CN119350499A - 一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体及其应用，涉及免疫学和分子生物学技术领域。所述一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的互补决定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1～4任一所示的CDR1、如SEQ ID NO:5～9任一所示的CDR2、如SEQ ID NO:10～15任一所示的CDR3。本发明通过构建羊驼免疫噬菌体展示库，从中筛选出系列特异性靶向密蛋白18.2的纳米抗体分子，并在CLDN18.2抗原蛋白和CLDN18.2靶细胞水平上验证了所述纳米抗体的功能和应用。

Description

一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体及其应用。

背景技术

紧密连接(Tight junctions，TJs)是一种重要的细胞黏附结构，主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连接复合体中，使相邻细胞膜紧靠在一起，形成环绕细胞的物理屏障结构。紧密连接膜结构域包含至少三种不同的蛋白质，分别称为occludins(咬合蛋白)，claudins(闭合蛋白)和junctio nal adhesion molecules(JAMs，连接黏附分子)。其中claudins(CLDNs)是1998年首次发现的一类跨膜蛋白，至少有27个家族成员。CLDNs具有四次跨膜结构域，N末端和C末端均位于细胞质中。CLDN18是CLDNs蛋白家族中被广泛研究的密蛋白，于2001年被首次鉴定。人类CLDN18基因有两个剪接变体，分别编码CLDN18.1和CLDN18.2(密蛋白18.2)两种蛋白亚型，二者均由261个氨基酸组成，具有两个胞外环，仅在胞外环1中存在8个氨基酸差别。在人体中，CLDN 18.1和CLDN18.2的表达具有组织特异性，CLDN18.1主要表达在肺组织中，CLDN18.2在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上表皮细胞上，不表达在胃干细胞上。而在多种肿瘤组织中，CLDN 18.2却高度表达，比如非小细胞肺癌(25％)、胃癌(70～80％)、胰腺癌(60％)和食道癌(30％)。虽然CLDN18.2在正常胃粘膜中也表达，但胃粘膜中表达的CLDN18.2存在于细胞紧密连接超分子复合物中，抗原表位难以接触靶向药物，而恶性肿瘤细胞由于极性的丧失导致了CLDN18.2表位的暴露，与靶向药物得以接触。这种特性使CLDN18.2成为消化道肿瘤靶向治疗的理想靶点。

截止目前，全球在CLDN18.2靶点的研发管线覆盖所有主流技术路线，包扩单克隆抗体、抗体偶联药物(ADC)、双特异性抗体和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)，其中单抗及ADC路线布局最多。进展最快的靶向药物是日本药企安斯泰来开发的CLDN18.2单抗药物IMAB362(Zolbetuxi mab，佐妥昔单抗)，已于今年先后被日本厚生劳动省(MHLW)和美国FDA批准用于CLDN18.2阳性胃癌患者的治疗，成为全球首款CLDN18.2靶向药物。CLDN18.2 CAR-T方向进展最快的为科济药业研发的一种用于治疗胃癌、胰腺癌及其它实体瘤的自体CAR-T细胞候选产品CT041，目前相关临床试验已进入II期。这些研究显示了CLDN18.2靶点的安全性和靶向治疗的有效性。

重链抗体是在骆驼科动物、护士鲨、大星鲨和鳐鱼等软骨鱼纲动物中发现的天然缺失轻链的单重链结构域抗体。克隆重链抗体可变区，可得到只有重链可变区组成的单域抗体(Singledomain antibody，sdAb)，因其分子量小，也被称为纳米抗体(Nanobodies,Nbs)。虽然纳米抗体的分子量仅为完整传统抗体的1/10(约15kDa)，但却保留了重链抗体的完整的抗原识别和结合能力，而且与传统抗体相比，具有特异性强，亲和力强，稳定性高，靶向性和组织穿透力强，免疫原性低，易于人源化改造等优点。纳米抗体的缺点在于半衰期短，但可将其与抗血清白蛋白或抗体的Fc段融合表达以延长其在血液中的半衰期。纳米抗体已被广泛用于生化机制和结构生物学的研究，以及用于肿瘤等疾病的诊断试剂和治疗药物的开发。

