JPH04208216A - 微細リポソームの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野と本発明の目的〕 本発明は、微細なリボソームの調製法及びその微細なリ
ボソームを含有する医薬用薬剤及び化粧料の調製法に関
するものである。更に詳しくは、本発明は、生体にとっ
て有害な有機溶媒を用いることなく、比較的低温で微細
なリボソームを形成させ、内包物の保持効率が高く、大
量生産に適する微細なリボソームの調製法を提供せんと
するものである。

〔背景技術〕

リボソームの研究は１９６４年、１３　ａｎｇ　ｌ＋　
ａ　ｍらが卵黄ホスファチジルコリンの水溶液への懸濁
物を電子顕微鏡、光学顕微鏡で観察し、水溶液のイオン
強度に依存して形態が変化することを見出したことに始
まる。生体膜由来のリン脂質を水溶液中に懸濁すると、
内部に水相を有するスメクチック液晶相の脂質二分子膜
よりなる閉鎖小胞が形成され、この小胞体がリボソーム
と呼ばれるものであるが、リボソームの調製にあたって
は、その脂質組成は適宜選択でき、リボソーム内水相ま
たは膜中に物質を保持できることがら、リボソームは、
生体膜モデルとして脂質の物性や膜の透過性研究、脂質
と膜タンパク貿との相互作用や膜面上で起こる諸反応の
解析などに広く用いられている。また、１９６９年にＷ
ｅｉｓｓｍａｎが遺伝子の酵素欠損にリボソームを用い
て以来、ドラッグデリバリ−としての応用も近年特に注
目されてきている。

こうしたリボソームの種類には大きく分けて多重層リボ
ソーム（Ｍｕｌｔｉ−１ａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌ
ｅ。

ＭＬＶ、粒子径数μＩＩ）、大きな一枚膜リボソーム（
Ｌａｒｇｅ　ｕｎｉ−１ａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌ
ｅ、　ＬＵＶ、粒子径０．１〜１．０μｍ）並びに小さ
な一枚膜リボソーム（Ｓｍａｌｌ　ｕｎｉ−１ａｍｅｌ
ｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ、　ＳＵＶ、粒子径２０〜５０
ｎｍ）があり、それぞれ種々の調製法が既に報告されて
いる（Ｓｚｏｋａ、　Ｆ、　Ｊｒ、　ａｎｄ　Ｐａｐａ
ｌｌａｄ−ｊｏｐｏｕｌｏｓ　Ｄ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅ
ｖ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ、、　９゜４６
７　　（１９８０））。

ところで、これらの従来技術により知られているリボソ
ームの調製は、いずれも実験室スケールの調製にすぎず
、しかも、いずれの方法もリボソーム膜構成物質の溶解
剤としてクロロボルム、エーテル等の人体に望ましくな
い揮発性有機溶媒を使用しているため実用化するには解
決すべき問題が存在している。特にスケール・アップを
した場合の保安作業上の問題、人体への安全性の問題及
び最終的に有機溶媒を除去したとしても、それらの残留
物の生体に及ばず危険性の問題が存在している。近年、
スケール・アップ可能なリボソーム製造装置も市販され
ているが、それらを用いる場合でも、リボソーム膜補強
成分であるコレステロール等のステロール類、セレブロ
シド等の膜への組み込みの為には、あらかじめ均一な膜
を作製する為に、上述のような有機溶媒を使用せねばな
らず、更にはそうした補強成分と組み合わさったリボソ
ームを微細化するにあたっては、たとえ加熱したとして
も、フィルターあるいはノズルをリボソームが通過しに
くく非常に時間がかかり、更なる加熱はスケール・アッ
プ時に保安作業上の問題が生じてくる。特開昭６０−７
９３２号公報記載の多価アルコールを用いる方法では、
前記した如き有機溶媒は用いられていないが、粒子径の
コントロール、特に微細リボソームを得るために撹拌機
、超音波乳化機、高圧乳化機、フィルター等が使用され
ている。これらの処理をほどこさないと粒子径は、はと
んどの場ａＯ１５μｍ以上となるが、これらの処理は内
包有効成分の保持効率を著しく低下させる等の問題があ
る。また、非常に高＠（通常９０°Ｃ以上、ステロール
類添加の際には１６０°Ｃ）にして調製しなければなら
ない為、脂質の分解及び内包有効成分の化学的安定性の
確保に対する問題があり、更には、その生体への安全性
への問題もある。

