JPH0398596A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH0398596A JPH0398596A JP23508589A JP23508589A JPH0398596A JP H0398596 A JPH0398596 A JP H0398596A JP 23508589 A JP23508589 A JP 23508589A JP 23508589 A JP23508589 A JP 23508589A JP H0398596 A JPH0398596 A JP H0398596A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［Ｉ１！業上の利用分野〕
本発明は、モノクローナル抗体に関する．更に詳しくは
、ポテトセリンプロテアーゼインヒビターの分子構造と
機能の研究に有用なモノクローナル抗体に関する． ［従来の技術とその問題点］ 一般に、モノクローナル抗体は、各種の抗原抗体反応の
測定に利用され、特定の蛋白貢等の抗原抗体反応の機構
を検討するために有用であることは周知である． しかし、特定の抗原抗体反応の機構の検討に有用なモノ
クローナル抗体は、該反応に対する抗体として機能しな
ければならないので、かかる抗体は、特定の蛋白質等の
目的とする抗原抗体反応に適合するように遺伝子工学の
方法等を用いて個々に生合戊しなければならない．そし
て該生合成の手段も個々に異る． 本発明者等は、ポテトセリンプロテアーゼインヒビター
（ＰＰＩ−ＩＩａ）の分子構造と機能の研究を行ってい
るが、この研究に抗原抗体反応を利用することが、該イ
ンヒビターの高次構造を解明する上で必要と考えられた
． そこで、体内免疫法で免疫したＢＡＬＢ／ＣマウスのＭ
細胞と主エローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を５：１の比で融合
させて得られたパイプリドーマから、特異抗体産生細胞
をスクリーニングすることにより、２種類の作成抗体１
−８０ （ ＩｇＧ＋）と１−１１＾（ＩｇＭ）を得た
．そして、該抗体がいづれも， ＰＰＴ−ＩＩａから調
製された＾ｃｔｌｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔと抗原抗体反
応をする一方、還元ＣＭ化および還元アセトアよド化さ
れたＰＰＩ−ＩＩａとは反応しないことを知見して、本
発明を完成した． 抗原抗体反応についての以上の事実は、＾ｅｔＩｖｅＦ
ｒａｇ嘗ｅｎｔ内に存在する抗原決定部位にとって鎮内
Ｓ−Ｓ結合によって保持されている高次構造が１１Ｊ！
であることを示唆するものである．以上の記述から明ら
かなように、本発明の目的は、ポテトセリンインブロテ
アーゼヒビターの研究に有用なモノクローナル抗体およ
びその製造法を提供することである． ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記（１）の構成を有する．（１）ポテトセ
リンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａ （ＰＰＩ−
ＩＩ ａ）で免疫しｋマウス８＾ＬＢ／Ｃの牌細胞とマ
ウスミローマ細ＱＰ３Ｕｌをポリエチレングリコール４
０００を用いて細胞融合させ、該融合物をＰＰＩ−Ｈａ
に対する特異抗体産生ハイブリドーマでスクリーニング
し、および限界希釈法によるクローニングを行って １
−１１Ａ株および１−８Ｄ株を取得し、該１−１１＾株
に産生せしめてなるモノクローナル抗体ＬｇＭおよび該
１−６Ｄ株に産生せしめてなるモノクローナル抗体１３
Ｇ．， 本発明の構成と効果につき以下に詳述する．ｌ．モノク
ローナル抗体の作製 ■ポテトセリンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａ（Ｐ
ＰＩ−１１ ａ）によるＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫：Ｐ
ＰＩｉｌａ抗原溶液（ＳＯＯμｇ／ ＩＪＬｏｆ Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ−ＰＢＳ） ２００μｌｌとＦｒｅｕｎｄ
’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＡＪｕｖａｎｔ ２００μぶ
を混合乳化させ、マウス（ ＢＡＬＢ／Ｃ．雌．８週令
