량 생성에 필수적인 응혈 캐스케이드의 2개의 인자, 즉 제Va 인자 및 제VIIIa 인자를 분해한다. 상기 인자들의 파괴는 형성되는 트롬빈의 양을 음성적으로 조절하며, 이는 항응고 효과를 가져온다. 상기 단백질은 특히 다음과 같은 다면발현적인 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다: 항혈전 활성(Taylor et al, 1987; Gruber et al, 1990; Chesebro et al, 1992; Hanson et al, 1993; Arnljots et al, 1994; Sakamoto et al, 1994, Jang et al, 1995, Kurz et al, 1997; Gresele et al, 1998; Mizutani et al, 2000; Bernard et al 2001) 뿐만 아니라 항-염증 활성(Emson, 2000), 항-아폽토틱 활성(Joyce et al, 2001) 및 프로-피브리노용해 활성(Comp et al, 1981; Rezaie, 2001).
제IX 인자(하기에서는 FIX라고 언급함)는 혈액응고의 필수적인 세린 프로테아제 중 하나이다. 상기 단백질의 결핍은 혈우병 B라고 불리우는 출혈 장애를 야기한다. 혈액응고 동안, 활성화된 FIX(FIXa)는 이의 활성화된 보조인자인 제VIIIa 인자(하기에서는 FVIIIa라고 언급함)와 결부되며, 이는 특이적 기질 제X 인자(하기에서는 FX라고 언급함)를 이의 활성화 유도체인 활성화된 제X 인자(하기에서는 FXa라고 언급함)로 전환시킨다.
제X 인자는 응혈 캐스케이드의 또다른 필수적인 인자이다. FX의 활성화된 형태(FXa)는 그의 보조인자(응혈 제Va 인자)와 결부되어 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시킬 수 있는 유일한 세린 프로테아제이다. 또한, 수동적인 방관성분으로서 오래 고려되어온 제X 인자는 이의 2개의 주요 수용체, 즉 프로테아제-활성화 수용체-1(PAR-1) 및 PAR-2의 활성화를 통해 매우 다양한 세포 유형들에 대해 직접적인 참가성분으로서 나타난다. 최근의 발견에 따르면, PAR-2는 응고와 질환의 진행 사이의 접점을 조정하는 중요한 매개체로서 제X 인자에 대한 포인트와 섬유증식성 질환, 예컨대 섬유증, 조직 재형성 및 암에서 중요한 역할을 한다는 점이 제안되었다(Borensztajn et al., 2008).
단백질 C, 제IX 인자 및 제X 인자는 각각 간에서 생성된 62 kDa, 55 kDa 및 59 kDa의 당단백질이다. 이들이 혈장으로 분비되기 전에, 이들의 폴리펩티드 사슬은 기능적 효소 전구체가 되기 위해 수개의 후-번역 성숙을 받는다.
2개의 지모겐인 단백질 C와 제X 인자는 아미노-말단 경쇄와 카르복시-말단 중쇄로 구성되며, 이는 펩티드 사슬의 절단으로부터 생성되며, 여기에서 경쇄와 중쇄는 이황화 다리에 의해 연결된다. 지모겐 제IX 인자는 단쇄 당단백질이다.
대부분의 세린 프로테아제 전구체들처럼, 단백질 C, 제IX 인자 및 제X 인자는 촉매적 활성이 결핍된 지모겐이다. 이의 활성화는 중쇄에서 단백질가수분해 절단의 결과이다. 단백질 C에서, 이러한 절단은 중쇄의 N-말단 끝에서 발생하며, 이는 12개 아미노산의 "활성화" 펩티드를 방출시킨다. 제X 인자에서, 이러한 절단은 지모겐의 Arg193 잔기와 Ile194 잔기 사이에서 발생하며, 이는 또한 52개 아미노산의 "활성화" 펩티드를 방출시킨다. 제IX 인자에서, 2개의 절단은 전구체 분자의 내부 영역으로부터 분자량이 대략적으로 11 kDa와 같은 활성화 펩티드를 또한 방출시킨다.
혈액응고는 출혈 또는 응혈의 임의의 위험을 피하기 위하여 잘 조절되어 왔다. 따라서, 혈액응고 과정의 탈조절은 심각한 장애, 예컨대 출혈(출혈 위험의 증가) 및 혈전증(응혈 위험의 증가)을 야기한다. 응혈 위험의 증가에 기인한 병리에는 정맥 또는 동맥 혈전증, 특히 대구경 혈관에 발생하는 혈전증, 심근경색, 혈전성 질환, 폐색전증, 혈전용해 또는 혈관형성술 이후의 관상동맥 재폐색, 및 단백질 C 유전자 또는 트롬보모듈린에 영향을 미치는 유전 이상을 갖는 환자의 응혈 이상과 같은 심각한 장애가 포함된다. 항응고는 혈전증(혈액 응고가 부적절하게 혈관 내에서 나타남)을 막기 위하여 사람들에게 제공된다. 이는 심부 정맥 혈전증, 폐색전증, 심근경색 및 뇌졸중에 취약한 대상체에게서 일차 및 이차 예방에 유용하다. 출혈은 혈전색전증 복합증의 치료 및 예방에 있어서 경구 항응고의 사용의 가장 심각한 문제이다. 와파린 또는 헤파린에 의해 항응고된 개체들은 출혈을 일으키거나 수술을 받게 된다면 각각 비타민 K 또는 프로타민과 같은 특이적 해독제로 처치되는 것이 통상적이다. 불행하게도, 와파린, 헤파린, 비타민 K 및 프로타민의 치료 작용은 그의 사용이 문제시되는 불리한 부작용과 결부된다. 반면, 특이적이고 효과적인 해독제는 저분자량 헤파린(LMWH) 또는 새로운 경구 항응고 표적 인자 Xa(fXa)의 항응고 효과의 역전을 위해 이용할 수 없다(문헌 [Harenberg, 2008], [Bauer, 2008], [Khoo et al, 2009] 참조). 상기 새로운 항응고 치료법들이 사용될 때, 중대한 출혈이 관찰될 수 있다. 따라서, 출혈을 제어하기 위해 기계적인 측면과 전신적인 측면 모두에서 즉각적이고 적절한 조치가 필요하다. 여기에는 항응고 치료법의 중단이 포함되며, 가능하다면 이용가능하고 특이적인 역전 제제를 사용하여 항응고 효과의 역전을 포함한다. 이러한 항응고에 대한 특이적 해독제에 대한 필요성이 현재 존재한다.
다른 한편으로, 출혈성 유형의 병리에는 특히 혈우병 A 또는 B(각각 제VIII 인자 및 제IX 인자의 결함)가 포함된다. 이러한 심각한 질환들은 치료를 위해 통상적으로 사용되는 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 동종-항체를 중화시키는 억제제의 존재에 의해 종종 문제가 된다.
상기 병리에 대한 치료를 개선할 필요성이 현재 존재한다.
치료의 첫번째 전략은 조절 및 응혈 캐스케이드의 결핍 단계들을 건너뛰는 것이다. 현재 치료를 개선시키기 위한 또다른 전략은 사용된 화합물, 주로 혈장에서 용이하게 중화되는 단백질의 반감기를 개선시키는 것이다. 치료를 개선시키기 위한 또다른 접근법은 자가-증폭 시스템 또는 역-조절을 재설정하는 것이다.
단백질 C 결함과 같은 응고과잉 장애에 대해 투여되는 치료는 단백질 C, 활성화 단백질 C, 단백질 C 유도체 등이다. 혈우병에 대한 현재 치료는 혈우병 A 및 B에 대해 각각 제VIII 인자 또는 제IX 인자의 투여이다.
상기 치료들은 특히 화합물의 짧은 반감기에 기인한 반복적인 주사의 필요성 때문에 비용이 많이 들며, 혈우병 A 및 B의 치료를 위해 통상적으로 사용되는 제VIII 인자 또는 제IX인자에 대한 동종항체의 중화 또는 억제제의 발달과 같은 한계점을 나타낸다. 또한, 혈우병 B를 치료하기 위한 재조합 단백질, 특히 제IX 인자의 투여는 혈장 유도 산물의 투여에 비해 더 낮은 회수 때문에 저해된다는 점이 관찰되었다.
잠재적인 해결방안이 새로운 치료 전략으로서 제안되어왔다. 특히, WO03035861 특허출원에는 단백질 C 및 제X 인자의 트롬빈-절단가능 키메라 유도체에 대해 기재되어 있다.
그러나, 이러한 화합물들의 짧은 반감기는 혈액응고 장애에 대한 사용을 제한한다. 본 발명은 이러한 기술적 문제점을 해결하기 위한 새로운 접근법을 제안한다.
본 발명의 요약
본 발명은, 39 또는 49 위치의 아스파라긴이 N-글리코실화된, 서열번호 2(제X 인자의 활성화 펩티드)의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 PP에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 세린 프로테아제 지모겐, 예를 들어 제IX 인자, 제X 인자, 단백질 C와 같은 순환 단백질의 회수 및 반감기를 개선하기 위한 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 융합 단백질 FP에 관한 것이다:
- 제1 폴리펩티드 PP, 및
- 서열번호 4의 위치 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드.
본 발명은 제X 인자 또는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것으로서, 상기 단백질의 천연 활성화 펩티드는 융합 단백질 FP에 의해 치환된 것이다.
본 발명은 제X 인자 또는 단백질 C의 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것으로서, 상기 단백질의 천연 활성화 펩티드는 융합 단백질 FP에 의해 치환된 것이다.
또한, 본 발명은 활성화된 제X 인자 또는 단백질 C 또는 이의 기능 보존 변이체 및 융합 단백질 FP를 포함하는 제X 인자 또는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 출혈성 유형의 응고 병리를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 항응고 표적 인자 Xa(fXa)에 의해 또는 저분자량 헤파린(LMWH)에 의해 유도된 출혈의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 응고과잉을 포함하는 병리의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 단백질 C의 키메라 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 키메라 유도체를 포함하는 혈액응고 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
제X 인자의 다른 구성물들에 대한 시험을 통해, 본 발명자는 제X 인자의 활성화 펩티드가 제X 인자의 클리어런스(clearance) 및 이의 회수(recovery) 과정에 대해 근본적인 역할을 한다는 것을 보여주었다.
특히, 본 발명자는 이러한 활성화 펩티드의 카르복시-말단의 19개의 아미노산이 제X 인자의 클리어런스의 반응속도론에서 주요한 역할을 한다는 것을 관찰하였다. 19개의 잔기의 이러한 서열은 관찰된 메카니즘에 대해 필수적인 2개의 N-글리코실화 부위를 포함한다.
정의
"기능-보존(function-conservative) 변이체"는 폴리펩티드의 전체적인 구조 및 기능을 변경시키지 않으면서 단백질 또는 효소의 특정의 아미노산 잔기가 변화된 것이며, 여기에는 아미노산이 유사한 성질들(예를 들어, 극성, 수소결합 가능성, 산성, 염기성, 소수성, 방향성 등)을 갖는 것으로 치환되는 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 보존되는 것으로 나타낸 것 외의 아미노산들은 단백질에서 다를 수 있으므로, 기능이 유사한 임의의 2개의 단백질 사이의 단백질 또는 아미노산 서열의 유사성 퍼센트는 달라질 수 있으며, 이는 예를 들어 클러스터 방법과 같은 정렬 도식에 따라 결정할 때 70 % 내지 99 %일 수 있으며, 유사성은 MEGALIGN 알고리즘에 기초한다. 또한, "기능-보존 변이체"에는, BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정될 때 60 % 이상, 바람직하게는 75 % 이상, 가장 바람직하게는 85% 이상, 훨씬더 바람직하게는 90 % 이상의 아미노산 동일성을 가지며, 비교되는 천연 또는 모 단백질과 성질 또는 기능이 동일하거나 실질적으로 유사한, 폴리펩티드가 포함된다.