従来技術によれば、過激な条件下でないとリボソームの
微細化は困離なことである。その理由としては、他の両
親媒性物質と比べて、レシチンに代表される脂質は、そ
の希薄水溶液でもミセルを形成せず【ＳＤＳのｃｍｃ　
　１．４５ｘｌＱ−’Ｍ。

ＤＰＰＣのｃｍｃ　　−１０−”Ｍ　（Ｓｍｉｔｈ、　
　Ｒ，ａｎｄ　　Ｃ。

Ｔａｎｆｏｒｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　６
７７５（１９７２）））　、液晶分散系（これは不均一
なＭＬＶ水溶液ともいえる）であり、その分子構造（リ
ボソームを形成しやすい脂質はコーン型、Ｃｕ１ｌｉｓ
、　　Ｐ、Ｒ，ａｎｄ　ＤｅＸｒｕｉｊｆｆ　Ｂ、、　
Ｂ、Ｂ−Ａ、、　５５９．３９９（１９７９））　、及
び非常に強固な分子間力（これは、水存在下での水との
大きな疎水性効果と強い親木部間のイオン結合（Ｔ、　
Ｋａｎｅｋｏ　ａｎｄ　Ｋ、　５ｂｉｎｏｄａ、　Ｙｕ
ｋａｇａｋｕ。

３７７０９（１９８８）、Ｋ、　５ｈｉｎｏｄａ　ａｎ
ｄ　Ｔ、　Ｋａｎｅｋｏ、　Ｊ。

Ｄｉｓ、　Ｓｃｉ、　Ｔｅｃ、、　９５５５（１９８９
））に起因するものである。

〔発明の開示〕

本発明者らは、上記従来技術の問題点を解決するため、
鋭意検討した結果、生体にとって有害な有機溶媒を使用
することなく、比較的低温で微細なリボソームを形成さ
せ、その粒子径を自由に調製することができ、しかも内
包物の保持効率が高く、大量生産に適し、かつ簡便な微
細リボソームの調製法を提供することに成功しｌこ　。

本発明方法によれば、大量の薬剤を内包した微細なリボ
ソームを得ることが可能であり、これにより該リボソー
ムを配合した優れたリボソーム製剤を得ることができる
。

すなわち、本発明により、リボソーム膜構成物質をその
良溶媒である多価アルコールに溶解し、次いで貧溶媒で
ある別の多価アルコールを添加し、充分に混合すること
によりリボソーム膜構成物質とそれらの多価アルコール
から成るラメラ液晶を形成させ、次に、これに水もしく
はリボソーム膜構成物質に応じて選択された適宜の物質
の水溶液を用いて、これをラメラ液晶が壊れないように
、緩徐に滴下しながら練り込むことにより膨潤したラメ
ラ液晶を形成させ、次いで上記の水又は水溶液と同一も
しくは別の水溶液を用いて、これを連続的に滴下するこ
とを特徴とする微細なリボソームの調製法ならびに、そ
れにより得られた微細なリボソームを利用して医薬およ
び／または化粧料を内包せしめ本発明方法は、生体にと
って無害であり、そのまま最終製品に残留しても投与可
能な水溶性非揮発性有機溶媒と少量の水を用い、それに
よって膨潤したラメラ液晶を形成させ、そのライラ液晶
と水との非常に低い界面張力を利用することにより、そ
の分散エネルギーも非常に低下し、容易にリボソームが
形成されるという界面化学的性質を利用することを特徴
とし、このメカニズム自体全く新規なものである。

しかも本発明の方法によれば、ラメラ液晶中に有効成分
を封じ込めるので、その保持効率も高く、またこのラメ
ラ液晶は高温にしなくとも例えば３０°Ｃでも形成され
、更には、膜構成物質に対する良溶媒と貧溶媒の比率あ
るいはそれらの溶媒に対する膜構成物質の濃度を調製す
ることにより任意の粒子径のリボソームが得られる。