消化道肿瘤在世界上属于高发病率的实体瘤，我国更是胃癌、胰腺癌等消化道癌症的高发国家，虽然目前已有靶向CLDN18.2靶点的临床在研抗体和CAR-T药物，但上市药物仅有一款，仍有继续开发靶向CLDN18.2靶点抗体的迫切需要。本发明旨在开发新的靶向CLDN18.2的抗体，特别是只特异性识别CLDN18.2而不识别CLDN18.1的候选纳米抗体分子，用于开发消化系统肿瘤等疾病的诊断试剂、靶向性抗体药物和CAR-T/NK等免疫细胞药物。鉴于此，本发明公开了一种特异性靶向密蛋白18.2的纳米抗体及其应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性靶向密蛋白18.2而不识别CLDN18.1的纳米抗体及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

第一方面，一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，所述一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的互补决定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1～4任一所示的CDR1、如SEQ ID NO:5～9任一所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO:10～15任一所示的CDR3。

进一步，所述靶向密蛋白18.2的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16～21任一所示。

第二方面，一种核酸，包括编码所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的核酸序列或其互补序列。

进一步，编码所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:28～33任一所示。

第三方面，一种融合蛋白，所述融合蛋白为将所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体与免疫球蛋白(IgG、IgA等)的Fc片段融合而产生的重组蛋白。

进一步，所述免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。

进一步，所述免疫球蛋白的Fc片段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示。

第四方面，一种药物组合物，所述的药物组合物包括所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，或者所述的一种核酸，或者所述的一种融合蛋白。

进一步，所述的药物组合物的剂型包括微球制剂、微囊制剂、纳米囊制剂中的至少一种。还包括药学上可接受的辅料和/或载体。

第五方面，一种所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，或者所述的一种核酸，或者所述的一种融合蛋白，或者所述的一种药物组合物在制备靶向密蛋白18.2的检测试剂、活体成像探针或治疗产品中的应用。

本发明的核心创新点在于，提供了一组6条特异性靶向密蛋白18.2(CLDN18.2)而不识别CLDN18.1的纳米抗体分子，现有技术中未发现与本发明的抗体CDR区序列一致的抗体，解决了现有技术中缺少特异性靶向CLDN18.2的候选纳米抗体分子的问题。

本发明的有益效果是：

(1)本发明选用的CLDN18.2靶点是潜在的最安全且有效的消化系统肿瘤治疗靶点：CLDN18.2在正常组织中仅表达在胃粘膜上皮组织细胞间紧密连接处，接触不到周围的靶向药物，而在胃癌、胰腺癌、食道癌、非小细胞肺癌高度表达，并暴露于靶向药物；已有研究表明靶向CLDN18.2的CAR-T或者抗体药物对正常表达组织无损伤，而对CLDN18.2表达肿瘤组织具有特异性杀伤效果。

(2)本发明为消化系统肿瘤的靶向治疗提供了候选纳米抗体分子：相比血液瘤，实体瘤的特异性免疫靶向治疗药物研发进展缓慢，制约因素之一为缺少有效且安全的靶点；目前的研究已表明CLDN18.2为消化系统肿瘤的安全且有效的治疗靶点，但针对CLDN18.2靶点的靶向药物研究起步较晚，全球仅有一款单抗药物刚刚在少数两个国家上市，制约瓶颈在抗体发现阶段，开发特异性靶向CLDN18.2而不识别CLDN18.1的抗体分子有一定难度，而涉及的纳米抗体更是稀少。

(3)本发明的纳米抗体具有广泛的应用领域：(a)本发明通过羊驼免疫库筛选得到的针对CLDN18.2的6条候选纳米抗体，将其C末端与人IgG1的Fc片段融合，在抗原蛋白CLDN18.2-VLP水平上检测其与CLDN18.2抗原的结合活性(ELISA检测)和亲和力(SPR检测)，结果都比传统对照抗体IMAB362更好或相当。在多种过表达CLDN18.2的细胞水平上，FACS检测Fc融合抗体与CLDN18.2抗原的结合活性，有4条纳米抗体都比传统对照抗体IMAB362更好。(b)纳米抗体相对于其它抗体具有显著的优点，如其半衰期长短可通过化学修饰或者蛋白融合改造进行调节，渗透性强，可识别普通抗体不可及的隐蔽表位，耐胃蛋白酶，耐酸，耐热，易生产，而且因为是单链，分子量小，易于和其它类型抗体组装为双价抗体/嵌合抗原受体(CAR)和多价抗体/CAR。因此，本发明的纳米抗体，可开发成免疫检测试剂、CAR-T/NK免疫细胞药物和抗体药物。结合CLDN18.2靶点的特性，本发明的候选抗体，若用于癌症的免疫诊断试剂，将具有更好的效果；若开发成细胞或抗体免疫治疗药物，则具有更低的毒副作用和更佳的临床药效，从而为患者提供更多的药物选择。

