CN118240087A - 一种Anti-RNAse R抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种Anti‑RNAse R抗体及其应用；本发明通过对RNase R的免疫筛选获得了一对Anti‑RNase R抗体，15C3F4和11A3E4，用该配对抗体进一步开发了高灵敏度RNase R残留检测Elisa试剂盒，适用于circRNA治疗药物及疫苗生产领域对circRNA中RNase R残留检测质控。

Description

一种Anti-RNAse R抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种Anti-RNAse R抗体及其应用。

背景技术

核糖核酸酶R(RNase R,Uniprot:P21499)来源于大肠杆菌，属于RNase II家族的一种镁离子依赖性的3'→5'核糖核酸外切酶。RNase R由外切核酸酶结构域(RNB)以及多个辅助结构域组成，RNB结构域具有对RNA解旋和降解的功能，辅助结构域则起到结合RNA的功能。RNase R可以结合，解旋并降解具有二级结构的RNA，包括线性RNA以及3'端突出末端至少7个核苷酸的双链RNA分子。但RNase R不易消化呈环形的RNA、套索结构或3'端突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。近年来体外合成的环状RNA(circRNA)凭借稳定性强、免疫原性低等诸多优点成为一类新兴的RNA治疗药物和疫苗。circRNA是一类没有5'或3'末端的闭合RNA，体外转录及环化反应结束后，产物中会存在多种类型的RNA杂质，主要包括未环化的前体(precursor)RNA；circRNA产生切口的(nicked)RNA，即长度与CircRNA相同的单链线性RNA；以及环化剪切产生的上下游内含子序列。RNase R可应用于工业生产消化线性RNA，富集circRNA。

而经过纯化的circRNA中，可能存在RNase R残留，如果跟随生物制品进入人体内，有可能引发免疫原性等反应，引起安全风险。因此需要对RNase R的残留进行准确的分析检测，使之控制在安全范围内。

发明内容

本发明通过对RNase R的免疫筛选获得了一对Anti-RNase R抗体，15C3F4和11A3E4，用该配对抗体进一步开发了高灵敏度RNase R残留检测Elisa试剂盒，适用于circRNA治疗药物及疫苗生产领域对circRNA中RNase R残留检测质控。

本发明第一个方面公开了一对高亲和力配对抗体，包括15C3F4和11A3E4；

根据IMGT编号系统，所述抗体15C3F4具有如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区CDR3；

CDR-1QSLLDSEGKTY(SEQ ID NO:1)

CDR-2LVS(SEQ ID NO:2)

CDR-3WQGTHFPWT(SEQ ID NO:3)；

以及如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区CDR3；

CDR-1GYSFTGYT(SEQ ID NO:4)

CDR-2INPYNGGT(SEQ ID NO:5)

CDR-3ATMIFDY(SEQ ID NO:6)。

所述抗体11A3E4具有如SEQ ID NO:7所示的轻链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:8所示的轻链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:9所示的轻链互补决定区CDR3；

CDR-1QDINRY(SEQ ID NO:7)

CDR-2RAN(SEQ ID NO:8)

CDR-3LQYDEFPFT(SEQ ID NO:9)

以及如SEQ ID NO:10所示的重链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:11所示的重链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:12所示的重链互补决定区CDR3。

CDR-1GFTFTDYY(SEQ ID NO:10)

CDR-2IRDKANGFTT(SEQ ID NO:11)

CDR-3ARDVGVY(SEQ ID NO:12)

所述抗体15C3F4包括序列如SEQ ID NO:13所示的轻链可变区以及序列如SEQ IDNO:14所示的重链可变区。

DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSEGKTYLNWLLQRPGQSPQSLMYLVSE LDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRLEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:13)

EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYN GGTSYNQKFRDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCATMIFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:14)

所述抗体15C3F4包括如SEQ ID NO:15所示的轻链氨基酸序列(轻链恒定区mouseIgkappa)；以及如SEQ ID NO:16所示的重链氨基酸序列(重链恒定区mouse IgG1)。

MSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSEGKTYLNWLLQRPGQSPQSLMYLVSELDSGVPDRFTGSGSGTDFTLRISRLEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:15)

MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFRDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCATMIFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:16)

所述抗体11A3E4包括序列如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区以及序列如SEQ IDNO:18所示的重链可变区。

DIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINRYLGWFQQKPGKSPKTLIYRANRLLDG VPSRFSGSGSGQDFSLTISTLDYEDVGFYYCLQYDEFPFTLGSGTKLEIK(SEQ ID NO:17)

EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLAIIRDKAN GFTTDYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDVGVYWGQGTLVTVS AES(SEQ ID NO:18)

所述抗体11A3E4包括如SEQ ID NO:19所示的轻链氨基酸序列(轻链恒定区mouseIgkappa)；以及如SEQ ID NO:20所示的重链氨基酸序列(重链恒定区mouse IgG1)。

MRTPAQFLGILLLWFPGFKCDIKMTQSPSSMYASLGERVTFTCKASQDINRYLGWFQQKPGKSPKTLIYRANRLLDGVPSRFSGSGSGQDFSLTISTLDYEDVGFYYCLQYDEFPFTLGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:19)

MKLWLNWILLVTLINGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFTDYYMTWVRQPPGKALEWLAIIRDKANGFTTDYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCARDVGVYWGQGTLVTVSAESARTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:20)术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

本发明第二个方面公开了一种核酸组合物，包括编码权利要求1-5任一项所述抗体15C3F4和11A3E4的核酸分子。

编码15C3F4的抗体轻链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示：

ATGTCTCCTGCCCAATTCCTGTTTCTGCTTGTGCTTTGGATAAGAGAGACCAATGGAGACGTCGTGATGACTCAAACCCCGCTCACTCTGTCTGTTACGATTGGCCAGCCCGCCAGCATTTCATGTAAAAGCTCCCAGAGCCTGCTGGACTCTGAAGGTAAGACCTACCTTAACTGGCTGCTCCAGAGACCTGGACAGAGTCCCCAGAGCCTGATGTACTTGGTCAGCGAATTGGATTCCGGCGTCCCAGACAGGTTTACCGGATCTGGATCAGGCACCGACTTCACACTGAGAATAAGTCGATTGGAAGCTGAGGACCTTGGGGTGTACTATTGTTGGCAGGGAACTCATTTCCCTTGGACATTTGGAGGCGGGACTAAGCTCGAAATAAAACGCGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGC(SEQ ID NO：21)；

编码15C3F4的抗体重链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示：

ATGGGATGGTCATGGATCTTTCTCTTCCTCCTTAGCGGAACCGCCGGGGTTCATTCAGAGGTGCAGCTTCAGCAGTCCGGACCAGAATTGGTTAAGCCTGGTGCAAGTATGAAGATTAGTTGTAAGGCCTCCGGGTATAGTTTTACCGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGTAAAAACCTCGAGTGGATAGGGCTGATTAACCCATACAATGGCGGCACTTCTTACAATCAGAAGTTCCGCGATAAGGCCACTCTGACAGTTGATAAGAGCTCATCCACCGCCTACATGGAACTGTTGAGTCTTACATCCGAGGACTCCGCAGTCTACTATTGTGCCACCATGATTTTCGACTATTGGGGCCAGGGGACGACGCTCACTGTATCAAGCGCCAA GACCACCCCTCCTAGCGTGTACCCCCTGGCCCCTGGATCCGCCGCTCAGACAAACTCTATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACAGTCACATGGAACTCCGGCAGCCTGTCTAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTTACCGTGCCTAGCAGCCCTAGACCCTCCGAGACAGTGACATGTAATGTGGCCCACCCAGCCTCCTCCACCAAGGTGGACAAGAAGATCGTGCCTAGGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGTATCTGTACAGTGCCTGAGGTGTCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGATGTGCTGACCATCACACTGACACCTAAGGTGACATGTGTGGTGGTGGATATCTCCAAGGACGATCCTGAGGTGCAGTTTAGCTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGACCCAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAATTCCACATTCAGGAGCGTGAGCGAGCTGCCTATCATGCACCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAGTTCAAGTGTAGAGTGAACAGCGCCGCCTTCCCAGCTCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGACAAAGGGCAGACCTAAGGCTCCTCAGGTGTACACCATCCCACCTCCTAAGGAGCAGATGGCCAAGGACAAGGTGAGCCTGACCTGTATGATCACCGATTTCTTCCCAGAGGATATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCCGCCGAGAATTACAAGAACACCCAGCCCATCATGAATACAAACGGCTCCTACTTTGTGTACTCCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAATACATTCACCTGCTCCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCGAGAAGAGCCTGTCCCACAGCCCAGGCAAG(SEQ ID NO：22)。