従って、先に挙げたリボソームの工業的生産性を困難な
らしめている要因及びリボソーム膜構成物質、内包有効
成分の分解、更には有毒性有機溶媒の他、蛇面活性剤な
どの最終製品中への残留性及びスケール・アップに伴う
設備上・操作上の問題等の諸問題は、本発明の方法によ
って解消されたといえる。

以下、本発明を詳細に述べる。

本発明において使用されるリボソーム膜構成物質きは、
主要膜構成成分の他必要に応じて膜補強成分、荷電成分
、酸化防止剤、防腐・殺菌剤などが用いられる。

主要膜構成成分は例えば卵黄レンチン、大豆レシチン、
水添した卵黄レシチン・大豆レシチン、及びＤＭＰＣ，
ＤＰＰＣ％ＤＳＰＣに代表される合成レシチン、卵黄ス
フィンゴミエリン、牛脳スフィンゴミエリン等に代表さ
れるリン脂質の他、ジガラクトシルジグリセリドのよう
な糖脂質、ジアルキル型合成界面活性剤等の一種又は二
種以上の混合物である。

また、膜補強成分としては、コレステロール、コレスタ
ノール等のステロール類、セレブロシーｑ−へヒ ド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質、セラミド、
グリセロ糖脂質及び配糖体等が用いられ、荷電成分とし
ては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルイノシＩ・−ル、ボス７アチジルセリン、ホスファチ
ジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジセチルホスフ
ェート、ステアリルアミン等が用いられ、更に酸化防止
剤としては、α−トコフェロール、防腐・殺菌剤として
は、パラベン類、塩化ベンザルコニウム等を加えてリボ
ソーム膜を形成させてもよい。これらリボソームの膜構
成物質の比率は特定されないが、好ましくは主要膜構成
成分１重量部に対して、膜補強成分を０〜１．０重量部
程度、荷電成分をθ〜０．２重量部程度加えるのが望ま
しい。

本発明方法で使用されるリボソーム膜構成物質に対する
良溶媒としての水溶性非揮発性有機溶媒の例としてはプ
ロピレングリコール％Ｉ、３−ブタンジオール等の多価
アルコール類の単独又は混合物、貧溶媒としての水溶性
非揮発性有−１〇− 機溶媒の例としてはグリセリン、ポリエチレングリコー
ル４００、Ｄ−ソルビト−ル等の多価アルコール類の単
独又は混合物が挙げられる。これら有機溶媒の混合比率
及び使用量は所望の粒子径に依存するが、好ましくは良
溶媒：貧溶媒＝１：０〜０．２　：　０．８、使用量は
リボソーム膜構成物質１重量部に対し約０〜２重量部程
度となるようにするのが望ましい。

また、リボソーム膜構成物質と上記多価アルコールの組
み合わせにより形成されたラメラ液晶相を膨潤させた、
いわゆる膨潤ラメラ液晶を形成させる為の水性溶液とし
ては、水、緩衝液、生理食塩水、糖水溶液及びこれらの
混合液などが用いられるが、分子間力が大きく、水分散
性が非常に悪いスフィンゴミエリン等を用いる場合、主
要膜構成成分との相互作用の強い内包有効成分を用いる
場合、あるいは膜構造を強固にする膜補強成分を多量に
用いる場合（主要膜構成成分１重量部に対し当該膜補強
成分を約０．３重量部以上用いる場合等）には、膨潤ラ
メラ液晶を形成させる為の水性溶液としては約３０％以
上の高濃度糖水溶液を用いるのが望ましい。この際に用
いる糖の例としては、ゲルコール、マンノース、ソルビ
トール、シュクロース、マルｉ・−ス、ｌ−レバロース
等単糖、二糖類等の単独又は混合物が挙げられる。膨潤
ラメラ液晶を形成させる為の水性溶液の使用量は、良溶
媒／貧溶媒の比率によるが、リボソーム膜構成物質−多
価アルコール液晶１重量部に対して約０〜２重量部が望
ましい。また、この膨潤ラメラ液晶を更に希釈する為の
水性溶液としては、水、ｐＨ緩衝液、生理食塩水、糖水
溶液及びこれらの混合いずれでも良い。