2개의 아미노산 서열에서, 80 % 초과, 바람직하게는 85 % 초과, 바람직하게는 90 % 초과의 아미노산이 동일할 때, 또는 약 90 % 초과, 바람직하게는 95 % 초과의 아미노산이 유사할 때(기능적으로 동일함), "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"이다. 바람직하게는, 유사 또는 상동의 서열들은 예를 들어, GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램, 또는 임의의 서열 비교 알고리즘, 예컨대 BLAST, FASTA 등을 사용한 정렬에 의해 동정된다.
본 발명에 따르면, "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"이라는 용어는 본래 별개의 폴리펩티드를 코딩하는 둘 이상의 유전자 또는 이의 단편의 결합을 통해 생성된 단백질을 나타낸다. 상기 융합 유전자의 번역은 각각의 본래 폴리펩티드로부터 유래된 기능 특징을 갖는 단일 폴리펩티드를 생성한다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료법에서 사용되는 재조합 DNA 기술에 의해 인위적으로 제조된다. 재조합 융합 단백질은 융합 유전자의 유전공학을 통해 제조된 단백질이다. 이는 통상적으로 제1 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에서 종결 코돈을 제거하는 단계, 그 후 리게이션 또는 오버랩 신장 PCR을 통해 프레임에서 제2 단백질의 cDNA 서열을 첨부하는 단계를 포함한다. 상기 DNA 서열은 그 후 단일 단백질로서 세포에 의해 발현될 것이다. 상기 단백질은 원 단백질 모두의 전장 서열 또는 어느 하나의 단지 일부를 포함하도록 조작될 수 있다.
"회수(recovery)"라는 용어는 계산된 이론적 또는 예상의 항원 또는 활성에 대한 주입된 분자의 항원 또는 활성 수준의 퍼센트로 표현되는 값을 나타낸다.
"순환 단백질"은 신체 기관의 세포에 의해 합성되고 혈류 내에서 운반되는 단백질을 의미한다. 순환 단백질의 예에는 혈액응고 인자, 단백질 호르몬이 포함된다.
응고 인자는 일반적으로 세린 프로테아제이다. 여기에는 일부 예외가 있다. 예를 들어, 제VIII 인자 및 제V 인자는 당단백질이며, 제XIII 인자는 트랜스글루타미나제이다.
단백질 호르몬은 혈류 내로 분비되고 살아있는 동물의 내분비 기능을 갖는 단백질의 군이다.
"세린 프로테아제 지모겐(zymogen)"이라는 용어는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 이는 활성 효소가 되기 위해 절단될 필요가 있는 세린 프로테아제 효소의 불활성 전구체를 나타낸다. 본 발명에 따르면, 관심대상인 세린 프로테아제는 순환 단백질에 속하는 것으로 한정된다.
세린 프로테아제에는 활성 부위에서 아미노산 중 하나가 세린인 수개의 프로테아제들이 포함된다. 본 발명에 따르면, 관심대상인 세린 프로테아제는 제IX 인자, 제X 인자 또는 단백질 C, 특히 제X 인자 및 단백질 C일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, "세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체"라는 용어는 세린 프로테아제 지모겐 또는 이의 단편을 관심대상인 폴리펩티드와 결합하여 수득된 융합 단백질이다. 수득된 단백질은 상기 세린 프로테아제의 기능적 특징을 나타낸다.
특히, "세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체"라는 용어는 활성화된 세린 프로테아제 또는 이의 단편을 관심대상인 폴리펩티드와 융합하여 수득된 융합 단백질이다.
본 발명에 따르면, 상기 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체는 천연 세린 프로테아제 지모겐과 상이하지만, 적어도 등가의 활성을 나타낸다.
"제X 인자"라는 용어는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 이는 응고 메카니즘에 연루된 것임을 보여주는 분비된 세린 프로테아제를 나타낸다. 제X 인자는 임의의 원으로부터 유래된 것일 수 있지만, 통상적으로는 포유류(예컨대, 인간 및 비-인간 영장류) 제X 인자, 특히 인간의 제X 인자이다. 통상적으로, 인간의 제X 인자의 아미노산 서열은 서열번호 1(도 1)에 의해 제공된다.
제X 인자에 대해 아미노산 잔기의 위치를 알아내기 위한 다양한 넘버링 시스템들이 존재한다:
- 제X 인자의 cDNA로부터 추정된 서열을 참고하여 넘버링하는 시스템.
- 경쇄, 활성화 펩티드 및 중쇄를 포함하는 분비 단백질로부터 추정된 서열을 참고하여 넘버링하는 시스템: 1로 넘버링된 아미노산 잔기는 경쇄의 아미노-말단의 제일 끝의 첫번째 아미노산 잔기임. 이러한 넘버링 시스템이 사용됨.
업스트림의 아미노산 위치는 음성의 식별을 갖는다: 프로-펩티드의 C-말단 아미노산은 -1로 넘버링되며, (프리-펩티드의 아미노-말단 아미노산 잔기인) 번역 단백질의 N-말단 아미노산 잔기는 -40으로 넘버링된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 제X 인자의 서열은 5개의 다른 영역으로 나누어지며, 이는 사용된 넘버링 시스템에 따라 하기에 대응한다:
- 위치 -40 내지 -28의 프리(pre)-펩티드(또는 신호 펩티드),
- 위치 -27 내지 -1의 프로(pro)-펩티드,
- 위치 1 내지 142의 경쇄,
- 위치 143 내지 194의 활성화 펩티드,
- 위치 195 내지 448의 중쇄.
"제X 인자" 또는 "FX" 또는 "성숙(mature) FX" 또는 "지모겐 FX"라는 용어는 생성 간세포에 의한 분비 후에 제X 인자의 혈액 순환 형태를 나타낸다. 신호 펩티드는 신호 펩티다제에 의해 절단되며, 프로펩티드 서열은 성숙 N-말단 사슬의 N-말단의 첫번째 11 글루탐산 잔기에서 발생하는 감마 카르복실화 이후에 절단된다. 추가적인 처리 단계는, 사용된 넘버링 시스템에 따른 Arg142와 Ser143(도 1, 서열번호 1의 위치 182-183) 사이의 절단에 의해 발생한다. 상기 처리 단계는 또한 트리펩티드 Arg140-Lys141-Arg142(서열번호 1의 위치 180-182)의 결실을 부수적으로 야기한다. 생성된 분비 제X 인자 지모겐은 Cys132와 Cys302 사이의 이황화 다리를 통해 공유결합적으로 연결된 139개 아미노산의 N-말단 경쇄 및 306개 아미노산의 C-말단 중쇄로 구성된다. 추가적인 번역후 처리 단계는 Asp63의 베타-히드록실화 뿐만 아니라 N- 및 O-유형 글리코실화를 포함한다.
"활성화 제X 인자" 또는 "FXa"라는 용어는 응고 활성(예컨대, 트롬빈 생성)이 필요한 경우에 생성된 순환 제X 인자의 효소적으로 활성인 형태를 나타낸다. 제X 인자를 활성화시킬 수 있는 생리학적 조건하에서, Ser143 내지 Arg194의 52개 아미노산의 소위 활성화 펩티드는 Arg194에서 중쇄의 카르복시-말단을 절단함으로써 분자의 나머지가 절단된다(도 1).
본 발명에 따르면, "제X 인자" 및 "활성화 제X 인자"라는 용어는 자연적으로 발생한 제X 인자 및 활성화된 제X 인자를 포함할 뿐만 아니라 이의 기능 보존 변이체 및 개질된 형태도 포함한다. 특히, 본 발명은 제X 인자(지모겐 또는 활성화된 형태)의 기능-보존 변이체의 알려진 모든 형태, 예컨대 γ-카르복실화된 성숙 단백질을 더 우수한 수율로 수득하기 위하여 천연 제X 인자의 프로펩티드가 프로트롬빈의 프로펩티드에 의해 치환된 문헌 [Camire et al, 2000]에 기재되어 있는 변이체, 또는 제X 인자의 잔기 -2에 대응하는 코돈(ACG, 이는 서열번호 1의 위치 39의 트레오닌에 대응함)이 AGG(이는 아르기닌에 대응함)로 변화되어 프로펩티드의 정확한 절단을 허용할 수 있는 문헌 [Rudolph et al 1997]에 기재되어 있는 변이체를 포함한다.
"제X 인자의 활성화 펩티드"라는 용어는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 사용된 넘버링 시스템에 따라 제X 인자의 위치 143 내지 194의 52개 아미노산 폴리펩티드를 나타낸다(서열번호 1의 위치 183-234). 상기 용어는 자연적으로 발생한 제X 인자 활성화 펩티드 및 이의 보존적 기능 변이체와 개질된 형태를 포함할 수 있다. 본원에서 정의된 활성화 펩티드는 제X 인자의 인간 활성화 펩티드에 대응하는 것이지만, 임의의 원으로부터 유래된 것일 수 있으며, 다만 통상적으로는 포유류(예컨대, 인간 및 비-인간 영장류)의 제X 인자, 특히 인간의 제X 인자이다. 제X 인자의 인간 활성화 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 2에 의해 제공된다.
본 발명에서, 제X 인자의 활성화 펩티드의 카르복시-말단 부분의 19개 마지막 아미노산 서열은, 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열, 또는 사용된 넘버링 시스템에 따른 제X 인자의 위치 176 내지 194에 대응하는, 관심대상인 폴리펩티드에 대응한다(도 1). 또한, 상기 폴리펩티드는 PA176-194로 지칭된다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 39 및 49의 2개의 글리코실화 부위를 포함하며, 이는 사용된 넘버링 시스템에 따른 제X 인자의 위치 181 및 191에 대응한다.
"단백질 C"라는 용어는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, "항응고 경로"라고 지칭되는 응고를 조절하는 주요 메카니즘에 연루된 것임을 보여주는 분비 세린 프로테아제를 나타낸다. 단백질 C는 임의의 원으로부터 유래된 것일 수 있지만, 통상적으로는 포유류(예컨대, 인간 및 비-인간 영장류)의 단백질 C, 특히 인간의 단백질 C이다. 통상적으로, 인간 단백질 C의 아미노산 서열은 서열번호 3에 의해 제공된다.
단백질 C의 활성화 펩티드는 서열번호 3의 위치 200 내지 211에서 발견되는 12개 아미노산 폴리펩티드이다.
"단백질 C" 또는 "PC" 또는 "성숙 PC" 또는 "지모겐 PC"라는 용어는 간 생성 세포에 의한 분비 후에 단백질 C의 혈액 순환 형태를 나타낸다. 신호 펩티드는 신호 펩티다제에 의해 절단되며, 프로펩티드 서열은 성숙 N-말단 사슬의 N-말단의 첫번째 9개 글루탐산 잔기에서 발생하는 감마 카르복실화 이후에 절단된다(서열번호 3의 위치 43의 알라닌에서 시작됨). 추가적인 처리 단계는 더블렛 Lys198-Arg199(서열번호 3)의 결실에 의해 발생한다. 생성된 분비 단백질 C 지모겐은 이황화 다리를 통해 공유결합적으로 연결된 155개 아미노산의 N-말단 경쇄 및 262개 아미노산의 C-말단 중쇄로 구성된다. 추가적인 번역후 처리 단계는 Asp113의 베타-히드록실화(서열번호 3) 뿐만 아니라 N-유형 글리코실화를 포함한다.
"활성화 단백질 X" 또는 "PCa"라는 용어는 응고 활성(예컨대, 트롬빈 생성)이 필요한 경우에 생성된 순환 단백질 C의 효소적으로 활성인 형태를 나타낸다. 단백질 C를 활성화시킬 수 있는 생리학적 조건하에서, Asp200 내지 Arg211(서열번호 3)의 12개 아미노산의 소위 활성화 펩티드는 Arg211(서열번호 3)에서 중쇄의 카르복시-말단을 절단함으로써 분자의 나머지가 절단된다.