）の腹腔内に注射した． ２週間後、同じ操作で追加免疫を行った．さらに２週間
後に １００μ角の抗原溶液のみを腹腔内に注射した．
その３日後に牌臓を摘出して牌細胞を調製した． ■牌ｍ胞とマウス由来ミエローマｍ胞とのｍ胞融合； 対数増殖期にあるマウスミエローマｍ胞（Ｐ３Ｕ１）２
ｘ １０’ ｃｅｌｌｓと上記調製牌細胞１０Ｘ １
０’ ｃｅｌｌｇ−細胞比ｌ／５−を４７％Ｐｏｌｙｅ
ｔｈｙｌｅｒ＋ｅｇｌｙｃｏｌ ４０００４．７％ ０
１ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｌｄｅ／ｒｓｃｏｖｅ Ｍ
ｏｄｌｆｌｄｅＤｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｅｄｌｕ＋ｓを用
いて融合させた．■ハイブリドーマの培養と特異抗体産
生ハイブリドーマのクローニング： 融合細胞を｝ＩＡＴ−ＩＭＤＭ （Ｈｙｐｏｘａｎｔｈ
Ｉｎｅ−ａｍｌｍｏｐｔａｒＩｎ−Ｊｈｙｍｆｄｌｎｅ
−Ｉｓｃｏｖｅ ＭｏｄｌｆＩｅｄ Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ Ｍｅｄ１ｕｍ（ ａｍｌｎｏｐｔｅｒｌｎを除
外した培地）で４〜５日間培養した．培養上清について
ＥＬｒＳＡ法により抗体陽性細胞を選択し、限界希釈
法によるクローニングを行った． この結果をまとめて表１、表２に示す．表１ 細胞融合
および抗体産生パイブリドーマの培養 −１０％ＦＣＳ）で７日間培養し，さらにＨＴ−ＩＭＤ
ｋｌ表２．抗体産生パイプリドーマのクローニング５−
８Ａ株よりクローニングされた抗体産生株１１１＾５−
ＩＦ株よりクローニングされた抗体産生株１−６Ｄ（
）特異抗体産生ウエル数 注）複数コロニー生成ウエルは 存在しなかった． ＋１ ．作製モノクローナル抗体の性質■モノクローナ
ル抗体の調製： ポテトセリンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａに対す
る抗体を産生ずるモノクローンハイブリドーｖ （１
−６Ｄ株，１−１１＾株）を！０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭで
培養して上清を得た．ついで、硫安１／２飽和で抗体を
分別沈殿させ、以下実験に供した． ■モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの同定： ウサギー抗マウスＩｇＧ＋． ＩｇＧ２ａ， ＩｇＧｚ
ｂ． ＩｇＧｓ（ＺＹＭＥＤ社）およびヤギー抗マウス
ＩｇＭ ＣＭＩＬＥＳ社）を用い、 ＥＬＩＳＡ法によ
り、上記２株の産生ずるモノクローナル抗体の同定を行
った．その結果第１図に示すように， ！−８Ｄ株と
１−１１Ａ株の彦生ずる抗体は各々ＩｇＧ．とＩｇＭと
同定された． ■モノクローナル抗体の抗原特異性： １−６０株と １−１１＾株の彦生ずる抗体の力価を評
価したところ、１−６０株の抗体は、第２図に示すよう
に約２５５０倍希釈上清で、抗体飽和率６０％を与える
ことが明らかになった．これに対し、１−１１Ａ株の抗
体は２５０倍希釈で同じ６０％の値を与えた．従って力
価の高かった１−６Ｄ株の産生ずる抗体について、以下
の実験を行うことにした． ＋１１．−Ｅ−ノクローナル抗体（１−６Ｄ）に対する
ＰＰＩ−■ａの抗原決定部位 ■Ｉ−６Ｄ株の産生ずるモノクローナル抗体（１−６０
−Ｍａｂ）に対する＾ｃｔｌｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔの
抗原特異性：ＰＰＩ−ＩＩａの抗原決定部位に関与する
アミノ酸残基を含むベプチドを分離する前段階として，
ＰＰＩ−ＩＩａ（構成アミノ酸残基数９７）より調製
したインヒビター活性をもつ＾ｃｔｉｖｅ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ（構成アミノ酸残基数４５）の抗原特異性を検討
し、第３図に示す結果を得た． ＾ｃｔｉｖｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ア≧ノ酸配列は後述
）が、ＰＰＩ−ＩＩａと１−６Ｄ−Ｍａｂの抗原抗体反
応を完全に阻害したことから、このＦｒａｇ璽ｅｎｔに
抗原決定部位が存在することが明示された． ■抗原決定部位を構成するアミノ酸残基を含むベブチド
の分離絹製： ＰＰＴ−Ｈａは分子内に６ヶのジスルフィド結合を有し
ているので、多数のループ断片から構成されていると考
えられる．従って、ループ断片そのものを分子より分割