ここで、主要膜構成成分と良溶媒の混合系にステロール
類等の膜補強成分を添加して均一溶液とする為には、約
８０°Ｃまで加温、撹拌することにより、容易に混合せ
しめることが可能であり、そこにグリセリン等の貧溶媒
を加えて、いったんラメラ液晶を形成させてしまえば、
もはやそのように加温して用いる必要はない。

本発明に係る微細リボソーム調製法における温度は、一
般に脂質の相転移温度（Ｔｃ）Ｕ上で行った方が効率は
良く、従って、有効成分の薬剤を内包化する場合におい
ても、薬剤を含有する水性溶液はあらかじめＴｃ以上に
しておくことが望ましい。また、本発明にかかるリボソ
ーム調製法において、リボソームへの薬剤の保持効率を
アップさせるには、保持させる薬剤をできるだけ少量の
水性溶液に溶かし込み、これをラメラ液晶相内に封じ込
める（または薬剤を水性溶液にとかさず、直接ラメラ液
晶相内に（練り込められれば、より良い）ことが重要で
ある。

本発明の微細なリボソーム製剤に保持させる医薬品用薬
剤としては、用いる水溶性非揮発性有機溶媒、水性溶液
に溶解するものなら特に制限はないが、塩酸エチレフリ
ン、アミノフィリンに代表される強心剤、シチコリン、
塩酸グロプラノロール等の循環器増強剤、カルボクロメ
ン等の血管拡張剤、デキストラン硫酸等の動脈硬化剤、
塩酸フェニレフリン等の血管収縮剤、チアミラールナト
リウム、ペンＩ・バルビタ〜ルナトリウム、塩酸ケタミ
ン等の全身麻酔剤、塩酸ヒロカルビン、塩酸カルテオロ
ール、マレイン酸チモロール等の緑内障剤等が用いられ
る。

本発明に係る微細なリボソームの調製法において製剤に
保持される化粧料用薬剤としては、用いる水溶性非揮発
性有機溶媒、水性溶液に溶解するものなら特に制限はな
いが、アスコルビン酸フォスフエイト、インフェルラ酸
すトリウムなどの美白剤、グリチルリチン酸カリウムな
どの抗炎症剤、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチ
ン硫酸などの保湿剤等が用いられる。

このようにして薬剤を保持した均一粒径のリボソーム製
剤が再現性良くしかも大量に得られるが、このリボソー
ム製剤はこのまま使用しても良く、また透析、ゲルろ過
、遠心分離等の手段によりリボソームに保持されなかっ
た薬剤を分離除去して使用しても良い。

次に実施例により本発明の具体化例を示すが、これらの
実施例は何ら本発明を限定するものではない。

実施例１ 微細リボソームの調製 プロピレングリコール４．５ｇを７５℃に加温し、これ
に卵黄レシチン（純度９５％）　０．６ｇ、コレステロ
ール０．３ｇ、ホスファチジルセリンＯ，１ｇを加え撹
拌し、均一な溶液とした。次に同一温度条件でグリセリ
ン４．５ｇを加えて液晶ゲルを調製した。これにｌｏｇ
の５０％グルコース／２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７，４）を撹拌しながら１滴ずつ滴下して、膨潤ラメラ
液晶を形成させた。更に９０ｇの２０ｍＭ　トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，４）を撹拌しながら滴下していき、透
明なリボソーム溶液を得た。このリボソームの粒子径を
コールタ−・カウンター（モデ、ルＮ４ＭＤ）により測
定したところ、１１０２ｎの均一粒子分布のリボソーム
であることがわかった。一方、膨潤ラメラ液晶を形成さ
せず、−気にｂｕｆｆｅｒを加えて、撹拌した場合には
、３１Ｏｎｍと６０Ｑｎｍにピークを持つ、不均一なリ
ボソームとなった。