본 발명에 따르면, "단백질 C" 또는 "활성화 단백질 C"라는 용어는 자연적으로 발생한 단백질 C 및 활성화 단백질 C를 포함할 뿐만 아니라 이의 기능 보존 변이체 및 개질된 형태도 포함한다. 특히, 본 발명은 단백질 C(지모겐 또는 활성화된 형태)의 기능-보존 변이체의 알려진 모든 형태, 예컨대 Asn 355 및 371의 치환을 포함하는 항응고 활성이 더 높은 활성화 단백질 C의 유도체(미국특허 제5453373호), 및 세포보호적인 원하는 성질(항-아폽토틱, 항-신경퇴행성 장애 및 뇌졸중에 대한 보호)을 가지면서 항응고 활성이 감소된 활성화 단백질 C의 유도체(예를 들어 WO/2005/007820 참조)를 포함한다. 이러한 돌연변이체는 예를 들어 3K3A-APC 및 229/230-APC이다.
"피브리노펩티드 A"라는 용어는 당업계의 일반적인 의미를 가지며, 이는 트롬빈의 작용에 의해 피브리노겐의 α-사슬의 N-말단 분절로부터 제거된 16개 아미노산 잔기의 작은 펩티드를 나타낸다. 상기 용어는 자연적으로 발생한 피브리노펩티드 A 및 이의 보존적 기능 변이체와 개질된 형태를 포함할 수 있다. 피브리노펩티드 A는 임의의 원으로부터 유래된 것일 수 있지만, 통상적으로는 포유류(예컨대, 인간 및 비-인간 영장류)의 피브리노펩티드 A, 특히 인간의 피브리노펩티드 A이다. 통상적으로, 인간 피브리노펩티드 A의 아미노산 서열은 서열번호 4에 의해 제공된다.
본 발명에 따르면, "피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체"라는 용어는 피브리노펩티드 A 또는 이의 단편 및 피브리노펩티드 A의 카르복시-말단 부위에서 트롬빈-절단가능 부위를 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 상기 유도체는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 대해 서열번호 5(도 3A) 또는 서열번호 6(도 3B)에 의해, 그리고 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 대해 서열번호 13(도 4A) 또는 서열번호 14(도 4B)에 의해 나타내어진다.
본 발명에 따르면, "트롬빈-절단가능 부위"라는 용어는 응고의 주요 세린 프로테아제인 트롬빈에 의해 인식되고 절단될 수 있는 짧은 아미노산 서열을 나타낸다.
글리코실화는 단백질에 당류를 결합시키는 효소적 과정이다. 단백질의 글리코실화는 통상적으로 N-결합된다. "N-결합"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 성분이 부착되는 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(X가 프롤린 외의 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대해 탄수화물 성분의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 상기 트리펩티드 서열들 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. 통상적으로, 단백질에 N-결합된 올리고당류는 글루코스, 만노스 및 2개의 N-아세틸글루코사민 분자로 구성되며, 이는 이후에 갈락토스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코스 및 시알산을 포함하는 다양한 다른 단당류에 의해 신장될 수 있다.
따라서, "N-글리코실화"라는 용어는 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 아스파라긴 잔기에 대한 폴리펩티드의 N-글리코실화를 나타낸다.
가장 넓은 의미에서, "예방하는" 또는 "예방"이라는 용어는 질환 또는 상태를 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 환자에게서 질환 또는 상태의 발생을 방지하는 것을 나타낸다.
가장 넓은 의미에서, "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 상기 용어가 적용되는 장애 또는 상태, 또는 상기 장애 또는 상태의 하나 이상의 징후의 진행을 역전, 완화, 억제시키는 것을 나타낸다.
"환자"라는 용어는 혈액응고 장애를 앓거나 혈액응고 장애에 걸리기 쉬운 임의의 대상체(바람직하게는 인간)를 나타낸다.
본 발명에 따르면, "단백질 C 및 제X 인자 관련 장애"라는 용어는 제X 인자 또는 단백질 C가 연관된 임의의 병리, 특히 혈액응고 장애를 나타낸다.
본 발명에 따르면, "혈액응고 장애" 또는 "응고 장애"는 혈액응고 메카니즘의 탈조절에 기인한 임의의 병리를 나타낸다. 따라서, 여기에는 혈액응고의 과잉 및 결핍(default)과 연관된 병리가 포함된다.
과량의 혈액응고 또는 응고과잉과 연관된 병리에는 정맥 또는 동맥 혈전증, 심근경색, 혈전성 질환, 폐색전증, 관상동맥 재폐색, 및 단백질 C의 결핍증이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
혈액응고의 결핍과 연관된 병리는 출혈성 병리로 지칭되며, 이는 제VIII 인자, 제IX 인자 또는 제XI 인자 결핍을 포함한다. 상기 병리는 특히 혈우병 A 또는 B 및 자가면역 질환 또는 암과 같은 다른 병리와 결부된 자가-항체의 출현에 의해 야기된 혈우병일 수 있다.
제X 인자의 활성화 펩티드에서 유래된 폴리펩티드
본 발명의 첫번째 목적은, 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된, 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 PP에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 위치 39 및 49의 아스파라긴은 N-글리코실화된다.
일구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 32 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 31 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 30 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 29 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 28 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 27 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 26 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 25 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 24 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 23 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 22 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 21 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 20 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 19 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 18 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 17 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 16 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 15 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 14 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 13 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 12 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 11 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 10 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 9 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 8 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 7 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 6 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 5 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 4 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 3 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 위치 2 내지 52의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
선택적인 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 또다른 목적은 지모겐의 반감기, 특히 세린 프로테아제 지모겐의 반감기를 개선하기 위한 폴리펩티드 PP의 용도에 관한 것이다.
제X 인자의 활성화 펩티드에서 유래된 융합 단백질
본 발명의 또다른 목적은 하기를 포함하는 융합 단백질 FP에 관한 것이다:
- 상기 기재된 폴리펩티드 PP로 이루어진 제1 폴리펩티드, 및
- 서열번호 4의 위치 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드.
본 발명의 또다른 목적은 하기를 포함하는 융합 단백질 FP에 관한 것이다:
- 상기 기재된 폴리펩티드 PP로 이루어진 제1 폴리펩티드, 및
- 서열번호 4의 위치 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드,
여기에서,
- 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신은 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환됨, 및/또는
- 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린은 프롤린에 의해 치환됨.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드의 카르복시-말단 영역이 제2 폴리펩티드의 아미노-말단 영역에 융합된 상기 융합 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 위치 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 위치 6 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 위치 5 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 위치 4 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 위치 3 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 위치 2 내지 16의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 키메라 유도체
상기 기재된 본 발명의 폴리펩티드 및 융합 단백질은 세린 프로테아제 지모겐 또는 활성 형태, 또는 이의 단편과 융합되어, 상기 세린 프로테아제 지모겐의 반감기 및 회수를 개선할 수 있다.
본 발명자는 제X 인자의 활성화 펩티드, 특히 이의 19개의 마지막 아미노산을 포함하는 단편이 제X 인자의 긴 반감기 및 주입된 분자의 우수한 회수에서 주요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 또한, 본 발명자는 제X 인자의 활성화 펩티드 또는 이의 19개의 마지막 아미노산을 포함하는 단편이 순환 단백질과 같은 다른 단백질들의 반감기 및 회수를 증가시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.
따라서, 본 발명의 또다른 목적은 상기 기재된 폴리펩티드 PP 및 관심대상인 단백질을 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
상기 관심대상인 단백질은 혈액 내에서 짧은 반감기를 갖는 효소 또는 다른 단백질일 수 있다. 특히, 이는 순환 단백질, 예컨대 세린 프로테아제 또는 단백질 호르몬일 수 있다.
통상적으로, 상기 관심대상인 단백질은 단백질 C, 제VII 인자, 활성화된 제VII 인자, 제IX 인자, 인슐린, 에리스로포이에틴, 가용성 P-셀렉틴 당단백질 리간드 등일 수 있지만, 천연 제X 인자는 아니다.
상기 단백질은 이의 지모겐 형태 또는 이의 활성화된 형태로 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드 PP가 카르복시-말단의 끝에서 관심대상인 단백질에, 아미노-말단의 끝에서 관심대상인 단백질에, 또는 관심대상인 단백질의 아미노산 서열 내로 융합된 상기 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드 PP가 카르복시-말단의 끝에서 관심대상인 단백질에, 아미노-말단의 끝에서 관심대상인 단백질에, 또는 관심대상인 단백질의 아미노산 서열 내로 융합된 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 관심대상인 지모겐의 활성화 펩티드가 폴리펩티드 PP에 의해 치환된 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드 PP가 천연 활성화 펩티드의 위치 부위에서 관심대상인 단백질의 활성화된 형태에 융합된 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드 PP가 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열로 이루어지고 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
통상적으로, 본 발명은 상기 폴리펩티드 PP가 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열을 포함하고 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화되고 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 아미노산의 최대 길이를 갖는 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 폴리펩티드 PP가 제X 인자의 천연 활성 펩티드(서열번호 2)로 이루어지지 않은 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 특허출원 WO2006018204에 기재된 단백질이 아닌 상기 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 펩티드의 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지지 않은, 단백질 C 및 폴리펩티드 PP를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열로 이루어지고 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된, 단백질 C 및 폴리펩티드 PP를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 단백질 C의 활성화 펩티드가 폴리펩티드 PP에 의해 치환되고, 상기 펩티드의 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지지 않은, 단백질 C를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 단백질 C의 활성화 펩티드가 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 PP에 의해 치환되고 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된, 단백질 C를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 펩티드의 서열이 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지지 않은, 폴리펩티드 PP 및 활성화 단백질 C를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 PP 및 활성화 단백질 C를 포함하는 키메라 단백질에 관한 것이다.
바람직하게는, 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열은 활성화 단백질 C의 중쇄의 N-말단 부분에 융합된다.
본 발명은 폴리펩티드 PP를 포함하는 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체에 관한 것이다.
특히, 상기 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체는 단백질 C 및 제X 인자의 키메라 유도체이다. 특히, 특허출원 WO03035861 또는 문헌 [Louvain-Quintard et al., 2005]에 기재되어 있는 키메라 트롬빈-절단가능 유도체가 사용되고 변형된다.
따라서, 본 발명은 상기 단백질의 천연 활성화 펩티드가 상기 기재된 융합 단백질 FP에 의해 치환된 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 기능 보존 변이체가 본 발명에 또한 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 천연 제X 인자의 중쇄의 3개의 처음 잔기에 대응하는 아미노산(Ile-Val-Gly, 서열번호 1의 위치 235-237)이 문헌 [Toso R and al, 2008]과 특허출원 WO03035861 및 WO04005347에 기재되어 있는 변형에 따라 변형될 수 있는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 하기를 특징으로 하는 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 서열번호 1의 위치 235의 잔기에 대응하는 이소류신이 알라닌, 세린 또는 류신에 의해 치환될 수 있음;
- 서열번호 1의 위치 236의 잔기에 대응하는 발린이 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환될 수 있음.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 추가적으로 피브리노펩티드 A의 3개의 마지막 잔기에 대응하는 아미노산(Gly-Val-Arg, 서열번호 4의 위치 14-16)이 또한 문헌 [Gustafsson D and al, 2004] 및 특허출원 WO04005347에 기재되어 있는 변형에 따라 변형될 수 있는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 하기를 특징으로 하는 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신이 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환될 수 있음;
- 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린이 프롤린에 의해 치환될 수 있음.
본 발명에 따르면, 상기 변형은 트롬빈에 의한 절단 또는 활성화된 제X 인자 유도체의 효능을 개선하기 위해 사용되며, 본 발명의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 활성을 변화시키지 않는다.
따라서, 본 발명은 단백질의 천연 활성화 펩티드가 하기를 포함하는 융합 단백질에 의해 치환된 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 폴리펩티드 PP, 및
- 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열에 의해 정의되는 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체.
일구현예에서, 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈 절단가능 유도체는 상기 폴리펩티드가 제X 인자의 천연 활성화 펩티드(서열번호 2)인 것을 특징으로 한다.
또다른 구현예에서, 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈 절단가능 유도체는 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체가 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 군에서 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 특징으로 하는 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 상기 폴리펩티드는 제X 인자의 천연 활성화 펩티드(서열번호 2)임, 및
- 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체는 아미노산 서열 DFLAEGGGVRIVG(서열번호 7)에 의해 정의됨.
또한, 본 발명은 상기 단백질의 천연 활성화 펩티드가 융합 단백질 FP에 의해 치환된 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 기능 보존 변이체가 본 발명에 또한 포함된다.