(4)可用于开发双靶点药物：研究发现密蛋白18.2(Claudin18.2)与CDH17一样为安全且有效的消化系统肿瘤治疗靶点，二者在食管癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌等消化系统肿瘤中共表达，且临床或临床前试验证明靶向这两个靶点皆可特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常组织无伤害，故本发明的抗CLDN18.2候选纳米抗体可与CDH17抗体联用开发抗CLDN18.2/CDH17双抗药物和双靶点CAR-T/NK药物，有望增强单抗或单靶点CAR-T/NK等免疫细胞药物的疗效。

附图说明

图1为CLDN18.2羊驼免疫单域抗体库构建流程图；

图2为与Fc融合表达的候选抗体蛋白与抗原Hu-18.2-VLP结合的ELISA检测结果；

图3为与Fc融合表达的候选抗体蛋白与阴性对照抗原GAG-VLP结合的ELISA结果；

图4为与Fc融合表达的候选抗体蛋白与过表达人抗原CLDN18.2的细胞Hu-18.2-HEK293结合的FACS检测结果；

图5为与Fc融合表达的候选抗体蛋白与过表达人抗原CLDN18.1的细胞Hu-CLDN18.1-HEK293结合的FACS检测结果；

图6为与Fc融合表达的候选抗体蛋白与过表达人抗原CLDN18.2的细胞Hu-18.2-BxPC-3结合的FACS检测结果；

图7为与Fc融合表达的候选抗体蛋白与过表达人抗原CLDN18.2的细胞Hu-18.2-NUGC4结合的FACS检测结果。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。

实施例

1、羊驼免疫

1.1羊驼免疫方法

采用全长人CLDN18.2抗原的病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)Hu-18.2-VLP(购自三优生物)、全长人CLDN18.2的过表达细胞株Hu-18.2-HEK293和Hu-18.2-KATOⅢ(购自三优生物)对2只羊驼(Alpaca)(编号：#1、#2)分别进行交叉免疫，每只羊驼每次免疫500μg抗原或1.00×10⁷细胞。抗原首免为弗氏完全佐剂(Sigma)，后续免疫为弗氏不完全佐剂(Sigma)，细胞免疫不添加佐剂。注射方式为皮下多点注射。羊驼免疫方案见表1。

表1羊驼免疫方案

1.2ELISA血清效价检测

采用Hu-18.2-VLP抗原(2μg/mL,30μL)包板，4℃过夜孵育；封闭液5％ PBSM(PBS，5％脱脂奶粉)室温封闭2h；加入3倍梯度稀释血清，室温孵育1h；加入二抗Goat anti-LlamaIgG(H+L)Secondary Antibody,HRP(ThermoFisher，A16060)孵育1h；加入30μl TMB(购自SurModics)显色，室温30min；加入50μl TMB显色终止液(购自碧云天，P0215)终止反应，读取酶标仪(Molecular Devices)OD450数值。根据1.65倍NC标定血清效价，效价大于32K为合格。免疫的两只羊驼，ELISA检测结果判定见表2。经ELISA血清效价检测，结果显示两只羊驼免疫效价均合格。