编码11A3E4的抗体轻链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示：

ATGCGCACGCCTGCTCAATTTTTGGGAATACTGCTCCTCTGGTTTCCCGGCTTCAAGTGTGATATAAAGATGACACAGTCCCCCTCAAGCATGTACGCATCCCTCGGAGAGAGAGTTACCTTCACCTGTAAAGCCTCCCAGGACATCAATCGGTACCTTGGGTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGGAAGAGCCCAAAAACGTTGATATACAGAGCGAACAGGCTTCTGGACGGCGTGCCTTCACGATTTTCAGGAAGCGGTAGCGGACAGGACTTCTCCTTGACAATCTCAACCCTCGACTATGAGGACGTGGGGTTCTATTACTGCCTGCAGTACGACGAGTTTCCCTTCACCCTGGGTTCCGGGACTAAGCTCGAAATAAAACGCGCCGATGCCGCTCCTACAGTGAGCATCTTTCCTCCTTCCTCCGAGCAGCTGACAAGCGGCGGCGCCAGCGTGGTGTGTTTCCTGAACAACTTCTATCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAGAACGGCGTGCTGAACTCCTGGACCGACCAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCATGTCCTCCACACTGACCCTGACCAAGGATGAGTACGAGAGGCACAACAGCTACACATGCGAGGCCACACACAAGACCTCCACCAGCCCTATCGTGAAGAGCTTCAATAGAAACGAGTGC(SEQ ID NO：23)；

编码11A3E4的抗体重链基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示：

ATGAAACTCTGGCTCAATTGGATACTTCTTGTGACGCTTATTAACGGGATCCAGTGCGAAGTCAAACTCGTTGAGTCCGGTGGAGGACTGGTCCAGCCAGGCGGTAGTCTCCGCTTGAGTTGTGCCGTCTCCGGCTTTACCTTTACAGATTACTACATGACCTGGGTCCGGCAACCACCCGGTAAAGCTCTTGAGTGGCTTGCTATAATCCGGGACAAAGCTAACGGCTTTACTACTGACTACAGTGCCTCTGTCAAGGGCCGGTTCACCATAAGCAGAGACAACTCCCAGAGCATCCTCTACCTGCAGATGAATACCCTGCGAGCCGAGGACTCTGCAACTTACTACTGTGCCCGAGACGTTGGGGTGTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACAGTTTCTGCCGAGAGCGCCAGGACCACCCCTCCTAGCGTGTACCCCCTGGCCCCTGGATCCGCCGCTCAGACAAACTCTATGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGGCTACTTCCCCGAGCCTGTGACAGTCACATGGAACTCCGGCAGCCTGTCTAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTTACCGTGCCTAGCAGCCCTAGACCCTCCGAGACAGTGACATGTAATGTGGCCCACCCAGCCTCCTCCACCAAGGTGGACAAGAAGATCGTGCCTAGGGACTGCGGCTGCAAGCCCTGTATCTGTACAGTGCCTGAGGTGTCCTCCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGCCTAAGGATGTGCTGACCATCACACTGACACCTAAGGTGACATGTGTGGTGGTGGATATCTCCAAGGACGATCCTGAGGTGCAGTTTAGCTGGTTTGTGGACGACGTGGAGGTGCACACCGCCCAGACCCAGCCCAGAGAGGAGCAGTTCAATTCCACATTCAGGAGCGTGAGCGAGCTGCCTATCATGCACCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAGTTCAAGTGTAGAGTGAACAGCGCCGCCTTCCCAGCTCCTATCGAGAAGACCATCAGCAAGACAAAGGGCAGACCTAAGGCTCCTCAGGTGTACACCATCCCACCTCCTAAGGAGCAGATGGCCAAGGACAAGGTGAGCCTGACCTGTATGATCACCGATTTCTTCCCAGAGGATATCACCGTGGAGTGGCAGTGGAATGGCCAGCCCGCCGAGAATTACAAGAACACCCAGCCCATCATGAATACAAACGGCTCCTACTTTGTGTACTCCAAGCTGAACGTGCAGAAGTCCAACTGGGAGGCCGGCAATACATTCACCTGCTCCGTGCTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCGAGAAGAGCCTGTCCCACAGCCCAGGCAAG(SEQ ID NO：24)。