특정 구현예에서, 상기 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 있어서, 천연 단백질 C의 중쇄의 3개의 처음 잔기에 대응하는 아미노산(Leu-Ile-Asp, 서열번호 3의 위치 212-214)이 특허출원 WO03035861에 기재되어 있는 변형에 따라 변형될 수 있다.
특히, 본 발명의 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 있어서:
- 서열번호 3의 위치 212의 잔기에 대응하는 류신이 알라닌 또는 세린에 의해 치환될 수 있으며;
- 서열번호 3의 위치 213의 잔기에 대응하는 이소류신이 페닐알라닌에 의해 치환될 수 있으며;
- 서열번호 3의 위치 214의 잔기에 대응하는 아스파르테이트가 글리신에 의해 치환될 수 있다.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 추가적으로 피브리노펩티드 A의 3개의 마지막 잔기에 대응하는 아미노산(Gly-Val-Arg, 서열번호 4의 위치 14-16)이 또한 문헌 [Gustafsson D and al, 2004] 및 특허출원 WO04005347에 기재되어 있는 변형에 따라 변형될 수 있는, 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 하기를 특징으로 하는 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신이 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환될 수 있음;
- 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린이 프롤린에 의해 치환될 수 있음.
본 발명에 따르면, 상기 변형은 트롬빈에 의한 절단 또는 활성화된 단백질 C 유도체의 효능을 개선하기 위해 사용되며, 본 발명의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 활성을 변화시키지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 단백질의 천연 활성화 펩티드가 하기를 포함하는 융합 단백질에 의해 치환된 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 폴리펩티드 PP, 및
- 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 의해 정의되는 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체.
일구현예에서, 상기 폴리펩티드는 제X 인자의 천연 활성화 펩티드(서열번호 2)이다.
또다른 구현예에서, 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체는 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26의 군에서 선택된 아미노산 서열에 의해 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 특징으로 하는 상기 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 상기 폴리펩티드는 제X 인자의 천연 활성화 펩티드(서열번호 2)임, 및
- 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체는 아미노산 서열 DFLAEGGGVRLID(서열번호 15))에 의해 정의됨.
본 발명의 추가적인 목적은 폴리펩티드 PP가 천연 단백질 C의 활성화 펩티드의 아미노-말단 부분에서 융합된 단백질 C의 키메라 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 상기 활성화된 세린 프로테아제 또는 이의 기능 보존 변이체 및 폴리펩티드 PP를 포함하는 것을 특징으로 하는 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 상기 활성화된 세린 프로테아제 또는 이의 기능 보존 변이체 및 융합 단백질 FP를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심대상인 세린 프로테아제의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 활성화된 제X 인자 또는 이의 기능 보존 변이체 및 융합 단백질 FP를 포함하는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 융합 단백질 FP의 카르복시-말단 부분이 활성화된 제X 인자의 중쇄의 아미노-말단 부분에 융합된 융합 단백질 FP 및 활성화된 제X 인자 또는 이의 기능 보존 변이체를 포함하는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 일부 아미노산들은 본 발명의 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 활성을 개선시키기 위하여 치환, 결실 또는 부가될 수 있다. 특히, 피브리노펩티드 A의 3개의 마지막 아미노산(서열번호 4의 아미노산 서열의 위치 14 내지 16) 및 활성화된 제X 인자의 중쇄의 3개의 처음 아미노산(서열번호 1의 아미노산 서열의 위치 235 내지 237) 에 대응하는 아미노산은 상기 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
특히, 본 발명은 하기를 특징으로 하는 본 발명의 상기 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다:
- 서열번호 1의 위치 235의 잔기에 대응하는 이소류신은 알라닌, 세린 또는 류신에 의해 치환될 수 있음;
- 서열번호 1의 위치 236의 잔기에 대응하는 발린은 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환될 수 있음;
- 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신은 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환될 수 있음;
- 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린은 프롤린에 의해 치환될 수 있음.
본 발명에 따르면, 상기 변형은 트롬빈에 의한 절단 또는 활성화된 제X 인자 유도체의 효능을 개선하기 위해 사용되며, 본 발명의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 활성을 변화시키지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 활성화 단백질 C 또는 이의 기능 보존 변이체 및 융합 단백질 FP를 포함하는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 융합 단백질 FP의 카르복시-말단 부분이 활성화 단백질 C의 중쇄의 아미노-말단 부분에 융합된 융합 단백질 FP 및 활성화 단백질 C 또는 이의 기능 보존 변이체를 포함하는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 일부 아미노산들은 본 발명의 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체를 개선시키기 위하여 치환, 결실 또는 부가될 수 있다. 특히, 활성화 단백질 C의 중쇄의 3개의 처음 아미노산(서열번호 3의 위치 212-214)에 대응하는 아미노산은 상기 기재된 바와 같이 변형될 수 있다.
특히, 본 발명의 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체에서:
- 서열번호 3의 위치 212의 잔기에 대응하는 류신은 알라닌 또는 세린에 의해 치환될 수 있으며;
- 서열번호 3의 위치 213의 잔기에 대응하는 이소류신은 페닐알라닌에 의해 치환될 수 있으며;
- 서열번호 3의 위치 214의 잔기에 대응하는 아스파르테이트는 글리신에 의해 치환될 수 있으며;
- 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신은 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환될 수 있으며;
- 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린은 프롤린에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 변형은 트롬빈에 의한 절단 또는 활성화 단백질 C 유도체의 효능을 개선하기 위해 사용되며, 본 발명의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체의 활성을 변화시키지 않는다.
핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포
본 발명의 추가적 목적은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 키메라 유도체를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
일구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소와 같은 발현 산물을 "인코딩하는" 서열 또는 "코딩 서열"은, 발현될 때 상기 RNA, 폴리펩티드, 단백질 또는 효소를 생성하는 뉴클레오티드 서열, 즉 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 단백질에 대한 코딩 서열은 개시 코돈(일반적으로 ATG) 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
이러한 핵산 분자들은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 통상의 방법에 의해 수득될 수 있으며, 특히 천연 단백질을 인코딩하는 유전자의 부위 특이적 돌연변이유도에 의해 수득될 수 있다.
통상적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자이며, 이는 적합한 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 에피좀, 인공염색체, 파지 또는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가적 목적은 본 발명의 핵산 분자가 전사를 조절하는 적합한 성분(특히 프로모터, 인핸서 및 선택적으로는 터미네이터) 및 선택적으로 번역을 조절하는 적합한 성분과 결합된 벡터 및 발현 카세트에 관한 것이며, 또한 본 발명에 따른 핵산 분자가 삽입된 재조합 벡터에 관한 것이다. 상기 재조합 벡터는 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.
"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예컨대, 전사 및 번역)을 촉진시키기 위하여 DNA 또는 RNA 서열(예컨대, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 매개체를 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 키메라 유도체를 인코딩하는 유전자가 삽입되고 발현될 수 있는 한, 동물 세포에 대한 임의의 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 pAGE107(Miyaji H et al. 1990), pAGE103(Mizukami T et al. 1987), pHSG274(Brady G et al. 1984), pKCR(O'Hare K et al. 1981), pSG1 베타 d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등이 포함된다.
플라스미드의 다른 예에는 복제 개시점을 포함하는 복제 플라스미드, 또는 통합 플라스미드, 예를 들어 pUC, pcDNA, pBR 등이 포함된다.
바이러스 벡터의 다른 예에는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스 및 AAV 벡터가 포함된다. 상기 재조합 바이러스는 당업계에 알려진 기법, 예컨대 패키징 세포의 형질감염, 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스에 의한 일시적 형질감염에 의해 제조될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 통상적인 예에는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등이 포함된다. 상기 복제-결함 재조합 바이러스를 제조하기 위한 상세한 프로토콜은 예를 들어 WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 찾을 수 있다.
동물 세포에 대한 발현 벡터에서 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예에는 SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(Mizukami T. et al. 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(Kuwana Y et al. 1987), 면역글로불린 H 사슬의 프로모터(Mason JO et al. 1985) 및 인핸서(Gillies SD et al. 1983) 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 생체내 또는 생체외 유전자 치료법에서 사용될 수 있는, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 유전자 운반 시스템을 포함한다. 여기에는 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스로부터 유래된 것과 같은 바이러스의 운반 벡터가 포함되며, 이는 유전자 치료법에 통상적으로 사용된다. 또한, 여기에는 비-바이러스 유전자 운반 매개체 및 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 유전자 운반 시스템이 포함된다. 비-바이러스 유전자 운반 매개체의 예에는 폴리에틸렌이민, 시클로덱스트린, 히스티딘/리신(HK) 폴리머 등과 같은 폴리머 및 리포좀이 포함된다.
본 발명의 주제는 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자에 의해 유전적으로 형질전환된 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다.
"형질전환"이라는 용어는 숙주 세포에 "외래"(즉, 외재성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열이 도입되는 것을 의미하며, 상기 숙주 세포는 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 통상적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 생성할 것이다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아들이고 발현시키는 숙주 세포는 "형질전환된다".
바람직하게는, 폴리펩티드 및 키메라 유도체, 특히 본 발명에 따른 단백질 C 및 제X 인자 유도체를 발현하고 생성하기 위해, 진핵 세포, 특히 포유류 세포, 더욱 특히 인간 세포가 선택될 것이다.
통상적으로, CHO, BHK-21, COS-7, C127, PER.C6 또는 HEK293과 같은 세포주가 유도체의 올바른 후-번역의 변형으로 처리하는 그의 능력을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에는 형질전환 동물, 특히 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 이식유전자를 적어도 숙주시키는 형질전환 비-인간 포유류가 포함된다. 상기 형질전환 동물은 예를 들어 문헌 [Brink et al., 2000]에 이미 기재된 바와 같이 본 발명의 키메라 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터의 구축, 숙주 세포의 형질전환, 및 형질전환 동물의 제조는 통상의 분자생물학적 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 키메라 유도체, 특히 단백질 C 또는 제X 인자 유도체는 예를 들어 본 발명에 따른 유전적으로 형질전환된 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포에 의해 발현된 유도체를 배양물로부터 회수하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 그 후, 필요하다면 이는 당업계의 통상의 기술자에게 그 자체로 알려진 통상의 과정, 예를 들어 분별 침전, 특히 황산 암모늄 침전, 전기영동, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다.
특히, 재조합 단백질을 제조하고 정제하기 위한 통상의 방법들이 본 발명에 따른 단백질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 단백질 C 유도체를 제조하기 위해, 미국특허 제4992373호 또는 미국특허 제4981952호에 기재된 것과 같은 방법들이 사용될 수 있다.
치료적 방법 및 용도
본 발명의 세번째 목적은 단백질 C 및 제X 인자 관련 장애, 특히 혈액응고 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 키메라 유도체에 관한 것이다.
일구현예에서, 본 발명은 전-응고제로서 본 발명의 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 출혈성 유형의 응고 병리, 특히 제VIII 인자, 제IX 인자 또는 제XI인자 결핍의 결과로서 유발되는 병리의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
상기 병리는 특히 혈우병 A 또는 B일 수 있으며, 이는 (치료를 위해 통상적으로 사용되는 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 동종-항체를 중화시키는) 억제제의 존재에 의해 복합될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으며; 이는 또한 다른 병리(자가면역 질환, 암, 림프증식 증후군, 특발성 장애 등)와 연관된 자가 항체의 출현에 의해 야기된 획득 혈우병일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 혈우병 A 또는 B의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 혈우병 B의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제IX 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 섬유증식성 질환, 예컨대 섬유증 조직 재형성 및 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 저분자량 헤파린(LMWH) 또는 항응고 표적 인자 Xa(fXa)에 의해 유도된 출혈의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한 본 발명의 제X 인자의 키메라 유도체에 관한 것이다.
항응고 표적 인자 Xa는 잘 알려져 있다(문헌 [Harenberg, 2008], [Bauer, 2008], [Khoo et al., 2009] 참조). 항응고 표적 인자 Xa의 예는 리바록사반 및 베트릭사반이다.