表2针对Hu-18.2-VLP免疫血清效价值

待测血清	免疫次数	效价(k)
			#1	4	64
#2	4	128

2、羊驼免疫库构建

2.1免疫库构建

经4次免疫后的2只羊驼分别采血，分别构建免疫库。每只羊驼采集外周血80ml，分别通过Ficoll-Paque密度梯度分离液(GE，17144003S)分离外周血单个核细胞(PBMC)。将分离的PBMC分别抽取RNA，并分别通过反转录试剂盒(TaKaRa，6210A)反转录成cDNA，获得所有抗体核苷酸序列。在胚系基因VH前端和CH2上设计引物，PCR得到两个不同大小的DNA片段，通过割胶回收较小的目的片段；通过比对VHH抗体所有V基因和J基因的所有序列，设计含有NcoI和NotI酶切位点的简并引物，然后以回收的DNA片段产物为模板扩增所有的VHH基因片段。对噬菌体展示载体及VHH片段进行酶切和连接，连接产物经回收试剂盒(Omega，D6492-02)回收，利用电转仪(Bio-Rad，MicroPulser)转化感受态大肠杆菌SS320(Lucigen，MC1061F)，从而获得驼源免疫噬菌体展示文库(RA044和RA045)。以上过程如图1所示。

2.2单域抗体库库容测定

通过稀释点板法测定单域抗体库的库容。库容测定结果如表3所示，两个单域抗体库的库容均满足大于或等于1.00×10⁸CFU的质量标准。

表3电转体系及库容统计

库名称	电转数量(个)	单电转库容(CFU)	总库容(CFU)
				RA044	2	6.75×108	1.35×109
RA045	1	3.75×108	3.75×108

2.3单域抗体库测序结果分析

挑取克隆进行测序，挑选出测序成功的结果进行进一步分析，测序分析总结见表4。

表4单域抗体库测序信息统计表

单域抗体库建库抗体基因序列分析标准为正确插入率大于或等于80％，空占比小于或等于10％，酶切位点正确率大于或等于90％；有效库容计算方式：总库容×抗体正确表达率×Unique序列占比＝有效库容。

2.4单域抗体库抗体基因分析结果

对单域抗体库测序成功的序列进行分析见表5，分析显示：RA044、RA045空载比例小于10％，该抗体基因正确插入率大于80％，CDR区比对有较高的丰富度，符合单域抗体库构建的质量标准。综上所述，RA044、RA045单域抗体库建库质量合格。

表5文库构建指标汇总表

3、羊驼免疫库筛选

通过噬菌体展示技术将构建好的羊驼免疫库抗体序列展示在噬菌体表面，再以特定蛋白、细胞作为抗原材料，经过多轮海选将结合抗原的噬菌体展示抗体不断富集，进一步通过ELISA筛选特异结合抗原的阳性克隆，并通过测序获得阳性克隆抗体序列。

3.1免疫库筛选方法

免疫库筛选方法，包括如下步骤：

(1)噬菌体制备：将羊驼免疫库库菌或获得的输出集合，通过接菌、辅助噬菌体侵染、噬菌体扩培、噬菌体沉淀与重悬等一系列步骤，制备富集后的噬菌体并投入下一步的海选。(2)固相海选:将抗原包被在具有高吸附力的免疫管表面，然后把制备的噬菌体加入免疫管进行孵育、洗涤和洗脱，经历4轮淘选后，将针对抗原的特异性单克隆抗体进行富集。(3)细胞海选:将制备的负筛后的噬菌体和抗原过表达细胞进行孵育、洗涤和洗脱，经过4轮淘选后，将针对抗原的特异性单克隆抗体进行富集。

结果显示：阳性噬菌体经第二、第三、第四轮固相海选和细胞海选后均有不同程度的富集，具体数据见表6。

表6海选数据统计表

备注：N/A表示未检出或不适用。

3.2单克隆初筛

免疫库海选结果显示，采用固相，细胞交叉筛选的方式，获得多组富集较好的噬菌体输出集合(Pool)。针对4轮筛选中有富集的Pool挑选单克隆，采用Hu-18.2-HEK293细胞进行FACS检测筛选。共挑取270个克隆，获得22个与Hu-18.2-HEK293细胞结合的阳性克隆，选择22个阳性克隆进行测序分析，获得16个序列独特的分子。

初筛结果汇总统计见表7。

表7FACS初筛结果统计汇总表

根据序列多样性分析对比，并去除含有翻译后修饰位点的分子，选择12个抗体克隆进行全长构建，该12个抗体克隆编号为：C002、C003、C005、C008、C013、C022、C004、C007、C011、C012、C017和C019，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO：16-27所示，其编码核苷酸序列依次如SEQ ID NO：28-39所示。