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明第三个方面公开了上述配对抗体或核酸组合物在制备用于检测RNase R的产品中的应用。

其中所述产品包括试剂盒，利用上述配对抗体对RNase R进行检测

本发明取得如下有益技术效果：

本发明通过小鼠免疫筛选获得了一对Anti-RNase R高亲和力配对抗体，克隆号15C3F4作为Elisa试剂盒捕获抗体，克隆号11A3E4作为Elisa试剂盒检测抗体；Anti-RNaseR配对抗体检测RNase R的灵敏度为39pg/ml；RNase R残留检测Elisa kit检测线性范围2.5ng/ml-39pg/ml；该试剂盒可以应用于对RNase R定量及其残留检测。适用于市场上不同公司生产的野生型RNase R定量及其残留检测。

附图说明

图1为实施例1利用RNase R加强免疫之后，免疫抗血清效价图；

图2为实施例1中多克隆杂交瘤细胞的效价图；

图3为实施例2中抗体15C3F4和11A3E4配对夹心Elisa图：结合三家公司的RNase R产品；

图4为实施例3中Elisakit检测RNase R标准曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。

实施例1RNase R免疫及抗体筛选

(1)小鼠免疫：

将50ug的RNase R(Kactus,RNR-EE001)与等体积CFA佐剂混合，乳化后以50ug/只剂量，选取6-8周雌性Balb/C小鼠进行皮下多点免疫。两周后再以相同剂量与IFA佐剂混合乳化皮下多点注射加强免疫，之后每间隔两周免疫三次以后进行血清效价检测，效价大于1：1000000后进行骨髓瘤细胞SP2/0融合，于融合前三天用50ug RNase R腹腔加强免疫一次；图1所示免疫抗血清效价>2187000。

(2)杂交瘤细胞株的筛选

小鼠加强免疫3天后，取小鼠脾脏细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1500融合，制备杂交瘤细胞。10天之后，以RNase R 1μg/ml包板，间接ELISA法检测，筛选对RNase R抗原结合阳性，且ELISA的OD值大于3的细胞株。进一步对阳性多克隆杂交瘤上清稀释100倍，选择图2上清效价高的多克隆杂交瘤细胞(1#，11A3，3#，4#，5#，15C3#，7#，8#)进行亚克隆。多克隆杂交瘤细胞经有限稀释至单克隆状态后进行扩大培养和冻存。将扩大培养的杂交瘤单克隆细胞上清通过间接法ELISA，再次验证杂交瘤细胞株抗体与RNase R结合的特异性，获得8株单克隆抗体，其中包括从11A3多克隆株筛选获得的11A3E4单克隆株，和从15C3多克隆株筛选获得的15C3F4单克隆株，并对每个抗体进行纯化制备，用于抗体配对测试。

实施例2抗RNase R单克隆抗体配对筛选及重组抗体表达纯化

将纯化的8株抗RNase R单克隆抗体做非定点生物素标记，生物素与抗体摩尔比20：1，生物素标记抗体作为配对检测抗体。将8株未标记单克隆抗体分别以2μg/ml包被在聚氯乙烯板上，作为捕获抗体，将RNase R以1μg/ml及3倍梯度稀释的量分别加入到以8个不同抗体包被的Elisa板上，结合一小时后，每个Elisa板分别加入与除了包被抗体之外的7个生物素标记检测抗体(2μg/ml)，SA-HRP显色。通过夹心法ELISA对8株抗体两两配对，筛选出能够配对并且信号最强的一对抗体15C3F4和11A3E4，如图3所示。使用抗体亚型鉴定试剂盒(武汉三鹰生物)确定15C3F4抗体亚型，重链为IgG1，轻链为kappa(κ)；11A3E4抗体亚型，重链为IgG1，轻链为kappa(κ)。

