JPH0361483A - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＬＬ≧旦皿旦土里 この発明は、新規な組織プラスミノーゲン活性化因子に
関するものであり、より詳しくは、プラスミノーゲンを
、血栓のフィブリン網目構造を崩壊させて可溶性生成物
を生ぜしめるプラスミンへ転換させる強い活性をもち、
従って血栓溶解剤として有用な、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子、それのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ　、それの製造法およびそれを含有する医薬組成物
に関するものである。

従来の技術およびこの　　が解゛しようとする１塁 天然のヒト「組織プラス主ノーゲン活性化因子」　（以
下ｒ　ｔ−ＰＡＪという）の全アミノ酸配列および構造
ならびにヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ）に由来する
それをコードするｔ）ＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術に
よって既に明らかにされている［Ｎａｔｕｒｅ　３０１
．２１４　（１９８３）参照］。天然ｔ−Ｐ＾は、車−
のジスルフィド結合で結合される重鎮および軽鎖の２鎖
形態にプラスミンによって転換されるところの単鎖セリ
ンプロテアーゼである。軽鎖（Ｌ）はプロテアーゼドメ
インであり、従ってこの酵素の活性部位を含んでいる０
重量１（）ｌ）はフィンガードメイン（Ｆ）、成長因子
ドメイン（Ｅ）および３つのジスルフィド結合をもつ２
つのクリングル（すなわちクリングル１およびクリング
ル２ドメイン；に１およびに２）を有する。

従って、天然のｔ−ＰＡは５つの機能性ドメインＦ１Ｅ
、に＋　、に２およびＬからなる［ヨーロッパ特許出願
公開公報第０１９６９２０号およびＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．４６７０　（１９
８Ｂ）参照］。

天然ｔ−ｐ＾は不安定であり、生体内半減期は極めて短
い（種にもよるが約１〜８分）、その半減期を延長する
ための天然ｔ−ＰＡの修飾に関する種々の研究の結果、
この発明の発明者らは、天然ｔ−ｐ＾のフィンガードメ
インおよび／またはクリングル１ドメインの電荷を正か
ら負に変換することによって、生体内で天然のｔ−ＰＡ
よりもより安定な新規ｔ、　−Ｐ　Ａを製出することに
成功した。

発明の構成および一里 それゆえ、この発明は、天然ｔ−ＰＡのフィンガードメ
インおよび／またはクリングル１ドメインの電荷が負に
変換されていることによって天然のｔ−ＰＡと相異する
新規ｔ−ｐ＾を提供する。換言すれば、この発明は、負
の電荷をもつフィンガードメインおよび／またはクリン
グル１ドメインを有する新規ｔ−ＰＡを提供する。

ポリペプチドの構成要素である塩基性アミノ酸は正（＋
１）の電荷を有し、ポリペプチドの構成要素である中性
アミノ酸は電荷ゼロ（０）であり、ポリペプチドを構成
する酸性アミノ酸は負（−１）の電荷を有することは周
知である［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、　１５４　、４５０−４７３　（１９８７）参照］
。それゆえ、天然ｔ−ＰＡのフィンガードメインおよび
クリングル１ドメインの総電荷はそれぞれ＋２および＋
１と計算される。

天然ｔ−Ｐ＾のフィンガードメインおよびクリングル１
ドメインの電荷を変えるには、一つ以上の構成塩基性ア
ミノ酸を酸性アミノ酸で置換したり除去したりすること
が好ましい。

天然ｔ−Ｐ＾のフィンガードメインおよびクリングル１
ドメインの塩基性構成アミノ酸には、リジン（Ｌｙｓ）
とアルギニン（＾ｒｇ）がある。

酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ）およ
びグルタミン酸（Ｇｌｕ）がある。

この明細書においては、天然または新規ｔ−ＰＡの構成
アミノ酸の番号付けは、ベニ力（Ｐｅｎｎｔｃａ）らが
提案した番号付け［Ｎａｔｕｒｅ　３０１　、２１４　
（１９８３）参照］に従うものとし、たとえばＴｙｒ２
は、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２位のチロシンを意
味する。