させ、抗原活性を示すループ断片を分離精製することを
試みた． （ａ） ＰＰＩ−Ｔｌ ａのジスルフィド結合の還元開
裂とこれに次ぐ、２−Ｎｉｔｒｏ−Ｓ−ｔｈｌｏｃｙａ
ｎｏｂａｎｘｏａｔｅ （ＮＴＣＢ）によるシスティン
残基のアミノ基側ベブチド結合の切断 ＰＰＩ−ＩＩａを６Ｎ塩酸グアニジン−０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ ８．０中でジチオスレイトール処
理することにより、分子内ジスルフィド結合を還元開裂
させた．次いで、生じたシスティン残基をＮＴＣ８で修
飾するとともに、そのアミノ基側のベブチド結合を切断
した．ついで反応混液を５０％酢酸を用いたＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−１ｓカラムによるゲル濾過に供し、過剰の
試薬を除去した．ペブチド画分を次の実験に供した． （ｂ）逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によるベブチドの分離精製上記ベブチド
画分をＣｌａ−７−００５−｝１カラム（４．６ｘ ２
ＳＯＩＩｓ）を用いたＨＰＬＣに供与し、第４図に示す
溶液パターンを得た． なお、分離されたＮＴＣＢ−１〜ＮＴＣＢ−７の各ピー
クの抗原活性は、各々のピークに含まれるペプチドを固
相に吸着させたのち、１−６０−Ｍａｂを結合させＥＬ
ＩＳＡ法によって測定した．二次抗体に結合させたＨｏ
ｒｓｅｒａｄｌｓｈ − Ｐｅｒｏｘｌｄａｓｅの酵素
活性の測定値を第４図中の各溶出ピーク名の後に記した
．同じ条件で測定したＰＰＩ−ＩＩａおよびＮＴＣＢ処
理ＰＰＩｉｌａ分割混合ペプチドの活性は、それぞれＯ
、４３と０．１３であった． ■抗原活性を有すベブチドのアミノ酸組成：抗原活性の
高かったＮ丁ＣＢ−３， ＮＴＣＢ−４， ＮＴＣＢ−
５（いづれも第４図中に陰をほどこしたピーク）につい
て、そのアミノ酸組成分析を行った．その結果を第３表
に、ＰＰＩＩＩａのアくノ酸配列上相同な部位のアミノ
酸組成とともに示す． 第３表 ＨＰＬＣ生成ベブチドのアミノ酸組成注、＊（
）内数は理論値を示す． ＋１７ＣＢ−３とＮ丁ＣＢ−４のアミノ酸組成はＰＰＩ
−ＩＩｇのアミノ酸配列（第５図）上の５７−９７に近
似していた．またＮＴＣＢ−５は、反応部位Ｌｙｓ”−
Ｓｅｒ”を含む５７−８７に一致していた． 以上の結果、１−６０−Ｍａｂによって認識される抗原
決定部位を構成する主要アミノ酸残基は、セリンブロテ
アーゼに対する反応部位（第５図中Ｏ印で囲んだ−Ｌｙ
ｓ−Ｓｅｒ）を含んだ（ｙｓ８７〜（ｙｓ８６の間のル
ープに存在することが明らかになった．■抗原決定部位
構成主要アミノ酸残基がＰＰＩ−１ｆａの−（Ｈｙｓ８
７〜Ｃｙｓ■一間のループに存在していることの間接的
証拠： ＨＰＬＣで分踵されたＮ丁ＣＢ−５ベプチドに抗原活性
が認められたことから、−（ｙｓ！７〜Ｃｙｓ６８−の
間のループに抗原決定部位を構成する主要なアミノ酸残
基が存在していることが直接証明された．ここでは，
ＰＰＴ−■ａとアミノ酸配列において相同性の高いＰＰ
Ｉ−１１ｂの抗原活性を比較することによって、抗原決
定部位を構成しているアミノ酸残基を明らかにすること
を試みた． その結果第６図に示すように、固相吸着ＰＰ■−ＩＩ
ｍと１−６０−Ｍａｂの抗原抗体反応に対するＰＰＩ−
１１ｂによる拮抗阻害は全く認められなかった．このこ
とからアミノ酸配列上相同性が高いにも拘らず、ＰＰＩ
−１１ｂには、このモノクローナル抗体に対する抗原決
定部位は存在しないことが明らかになった． １−６Ｄ−ＭａｂはＰＰＩ−ＩＩａの＾ｃｔｉｖａ Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔを抗原として認識し、また＾ｃｔｌｖｅ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ分子由来のＮＴＣＢ−５ベブチドを
も認識することは既に記述したとおりである．いま、ア
ミノ酸配列が決定されているＰＰＩ−ＩＩａの＾ｃｔｌ
ｖａ Ｆｒａｇ＋ａｅｎｔとＰＰＩ−１１ｂの＾ｃｔｌ
ｖｅ Ｆｒａｇｍ＠ｎｔ（共に第７図に示す）を比較す
ると、ＰＰＩ−ＩＩａ＾．Ｆ．に抗原活性があり、ＰＰ
Ｉ−１１ｂ＾，Ｆ．に抗原活性がなかったことから、０
で囲んだ相同のア暑ノ酸残基は抗原決定部位に関与して
いす、ロで囲んだ相異アミノｍ残基のみが関与している
ことが推測された．また、一Ｃｙｓｓ７〜Ｃｙｓ＠Ｂ一