4、羊驼免疫库候选分子制备及检测

4.1全长抗体蛋白的表达质粒构建

将纳米抗体的编码核苷酸序列与人IgG1的Fc段(其氨基酸序列及编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示)的编码核苷酸序列融合进行全基因合成，构建到pcDNA3.4载体(Invitrogen)上，得到VHH-Fc融合蛋白即全长抗体蛋白的表达质粒。

4.2全长抗体蛋白的表达与纯化

将构建的抗体质粒转染至Expi CHO细胞(Gibco，A29133)，进行瞬转表达，抗体表达体积为10mL，表达时间为7天。对表达蛋白进行纯化、分装；对纯化的蛋白进行SDS-PAGE、SEC、FACS/ELISA、亲和动力学等检测。

4.3全长抗体蛋白的SDS-PAGE鉴定

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)鉴定全长抗体蛋白的分子量和纯度，方法与步骤如下：(1)纯化蛋白样品溶液制备：非还原样品溶液制备：将纯化样品溶液、4×LDS上样缓冲液(泽叶生物，ZY6SL1197)和碘代乙酰胺(泽叶生物,ZY144)按照比例混合，使碘代乙酰胺的终浓度为40mM、非还原样品上样量为1μg，混合后的样品置于75℃干浴仪上加热10min。还原样品溶液制备：将纯化样品溶液、4×LDS上样缓冲液和二硫苏糖醇(DTT)(泽叶生物，ZY3483)按照比例混合，使DTT的终浓度为5mM、还原样品上样量为2μg，混合后的样品置于100℃干浴仪上加热10min。(2)电泳：140V，75min。(3)染色、脱色、扫描：凝胶考马斯亮蓝染色，脱色后用EPSON V550彩色扫描仪扫描。(4)计算纯度：用ImageJ按照峰面积归一法计算还原条带纯度，或者还原重链加轻链和的纯度。

系统适应性标准：参照品IPI(Ipilimumab，伊匹木单抗)非还原条带分子量150kDa左右，纯度大于90％；还原重链分子量50kDa左右，轻链分子量25kDa左右，重链加轻链纯度大于90％。4.4全长抗体蛋白的SEC鉴定

采用尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography，SEC)鉴定全长抗体蛋白的纯度，方法与步骤如下：(1)流动相配制：配制0.15M PB+NaCl，pH调至6.0。(2)样品处理：将样品浓度稀释至0.5mg/mL。(3)色谱柱条件：使用XBridge BEHSEC 3.5μm，7.8×300mm，柱温设置20℃，检测基线平稳。(4)参数设置：流速设置0.8mL/min；样品进样体积设置为20μL；检测波长280nm，带宽4nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)＞0.1min(2s响应时间)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU。

系统适应性标准：参比品Herceptin(赫赛汀，曲妥珠单抗)单体纯度大于95％，BSA单体与二聚体的分离度大于1.5，基线平稳，则视为系统适应性通过。

4.5全长抗体蛋白的亲和动力学

采用基于Biacore T200(Cytiva)平台的表面等离子共振(Surface PlasmonResonance,SPR)技术检测候选抗体蛋白与抗原之间的相互作用。亲和检测过程包括捕获、平衡、结合、解离和再生，参数设定详见表8。

表8亲和检测参数设定

表注：时间和样品的配制浓度数值仅供参考，具体数值可以根据实验情况进行优化调整。

系统适应性标准：Chi²≤10％×Rmax。Chi²：拟合线与实验线贴合程度，Rmax：曲线拟合最高响应值。

4.6全长抗体蛋白的ELISA检测

全长抗体蛋白的ELISA检测的方法与步骤：(1)包板：用1×PBS稀释抗原Hu-18.2-VLP至浓度为2μg/mL，按30μL/孔加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。(2)封闭：用PBST洗板3次，加入封闭液(5％ PBSM)室温封闭2h。(3)孵育：洗板，按30μL/孔加入1％ PBSM稀释的样品，室温孵育60min。(4)二抗孵育：用PBST洗板3次，加入二抗Goat-Anti-Human-IgG-Fc-HRP(购自Abcam)，室温孵育50min。(5)显色：用PBST洗板3次，每孔加入30μL TMB(购自SurModics)。(6)终止：加入2M终止液终止反应同时检测OD₄₅₀。