この発明の新規ｔ−ＰＡの好ましい例は、次のアミノ酸
配列によって表わすことができる Ｒ１−八２′″Ｂ−Ｒ２−Ａ３１−１２３−Ｒ３−八１
３８−５２７　　（Ｉ　）（式中、Ｒ１は５ｅｔ−また
はＧｌｙＡｌａＡｒｇＳｅｒ−Ｒ２は−ＡｒｇＡｓｐＧ
ｌｕＬｙｓＴｈｒＧｌｎＭｅｔＩ　ｌｅＴｙｒＧ１ｎＧ
ｌｎＨ１ｓＧ１ｎＳｅｒＴｒｐＬｅｕＡｒｇＰｒｏＶａ
ｌＬｅｕＡｒｇＳｅｒ＾ｓｎＡｒｇ−または 一５ｅｒＡｓｐＧｌｕＴｈｒＧ１ｎＭｅｔｌｌｅＴｙｒ
ＧｌｎＧｌｎＨ１ｓＧｌｎＳｅｒＴｒｐＬｅｕＡｓｐＰ
ｒｏＶａｌＬｅｕＧ１ｕＳｅｒＡｓｎＧ１ｕ−Ｒ３は−
ＬｙｓＰｒｏＴｙｒＳａｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＰｒｏＡ
ｓｐＡｌａｌｌｅＡｒｇ−または −ＧＩｕＰｒｏＴｙｒＳｅｒＧｌｙＧｌｕＧｌｕＰｒｏ
ＡｓｐＡｌａＬｅｕＧ１ｕ−１Ａ２−６は天然ｔ−ＰＡ
のＴｙｒ’からＣｙｓ’までと同じアミノ酸配列、 八３１−１２３は天然ｔ−ＰＡのＶａｌ”から６１　ｎ
　１２　Ｓまでと同じアミノ酸配列、 ＾１１８，５２７は天然ｔ−Ｐ＾のＬｅｕ１３６からｐ
、Ｏ＠２１までと同じアミノ酸配列を示す。） この明細書においては、便宜上、該新規ｔ−ｐ＾につい
て次のコード名を使用する： ＦＰＡ 上記アミノ酸配列ＣＩ）にオイテ、 Ｒ１が５ｅｒ−１ Ｒ２が一５ｅｒＡｓｐＧ１ｕＴｈｒＧｌｎＭｅｔｌｌｅ
ＴｙｒＧｌｎＧｌｎＨｉｓＧ１ｎＳｅｒＴｒｐＬｅｕＡ
ｓｐＰｒｏＶａｌＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｓｎＧｌｕ−で
あり、 Ｒ３は−ＬｙｓＰｒｏＴｙｒＳｅｒＧ１ｙＡｒｇＡｒｇ
ＰｒｏＡｓｐＡ１ａｌｌｅＡｒｇ−であり、 Ａ””−Ａ３ｌ−’　”　！５　Ｊ：　ヒ”３６−”７
ハ各々上記定’Ａ　ノ通りである。

ａＫｌ−１２４ 上記アミノ酸配列（１）において、 Ｒ１が５ｅｒ−１ Ｒ２が−ＡｒｇＡｓｐＧｌｕＬｙｓＴｈｒＧ１ｎＭｅｔ
ＩｌｅＴｙｒＧ１ｎＧｌｎＨｉｓＧ１ｎＳｅｒＴｒｐＬ
ａｕＡｒｇＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒ’ｇＳｅｒ＾ｓｎＡ
ｒｇ−であり、 Ｒ３が−Ｇ１ｕＰｒｏＴｙｒＳｅｒＧｌｙＧｌｕＧｌｕ
Ｐｒｏ＾５ｐＡ１ａＬｅｕＧ１ｕ−であり、 Ａ２−６、＾３１−１２３および＾１３１１−！ｌｌ？
は各々上記定義の通りである。

この発明の新規ｔ−ＰＡは、組換えＱＮ＾技術およびポ
リペプチド合成によって製造される。

すなわち、この発明の新規なｔ−ｐ＾は、該新規ｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる発現
ベクターで形質転換した宿主細胞を培地に培養し、培養
物から該新規ｔ−ｐ＾を採取すること（よって製造でき
る。

上記製造法の詳細を以下に説明する。

宿主細胞は、微生物［細菌（たとえば、大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　、等）、酵母（たとえばパン
酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　、等］、動物細胞糸および培養植物細胞を包含
しつる。微生物の好ましい例としては、細菌、とくにエ
シェリヒア属に属する菌株（たとえばＥ、、　ｃｏｌｔ
　ＨＢＩＯＩ　ＡＴＣに３３６９４、　　Ｅ、　　ｃｏ
ｌｔ　　ＨＢＩＯＩ−１６ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８７２
゜Ｅ、　ｃ、ｏｌｉ　２９４＾ＴＣＣ３１４４６，Ｅ、
　ｃｏｌｉｚ　　１７７６　ＡＴＣＣ３１５３７、等）
、酵母、とくにサツカロマイセス属に属する菌株［たと
えば５ａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ　ＣＲＦ　１８　　（ヨーロッパ特許出願公開公報第
０２２５２８６号参照）］、動物細胞糸［例えばマウス
Ｌ９２９細胞、チャイニーズ・ハムスター・オバリー（
Ｃ）１０）細胞等］などが含まれる。

細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターは、通常、少なくともプロモーター、開始コ
ドン、新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
、終止コドン、ターミネータ−領域および自己複製可能
ユニットから構成されるのが通常であり、酵母や動物細
胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターは少
なくともプロモーター、開始コドン、シグナル・ペプチ
ドおよび新規ｔ−ＰＡのアよノ酸配列をコードするＤＮ
Ａならびに終止コドンから構成されるのが好ましく、さ
らにエンハンサ−配列、天然ｔ−ｐ＾の５°−および３
°−非コード領域、スプライシング・ジャンクション、
ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を発現ベク
ターに挿入することもできる。