のループに限って、その相同性を比較すると下に示すよ
うに、反応部位を含む−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−は相
同であることから、ＰＰＩ−ＩＩａ＾．Ｆ，のアミノ酸
配列のうち、＾ｓｐ”−Ｓｅｔ” （Ｈｅｘａｐｅｐｔ
ｌｄｅ）のアミノ酸側鎮が、抗原一抗体反応にとってＩ
ｉ要であることが示唆された． Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ＾ ［効果］ ・ポテトセリンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａ（Ｐ
ＰＩ−ＩＩａ）で免疫したマウスＢＡＬＢ／Ｃの牌細胞
とマウスミエローマ細胞Ｐ３１１１を Ｐｏｌｙｅｔｈ
ｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏ１ ４０００を用いて細胞融合さ
せた．ついで、ＰＰＩ−ＩＩａに対する特異抗体産生八
イプリドーマのスクリーニングと限界希釈法によるクロ
ーニングを行い、 １−１１Ａ株と１−６Ｄ株を得た．
１−１１Ａ株および１−６Ｄ株の産生ずるモノクローナ
ル抗体は、各々 ＩｇＭとＩｇＧ，であった．また、１
−６０株の培養上清の抗体力値は１−１１＾の約ｌθ倍
であった． ・１−８０株の産生ずるモノクローナル抗体（ １−６
Ｄ−Ｍａｂ）は、ＰＰＩ−ＩＩａ （構成アミノ酸残
基９７）とＰＰＩ−ＩＩａ由来の＾ｂｔｌｖｅ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ （構成アミノ残基４５）と共に認識し抗
原一抗体反応した．このことから抗原決定部位は＾ｂｔ
１ｖａ Ｆｒａｇｍｅｎｔ内に存在することが示された
． ・抗原活性を保持するベブイチドを得るため、ＰＰＩ−
ＩＩａのジスルフィド結合を還元開裂させたのち、２−
ｎＩｔｒｏ−Ｓｔｈｌｏｃｙａｎｏｂｅｎｘｏａｔｅ
（ＮＴＩＩ：Ｂ）によりシステイン残基のアミノ基側の
ベブチド結合を切断した．ついで、Ｃ，，−７−００５
−｝１カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより、抗原活性を
保持した３つのべブチド（ ＮＴＣＢ−３、ＮＴＣＢ−
４、ＮＴＣＢ−５ ）を分離した．・分離したべブチド
のうちＮＴＣＢ−５は、そのアミノ酸組戒から、＾ｂｔ
ｉｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （Ｓｅｒｓ４−＾ｒ１８
）内のＣｙｓ”−Ｖａｌ”に相当するベブチドであるこ
とが明らかとなった． ＮＴＣＢ−３とＮＴＣＢ−４は
互にア主ノ酸組成が近似していて、いづれもＰＰＩ−Ｉ
Ｉａ （＾ｌａ’−＾１ａ９？）のうち、ＮＴＣＢ−５
ベブチドも含んだベブチドＣｙｓ”−八１ａ４？である
ことが推定された．後者の２つのべブチドは、ＮＴＣＢ
による切断が不充分な結果生じたべブチドであることが
推測された．・ＰＰＩ−１１ ａ由来の＾ｂｔ１ｖｅ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ （抗原活性有り）とＰＰＩ−１１
ｂ由来の＾ｂｔｌｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （抗原活
性無し）のアミノ酸配列の比較から、−（ｙＳＳ？〜Ｃ
ｙｓ１１Ｍ一間のループを形成しているアミノ酸残基の
うち、特に＾ｐｓ”−Ｔｈｒ−＾ｓｎ−ＩＩｓ−＾１ａ
−Ｓａｒ”のＨｅｘａｐｅｐｔｌｄａの側鏡が抗原決定
部位の構成に主要であることが示唆された．
、ポテトセリンプロテアーゼインヒビターの分子構造と
機能の研究に有用なモノクローナル抗体に関する． ［従来の技術とその問題点］ 一般に、モノクローナル抗体は、各種の抗原抗体反応の
測定に利用され、特定の蛋白貢等の抗原抗体反応の機構
を検討するために有用であることは周知である． しかし、特定の抗原抗体反応の機構の検討に有用なモノ
クローナル抗体は、該反応に対する抗体として機能しな
ければならないので、かかる抗体は、特定の蛋白質等の
目的とする抗原抗体反応に適合するように遺伝子工学の
方法等を用いて個々に生合戊しなければならない．そし
て該生合成の手段も個々に異る． 本発明者等は、ポテトセリンプロテアーゼインヒビター
（ＰＰＩ−ＩＩａ）の分子構造と機能の研究を行ってい
るが、この研究に抗原抗体反応を利用することが、該イ
ンヒビターの高次構造を解明する上で必要と考えられた