実施例２ 目薬用微細リボソームの調製 プロピレングリコール６ｇを７５°Ｃに加温し、これに
卵黄レシチン０．６ｇ、コレステロール０．３ｇ、ステ
アリルアミン０．ｈを加え、撹拌し、均一溶液とした。

次に同一温度条件でグリセリン３ｇを加えて、ｌＯ％上
記膜成分の３３．３％グリセリン・プロピレングリコー
ルの液晶ゲルを調製した。この液晶ゲル１ｇをとり、緑
内障側塩酸ピロカルピン０．１ｇを添加し、７５°Ｃに
てよく混合し、これに２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐ
ｌ’１７．４）　１　ｇを撹拌しながら１滴ずつ滴下し
、更に同一のｂｕｆｆｅｒ７．９ｇを撹拌しながら滴下
して、透明なリボソーム溶液を得た。このリボソーム溶
液をセファデックスＧ−５０ゲルカラム（ファルマシア
製）で外相の塩酸ピロカルピンを除去した。次いで、リ
ボソーム内に保持された塩酸ピロカルピンを高速液体ク
ロマトグラフィーにより測定したところ、保持効率は２
０．４％であった。このリボソームの粒子径は１３２ｎ
ｍであった。一方、同一の系＝１５− をイクストルーダー（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）にてリボソー
ムを調製したところ、粒子径はＩ　１２ｎｍで、保持効
率は５．３％にすぎなかった。

実施例３ 医療用微細リボソームの調製 １．３−ブチレングリコール３ｇを８０°Ｃに加温し、
これにＤＰＰＣ（純度９８％）　Ｏ，ｈｔ、コレスタノ
ール０．３ｇを加え、撹拌し、均一溶液とした。次に同
一温度条件でポリエチレングリコール４００　４ｇを加
えて、１２，５％上記膜成分の５７．１％ポリエヂレン
グリコール４００・１．３−　フチレンゲリコールの液
晶ゲルを調製した。この液晶ゲル１ｇをとり、血管拡張
剤カルボクロメン０．１ｇを添加し、８０　’Ｏにてよ
く混合し、これに２０＋ｎＭｌ−リス塩酸５ａｌｉｎｅ
　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７，４）　ｌ　９を撹拌しながら
１滴ずつ滴下し、更に同一のｂｕｆｆｅｒ　７．ｈを撹
拌しながら滴下して、澄明なりポソーム溶液を得た。

このリボソーム溶液をセファデックスＧ−５０ゲルカラ
ムで外相のカルボクロメンを除去し、リボソーム内のカ
ルボクロメンを高速液体クロマトグラフイーにより測定
したところ、保持効率は、１１．１％であった（粒子径
１５２旧ｎ）。一方、同一の系を旧ｃｒｏｆ　１ｕｉｄ
ｉｚｅｒにてリボソームを調製したところ、粒子径はｌ
　３０　ｎ　ｍで保持効率は２．２％にすぎず、同様に
、ラメラ液晶を用いず、後でカルボクロメンｂｕｆｆｅ
ｒ溶液を添加した場合には、１．８％にすぎなかった。

実施例４ 医薬用微細リボソームの調製 プロピレングリコール６ｇを７５°Ｃに加温し、これに
牛脳スフィンゴミエリン０．（３ｇ、コレステロール０
．３ｇ、ホスファチジルグリセロール０，１ｇを加え、
撹拌し、均一溶液とした。次に同一温度条件で、グリセ
リン６ｇを加えて、７．７％上記膜成分の５０％グリセ
リン・プロピレングリコールの液晶ゲルを調製した。こ
の液晶ゲルＩｇをとり、動脈硬化剤デキストラン硫酸帆
１ｇを添加し、７５℃にてよく混合し、これに１ｇの５
０％シュクロース／２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，４）を撹拌しながら１滴ずつ滴下して、更に５．６９
の２０ｍＭｌ・リス塩酸緩衝液を撹拌しながら滴下して
、澄明なりボソーム溶液を得た。このリボソームを実施
例３と同様に分離処理して、リボソーム内のデキストラ
ン硫酸を高速液体クロマトグラフィーにより測定したと
ころ、保持効率は９．９％であった（粒子ザイズｌ１８
ｎｍ）。