好ましいプロモーターとしては、慣用のプロモーター［
たとえば、大腸菌用のＰＬ−プロモーターおよびｔｒｐ
−プロモーター、パン酵母用のＴＲＰＩ遺伝子ＡＤ旧ま
たは＾Ｄ）ＩＩＩ遺伝子および酸性ホスファターゼ（Ｐ
Ｈ０５）遺伝子のプロモーター、咄乳動物細胞用のＨＴ
ＬＶ−プロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー
ター、ＬＴＲ−プロモーター、マウス・メタロチオネイ
ンＩ　（ＭＭＴ）−プロモーターおよびワタシニアープ
ロモーター等］が挙げられる。

好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン（ＡＴＧ
）が挙げられる。

シグナル・ペプチドとしては、天然ｔ−ＰＡなどのシグ
ナル・ペプチドが挙げられる。

シグナル・ペプチドまたは新規ｔ−ｐ＾のアミノ酸配列
をコードする［ｌＮ八は、たとえば、ＤＮ八へ合成置を
用いての部分または全ＤＮＡ合成および／または形質転
換体、［たとえば旦、　ｃａｌｌ　ＬＥ　３９２人０（
ｐＴＰ＾２１）、　Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＪＡ　２２１　（
ｐＴＰ＾２５）　ＡＴＣＣ３９８０８、Ｅ、　ｃｏｌｉ
　ＪＡ　２２１　（ｉ）ＴＰ＾１０２）ＡＴＣＣ３９８
１０゜Ｅ、　ｃｏｌｉＪＡ　２２１　（ｐＴＰＡ１０２
）　（Ｌｙｓ　２７７−ｈＩｌｅ）　ＡＴＣＣ３９８１
１、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＪＭ　１０９　（ｐ５１Ｈ）　Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−９７７４゜Ｅ、　ｃｏｌｔ　　ＪＭ　ＩＱ
Ｂ　（ｐ８５３）　ＦＥＲＩＡ　Ｐ−９７７５３から得
られる適当なベクター［たとえば、　ｐｒｐ＾２１、ｐ
ＴＰＡ２５、ｐＴｐＡ１０２　、　ｐＴＰ＾ｘ０２（Ｌ
ｙｓ　２７７−１１ｅ）、ｐ５１）１％ｐＮ５３］　に
挿入された天然または変異ｔ−ＰＡをコードする完全な
りＮＡ配列の適当な酵素（たとえば、制限酵素、アルカ
リホスファターゼ、ポリヌクレオチド・キナーゼ、ＤＮ
Ａリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等）による処理のごと
き常法によって調製できる。この発明の好ましい実施態
様においては、新規ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡの調製
を、ウェズル（Ｗｅｌｌｓ）らが５ｃｉｅｎｃｅ　２３
３，６５９−６６３　（１９８８）に記載しているカセ
ット変異誘発および／またはフリンジ（Ｆｒ１ｔｚ）が
ＤＮＡクローニングＩ、１５１（１９８５Ｌ　ＩＲｌ、
プレスに記載しているオリゴヌクレオチド特異的変異誘
発によって行うことができる。

終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たとえ
ばＴＡＧ　、　ＴＧＡ　、等）が挙げられる。ターミネ
ータ−領域としては、天然または合成のターミネータ−
（たとえば、合成ｆｄファージターミネーター１等）が
挙げられる。

自己複製可能ユニットとしては、それに属する全ＤＮＡ
を宿主細胞中で自己複製しつるＤＮＡ配列で、天然のプ
ラスミド、人工的に修飾したプラスミド（たとえば、天
然プラスミドから調製したＤＮＡ断片）および合成プラ
スミドが挙げられる。

このプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細
胞とする場合に例えばプラスミドｐＢＲ３２２またはそ
の人工修飾体（ｐＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によ
って得られたＤＮＡ断片）が挙げられ、酵母を宿主細胞
とする場合に例えば酵母２μプラスミドまたは酵母染色
体ＤＮＡが挙げられ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場
合に例えばプラスミド、ｐＲ５Ｖｎｅｏ　ＡＴＣＣ３７
１９８、プラスミド＋）ＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣ３７
１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　　ＡＴ
ＣＣ３７２２４、プラスミドｐｓＶ２ｎｅｏ八ＴＣＣ３
７１４９が挙げられる。

エンハンサ−配列としては、例えばＳＶ４０のエンハン
サ−配列（７２ｂ、ｐ、）が挙げられる。

ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリア
デニル化部位が挙げられる。

スプライシング・ジャンクションとしては、例えば　Ｓ
Ｖ４０のスプライシング・ジャンクションが挙げられる
。

プロモーター、開始コドン、新規ｔ−ＰＡのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ　、終止コドンおよびターミネー
タ−領域は、適当な自己複製可能ユニット（プラスミド
）と共に、上流から下流に連続的に環状に、所望じより
適当なりＮＡ断片（例えばリンカ−５他の制限部位、等
）を用いて、常法（例えば制限酵素による消化、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いたライゲーション）により連結して
、発現ベクターを調製できる。＠乳動物細胞株を宿主と
して用いる場合には、エンハンサ−配列、プロモーター
天然ｔ−ＰＡのｃＤＮＡの５′−非コード領域、開始コ
ドン、シグナル・ペプチドおよび新規ｔ−ＰＡのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ　、終止コドン、３°−非コ
ード領域、スプライシング・ジャンクションおよびポリ
アデニル化部位を上記の手法で適当な自己複製可能ユニ
ットに上流から下流に連続的にかつ環状に連結して発現
ベクターを調製してもよい。