바람직한 구현예에서, 서열번호 1의 위치 419의 잔기에 대응하는 상기 제X 인자의 키메라 유도체의 세린은 알라닌에 의해 치환된다.
또다른 구현예에서, 서열번호 1의 위치 387, 391 및 419의 잔기에 각각 대응하는 상기 제X 인자의 키메라 유도체의 아르기닌, 리신 및 세린은 알라닌에 의해 치환된다.
본 발명의 상기 제X 인자의 키메라 유도체는 제Xa 인자 억제제에 직접적 또는 간접적으로 결합되도록 변형되었다.
구조적으로, 상기 유도체는 전응고(procoagulant) 활성을 제공하지 않거나 전응고 활성이 감소되도록 변형되며, 이는 후자의 구현예에 대해 프로트롬빈아제 복합체로 집합되지 않는다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 항혈전, 항-염증, 항-신경퇴행 및 항-아폽토틱 제제로서 단백질 C의 키메라 유도체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 응고과잉과 연관된 병리의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 단백질 C의 키메라 유도체에 관한 것이다.
상기 병리에는 정맥 또는 동맥 혈전증, 특히 대구경 혈관에 발생하는 혈전증, 심근경색, 혈전성 질환, 폐색전증, 혈전용해 또는 혈관형성술 이후의 관상동맥 재폐색, 뇌졸중, 및 PC 유전자 또는 트롬보모듈린에 영향을 미치는 유전 이상을 갖는 환자의 응고 이상이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 본 발명은 혈우병 A 또는 B의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 단백질 C의 키메라 유도체에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 호흡기 질환 및 염증성 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 단백질 C의 키메라 유도체에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 키메라 유도체는 치료적으로 유효량이 투여된다.
"치료적으로 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 적정의 수익성/위험성 비율로 단백질 C 및 제X 인자 관련 장애를 치료 또는 예방하는데 충분한 본 발명의 키메라 유도체의 양을 의미한다.
본 발명의 화합물 및 조성물의 전체 일일 사용량은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 담당의사에 의해 결정될 것임이 이해되어진다. 임의의 특정 환자에 대해 특이적인 치료적으로 유효한 투여수준은 치료대상인 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특이적 화합물의 활성; 사용되는 특이적 화합물, 환자의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별 및 식이요법; 사용되는 특이적 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 속도; 치료되는 기간; 사용되는 특이적 화합물과 조합되어 사용되거나 동시적으로 사용되는 약물; 및 의학적 분야에 잘 알려진 유사 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 의존할 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 투여량보다 더 낮은 수준으로 화합물의 투여를 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 것이다. 그러나, 생성물의 일일 투여량은 매일 성인에 대해 0.01 내지 1,000 mg의 넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 치료대상인 환자에게 대증요법의 투여량을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 활성성분을 포함한다. 약제는 통상적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성성분, 바람직하게는 1 mg 내지 약 100 mg의 활성성분을 포함한다. 약물의 유효량은 매일 체중의 0.0002 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 특히 매일 체중의 약 0.001 mg/kg 내지 7 mg/kg의 투여 수준에서 공급되는 것이 통상적이다.
약학 조성물
본 발명의 추가적인 목적은 단백질 C 및 제X 인자 관련 장애, 특히 혈액응고 장애의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명의 키메라 유도체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
"약학적" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 포유류, 특히 인간에게 적절하게 투여될 때 역작용, 알러지 반응 또는 다른 부작용을 발생시키지 않는 분자체 및 조성물을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제는 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐형성 물질 또는 임의 유형의 제형 보조제를 나타낸다.
일구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 섬유증식성인 출혈성 유형의 응고 병리의 치료를 위한, 제X 인자의 키메라 유도체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 응고과잉, 염증성 또는 호흡기 질환과 연관된 병리의 치료 또는 예방을 위한 단백질 C의 키메라 유도체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체는 약학적으로 허용가능한 부형제 및 선택적으로는 서방성 기질, 예컨대 생분해성 폴리머와 조합되어, 치료 조성물을 형성할 수 있다.
경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 국부 또는 직장 투여를 위한 본 발명의 약학 조성물에서, 활성성분은 단독으로 또는 다른 활성성분과 조합되어 통상의 약학적 지지체와의 혼합물로서 단위 투여 형태로 동물과 인간에게 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여 형태에는 경구-투여 형태, 예컨대 정제, 겔 캡슐, 분말, 입자 및 경구 현탁액 또는 용액, 설하 및 구강 투여 형태, 에어로졸, 임플란트, 피하, 경피, 국부, 복강내, 근육내, 정맥내, 피부, 경피, 척추강내 및 비강내 투여 형태 및 직장 투여 형태가 포함된다.
바람직하게는, 약학 조성물에는 주사될 수 있는 제형을 위해 약학적으로 허용가능한 담체가 포함된다. 이는 특히 등장액, 멸균액, 염류 용액(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 상기 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수가 첨가되어 주사액을 구성할 수 있는 건조 조성물, 특히 동결건조 조성물일 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학적 형태에는, 멸균 수용액 또는 분산액; 참기름, 땅콩기름 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균되어야 하며, 용이하게 주사할 수 있을 정도까지 유체성이어야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
자유염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 본 발명의 화합물을 포함하는 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한, 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물에서, 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적 조건하에서, 상기 제제들은 미생물의 성장을 방지하는 보존제를 포함한다.
본 발명의 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 산부가염(단백질의 자유 아미노기에 의해 형성됨)이 포함되며, 이는 무기산, 예컨대 염화수소산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 또한, 자유 카르복실기에 의해 형성된 염은 무기염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 철수산화물, 및 유기염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수도 있다.
또한, 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물, 및 식물기름을 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유체성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해, 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항바이러스제 및 항균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 지연된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제의 조성물에서 사용함으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사액은 필요에 따라 상기 열거된 수개의 다른 성분들과 적합한 용매에서 필요량의 활성 폴리펩티드를 혼입하고, 그 후 여과 멸균에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매 및 상기 열거된 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 담체로 다양한 멸균 활성성분을 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조 기법이며, 이는 미리 멸균여과된 용액으로부터 활성성분 및 임의의 원하는 추가 성분의 분말을 생성한다.
제형화에 따라, 용액은 투여 제형에 적합한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 상기 제형들은 다양한 투여 형태, 예컨대 상기 기재된 주사액의 유형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등도 또한 이용될 수 있다.
수용액의 비경구적 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요하다면 적절하게 완충되어야 하며, 액체 희석물은 먼저 충분한 염류 또는 글루코스에 의해 등장성이 주어진다. 상기 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 발명의 개시관점에서 당업계의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 예를 들어, 일회 투여량은 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있으며, 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가되거나 또는 제안된 주입부위에 주사될 수 있다. 치료대상인 대상체의 상태에 따라 투여량의 일부 변화가 필수적으로 이루어져야 할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개개의 대상체에 대해 적합한 투여량을 결정할 것이다.
본 발명의 세린 프로테아제 지모겐의 키메라 유도체는 투여량 당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 밀리그램 정도를 포함하여, 치료 혼합물 내에 제형화될 수 있다. 복수의 투여량이 또한 투여될 수 있다.
정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구적 투여용으로 제형화된 본 발명의 화합물 외에, 다른 약학적으로 허용가능한 형태에는 예컨대 경구 투여용 정제 또는 다른 고형물; 리포좀 제형; 시간 방출 캡슐; 및 현재 사용되는 임의의 다른 형태가 포함된다.
도 1 : 제X 인자 지모겐 아미노산 서열의 다양한 부분들의 도식도.
프리-펩티드(또는 신호 펩티드)(이는 한 줄의 하선으로 표시됨)는 위치 -40 내지 -18의 아미노산 서열에 의해 정의되며, 프로-펩티드(이는 두 줄의 하선으로 표시됨)는 위치 -17 내지 -1의 아미노산 서열에 의해 정의된다. 경쇄(이는 물결 모양의 하선으로 표시됨)는 아미노산 위치 1 내지 142의 서열에 대응하며, 중쇄는 아미노산 위치 195 내지 448의 서열에 대응한다. 활성화 펩티드(위치 143 내지 194)는 박스처리되어 표시되어 있으며, 관심대상인 N-글리코실화 부위는 *에 의해 태그되어 있다. 사용된 넘버링 시스템은 서열과 동일한 선상에서 나타나며, 다른 참조 시스템은 서열 아래의 선상에서 회색으로 나타난다.
도 2 : 제X 인자의 트롬빈-절단가능 유도체에 대한 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체의 도식도.
A. 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체는 피브리노펩티드 A의 아미노산 서열을 포함하며, 위치 14 또는 15의 아미노산은 도면에 따라 변형될 수 있다. 카르복시-말단 부분에서 3개의 추가 아미노산이 부가되어, 피브리노펩티드 A(또는 유도체)의 3개의 마지막 아미노산을 포함한 6개 아미노산의 트롬빈-절단가능 부위를 형성한다.
B. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 피브리노펩티드 A의 10개의 마지막 아미노산만 사용되고 3개의 아미노산 펩티드와 융합되어, 트롬빈 절단가능 부위를 형성한다.
도 3 : 단백질 C의 트롬빈-절단가능 유도체에 대한 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체의 도식도.
A. 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체는 피브리노펩티드 A의 아미노산 서열을 포함하며, 3개의 아미노산이 카르복시-말단 부분에 부가되어, 피브리노펩티드 A(또는 유도체)의 3개의 마지막 아미노산을 포함한 6개 아미노산의 트롬빈-절단가능 부위를 형성한다.
B. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 피브리노펩티드 A의 10개의 마지막 아미노산만 사용되고 3개의 아미노산 펩티드와 융합되어, 트롬빈 절단가능 부위를 형성한다.
도 4 : FX 변이체 구축물의 도식도.
도 4에는 7개의 재조합 제X 인자(FX) 단백질이 도시되어 있다. 단백질 도메인은 경쇄는 회색으로, 활성화 펩티드(AP)는 흰색으로, 제X 인자의 촉매 도메인은 검은 색으로 표시되어 있다. 활성화 펩티드는 다른 변이체들 사이에서 차이가 나는 부위이다. FpA는 서열번호 7에 의해 정의되는 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체에 대응하며, ap는 FX 활성화 펩티드의 카르복시 말단 끝의 잔기 176-194에 대응하며, 검은 선은 FX 활성화 펩티드에서 돌연변이 N181A 및 N191A의 부위를 나타낸다.
도 5 : 단백질 C 변이체 구축물의 도식도.
도 5에는 3개의 재조합 단백질 C 단백질이 도시되어 있다. 단백질 도메인은 경쇄는 회색으로, 활성화 펩티드(AP)는 흰색으로, 단백질 C의 촉매 도메인은 검은 색으로 표시되어 있다. FpA는 서열번호 7에 의해 정의되는 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체에 대응하며, PP는 FX 활성화 펩티드의 카르복시 말단 끝의 잔기 176-194에 대응한다.
도 6 : 혈장의 wt-FX의 이상성(biphasic) 클리어런스.
마우스는 정제된 wt-FX(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내에 잔류한 wt-FX 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
도 7 : 혈장의 FX/delAP-FpA의 단상성(monophasic) 클리어런스.
마우스는 정제된 FX/delAP-FpA(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내의 잔류 FX/delAP-FpA 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
도 8 : 혈장의 FX/AP-FpA의 이상성 클리어런스.
마우스는 정제된 FX/AP-FpA(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내의 잔류 FX/AP-FpA 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
도 9 : 혈장의 FX/AP176-194의 이상성 클리어런스.
마우스는 정제된 FX/AP176-194(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내의 잔류 FX/AP176-194 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
도 10 : 혈장의 FX/AP176-194-N181A-N191A의 단상성 클리어런스.
마우스는 정제된 FX/AP176-194-N181A-N191A(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내의 잔류 FX/AP176-194-N181A-N191A 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
도 11 : 혈장의 FX/AP176-194-N181A의 이상성 클리어런스.
마우스는 정제된 FX/AP176-194-N181A(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내의 잔류 FX/AP176-194-N181A 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
도 12 : 혈장의 FX/AP176-194-N191A의 단상성 클리어런스.