系统适应性标准，如表9：

表9

序号	判定指标	放行标准
			1	样品名称准确性	完全一致
2	R2	≥0.90
			3	阳性抗体上下平台OD比值	≥3
4	空白对照OD值(背景值)	≤0.25

上述检测中，阳性对照抗体为IMAB362(Zolbetuximab，佐妥昔单抗，一种靶向Claudin-18.2的单克隆抗体)，阴性对照抗体NC为IPI，空白对照BC为1％ PBSM；阴性对照抗原为GAG-VLP(表达人类免疫缺损病毒HIV-1的GAG蛋白的病毒样颗粒，购自三优生物)。

4.7全长抗体蛋白的FACS检测

对12个全长表达的融合抗体蛋白与三种过表达人CLDN18.2的人胰腺癌细胞Hu-18.2-BxPC-3、人胃癌细胞Hu-18.2-NUGC4和Hu-18.2-HEK293细胞，以及一种人CLDN18.1过表达细胞Hu-CLDN18.1-HEK293(上述四种细胞株皆购自三优生物)的结合活性进行FACS检测，其方法与步骤如下：

(1)细胞铺板：将培养瓶中的细胞转移至离心管中，离心去上清，用培养基重悬计数后，将细胞密度调整为1×10⁶cells/mL。取96孔圆底板，用100μL的移液排枪将细胞加入孔板中，每孔加入100μL。离心机300g/min，离心5min。甩去上清。

(2)抗体蛋白样品的加入：用含2％ FBS的FACS将抗体蛋白样品稀释成8个浓度梯度的稀释液：150.000、37.500、9.375、2.3438、0.5859、0.1465、0.0366、0.0092nM。采用100μL的12道移液器将抗体稀释液加到96孔细胞板，每孔100μL。混匀后置于4℃冰箱中孵育1h。

(3)二抗的加入：将二抗PE labelled anti-Human Fc(Jackson)用含2％ FBS的FACS Buffer进行1：200稀释，将细胞培养板离心去上清，采用100μL的12道移液器在细胞培养板加入100μL的二抗稀释液。将细胞培养板置于4℃冰箱中培养30min。离心去上清，FACSBuffer洗板2次，每孔用120μL的FACS Buffer重悬细胞。

(4)数据采集：打开流式细胞仪(购自Beckman)，待仪器清洗结束后，进行FACS结合的检测。

上述检测中，阳性对照抗体为IMAB362，同型对照抗体为IgG1(P93950-1，购自三优)，只加二抗的对照标为“cell sec”，不加任何抗体的空白细胞对照标为“cell only”。

4.8实验结果

(1)理化性质检测结果

12个与Fc融合的候选抗体分子经质粒构建、蛋白表达、纯化，成功制备了目的蛋白，对其进行的理化性质检测结果如表10所示：

表10理化性质检测结果汇总

结果显示：(1)12个目的蛋白纯化获得蛋白量为0.03mg～3.19mg，有3个蛋白(C007、C011和C012)由于纯化量较低，未进行SDS-PAGE检测、SEC检测和后面的亲和动力学检测。(2)经SDS-PAGE检测，9个受测样品的纯度均大于95％。(3)经SEC检测，C022(P237142)的纯度检测未达到90％，其余8个受测样品的纯度均大于90％。

(2)亲和动力学检测结果

9个目的蛋白经亲和动力学检测，结果显示与抗原的亲和力均优于阳性对照抗体IMAB362，且都满足Chi²≤10％×Rmax，符合系统适应性标准，结果可靠。见表11。

表11亲和动力学检测结果

备注：Chi²：拟合线与实验线贴合程度；Rmax：曲线拟合最高响应值。

(3)ELISA检测结果

12个与Fc融合表达的候选抗体蛋白与抗原Hu-18.2-VLP及阴性对照抗原GAG-VLP结合的ELISA检测结果如图2～图3和表12。

表12候选抗体ELISA检测结果汇总表EC₅₀(μg/mL)