その発現ベクターを宿主細胞に導入する。導入は常法［
たとえば、形質転換（トランスフェクジョンを含む）、
マイクロインジェクション等、］によって実施でき、形
質転換体が得られる。

この発明の製法における新規ｔ−ＰＡの製造のためには
、このようにして得た発現ベクター含有形質転換体を水
性培地に培養する。

培地は、炭素源（たとえば、グルコース、グリセリン、
マンニトール、フラクトース、ラクトース、等）および
無機または有機の窒素源（たとえば、硫酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス
、ポリペプトン、バタトトリブトン、牛肉エキス、等）
を含有する。

所望により、他の成分［たとえば、無機塩類（たとえば
、１ｉ燐酸ナトリウムまたはカリウム、燐酸水素二カリ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウム）、ビタよン類（たとえば、ビタミンＢｌ）、抗
生物質（たとえば、アンピシリン、カナマイシン）、等
］を培地に加えてもよい、ｆｆ１ｉ乳動物細胞の培養に
は、クシ胎児血清および抗生物質を添加したダルベツコ
の改良イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）がしばしば用
いられる。

形質転換体（トランスフェクタントを含む）の培養は、
一般に、ｐＨ５，５〜８．５（好ましくはｐＨ７〜７．
５）、１８〜４０℃（好ましくは２５〜３８℃）で５〜
５０時間にわたって実施すればよい。

このようにして生産された新規ｔ−ＰＡが培養物の溶液
画分中に存在するときには、培養物の濾過または遠心分
離によって培養濾液（上澄液）を得て、これから、天然
または合成の蛋白質の精製１、ＩＩＬＩＩに一般的に用
いられている通りの常法（たとえば、透析、ゲル濾過、
抗−ｔ−Ｐ＾モノクローナル抗体を用いるアフィニティ
・カラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いるカ
ラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
、等）により精製、単離できる。生産された新規ｔ−Ｐ
Ａが培養形質転換体の細胞中に存在するときは、細胞を
濾過または遠心分離によって集め、細胞壁および／また
は細胞膜を、たとえば、超音波および／またはリゾチー
ムによる処理により破壊して、デブリスとする。デブリ
スは適当な水溶液（たとえば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグ
アニジウム塩水溶液）に溶解でき、その溶液から、上述
したような常法により新規ｔ−ＰＡを精製することがで
きる。

大腸菌で製造した新規ｔ−ＰＡはリホールドする必要が
ある。リホールディングは常法によって行うことができ
る。

この発明の新規ｔ−ｐ＾は、血管疾患（たとえば、心筋
梗塞、卒中、心臓発作、肺塞栓症、等）の治療のための
血栓溶解剤として有用である。この発明の新規ｔ−ＰＡ
は、医薬として許容しうる担体と混合して、注入剤のご
とき医薬製剤の形で、ヒトを含めた哺乳動物に非経口的
に投与できる。

医薬として許容できる担体は、ペプチドまたは蛋白質（
たとえば、血清アルブミン、等）を含有する医薬組成物
の調製に慣用されている種々の有機または無機の担体材
料を包含しうる。

この発明の新規ｔ−Ｐ＾の投与量は、疾患の種類、患者
の体重および／または年令、さらに投与経路の種類のご
とき種々の因子に応じて変動するが、この発明の新規ｔ
−ＰＡの最適投与量は、通常、注射または注入の場合は
０．１〜ｌａｆｆＩｇ／ｋｇ／日の範囲内から選択され
る。上記の一日量は数時間ごとに分割して患者に与えて
もよい。

以下の実施例はこの発明を説明するためのものであって
、それらに限定されるものではない。

実施例中、使用した酵素（たとえば、制限酵素、アルカ
リホスファターゼ、ＤＮ＾ポリメラーゼ、ＯＮ＾リガー
ゼ等）は全て市販のものであり、それら酵素の使用条件
は、たとえば市販の酵素に添付されている説明書を参照
すれば、当業者にとっては自明のところである。

バクテリオファージラムダシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４
＾のＥｃｏＲＩ部位にクローン化したヒトＤＮＡの部分
消化物を含有するヒトジェノムライブラリ−［Ｔ、マニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）から入手可能、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、Ｃｅ１ｌ　１５．６８７−７０１　（１９
７８）参照］を、ｆｆ２ｐニツクトランスレーシヨンに
よって得られる＋ＩＮＡプローブを用いて、プラークハ
イブリダイゼーション［Ｗａｈｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ。