마우스는 정제된 FX/AP176-194-N191A(10μg/마우스)로 정맥 주사되었다. 표시된 시간 포인트에서 혈액 샘플이 획득되었다. 혈장 내의 잔류 FX/AP176-194-N191A 항원의 양은 ELISA에서 정량화되었다("Experimental Procedure" 참조). 주사 이후의 시간에 대하여, 주사한지 2분 후에 존재하는 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 항원의 퍼센트가 나타내어진다. 상기 데이터에서 유래된 약동학적 파라미터가 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 각 시간 포인트에서 세마리의 마우스의 평균값±표준편차를 나타낸다.
재료 및 방법
재료
아기 햄스터 신장(BHK)은 ATCC(Rockville, 미국)에서 구입되었다. 소태아혈청(FCS)과 소혈청알부민(BSA 프로테아제 프리)은 PAA Laboratories(Les Mureaux, 프랑스)에서 구입되었다. 둘베코 변형 이글/F12 배지, 페니실린/스트렙토마이신, 펀지존(암포테리신 B 데옥시콜레이트)은 Invitrogen(Cergy Pontoise, 프랑스)에서 구입되었다. 벤즈아미딘과 페닐설포닐플로라이드(PMSF)는 Calbiochem(Meudon, 프랑스)에서 구입되었다. 메토트렉세이트, 비타민 K1, 폴리에틸렌글리콜 8000(PEG)은 Sigma(Saint Quentin Fallavier, 프랑스)에서 구입되었다. N-아벤질옥시카보닐-D-아르기닐-L-아르기닌-p-니트로아닐리드-디히드로클로라이드(N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-NA) 상품명 S-2765는 Chromogenix(Molndal, 스웨덴)에서 구입되었다. L-알파-포스파티딜-L-세린(소 뇌에서 유래된 것임)과 L-알파-포스파티딜콜린(난황에서 유래된 것임)은 Avanti Polarlipids(Albaster, 미국)에서 구입되었다. QAE 세파덱스 A-50, HiTrapTM Q 컬럼, 헤파린 HiTrap 컬럼은 GE Healthcare(Orsay, 프랑스)에서 구입되었다. 항 단백질 C 친화성 기질은 Roche Diagnostics(Meylan, 프랑스)에서 구입되었다.
재조합 FX 유도체의 구축물
C-말단 HPC-4 태그(잔기 EDQVDPRLIDGK, 서열번호 27)된, 전장길이의 인간 제X 인자, 전장길이의 인간 인슐린 및 전장길이의 인간 단백질을 각각 인코딩하는 cDNA를 생성하기 위하여, 표준 PCR 돌연변이생성을 위한 주형으로써 인간 제X 인자 cDNA를 포함하는 포유류 발현 플라스미드 pKG5(Christophe, et al., 2001), 인간 인슐린 cDNA를 포함하는 플라스미드, 및 인간 단백질 C cDNA를 포함하는 플라스미드가 사용되었다. 발현 벡터 pNUT로 클로닝된 변이된 전장길이의 cDNA는 제조사의 지시에 따라 ABI PRISM 310 DNA 서열분석기에서 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit v3.1(Applied Biosystems Applera, Courtaboeuf, 프랑스)을 사용하여 DNA 서열 분석에 의해 체크되었다. FX/AP176-194, FX/delPA-FpA, FX/AP-FpA, FX/AP176-194-N181A, FX/AP176-194-N191A 및 FX/AP176-194-N181A-N191A로 지칭되는 활성화 펩티드(도 4)에서 부분 결실 및 특이적 돌연변이를 갖는 제X 인자 변이체를 인코딩하는 cDNA를 제조하기 위하여, 표준 PCR 돌연변이생성을 위한 주형(표 1의 프라이머 참조)으로써 FX 구축물이 사용되었다. 서열번호 2(제X 인자의 활성화 펩티드)의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 PP를 함유하는 인슐린 변이체를 인코딩하는 cDNA를 제조하기 위하여, 표준 PCR 돌연변이생성을 위한 주형으로써 인슐린 구축물이 사용되었다. 이와 유사하게, 단백질 C 변이체(도 5)를 인코딩하는 cDNA를 제조하기 위한 주형으로써 단백질 C 구축물이 사용되었다. pNUT-발현 벡터로 클로닝된 구축물들은 완전히 서열화되었다.
하기의 표 1에는 다양한 제X 인자 변이체들을 제조하는데 사용되는 프라이머가 기재되어 있다.
Figure pct00001
재조합 유도체를 발현하는 세포주의 획득
pNUT-구축물은 제조사의 지시에 따라 jetPEI 반응물(Qbiogen, Ozyme, 프랑스)을 사용하여 아기 햄스터 신장(BHK) 세포로 형질감염되었다. 100 μM의 농도로 메토트렉세이트를 포함하는 배지(Sigma)에 의한 형질감염된 세포의 선택 후에, 단일 클론이 획득되고 선택 배지에서 번식되어, 안정적인 세포주가 획득되었다. 제X 인자 항원의 생성은 Dako(Dakopatts, Glostrup, 덴마크)에서 구입한 호스래디시 퍼옥시다제 없이 컨쥬게이트된 제X 인자에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 효소-연결 면역흡수 측정법(ELISA)에 의해 검정되었다. Kordia(Leiden, 네덜란드)에서 구입한 정제된 인간의 혈장 유래 제X 인자(pd-FX)가 참조로서 사용되었다. 인슐린의 생성은 Dako에서 구입한 인간 인슐린 ELISA 키트에 의해 검정되었다. 단백질 C의 생성은 코팅을 위한 친화성 정제된 마우스 모노클로날 항체(Roche, Meylan, 프랑스) 및 Dako에서 구입한 호스래디시 퍼옥시다제와 컨쥬게이트된 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 2-부위 ELISA에 의해 검정되었다. 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C를 생성하는 세포주가 선택되었다.
재조합 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C 유도체의 제조 및 정제
재조합 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C 유도체 뿐만 아니라 야생형 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C를 생성하는 안정적인 세포주는, 10% FCS, 50 μM 메토트렉세이트, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 5 μg/ml 비타민 K1(인슐린에 대한 것이 아님)이 보충된 DMEM/F-12에서 단백질 생성을 위해 300 cm 플라스크에서 유지되었다. 배지를 함유하는 관심대상인 단백질은 48시간마다 채취되었다. 벤즈아미딘 및 PMSF는 각각 최종 농도 10 및 2 mM까지 첨가되었으며, 배지는 원심분리(600Og)되고, 셀룰로스 아세테이트 막(0.45 μm)을 통과하여 세포 잔재물이 제거되고, 사용시까지 -20℃에서 저장되었다. 조건화 배지는 37℃에서 해동되었다. EDTA는 최종 농도 5 mM까지 첨가되었다. 배지는 증류수에서 그리고 Tris(pH 7.4)에서 희석되었으며, Tris 및 NaCl의 최종 농도가 각각 25 및 60 mM까지 되도록 하였다. 그 후, 상기 혼합물은 QAE 세파덱스 A-50 비드에 의해 30분 동안 실온에서 교반되었으며, 최종 농도 0.25%(wt/v)가 얻어졌다. 비드는 50 mM Tris(pH 7.4), 500 mM NaCl 및 10 mM 벤즈아미딘으로 용출하기 전에 세척되었다. 용출된 분획에 포함된 재조합 단백질(ELISA)은 10 mM 벤즈아미딘을 포함하는 25 mM Tris(pH 7.4) 및 100 mM NaCl에 대해 즉시 투석되었다. 사용 전에 -20℃에서 저장되었다. 농축된 단백질은 37℃에서 해동되었다. 칼슘은 최종 농도 5 mM까지 첨가되었다. 재조합 단백질의 정제는 제조사의 지시에 따라 HPC-4-아가로스(Roche, Meylan, 프랑스)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 지모겐으로서 사용하기 1시간 전에, 제X 인자 유도체는 1 mM PMSF에 의해 인큐베이트되어, 재조합 단백질을 제조하거나 정제하는 동안 생성될 수 있는 임의의 미량의 활성화된 제X 인자가 중화된다. 단백질 C 유도체에 동일한 처리가 적용되었다. 대조군 실험은 Tris-HCl 완충액에서 30분 후에 PMSF가 완전히 가수분해되고 다른 반응들을 방해하지 않는다는 것을 보여주었다. 단백질 순도는 환원 조건(100 mM 디티오트레이톨, 최종 농도) 및 비-환원 조건 후 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하여, 재조합 단백질의 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 사용하여 평가되었다. 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C의 동정은 정제된 재조합 단백질이 환원되고 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩된 후에 수행되었다. 용해된 단백질은 Immobilon 막으로 이동되었으며, 호스래디시 퍼옥시다제(Dakopatts, Glostrup, 덴마크)와 컨쥬게이트된 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 블롯팅되었다. 정제된 유도체는 분취되어 사용시까지 -80℃에서 저장되었다. 분취물의 농도는 280 nm에서 그의 흡광에 의해 추산되며, 이는 제X 인자, 인슐린 및 단백질 C의 소광 계수(E280 nm 0.1%)가 1.16, 1.05 및 1.45인 것으로 얻어진다.
마우스
C57BL/6 배경에 있는 야생형의 수컷 마우스(Janvier, Le Genest-St-Isle, 프랑스)가 본 시험에서 사용되었으며, 연령은 8주령 내지 9주령 사이였다. 프랑스 규제 및 유럽공동체의 실험 가이드라인에서 제안된 바에 따라, 거주제공 및 실험이 행해졌다. 24 마리의 마우스가 각각의 클리어런스 조사를 위해 사용되었다.
마우스에서 제X 인자 유도체의 클리어런스, 회수 및 생체분포
마취되지 않은 마우스가 신체속박 용구에 놓여졌으며, 마우스의 꼬리가 3분 동안 40℃에서 수조에 침지되었다. 그 후, 인산완충식염수(PBS)에서 50μg/ml에서 희석된 200μl의 제X 인자 유도체가 마우스 꼬리 정맥으로 주사되었다. 다른 시간 포인트(주사한지 2분 후, 6분 후, 10분 후와 30분 후, 및 1시간 후, 2시간 후, 4시간 후 및 8시간 후)에서, 마우스는 펜토바르비탈 나트륨(60 mg/kg; Ceva Sante Animale, Libourne, 프랑스)의 복강내 주사에 의해 마취되었으며, 혈액은 안구 뒤의 정맥총으로부터 시트르산삼나트륨을 함유하는 플라스틱 튜브로 수집되었다(9 부피의 혈액 대 1 부피의 0.138 M 시트르산삼나트륨). 3마리의 마우스가 각 시간 포인트에서 사용되었으며, 각각의 마우스는 단 한번만 혈액이 채취되었다. 혈소판 부족 혈장을 얻기 위하여, 혈액 샘플은 실온에서 20분 동안 1000g 원심분리되었다. 혈장 내 제X 인자 유도체의 농도는 탄산염 완충제(pH 9.6)에서 코팅된 HPC-4라고 불리우는 마우스 모노클로날 항체(Roche)와 호스래디시 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 폴리클로날 항체 항-인간 제X 인자(Dako)를 사용하여 면역흡착 검정에 의해 측정되었다. HPC4 태그된 재조합 정제 및 정량화된 야생형 제X 인자(상기 참조)가 참조로서 사용되었다. 그 결과는 주사된 재조합 인간 제X 인자의 퍼센트로서 표시되었다. 생체분배 실험 및 회수 측정을 위해, 고도로 정제된 재조합 FX 변이체가 문헌 [Fracker and Speck, BBRC 1978]에 기재된 바에 따라 Iodo Gen(Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 미국)을 사용하여 Na125I(Perkin-Elmer, Courtaboeuf, 프랑스)로 표지되었다. 특정 방사능은 2 내지 10 x 104 cpm/μg의 FX 변이체로 달라졌다. 최종 제조물에서 자유 요오드는 20% 트리클로로아세트산에 의한 침전에 의해 측정될 때 5% 미만이었다. 회수는 주사된 양에 대해 상대적으로 주사한지 5분 후에 혈장 내에 존재하는 FX의 퍼센트를 나타낸다.