一方、同一の系をラメラ液晶を形成させずにリボソーム
を調製したところ、その粒子径は１１０００ｎ以上でし
かも不均一であり、数時間後には沈澱を生じてしまった
。

実施例５ 化粧料用微細リボソームの調製 アスコルビン酸ホスフェイト含有美自リボソーム化粧料 プロピレングリコール４．５ｇを７５℃に加温し、これ
に卵黄レシチン０．（ｉｇ、コレステロール０．３ｇ、
ジセチルリン酸帆１ｇを加え、撹拌し、均一溶液とした
。次に同一温度条件で、グリセリン４．５ｇを加えて、
ｌＯ％上記膜成分の５０％グリセリン・プロピレングリ
コールの液晶ゲルを調製した。

この液晶ゲル１９をとり、０．３ｇのアスコルビン酸ホ
スフェイトを添加し、４０℃にてよく混合し、混合しな
がら、これに０．５ｇの５０％グルコース水溶液を添加
し、更に８．２ｇの水を滴下して、澄明なりポソーム溶
液を得た。このリボソームを実施例３と同様に分離処理
して、アスコルビン酸ホスフェイトを高速液体クロマト
グラフィーにて測定したところ、保持効率は１８．７％
（粒子ザイズ１４１ｎｍ）であった。

〔発明の効果〕

既知のリボソーム調製法に比べて本発明法が優れている
点としては以下のことが挙げられる。

■、良溶媒と貧溶媒の比率を変えることにより任意のほ
ぼ均一な粒子径のリボソームを得ることができる。

２、膜補強成分を添加しても、貧溶媒の添加により室温
付近でもラメラ液晶を形成させることができるので、高
温に加熱する必要がない。

３、　ラメラ液晶相に大量の薬剤を封入できるので、他
の方法に比べて保持効率が高い。

４、　スフィンゴミエリン等の分子間力の大きい脂質で
も、１１００ｎ前後のリボソームを得ることができる。

５、　ピークの均質な粒子径のリボソームが再現良く得
られる。

６、大量生産が容易である。

本発明方法により調製された微細リボソームは安定であ
り、例えば窒素ガス置換、冷蔵庫放置（５℃）で状態は
変化しない（調製直後の粒子径１１０２ｎが１年６ケ月
後１０１０５ｎ。

また、抗酸化剤を添加した系では、室温でも安定であっ
た。

また、本発明方法により得られる微細リボソームを用い
ることにより、薬剤の経皮（あるいは経角膜）等の透過
性及び薬剤の血中安定性も非常に優れていた。例えば、
スフィンゴミエリン／コレステロール／ホスファチジル
グリセロール（６０／３０／１０）の系を用いて、カル
ボキシ７ルオロセインを内包させ、その血中動態を日本
内色種ウサギを用いて調べたところ、半減期は５時間以
上であり、リボソーム化しない場合に比べてのＡＵＧ（
ニアリア・アンダー・カーブ）も約２０倍であった。

特許出願人　ポーラ化成工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）リボソーム膜構成物質をその良溶媒である多価アル
   コールに溶解し、次いで貧溶媒である別の多価アルコー
   ルを添加し、充分に混合することによりリボソーム膜構
   成物質とそれらの多価アルコールから成るラメラ液晶を
   形成させ、次に、これに水もしくはリボソーム膜構成物
   質に応じて選択された適宜の物質の水溶液を用いて、こ
   れをラメラ液晶が壊れないように、緩徐に滴下しながら
   練り込むことにより膨潤したラメラ液晶を形成させ、次
   いで上記の水又は水溶液と同一もしくは別の水溶液を用
   いて、これを連続的に滴下することを特徴とする微細な
   リボソームの調製法。 ２）医薬および／または化粧料を内包せしめた請求項１
   ）に記載の微細なリボソームの調製法。