ＩＪｓＡ　７８．３８８３−３６８７　（１９７９）参
照］によりスクリーニングした。プラスミドｐＴＰＡ１
０２　（Ｌｙｓ２７７−１ｉｅ）［それを含有する形質
転換株Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１（ｐＴＰＡ１０２）
　（Ｌｙｓ２７７−４１ｉｅ）　ＡＴＣ（：　３９８１
１から単離できる変異ｔ−ＰＡ（Ｌｙｓ２７７−１１ｅ
）発現ベクター、　ＰＣＴ国際公開第ＷＯＢＢ／（１１
５３Ｂ号参照〕の２３２ｂｐ　ＰｓｔＩ−ＲｓａＩ断片
をプローブとして用いることにより、６Ｘ１０’プラー
クのスクリーニングから、３種の重なり合う組換え体λ
１８Ａ１、λ１９＾２およびλ２１＾２を単離した。ｔ
−ＰＡ遺伝子の転写開始部位および５゛−非コード配列
を含むファージを単離するために、ｔ：　−Ｐ　Ａ遺伝
子の５°　−非コード配列を含むλ１９Ａ２からの１．
５　Ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｂａｍ　）ＩＩ断片をプロ
ーブとして、２回目のプラークハイブリダイゼーション
を行った。このハイブリダイゼーションにより、ｔ−Ｐ
Ａ遺伝子の最初の二つのエキソンを含有するん１３２　
ＡＩおよびλ１１０＾１を得た。挿入ＤＮＡ配列のマツ
ピング制限酵素解析によって行い、それらのＩ）ＮＡ配
列をＭ１３シーケンシングキット（アマ−ジャム）を用
いるジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション
法によって部分的に決定した。

それらの挿入ＤＮＡの配列およびマツピングは、発表さ
れているｔ−ｐ＾ジェノムクローン［Ｄｅｇｅｎら、Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、（ｔ＋ａｍ、　２６１．６９７２−８９
８５　　（１９８６）］と一致することがわかった。

メラノーマ（黒色１１！り細胞培養からの全ＦＩＮＡを
Ｃｈｉｒｇｖｌｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８
　、　５２９４　　（１９７９）　　の報告と実質的に
同様にして抽出した。ヒトメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ
）を、３％（Ｖ　／　Ｖ　）ウシ胎児血清および１０　
ｍＭ　ＨＥＰＳを補ったダルベツコの改良イーグル最小
必須培地（ＤＭＥＭ）　４００ｍＡをそれぞれ入れた１
０本の回転びんの中で、コンフルエントな単層となるま
で培養し・た、　　ｔ−ｐ＾を盛んに生産するために、
ヒトメラノーマ細胞を、プロテアーゼ阻害剤の７ブロチ
ニン６６６μｇを含むＤＭＥＭ各４００ｍｆ！、中で１
８時間培養した。細胞を遠心分離によって集め、６Ｍイ
ソチオシアン酸グアニジウム、５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，０）、０．１１ｉｔ２−メルカプトエタノ
ールおよび０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウ
ムの５０１１１１．に再悲濁した。細胞をホモジナイゼ
ーションによって分散させた。ホモジネートを、ベック
マン５Ｗ５０．１ポリアロマ−管に入れた０、１　Ｍ　
ＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）中の５．７Ｍ塩化セシウムのク
ツション３　　ｌｌ１ｆｌの上へ載せ、３０．０００ｒ
ｐｍ　、　　２０℃で１２時間遠心分離した。

上澄みを捨て、ＲＮＡベレットを水１　　ｍＪＺに溶か
した。０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ）ｌ　５．２
）および２．５容のエタノールを加えて、ＲＮＡを沈澱
させた。オリゴ−ｄＴセルロースカラムクロマトグラフ
ィーを用いて、全ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを精製した
［Ａｖｉｖ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　６９．１４０８（１９７２）参照］。４　
Ｘ　１０”細胞からの代表的な収量は、全ＲＮＡ約１１
ｍｇ、ポリ（Ａ）プラスｍｔｌＮＡ約９００　μｇであ
った。

このポリ（＾）プラスＩＩＩＲＮ＾を、５°−ブライマ
ー伸長法［Ｌａｗｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、９．６１０３−１！１１４　（１９８１）参照
］による二本１１１ｃＤＮ＾の調製に用いた。　ｍＲＮ
Ａ　１８０μｇと配列５’　−ＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴ
ＡＡＧＡ−３°を有するブライマー５μｇを、Ｑ、ＩＭ
　ＫＣＩ　２００μ℃中、９０℃で５分間加熱し、つぎ
にゆっくり４２℃まで冷却した。アニールしたｍＲＮＡ
を用い、５０ｆｆ１ＭトリスＨＣＩ（ｐＨ８，３）、１
０ｍＭ　ＭｇＣｂ　、１０ｍＭＤＴＴ　、　４ｍＭ　　
ビロリン酸ナトリウムおよび各１ｍＭの４種のデオキシ
リボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡ丁Ｐ、　ｄＴ
ＴＰ、　ｄ（：ＴＰ、　ｄＧＴＰ）　　の４００　μ℃
中で逆転写酵素２０Ｑ　４１位を用いて、第一のｃＤＮ
Ａ鎖を４２℃で６０分間にわたり合成した。混合物を、
２００１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、５　ｍＭ
　Ｍｇｅｔ２．１０　ｍＭ　（ＮＨ４）　２５０４．１
００ｍＭ　ＫＣＩ　、　０．１８ＬＩＩＭ　ＮＡＤ。