마우스에서 단백질 C 및 인슐린 변이체의 클리어런스
각각의 단백질 C 및 인슐린 변이체에 대해, 24 마리의 수컷 WT 마우스(8-주령)가 사용된다. PBS에서 희석된 10 μg의 정제된 재조합 단백질이 꼬리의 정맥을 통해 마우스마다 주사된다. 주사 후에 다른 시간 포인트에서 마우스는 트리브로모에탄올(60mg/kg 체중)로 마취되고, 혈액은 히루딘(Diagnostica Stago, Asnieres, 프랑스)(100 UI, 최종 농도)에 대한 안구 뒤의 정맥 샘플링에 의해 수집된다. 3 마리의 마우스가 시간 포인트마다 사용되고, 각각의 마우스에서 단 한번만 혈액을 뽑는다. 혈장이 준비되고, ELISA에 의하거나 또는 잔류 활성에 의해 잔여의 주사 항원 농도가 분석되었다.
데이터 분석
클리어런스 곡선은 시간의 함수로서 주사된 양(주사된 농도 %)에 대해 상대적으로 마우스 혈장 내 잔류 제X 인자, 단백질 C 및 인슐린 유도체 항원의 양을 나타낸다.
데이터는 하기 중 어느 하나에 적용되었다:
- 단일지수 식:
Cp = Ae-αt 식 1
- 또는 이중지수 식:
Cp = Ae-αt + Be-βt 식 2
파라미터 A, α, B 및 β는 KaleidaGraph 소프트웨어(KaleidaGraph version 4.02. for Mac OS X, Synergy Software, Reading, 미국)를 사용하여 결정되었다. Cp는 주사된 양에 대해 상대적인 혈장 내 잔류 제X 인자 유도체의 양을 나타낸다. 상기 파라미터들은 평균체류시간(MRT)을 계산하기 위해 필요하다.
- 이상성 클리어런스 과정에서:
MRT = (A/α2 + B/β2) / (A/α + B/β) 식 3
- 단상성 클리어런스 메카니즘에서:
MRT = (A/α2) / (A/α) 식 4
또한, α 및 β가 사용되어, T1/2α = 1n 2/α 및 T1/2β = 1n 2/β를 이용하여 각각 처음 시기와 마지막 시기의 반감기가 계산되었다.
트롬빈 생성의 검정
트롬빈의 생성은 디스펜서가 장착된 Fluoroscan Ascent 형광계(Thermolabsystems OY, Helsink, Finland)에서 Hemker 등의 문헌[Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, et al. Pathophysiol Haemost Thromb 2003; 33:4-15]에 기재된 방법에 따라 측정되었다. 요약하면, 염류(대조군) 또는 지시된 농도의 항응고 폰다파리눅스(Arixtra®, GlaxoSmithKline, Brentford, 영국)로 보충된 80 μl의 혈장 및 다양한 농도의 재조합 제X 인자 유도체가 둥근 바닥의 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 제공되었다. TF(Dade Behring에서 구입한 재조합 지질화 인간 조직 인자, Innovin®) 및 인지질(PL) 담체를 포함하는 20 μl의 혼합물이 혈장 샘플에 첨가되어, 최종 농도 1 pM TF 및 4 μM PL 담체가 수득되었다. L-α-포스파티딜-L-세린(PS)과 L-α-포스파티딜콜린(PC)(Avanti Polarlipids, Albaster, Alabama, 미국)으로부터 제조되고 공칭 100 nm-직경(PC:PS, 3:1)을 갖는 PL 담체는 막 압출 방법(Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C, Vail, W. J., and Papahadjopoulos, D. (1979) Biochim Biophys Acta 557(1), 9-23)에 의해 제조되었다. 인지질의 농도는 포스페이트의 분석에 의해 결정되었다. 마지막으로, 트롬빈의 생성은 형광생성 기질 및 CaCl2를 함유하는 20 μl의 개시 시약을 첨가함으로써 촉발되었다. 형광생성 기질 I-1140(Z-Gly-Gly-Arg-AMC)은 Bachem AG(Bubendorf, 스위스)에서 구입되었다. 혈장의 응고에 있어서 트롬빈 생성의 반응속도론은 캘리브레이트된 자동화 트롬보그램(thrombogram)을 사용하여 37℃에서 60분 동안 모니터링되었으며, Thrombinoscope™ 소프트웨어(Thrombinoscope B.V., Maastricht, 네덜란드)를 사용하여 분석되었다. 3개의 웰이 각각의 실험에 필요하며, 2개의 웰은 혈장 샘플의 트롬빈 생성을 측정하기 위해 요구되고 1개의 웰은 캘리브레이션을 위해 요구된다. 모든 실험들은 3회 수행되었으며, 평균값이 기록되었다. 내인성 트롬빈 퍼텐셜(ETP), 즉 곡선하 면적, 피크 트롬빈, 및 트롬빈 검출을 위한 래그 타임이 결정되었다.
결과
재조합 야생형 제X 인자의 이상성 클리어런스
혈장의 제X 인자의 클리어런스를 조사하기 위하여, 마우스는 재조합 야생형 제X 인자가 정맥 주사되었다. 주사 후 지시된 시간 포인트에서 마우스의 혈액이 채취되었으며, 혈장이 제X 인자 항원에 대해 분석되었다. 주사 이후 시간의 함수로서 항원 값의 그래프 도식에 따르면, 야생형 제X 인자는 빠른 반감기와 느린 반감기가 각각 43분과 305분인 것을 특징으로 하는 이상성 클리어런스에 의해 혈액으로부터 제거되었음이 나타났다(도 6). 또한, MRT는 380분인 것으로 산출되었다(표 2).
하기의 표 2에는 혈장의 wt-제X 인자 및 이의 변이체의 클리어런스 및 회수를 기재한 약동학적 파라미터가 기재되어 있다. N.A. = 적용할 수 없음. N.D. = 측정되지 않음.
Figure pct00002
재조합 FX/delAP-FpA의 단상성 클리어런스
제X 인자의 클리어런스의 반응속도론에서 활성화 펩티드의 역할을 확인하기 위하여, 활성화 펩티드가 결실된 제X 인자 변이체가 설계되고, 제조되고, 정제되었다. FX/delAP-FpA라고 지칭되는 상기 변이체는 제X 인자 활성화 펩티드를 포함하지 않지만, 대신에 피브리노펩티드 A의 카르복시-말단 끝에 대응하는 10개 잔기를 포함한다. 피브리노펩티드 A 잔기의 서열은 FX 활성화 펩티드에 존재하는 대응 잔기와 상이하다. 야생형 제X 인자와 대조적으로, 마우스에 주사 이후에 FX/delAP-FpA는 겉보기 반감기가 40분인 클리어런스의 단상성 패턴을 나타내었다(도 7). 또한, MRT는 야생형 제X 인자에 비해 결실 분자에서 6배 감소되었다(표 2). 결론적으로, 상기 데이터는 제X 인자의 활성화 펩티드가 혈장에서 제X 인자 클리어런스의 속도에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
재조합 FX/AP-FPA의 이상성 클리어런스
FX/delAP-FpA의 클리어런스 패턴 및 약동학적 파라미터에 대해 관찰된 효과가 피브리노펩티드 A 잔기의 존재에 기인한 것이 아니라 제X 인자 활성화 펩티드의 결실에 기인한 것이라는 점을 입증하기 위하여, FX/AP-FpA가 설계되고, 제조되고, 정제되고, 특징화되었다. 상기 제X 인자 변이체는 카르복시 말단 끝에서 피브리노펩티드 A의 10개 잔기에 연결된 제X 인자 활성화 펩티드의 52개 잔기를 포함한다. 정제된 변이체는 꼬리 정맥 투여에 의해 마우스에게 투여되었다. 야생형 제X 인자와 유사한 클리어런스 패턴이 관찰되었다(도 8). 표 2에 요약된 바와 같이, 유사한 약동학적 파라미터들이 상기 변이체와 wt-FX에서 얻어졌다. 따라서, 앞서 관찰된 FX/delAP-FpA 클리어런스의 빠른 속도(상기 참조)는 FIX 서열의 존재에 대해 독립적이었지만, FX 활성화 펩티드의 52개 잔기의 부재에 기인한 것이었다.
재조합 FX/AP176-194의 이상성 클리어런스
제X 인자 클리어런스의 원인이 되는 활성화 펩티드의 잔기를 동정하는 것이 관심대상이 된다. 이를 위해, 제X 인자 활성화 펩티드의 카르복시-말단 끝의 19개 잔기만을 갖는 FX/AP176-194라고 지칭되는 제X 인자 변이체가 구축되었다. 정제된 변이체는 꼬리 정맥 투여에 의해 마우스에게 투여되었다. 다른 시간 포인트에서 마우스의 혈액이 채취되었으며, 혈장은 제X 인자 항원에 대해 분석되었다. 이러한 실험들은 FX/AP176-194가 야생형 제X 인자와 유사한 방식으로 혈장으로부터 클리어되었다는 점을 나타내었다(도 9). 실제로, 유사한 약동학적 파라미터가 실험 데이터로부터 산출될 수 있다(표 2). 상기 데이터는 제X 인자 활성화 펩티드의 카르복시-말단 끝에 있는 잔기들이 제X 인자 클리어런스의 속도에 중요한 역할을 한다는 점을 입증한다.
순환으로부터 FX의 클리어런스에 있어서 활성화 펩티드의 N-글리코실화의 연관
제X 인자의 카르복시-말단 끝이 2개의 N-글리코실화 부위(Asn 181 및 191)를 포함하기 때문에, 제X 인자의 순환 수명에 대한 상기 후-번역 변형의 가능성 있는 역할은 1개 또는 2개의 N-글리코실화 부위에서 변이된 FX/AP176-194를 사용하여 시험되었다. FX/AP176-194-N181A, FX/AP176-194-N191A 및 FX/AP176-194-N181A-N191A라고 지칭되는 2개의 단일-변이된 변이체와 1개의 이중-변이된 변이체가 제조되고, 정제되고, 이의 클리어런스가 시험되었다. 이중 돌연변이 FX/AP176-194-N181A-N191A는 야생형 제X 인자보다 더 빠르게 순환으로부터 클리어되었으며, 흥미롭게도 FX/delAP-FpA와 유사한 클리어런스 패턴을 나타내었으며, 상기 제X 인자 변이체는 제X 인자 활성화 펩티드를 갖지 않았다(도 10). 표 2에 나타낸 바와 같이, FX/AP176-194-N181A-N191A 및 FX/delAP-FpA에 대해 유사한 약동학적 파라미터들이 수득되었다. 상기 데이터는 활성화 펩티드의 위치 181 및 191의 N-글리코실화가 제X 인자의 생존에 중요한 역할을 한다는 점을 입증한다. 변이체 FX/AP176-194-N181A에 대해 이상성 클리어런스가 관찰되었으며(도 11), 이는 야생형 제X 인자와 유사하다. 그러나, 순환으로부터 이의 제거는 표 2에 나타낸 바와 같이 wt-FX보다 더 빨랐다. 변이체 FX/AP176-194-N191A에 대해 단상성 클리어런스가 관찰되었으며(도 12), 이는 FX/delAP-FpA와 유사하다. 반면, 이의 제거는 FX/delAP-FpA보다 더 오래 걸렸지만, FX/AP176-194-N181A와 비교할 때 MRT가 유사하였다. 상기 데이터는 위치 181의 N-글리코실화가 제X 인자 클리어런스의 단상성 패턴의 원인이 되는 반면, 위치 191의 N-글리코실화는 이상성 패턴의 원인이 된다는 점을 나타낸다. 또한, 2개의 N-글리코실화는 제X 인자의 약동학적 파라미터에서 중요한 역할을 한다.
참고문헌
본 출원에서, 다양한 참고문헌들이 본 발명이 속하는 기술분야의 내용을 기재하고 있다. 이러한 참고문헌들의 개시내용은 본원의 개시내용에 참조로 삽입된다.