． そこで、体内免疫法で免疫したＢＡＬＢ／ＣマウスのＭ
細胞と主エローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を５：１の比で融合
させて得られたパイプリドーマから、特異抗体産生細胞
をスクリーニングすることにより、２種類の作成抗体１
−８０ （ ＩｇＧ＋）と１−１１＾（ＩｇＭ）を得た
．そして、該抗体がいづれも， ＰＰＴ−ＩＩａから調
製された＾ｃｔｌｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔと抗原抗体反
応をする一方、還元ＣＭ化および還元アセトアよド化さ
れたＰＰＩ−ＩＩａとは反応しないことを知見して、本
発明を完成した． 抗原抗体反応についての以上の事実は、＾ｅｔＩｖｅＦ
ｒａｇ嘗ｅｎｔ内に存在する抗原決定部位にとって鎮内
Ｓ−Ｓ結合によって保持されている高次構造が１１Ｊ！
であることを示唆するものである．以上の記述から明ら
かなように、本発明の目的は、ポテトセリンインブロテ
アーゼヒビターの研究に有用なモノクローナル抗体およ
びその製造法を提供することである． ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記（１）の構成を有する．（１）ポテトセ
リンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａ （ＰＰＩ−
ＩＩ ａ）で免疫しｋマウス８＾ＬＢ／Ｃの牌細胞とマ
ウスミローマ細ＱＰ３Ｕｌをポリエチレングリコール４
０００を用いて細胞融合させ、該融合物をＰＰＩ−Ｈａ
に対する特異抗体産生ハイブリドーマでスクリーニング
し、および限界希釈法によるクローニングを行って １
−１１Ａ株および１−８Ｄ株を取得し、該１−１１＾株
に産生せしめてなるモノクローナル抗体ＬｇＭおよび該
１−６Ｄ株に産生せしめてなるモノクローナル抗体１３
Ｇ．， 本発明の構成と効果につき以下に詳述する．ｌ．モノク
ローナル抗体の作製 ■ポテトセリンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａ（Ｐ
ＰＩ−１１ ａ）によるＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫：Ｐ
ＰＩｉｌａ抗原溶液（ＳＯＯμｇ／ ＩＪＬｏｆ Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ−ＰＢＳ） ２００μｌｌとＦｒｅｕｎｄ
’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＡＪｕｖａｎｔ ２００μぶ
を混合乳化させ、マウス（ ＢＡＬＢ／Ｃ．雌．８週令
）の腹腔内に注射した． ２週間後、同じ操作で追加免疫を行った．さらに２週間
後に １００μ角の抗原溶液のみを腹腔内に注射した．
その３日後に牌臓を摘出して牌細胞を調製した． ■牌ｍ胞とマウス由来ミエローマｍ胞とのｍ胞融合； 対数増殖期にあるマウスミエローマｍ胞（Ｐ３Ｕ１）２
ｘ １０’ ｃｅｌｌｓと上記調製牌細胞１０Ｘ １
０’ ｃｅｌｌｇ−細胞比ｌ／５−を４７％Ｐｏｌｙｅ
ｔｈｙｌｅｒ＋ｅｇｌｙｃｏｌ ４０００４．７％ ０
１ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｌｄｅ／ｒｓｃｏｖｅ Ｍ
ｏｄｌｆｌｄｅＤｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｅｄｌｕ＋ｓを用
いて融合させた．■ハイブリドーマの培養と特異抗体産
生ハイブリドーマのクローニング： 融合細胞を｝ＩＡＴ−ＩＭＤＭ （Ｈｙｐｏｘａｎｔｈ
Ｉｎｅ−ａｍｌｍｏｐｔａｒＩｎ−Ｊｈｙｍｆｄｌｎｅ
−Ｉｓｃｏｖｅ ＭｏｄｌｆＩｅｄ Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ Ｍｅｄ１ｕｍ（ ａｍｌｎｏｐｔｅｒｌｎを除
外した培地）で４〜５日間培養した．培養上清について
ＥＬｒＳＡ法により抗体陽性細胞を選択し、限界希釈
法によるクローニングを行った． この結果をまとめて表１、表２に示す．表１ 細胞融合
および抗体産生パイブリドーマの培養 −１０％ＦＣＳ）で７日間培養し，さらにＨＴ−ＩＭＤ
ｋｌ表２．抗体産生パイプリドーマのクローニング５−
８Ａ株よりクローニングされた抗体産生株１１１＾５−
ＩＦ株よりクローニングされた抗体産生株１−６Ｄ（
）特異抗体産生ウエル数 注）複数コロニー生成ウエルは 存在しなかった． ＋１ ．作製モノクローナル抗体の性質■モノクローナ