５０　ｕ　ｇ／　ｍｎ　　ＢＳＡ２ａ＋ｆｌ中で１．Ｏ
ＪＩ位／ｍｌｌのＲＮａｓｅ　Ｈ、５０車位／ｍ！Ｑの
ＤＮＡポリメラーゼＩおよび５０１１位／＋＋ｊ２の大
腸菌ＤＮ’Ａリガーゼにより、１２℃で１時間、２２℃
で１時間処理した。

反応混合物に７４　ＤＮＡポリメラーゼ１５単位を加え
た。３７℃で１０分間インキニーベートしたのち、反応
混合物をフェノール／クロロホルムで１回抽出し、水溶
液を１容の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび４容のエタノー
ルで沈澱させた。二本鎖ｃＤＮＡを、２００　ｍＭカコ
ジル酸カリウム、２５ｍＭトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ６，
９）、１　ｍＭ　ｄＣＴＰ　、　０．１ｍＭ　ＤＴＴ　
、　１ｍＭ　　ＣｏＣ１ｚ　２００μＡ中、ターミナル
トランスフェラーゼ１０単位を用いて、３７℃で３０分
間にわたり、デオキシ　（Ｃ）残基で伸長させた。反応
混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、水溶液を
０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（９８５，２）および２
容量のエタノールで沈澱させた。テイルのついたｃＤＮ
Ａを、１０ｍＭトリス−）ＩＣＩ（ｐＨ８，０）　　、
１ｍＭ　ＥＤＴ＾、０．１５Ｍ　ＮａＣ１６００μＸ中
、５８℃で１時間にわたり、デオキシ（Ｇ）テイルつき
ｐｕｃ９　（ファルマシア）　８８０ｎｇとアニールし
た。アニールしたＤＮＡを用いて、コンピーテントなＥ
、　ｃｏｌｔ　ＤＨＩを形質転換した。アンピシリン耐
性表現型として約１７，０００の形質転換株を得た。こ
の５°−ブライマー伸長ｃＤＮＡライブラリーを、３２
ｐニツクトランスレーシヨンによって得られたＤＮＡプ
ローブによりコロニーハイブリダイゼーション（Ｇｒｕ
ｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、７２．３９８１−３９６５（１９７５）参照コ
によりスクリーニングした。λ１９＾２からの１．５ｋ
ｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をプローブとして、陽
性のハイブリダイゼーションシグナルを与えた８コロニ
ー中の一つから、ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの５°−非コー
ド配列およびシグナル配列を含有するプラスミドｐＭＩ
　２００をＩＬ離した。ｐＭＩ２００のｃＤＮＡ挿入断
片は、長さが約１７０ｂｐで、ジデオキシヌクレオチド
チェーンターミネーション法によってＤＮＡの塩基配列
を決定した（そのｃＤＮ＾配列を第４図に示す）。

旦、ｃｏｌｉ　　ＪＡ２２１　（ｐＴＰ八１へ２）（Ｌ
ｙｓ２７７−＝　１ｉｅ）ＡＴＣＣ３９８１１の斜面培
養の１白金耳を、５０℃ｇ／ｍＪＺのアンピシリンを含
有するし一ブロス１１．に接種し、３７℃で、８００ｎ
ｍでの光学密度（ｏ、ｏ、）が約ｏ、ａ吸収車位となる
まで、振盪しながらインキュベートした。　０．０．が
約０．６　となったとき、培地にクロラムフェニコール
粉末を最終濃度１００μｇ／　ｍＡとなるよう添加し、
インキュベーションを一夜続行した。

Ｂ、プラスよドｐＴＰＡ１０２（Ｌ　５２７７−１１ｅ
）の単離実施例３Ａで得た培養ブロスからＥ、　ｃｏｌ
ｉ　Ｊ＾２２１　（ｐＴＰＡ１０２）　（Ｌｙｓ２７７
　→ｌ１ｅ）の細胞を集めた。

細胞は４０００ｇ　、　４℃で１０分間の遠心分離によ
って集め、上澄液は捨てた。細胞ベレットを、５ｍｇ／
ｍＩＬのリゾチームを含有する溶液１（５０ｍＭグルコ
ース、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）、１０
ｍＭＥＤＴＡを含有する水溶？ｒｉ）２０ｍｆｔに再懸
濁し、室温で５分間放置した。つぎに、リゾチーム処理
細胞に溶液２　（０，２Ｎ　ＮａＯＨおよび１％ＳＯＳ
を含有する水溶？ｒ！ｉ、）４０ｍＩＬを加え、倒置に
より溶液をおだやかに混合した。混合物を氷上に１０分
間放置した。