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Figure pct00004
Figure pct00005
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SEQUENCE LISTING <110> INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE) <120> SERINE PROTEASE DERIVATIVES AND USES IN THE PREVENTION OR THE TREATMENT OF BLOOD COAGULATION DISORDERS <130> IP20111782/FR <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 488 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 <210> 2 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro Asp Ser Ile 1 5 10 15 Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr Glu Asn Pro 20 25 30 Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn 35 40 45 Asn Leu Thr Arg 50 <210> 3 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile 1 5 10 15 Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg 20 25 30 Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu 35 40 45 Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys 50 55 60 Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu 65 70 75 80 Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro 85 90 95 Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile 100 105 110 Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly 115 120 125 Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn 130 135 140 Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys 145 150 155 160 Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His 165 170 175 Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys 180 185 190 Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val 195 200 205 Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro 210 215 220 Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala 225 230 235 240 Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp 245 250 255 Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg 260 265 270 Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His 275 280 285 Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His 290 295 300 Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu 305 310 315 320 Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu 325 330 335 Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala 340 345 350 Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val 355 360 365 Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn 370 375 380 Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly 385 390 395 400 Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu 405 410 415 Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr 420 425 430 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His 435 440 445 Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro 450 455 460 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X is G or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X is V or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X is I, A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X is V or F <400> 5 Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Xaa Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Xaa Gly <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is V or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is V or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is I, A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is V or F <400> 6 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 7 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ile Val Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 8 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ala Val Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 9 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 10 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ile Phe Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 11 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ala Phe Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 12 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ser Phe Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X is L, A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X is I or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X is G or D <400> 13 Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURES <222> (11)..(11) <223> X is L, A or S <220> <221> MISC_FEATURES <222> (12)..(12) <223> X is I or F <220> <221> MISC_FEATURES <222> (13)..(13) <223> X is G or D <400> 14 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 15 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Leu Ile Asp 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 16 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Leu Ile Gly 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 17 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ala Ile Asp 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 18 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ala Ile Gly 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 19 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ser Ile Asp 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 20 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ser Ile Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 21 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ala Phe Asp 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 22 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ala Phe Gly 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 23 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ser Phe Asp 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 24 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Ser Phe Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 25 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Leu Phe Asp 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 26 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Leu Phe Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide <400> 27 Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 28 ctggaacgcc ggaagaggga cctgcttgac ttcaaccaga cgcag 45 <210> 29 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 29 gttgaagtcc agcaggtccc tcttccgacg ttccagtgtc tgttt 45 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 30 gactttctag ctgaaggagg aggcgtgcgt atcgtgggag gccaggaatg c 51 <210> 31 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 31 cctcctcctt ctgctagaaa gtctctcttt ctgcgttcca gggtctgttt 50 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 32 cctcctcctt ctgctagaaa gtccctggtc aggttgttgt cg 42 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 33 cttgacttcg cccagacgca gcct 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 34 aggctgcgtc tgggggaagt caag 24 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 35 ggcgacaatg ctctcaccag gatcgt 26 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primers <400> 36 gatcctggtg agagcattgt cgcccct 27

Claims (35)

  1. 서열번호 2의 위치 33 내지 52의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 위치 39 또는 49의 아스파라긴이 N-글리코실화된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    세린 프로테아제 지모겐의 반감기를 향상시키기 위한 폴리펩티드.
  3. 하기를 포함하는 융합 단백질:
    - 제1항에 따른 제1 폴리펩티드, 및
    - 서열번호 4의 위치 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서,
    제1 폴리펩티드의 카르복시-말단 영역이 제2 폴리펩티드의 아미노-말단 영역에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 단백질의 천연 활성화 펩티드가 제3항 또는 제4항에 따른 융합 단백질에 의해 치환된 것을 특징으로 하는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  6. 제5항에 있어서,
    하기를 특징으로 하는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 서열번호 1의 위치 235의 잔기에 대응하는 이소류신이 알라닌, 세린 또는 류신에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 1의 위치 236의 잔기에 대응하는 발린이 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신이 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린이 프롤린에 의해 치환된 것임.
  7. 단백질의 천연 활성화 펩티드가 하기를 포함하는 융합 단백질에 의해 치환된 것을 특징으로 하는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 제1항에 따른 폴리펩티드, 및
    - 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열에 의해 정의되는 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체가 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기를 특징으로 하는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열에 의해 정의됨, 및
    - 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체가 서열번호 7의 아미노산 서열에 의해 정의됨.
  11. 단백질의 천연 활성화 펩티드가 제3항 또는 제4항에 따른 융합 단백질에 의해 치환된 것을 특징으로 하는, 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  12. 제11항에 있어서,
    하기를 특징으로 하는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 서열번호 3의 위치 212의 잔기에 대응하는 류신이 알라닌 또는 세린에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 3의 위치 213의 잔기에 대응하는 이소류신이 페닐알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 3의 위치 214의 잔기에 대응하는 아스파르테이트가 글리신에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신이 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린이 프롤린에 의해 치환된 것임.
  13. 단백질의 천연 활성화 펩티드가 하기를 포함하는 융합 단백질에 의해 치환된 것을 특징으로 하는, 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 제1항에 따른 폴리펩티드, 및
    - 서열번호 13 또는 서열번호 14의 아미노산 서열에 의해 정의되는 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체가 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열에 의해 정의되는 것을 특징으로 하는, 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기를 특징으로 하는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 상기 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열에 의해 정의됨, 및
    - 상기 피브리노펩티드 A 트롬빈-절단가능 유도체가 서열번호 15의 아미노산 서열에 의해 정의됨.
  17. 활성화된 제X 인자 또는 이의 기능 보존 변이체 및 제3항 또는 제4항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 활성화된 제X 인자 또는 이의 기능 보존 변이체의 중쇄의 아미노-말단 끝에 융합된 것을 특징으로 하는, 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    하기를 특징으로 하는 제X 인자의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 서열번호 1의 위치 235의 잔기에 대응하는 이소류신이 알라닌, 세린 또는 류신에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 1의 위치 236의 잔기에 대응하는 발린이 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신이 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린이 프롤린에 의해 치환된 것임.
  20. 활성화된 단백질 C 또는 이의 기능 보존 변이체 및 제3항 또는 제4항에 따른 융합 단백질을 포함하는, 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 활성화된 제X 인자 또는 이의 기능 보존 변이체의 중쇄의 아미노-말단 끝에 융합된 것을 특징으로 하는, 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    하기를 특징으로 하는 단백질 C의 키메라 트롬빈-절단가능 유도체:
    - 서열번호 3의 위치 212의 잔기에 대응하는 류신이 알라닌 또는 세린에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 3의 위치 213의 잔기에 대응하는 이소류신이 페닐알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 3의 위치 214의 잔기에 대응하는 아스파르테이트가 글리신에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신이 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나; 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린이 프롤린에 의해 치환된 것임.
  23. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 키메라 트롬빈-절단가능 유도체를 인코딩하는 핵산 분자.
  24. 출혈성 유형의 응혈 병리의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제5항 내지 제10항 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 제X 인자의 키메라 유도체.
  25. 제24항에 있어서,
    혈우병 A 또는 B의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제X 인자의 키메라 유도체.
  26. 응고과잉과 연관된 병리의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제11항 내지 제16항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 단백질 C의 키메라 유도체.
  27. 제26항에 있어서,
    혈전증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 단백질 C의 키메라 유도체.
  28. 제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 키메라 유도체를 포함하는, 혈액응고 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  29. 하기를 포함하는 융합 단백질:
    - 제1항에 따른 제1 폴리펩티드, 및
    - 서열번호 4의 위치 7 내지 16의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드,
    여기에서,
    - 서열번호 4의 위치 14의 잔기에 대응하는 글리신은 발린, 페닐알라닌 또는 알라닌에 의해 치환되거나, 및/또는
    - 서열번호 4의 위치 15의 잔기에 대응하는 발린은 프롤린에 의해 치환된 것임.
  30. 제29항에 있어서,
    제1 폴리펩티드의 카르복시-말단 영역이 제2 폴리펩티드의 아미노-말단 영역에 융합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  31. 저분자량 헤파린(LMWH) 또는 항응고 표적 인자 Xa(fXa)에 의해 유도된 출혈의 치료 또는 예방을 위한 방법에 사용하기 위한, 제5항 내지 제10항 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 제X 인자의 키메라 유도체.
  32. 제31항에 있어서,
    서열번호 1의 위치 419의 잔기에 대응하는 상기 제X 인자의 키메라 유도체의 세린이 알라닌에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 제X 인자의 키메라 유도체.
  33. 제32항에 있어서,
    서열번호 1의 위치 387 및 391의 잔기에 각각 대응하는 상기 제X 인자의 키메라 유도체의 아르기닌 및 리신이 알라닌에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 제X 인자의 키메라 유도체.
  34. 하기를 포함하는 융합 단백질:
    - 제1항에 따른 제1 폴리펩티드, 및
    - 관심대상인 단백질.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 관심대상인 단백질이 순환 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150113205A (ko) * 2013-02-04 2015-10-07 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 인자 ｘ 돌연변이체

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008006313A (es) 2005-11-15 2008-11-06 Philadelphia Children Hospital Metodos y composiciones para modular la hemostasia.
EP3824902A1 (en) 2007-09-28 2021-05-26 Portola Pharmaceuticals, Inc. Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same
JP5709316B2 (ja) 2008-11-14 2015-04-30 ポートラ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 第Ｘａ因子阻害剤のための解毒剤および血液凝固剤と組み合わせて該解毒剤を使用する方法
WO2010070137A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Serine protease derivatives and uses in the prevention or the treatment of blood coagulation disorders
EP3604510B1 (en) 2009-03-30 2025-03-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same
US9056106B2 (en) 2009-07-15 2015-06-16 Portola Pharmaceuticals, Inc. Unit dose formulation of antidotes for factor Xa inhibitors and methods of using the same
EP2760887B1 (en) * 2011-09-30 2024-10-23 The Children's Hospital of Philadelphia Compositions and methods for modulating hemostasis
BR112015001628A2 (pt) 2012-07-25 2017-11-07 Catalyst Biosciences Inc polipeptídeos de fator x modificados e uso dos mesmos
ES2761730T3 (es) 2013-01-31 2020-05-20 Pfizer Composiciones y procedimientos para contrarrestar la inhibición del factor Xa
EP2970933A2 (en) * 2013-03-12 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Thrombin sensitive coagulation factor x molecules
WO2015044836A1 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Pfizer Inc. Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins
US10676730B2 (en) 2015-01-07 2020-06-09 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Mutated factor X polypeptides and uses thereof for the treatment of haemophilia
WO2017017109A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated factor x polypeptides and uses thereof for the treatment of haemophilia

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4992373A (en) 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US4981952A (en) 1988-10-04 1991-01-01 Eli Lilly And Company Method for the purification of vitamin K-dependent proteins
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
MY110664A (en) 1992-05-21 1999-01-30 Lilly Co Eli Protein c derivatives
AU6248994A (en) 1993-02-22 1994-09-14 Rockefeller University, The Production of high titer helper-free retroviruses by transient transfection
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
FR2831170B1 (fr) 2001-10-19 2004-03-19 Inst Nat Sante Rech Med Proteines c modifiees activables directement par la thrombine
FR2841904B1 (fr) 2002-07-03 2004-08-20 Inst Nat Sante Rech Med Analogues de facteurs x clivables par la thrombine
CA2531695A1 (en) 2003-07-08 2005-01-27 The Scripps Research Institute Activated protein c variants with normal cytoprotective activity but reduced anticoagulant activity
WO2006000020A1 (en) 2004-06-29 2006-01-05 European Nickel Plc Improved leaching of base metals
AU2005274406B2 (en) 2004-08-17 2010-07-01 Csl Behring Gmbh Modified vitamin K dependent polypeptides
EP1820508A1 (en) * 2006-02-21 2007-08-22 CSL Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
JP5519503B2 (ja) 2007-08-01 2014-06-11 ダウ グローバル テクノロジーズ エルエルシー 剥離グラフェンを製造するための高効率の方法
WO2010070137A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Serine protease derivatives and uses in the prevention or the treatment of blood coagulation disorders

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150113205A (ko) * 2013-02-04 2015-10-07 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 인자 ｘ 돌연변이체

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