ル抗体の調製： ポテトセリンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａに対す
る抗体を産生ずるモノクローンハイブリドーｖ （１
−６Ｄ株，１−１１＾株）を！０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭで
培養して上清を得た．ついで、硫安１／２飽和で抗体を
分別沈殿させ、以下実験に供した． ■モノクローナル抗体のクラス、サブクラスの同定： ウサギー抗マウスＩｇＧ＋． ＩｇＧ２ａ， ＩｇＧｚ
ｂ． ＩｇＧｓ（ＺＹＭＥＤ社）およびヤギー抗マウス
ＩｇＭ ＣＭＩＬＥＳ社）を用い、 ＥＬＩＳＡ法によ
り、上記２株の産生ずるモノクローナル抗体の同定を行
った．その結果第１図に示すように， ！−８Ｄ株と
１−１１Ａ株の彦生ずる抗体は各々ＩｇＧ．とＩｇＭと
同定された． ■モノクローナル抗体の抗原特異性： １−６０株と １−１１＾株の彦生ずる抗体の力価を評
価したところ、１−６０株の抗体は、第２図に示すよう
に約２５５０倍希釈上清で、抗体飽和率６０％を与える
ことが明らかになった．これに対し、１−１１Ａ株の抗
体は２５０倍希釈で同じ６０％の値を与えた．従って力
価の高かった１−６Ｄ株の産生ずる抗体について、以下
の実験を行うことにした． ＋１１．−Ｅ−ノクローナル抗体（１−６Ｄ）に対する
ＰＰＩ−■ａの抗原決定部位 ■Ｉ−６Ｄ株の産生ずるモノクローナル抗体（１−６０
−Ｍａｂ）に対する＾ｃｔｌｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔの
抗原特異性：ＰＰＩ−ＩＩａの抗原決定部位に関与する
アミノ酸残基を含むベプチドを分離する前段階として，
ＰＰＩ−ＩＩａ（構成アミノ酸残基数９７）より調製
したインヒビター活性をもつ＾ｃｔｉｖｅ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ（構成アミノ酸残基数４５）の抗原特異性を検討
し、第３図に示す結果を得た． ＾ｃｔｉｖｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ア≧ノ酸配列は後述
）が、ＰＰＩ−ＩＩａと１−６Ｄ−Ｍａｂの抗原抗体反
応を完全に阻害したことから、このＦｒａｇ璽ｅｎｔに
抗原決定部位が存在することが明示された． ■抗原決定部位を構成するアミノ酸残基を含むベブチド
の分離絹製： ＰＰＴ−Ｈａは分子内に６ヶのジスルフィド結合を有し
ているので、多数のループ断片から構成されていると考
えられる．従って、ループ断片そのものを分子より分割
させ、抗原活性を示すループ断片を分離精製することを
試みた． （ａ） ＰＰＩ−Ｔｌ ａのジスルフィド結合の還元開
裂とこれに次ぐ、２−Ｎｉｔｒｏ−Ｓ−ｔｈｌｏｃｙａ
ｎｏｂａｎｘｏａｔｅ （ＮＴＣＢ）によるシスティン
残基のアミノ基側ベブチド結合の切断 ＰＰＩ−ＩＩａを６Ｎ塩酸グアニジン−０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ ８．０中でジチオスレイトール処
理することにより、分子内ジスルフィド結合を還元開裂
させた．次いで、生じたシスティン残基をＮＴＣ８で修
飾するとともに、そのアミノ基側のベブチド結合を切断
した．ついで反応混液を５０％酢酸を用いたＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−１ｓカラムによるゲル濾過に供し、過剰の
試薬を除去した．ペブチド画分を次の実験に供した． （ｂ）逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によるベブチドの分離精製上記ベブチド
画分をＣｌａ−７−００５−｝１カラム（４．６ｘ ２
ＳＯＩＩｓ）を用いたＨＰＬＣに供与し、第４図に示す
溶液パターンを得た． なお、分離されたＮＴＣＢ−１〜ＮＴＣＢ−７の各ピー
クの抗原活性は、各々のピークに含まれるペプチドを固
相に吸着させたのち、１−６０−Ｍａｂを結合させＥＬ
ＩＳＡ法によって測定した．二次抗体に結合させたＨｏ
ｒｓｅｒａｄｌｓｈ − Ｐｅｒｏｘｌｄａｓｅの酵素
活性の測定値を第４図中の各溶出ピーク名の後に記した
．同じ条件で測定したＰＰＩ−ＩＩａおよびＮＴＣＢ処
理ＰＰＩｉｌａ分割混合ペプチドの活性は、それぞれＯ
、４３と０．１３であった． ■抗原活性を有すベブチドのアミノ酸組成：抗原活性の