氷酢酸１１．５　ｍＪ２．と水２８．５　ｍＪ２を５Ｍ
酢酸カリウム溶液（ｐＨ４，８）　　６０　　Ｉｆに加
えて調製した水冷酢ｍ緩衝液３０ｍ４を上で得に混合物
に加え、倒置により混合した。溶液を氷上に１０分間放
置し、トミー・セイコーＮｏ、−４Ｎ−Ｉｆ　（または
それの等個物）中、２Ｇ、ＯＯＯｒｐｍ、４℃で２０分
間遠心分離した。宿主ＤＮ＾とデブリスが管底にペレッ
トを形成した。上澄液約７２ｍＪｌを回収し、イソプロ
パツールＯ，ａ容量を加え、混合し、室温で１５分間放
置した。１１，０００ｇ　、室温で１５分間遠心分離し
てプラスミドＤＮ＾を集めた。上澄みを捨て、ＤＮＡペ
レットを室温で７０％エタノールで洗い、デカントした
。ベレットを真空デシケータ−中で乾燥し、ＴＥ緩衝液
［１０ｍＭ）’リスー〇ＣＩ　（＋）Ｈ７，５）および
１ｍＭ　　ＥＤＴＡ］　８　　ｍｌｌに再懸濁した。

そのＤＮＡ溶液にＣｓＣ１８ｇを加えた。１０ａ＋ｇ／
ｍＪＺの臭化エチジウム水溶７夜をＣｓＣ１−ＤＮＡ溶
液の各１０ｍｕに加えた。溶液の最終密度は約１．５５
ｇ／ｍｌＬ、臭化エチジウム濃度は約６００μｇ　／＋
ｎＪ！であった。溶液をベックマンＶＴｉ６５遠心分離
管に移し、頂部まで満たし、シールし、５０．ＯＯＯｒ
ｐｍ　。

２０℃で１２時間遠心分離した。遠心後、通常光で二つ
のＤＮＡバンドが見えた。＃２１皮下注射針つきの注射
器を遠心管の側面ぞいに挿入して、下方のＤＮＡバンド
を回収した。回収したＤＮＡ溶液は５ＭＮａＣ１飽和イ
ソプロパツールで数回抽出して臭化エチジウムを除去し
た。ＴＥ１１衝液に対しての透析によりＣｓＣ１を除去
した。プラスミドｐＴＰＡ１０２（Ｌｙｓ２７７−　Ｉ
Ｌｅ）約１ｍｇが得られ。これを４℃で保存した。

生型 プラスミドｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７−１１ｅ）
約５０μｇを、１００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭトリス
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、７
ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる制限緩衝液Ａ１
００μ℃中、制限酵素Ｂｇ１１１３０単位により、３７
℃で２時間消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により濃
縮し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動した。１９
７４ｂｐの生ＩＩ断片（そのＤＮＡ配列を第４図に示す
）を実施例５Ａと同様にして可視化し、回収した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、ｃｏ口［１）＋１の形質
転換 プラスミド９ＭＩ２００約０．８μｇを制限酵素緩衝液
Ａ４０μ℃中で艶３１＋１３０単位により３７℃で２時
間消化して、線状ＤＮＡを調整した。線状化したプラス
ミドを、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下は２．５容量
のエタノールで沈殿させ、遠心分＠ＣよりＤＮＡを集め
た。ＤＮＡベレットを、水９４μ℃、アルカリホスファ
ターゼン夜（２５０、ＱＬ（立／ｒｎＲ，；宝酒製株式
会社）１μ℃および１Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）
　　５μ℃中に再懸濁し、３７℃に１時間置いた。　Ｄ
ＮＡを、フェノールとクロロホルムの（１：１）混合物
およびクロロホルムとイソアミルアルコールの（２４：
１）混合物とで抽出後、エタノールで沈澱させ、水２０
μ℃中に再懸濁した。この脱リン酸化ｐＭＩ　２００７
　ｕｌ　（約２００ｎｇ）を１９７４ｂｐ　出１１断片
２μｆｔ（約１０１００ｎ、５×ライゲーシヨン緩衝７
夜［３３０ＩＩＩＭトリスー１（Ｃ１（ｐＨ７，５）、
３３　ｍＶ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、２．５ｍＭ　ＡＴＰＩ　３　μＩｔ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１μｍおよび水２μ℃に加えた。この反応混
合物を１４℃で一部インキユベートした。

実施例５Ｄと同様にして、ライゲーション混合物により
Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＨＩを形質転換し、生じたＥ、　ｃ
ｏｌｉ　ＤＨＩ（ｐＭＩ　２０５）形質転換体をそれら
のアンピシリン耐性表現型およびそれらのプラスミドＤ
ＮＡの数種の制限酵素による分析によって同定した。形
質転換体の一つから、実施例３と同様（して、プラスミ
ドｐＭＩ　２０５を！＃離した。

プラスミドｐＲ５Ｖｎｅｏ八Ｔ（：ＣＮｏ、　３７１９
８約１３μｇを、制限緩衝液Ａ５０μ℃中、制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩ＋　３０単位および制限酵素Ｒａｍ　ＩＩ　
３　ｏｘ位により、３７℃で２時間消化した。消化した
プラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で泳動し、ゲ
ルを臭化エチジウムで染色し、長波Ｕｖ光で可視化した
。大きい旧ｎｄｌｌｌ　−Ｂａｍ　Ｈ１制制限片を切り
出し、−８０℃で２０分間凍結した。凍結融解法（Ｔｈ
ｕｒｉｎｇら、１９７５年、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、６６、２１３参照）によりＤＮＡ溶液を回収し、２
．５容量のエタノール−０，３Ｍ酢酸ナトリウムで沈澱
させ、遠心分離によりＤＮＡを採取した。ベレットを真
空中で乾燥し、乾燥蒸留水２０μｍ中に再懸濁させた。