备注：/代表未测，N代表无结合，W代表弱结合，Y代表有结合，但无法计算EC₅₀值。

ELISA检测结果表明，12个Fc融合抗体蛋白中，9个抗体与hu-18.2-VLP抗原有较强结合活性，EC₅₀值范围为0.00355μg/mL～0.01172μg/mL。12个抗体蛋白与GAG-VLP均无非特异性结合。

(4)候选抗体FACS检测结果

候选抗体FACS检测结果如下图4～图7。

表13纯化后候选抗体FACS检测EC50结果汇总表(nM)

序号	蛋白编号	样品名称	Hu-18.2-HEK293	hu-18.1-HEK293	Hu-18.2-BxPC-3	Hu-18.2-NUGC4
							1	P237129	C002	2.519	N	5.320	2.340
2	P237130	C003	6.040	N	5.320	3.850
							3	P237131	C004	3.643	Y	4.350	1.100
4	P237132	C005	3.298	N	4.430	4.000
							5	P237133	C007	N	N	N/A	N/A
6	P237134	C008	3.411	N	2.170	4.360
							7	P237135	C011	W	Y	W	W
8	P237136	C012	N	N	N	N
							9	P237137	C013	3.113	N	6.190	2.360
10	P237139	C017	2.113	Y	4.550	1.130
							11	P237140	C019	W	Y	4.830	W
12	P237142	C022	6.179	N	6.090	6.530

备注：1)Y代表较好结合，W代表弱结合，N代表无结合，N/A代表没有检测。

FACS检测结果表明：12个纯化抗体样品中，有9个抗体样品(C002、C003、C004、C005、C008、C013、C017、C019和C022)在Hu-18.2-BxPC-3细胞上有较好的结合，EC50值范围：2.170nM～6.190nM；有8个抗体样品(C002、C003、C004、C005、C008、C013、C017和C022)在Hu-18.2-HEK293和HU-18.2-NUGC4细胞上都有较好的结合，抗体与两种细胞结合的EC50值范围分为2.113nM～6.179nM和1.100nM～6.530nM；有4个候选抗体样品(C004、C011、C017和C019)在Hu-CLDN18.1-HEK293细胞上有非特异性结合；有6个抗体样品(C002、C003、C005、C008、C013和C022)与三种CLDN18.2表达细胞Hu-18.2-BxPC-3、Hu-18.2-HEK293和HU-18.2-NUGC4均有特异性结合，而与CLDN18.1表达细胞Hu-CLDN18.1-HEK293无结合。

对所述6个特异性结合CLDN18.2的纳米抗体克隆的VHH的氨基酸序列，采用Kabat编号方案和定义方案分析其CDR1～3，结果如表14所示。

表14 6个候选纳米抗体的互补决定区(CDR1～3)的氨基酸序列

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，其特征在于，所述一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的互补决定区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO:1～4任一所示的CDR1、如SEQ ID NO:5～9任一所示的CDR2、如SEQ ID NO:10～15任一所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，其特征在于，所述靶向密蛋白18.2的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:16～21任一所示。

3.一种核酸，其特征在于，包括编码如权利要求1至2任一项所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的核酸序列或其互补序列。

4.根据权利要求3所述一种核酸，其特征在于，编码所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:28～33任一所示。

5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为将权利要求1或2所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体与免疫球蛋白的Fc片段融合而产生的重组蛋白。

6.根据权利要求5所述一种融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。

7.根据权利要求5或6所述一种融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的Fc片段的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1至2任一项所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，或者权利要求3至4任一项所述的一种核酸，或者权利要求5至7任一项所述的一种融合蛋白。

9.根据权利要求8所述一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型包括微球制剂、微囊制剂、纳米囊制剂中的至少一种。

10.一种权利要求1至2任一项所述的一种靶向密蛋白18.2的纳米抗体，或者权利要求3至4任一项所述的一种核酸，或者权利要求5至7任一项所述的一种融合蛋白，或者权利要求8至9任一项所述的一种药物组合物在制备靶向密蛋白18.2的检测试剂、活体成像探针或治疗产品中的应用。