高かったＮ丁ＣＢ−３， ＮＴＣＢ−４， ＮＴＣＢ−
５（いづれも第４図中に陰をほどこしたピーク）につい
て、そのアミノ酸組成分析を行った．その結果を第３表
に、ＰＰＩＩＩａのアくノ酸配列上相同な部位のアミノ
酸組成とともに示す． 第３表 ＨＰＬＣ生成ベブチドのアミノ酸組成注、＊（
）内数は理論値を示す． ＋１７ＣＢ−３とＮ丁ＣＢ−４のアミノ酸組成はＰＰＩ
−ＩＩｇのアミノ酸配列（第５図）上の５７−９７に近
似していた．またＮＴＣＢ−５は、反応部位Ｌｙｓ”−
Ｓｅｒ”を含む５７−８７に一致していた． 以上の結果、１−６０−Ｍａｂによって認識される抗原
決定部位を構成する主要アミノ酸残基は、セリンブロテ
アーゼに対する反応部位（第５図中Ｏ印で囲んだ−Ｌｙ
ｓ−Ｓｅｒ）を含んだ（ｙｓ８７〜（ｙｓ８６の間のル
ープに存在することが明らかになった．■抗原決定部位
構成主要アミノ酸残基がＰＰＩ−１ｆａの−（Ｈｙｓ８
７〜Ｃｙｓ■一間のループに存在していることの間接的
証拠： ＨＰＬＣで分踵されたＮ丁ＣＢ−５ベプチドに抗原活性
が認められたことから、−（ｙｓ！７〜Ｃｙｓ６８−の
間のループに抗原決定部位を構成する主要なアミノ酸残
基が存在していることが直接証明された．ここでは，
ＰＰＴ−■ａとアミノ酸配列において相同性の高いＰＰ
Ｉ−１１ｂの抗原活性を比較することによって、抗原決
定部位を構成しているアミノ酸残基を明らかにすること
を試みた． その結果第６図に示すように、固相吸着ＰＰ■−ＩＩ
ｍと１−６０−Ｍａｂの抗原抗体反応に対するＰＰＩ−
１１ｂによる拮抗阻害は全く認められなかった．このこ
とからアミノ酸配列上相同性が高いにも拘らず、ＰＰＩ
−１１ｂには、このモノクローナル抗体に対する抗原決
定部位は存在しないことが明らかになった． １−６Ｄ−ＭａｂはＰＰＩ−ＩＩａの＾ｃｔｉｖａ Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔを抗原として認識し、また＾ｃｔｌｖｅ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ分子由来のＮＴＣＢ−５ベブチドを
も認識することは既に記述したとおりである．いま、ア
ミノ酸配列が決定されているＰＰＩ−ＩＩａの＾ｃｔｌ
ｖａ Ｆｒａｇ＋ａｅｎｔとＰＰＩ−１１ｂの＾ｃｔｌ
ｖｅ Ｆｒａｇｍ＠ｎｔ（共に第７図に示す）を比較す
ると、ＰＰＩ−ＩＩａ＾．Ｆ．に抗原活性があり、ＰＰ
Ｉ−１１ｂ＾，Ｆ．に抗原活性がなかったことから、０
で囲んだ相同のア暑ノ酸残基は抗原決定部位に関与して
いす、ロで囲んだ相異アミノｍ残基のみが関与している
ことが推測された．また、一Ｃｙｓｓ７〜Ｃｙｓ＠Ｂ一
のループに限って、その相同性を比較すると下に示すよ
うに、反応部位を含む−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−は相
同であることから、ＰＰＩ−ＩＩａ＾．Ｆ，のアミノ酸
配列のうち、＾ｓｐ”−Ｓｅｔ” （Ｈｅｘａｐｅｐｔ
ｌｄｅ）のアミノ酸側鎮が、抗原一抗体反応にとってＩ
ｉ要であることが示唆された． Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ＾ ［効果］ ・ポテトセリンプロテアーゼインヒビターＩＩ ａ（Ｐ
ＰＩ−ＩＩａ）で免疫したマウスＢＡＬＢ／Ｃの牌細胞
とマウスミエローマ細胞Ｐ３１１１を Ｐｏｌｙｅｔｈ
ｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏ１ ４０００を用いて細胞融合さ
せた．ついで、ＰＰＩ−ＩＩａに対する特異抗体産生八
イプリドーマのスクリーニングと限界希釈法によるクロ
ーニングを行い、 １−１１Ａ株と１−６Ｄ株を得た．
１−１１Ａ株および１−６Ｄ株の産生ずるモノクローナ
ル抗体は、各々 ＩｇＭとＩｇＧ，であった．また、１
−６０株の培養上清の抗体力値は１−１１＾の約ｌθ倍
であった． ・１−８０株の産生ずるモノクローナル抗体（ １−６
Ｄ−Ｍａｂ）は、ＰＰＩ−ＩＩａ （構成アミノ酸残
基９７）とＰＰＩ−ＩＩａ由来の＾ｂｔｌｖｅ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ （構成アミノ残基４５）と共に認識し抗
原一抗体反応した．このことから抗原決定部位は＾ｂｔ
１ｖａ Ｆｒａｇｍｅｎｔ内に存在することが示された
． ・抗原活性を保持するベブイチドを得るため、ＰＰＩ−
ＩＩａのジスルフィド結合を還元開裂させたのち、２−