将15C3F4和11A3E4杂交瘤细胞株培养至1E+07cell/ml细胞密度，送做杂交瘤单抗测序(苏州鸿讯生物科技股份有限公司)。基因合成编码信号肽，可变区及恒定区的抗体重链及轻链基因序列，分别构建进哺乳细胞表达载体，表达载体可选用pTT5、pCDNA3.1等任意哺乳细胞表达商业化载体。重组质粒转染Expi293哺乳细胞，分泌表达15C3F4和11A3E4抗体，细胞表达上清经proteinA亲和纯化得到RNase R特异性重组抗体15C3F4和11A3E4。用于抗体表征及Elisa试剂盒开发。

实施例3RNAse R残留检测试剂盒

RNase R残留检测试剂盒制备及获得标准曲线实验，简述如下：

1)15C3F4捕获抗体包板

将15C3F4抗体使用1XPBS稀释至5μg/ml，每孔100μl加入至96孔聚氯乙烯板上，37度孵育2小时后以PBST洗板一次。每孔加入200μl 3％BSA的PBST溶液，37度孵育1小时，封闭。

2)RNase R标准品配制及捕获

将浓度为1μg/ml的RNase R酶，取2.5μl以1ml含1％BSA的PBST溶液稀释至2.5ng/ml，配制成浓度为2.5ng/ml的标准品，之后按2倍梯度稀释成1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.313ng/ml、0.156ng/ml、0.078ng/ml、0.039ng/ml，获得7个浓度的标准品，使用1％BSA的PBST溶液作为零点，往1)中Elisa板，每孔加入100μl，37度孵育1小时后洗板3次，RNase R捕获完成。

3)生物素标记11A3E4检测抗体配制及结合

使用1％BSA的PBST溶液将生物素标记的11A3E4抗体(实施例2中所述抗体生物素标记)稀释至0.5μg/ml，往2)中Elisa板每孔加入100μl，37度孵育1小时后洗板3次。

4)SA-HRP结合显色

使用1％BSA的PBST溶液将SA-HRP稀释至0.5μg/ml，往3)中Elisa板每孔加入100ul，37度孵育1小时后洗板三次。Elisa板每孔加入TMB显色液100μl，37℃避光显色10-15min，加入终止液每孔50μl，终止反应。立即使用酶标仪读取450nm波长的OD值。获得表1的数据。

RNase R残留检测试剂盒标准曲线以四参数拟合，如图4所示其线性范围为2.5ng/ml-39pg/ml,灵敏度为39pg/ml，该试剂盒能对RNase R定量及残留进行定量检测。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种Anti-RNAse R抗体，其特征在于，包括抗体15C3F4和11A3E4；所述抗体15C3F4具有如SEQ ID NO:1所示的轻链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:2所示的轻链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:3所示的轻链互补决定区CDR3，以及如SEQ ID NO:4所示的重链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:5所示的重链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:6所示的重链互补决定区CDR3；

所述抗体11A3E4具有如SEQ ID NO:7所示的轻链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:8所示的轻链互补决定区CDR2和如SEQ ID NO:9所示的轻链互补决定区CDR3，以及如SEQ ID NO:10所示的重链互补决定区CDR1、如SEQ ID NO:11所示的重链互补决定区CDR2和如SEQ IDNO:12所示的重链互补决定区CDR3。

2.根据权利要求1所述的Anti-RNAse R抗体，其特征在于，所述抗体15C3F4包括序列如SEQ ID NO:13所示的轻链可变区以及序列如SEQ ID NO:14所示的重链可变区。

3.根据权利要求2所述的Anti-RNAse R抗体，其特征在于，所述抗体15C3F4包括如SEQID NO:15所示的轻链氨基酸序列；以及如SEQ ID NO:16所示的重链氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的Anti-RNAse R抗体，其特征在于，所述抗体11A3E4包括序列如SEQ ID NO:17所示的轻链可变区以及序列如SEQ ID NO:18所示的重链可变区。

5.根据权利要求4所述的Anti-RNAse R抗体，其特征在于，所述抗体11A3E4包括如SEQID NO:19所示的轻链氨基酸序列；以及如SEQ ID NO:20所示的重链氨基酸序列。

6.一种核酸组合物，其特征在于，包括编码权利要求1-5任一项所述抗体15C3F4和11A3E4的核酸分子。

7.权利要求1-5任一项所述的Anti-RNAse R抗体或权利要求6所述的核酸组合物在制备用于检测RNAse R的产品中的应用。