ｎＩｔｒｏ−Ｓｔｈｌｏｃｙａｎｏｂｅｎｘｏａｔｅ
（ＮＴＩＩ：Ｂ）によりシステイン残基のアミノ基側の
ベブチド結合を切断した．ついで、Ｃ，，−７−００５
−｝１カラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより、抗原活性を
保持した３つのべブチド（ ＮＴＣＢ−３、ＮＴＣＢ−
４、ＮＴＣＢ−５ ）を分離した．・分離したべブチド
のうちＮＴＣＢ−５は、そのアミノ酸組戒から、＾ｂｔ
ｉｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （Ｓｅｒｓ４−＾ｒ１８
）内のＣｙｓ”−Ｖａｌ”に相当するベブチドであるこ
とが明らかとなった． ＮＴＣＢ−３とＮＴＣＢ−４は
互にア主ノ酸組成が近似していて、いづれもＰＰＩ−Ｉ
Ｉａ （＾ｌａ’−＾１ａ９？）のうち、ＮＴＣＢ−５
ベブチドも含んだベブチドＣｙｓ”−八１ａ４？である
ことが推定された．後者の２つのべブチドは、ＮＴＣＢ
による切断が不充分な結果生じたべブチドであることが
推測された．・ＰＰＩ−１１ ａ由来の＾ｂｔ１ｖｅ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ （抗原活性有り）とＰＰＩ−１１
ｂ由来の＾ｂｔｌｖｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （抗原活
性無し）のアミノ酸配列の比較から、−（ｙＳＳ？〜Ｃ
ｙｓ１１Ｍ一間のループを形成しているアミノ酸残基の
うち、特に＾ｐｓ”−Ｔｈｒ−＾ｓｎ−ＩＩｓ−＾１ａ
−Ｓａｒ”のＨｅｘａｐｅｐｔｌｄａの側鏡が抗原決定
部位の構成に主要であることが示唆された．
第１〜７図は、本発明のモノクローナル抗体の調製工程
または物性を説明するための説明図である．
または物性を説明するための説明図である．
Claims (1)
- （１）ポテトセリンプロテアーゼインヒビターIIａ（Ｐ
Ｐ I −IIａ）で免疫したマウスＢＡＬＢ／Ｃの■細胞
とマウスミローマ細胞Ｐ３Ｕ１をポリエチレングリコー
ル４０００を用いて細胞融合させ、該融合物をＰＰ I
−IIａに対する特異抗体産生ハイブリドーマでスクリー
ニングし、および限界希釈法によるクローニングを行っ
て I −１１Ａ株および I −６Ｄ株を取得し、該 I −
１１Ａ株に産生せしめてなるモノクローナル抗体１ｇＭ
および該 I −６Ｄ株に産生せしめてなるモノクローナ
ル抗体１ｇＧ＿１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23508589A JPH0398596A (ja) | 1989-09-11 | 1989-09-11 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23508589A JPH0398596A (ja) | 1989-09-11 | 1989-09-11 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0398596A true JPH0398596A (ja) | 1991-04-24 |
Family
ID=16980847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23508589A Pending JPH0398596A (ja) | 1989-09-11 | 1989-09-11 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0398596A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002515454A (ja) * | 1998-05-20 | 2002-05-28 | エラスムス ユニフェルシテイト ロッテルダム | 炎症または掻痒の予防または治療方法および手段 |
-
1989
- 1989-09-11 JP JP23508589A patent/JPH0398596A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002515454A (ja) * | 1998-05-20 | 2002-05-28 | エラスムス ユニフェルシテイト ロッテルダム | 炎症または掻痒の予防または治療方法および手段 |
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