Ｂ、プラスミドＭＩ２０５の約２．１ｋｂ　）Ｉｉｎｄ
ｌｌｌ　−Ｒａｍ）ＩＩ断片の単離 プラスミド９ＭＩ２０５約３０μｇを、制限緩衝液Ａ中
制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩｌｌおよびＢａｍＨＩ各３０
．４！−位により３７℃で完全に消化した。これにより
、大きさが２．７ｋｂと２．１ｋｂの二つのＤＮＡ断片
が生じた。１％アガロースゲルへかけるに先立ち、ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させた。約２．１ｋｂのＨｉｎｄ
ｌｒｌ　−ＢａｍＨＩバンドを、実施例５Ａと同様にし
て可視化し、切り出し、回収した。

Ｃ，ライゲーション 実施例５八および５Ｂで得た上記断片各駒１１００ｎを
、６６ｍＭ）リス−〇（：ｌ　（ｐ１４７．５）、８．
６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルおよび０．５ｍＭＡＴＰを含有する反応混合物２０μ
Ａ中、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（３５０，０００単位／
ｌｎｌ；宝酒造株式会社）１μ℃を用いて、室温で４時
間ライゲートした。

Ｄ、　Ｅ、　ｃａｌｆ　ＨＢＩＯＩのづ　転）生じたラ
イゲーション混合物を用いて、ＶＳｉｍａｎｉｓ、ＤＮ
Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ第１巻、ＩＲＬプレス、オックスフ
ォード、ワシントン特別行政区（１９８５）の形質転換
法と同様にして、アンピシリン５０μｇ／ｍＪｌ含有Ｌ
プレート（１％バクトドリブトン、０．５％酵母エキス
、０．５％塩化ナトリウム、１．５％寒天、ｐＨ７，５
）上で、旦、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。

形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型ならび
に２．Ｏｋｂ　９３３　Ｉ＋断片の存在を含めてのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素切断パターンの分析によって同
定した。生じた細胞を用いて実施例３と同様にして、プ
ラスミドｐｓＴ１０４を隼、＠しり。

実施例６ プラスミド５Ｔ１０５Ｎの構築 藤 プラスくドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣＮｏ、３７１４
５約５０ｕｇを、制限）Ｊｌ衝漬液Ａ１００μ びＢａｍＨＩ各３０ＪＳＬ位を用いて、３７℃で２時間
完全に消化した。エタノール沈澱によりＤＮＡを濃縮し
、１％アガロースゲルで電気泳動した。約０．９ｋｂの
断片を実施例５Ａと同様にして可視化し、回収した。

Ｂ．ライゲーションおよびＥ．　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ
の堅携 プラスミドｐｓＴ１０４約０．６μｇを、制限ｉ清液Ａ
４０μｊ！中、３０単位のＢａｍＨＩにより３７℃で２
時間消化して、線状ＤＮＡを調製した。線状化プラスミ
ドを２．５容のエタノールと０．３Ｍ酢酸ナトリウムで
沈澱させ遠心分離によりＤＮＡを採取した。

ＤＮＡベレットを水９４μ℃、アルカリホスファターゼ
溶液（２５０単位／ｆｆ１ｆＬ：宝酒造株式会社）１μ
℃およびＩＭ）リス−）ＩＣＩ　（ｐ）１１３．０）　
　５μ℃中に再懸濁し、３７℃に１時間置いた，　ＤＮ
Ａを、フェノールとクロロホルムの（１：１）混合物お
よびクロロホルムとイソアミルアルコールの（２４：１
）混合物とで抽出後、エタノールで沈澱させ、水２０μ
℃中に再懸濁した。この脱リン酸化ｐｓＴ１０４　７　
ｕ　ｆｌ　（約２００ｎｇ）を、実施例６Ａで得たＬＬ
！　ＩＩ　−　Ｒａｍ旧断片２μｆＬ（約１０１００ｎ
、５×ライゲーシヨン緩衝液（　ＡＴＰ含有）３μＡ％
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μ℃および水２μ℃の混合物に加
えた。この反応混合物を１４℃で一部インキエベートし
た。

実施例５Ｄと同様にして、ライゲーション混合物により
Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換し、生じた形質
転換体Ｅ．　ｃｏｌｔ　）ＩＢＩＯＩ（ｐｓＴ１０５）
をそれらのアンピシリン耐性表現型ならびにそれらのプ
ラスミドＤＮＡの旧ｎｄｌｌｌ　−　ＢａｍＨＩ制限酵
素分析によって同定した。形質転換体の一つから、実施
例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１０５を単離した
。

Ｃ．　　５Ｔ１０５　ＮａｒＩ　−５ａｃＩ断片の単離
プラスミドｐｓ７１０５約１０μｇを、１９＋ｎＭ）−
リス−ＨＣｌ　（’ｐＨ７　、５）、１　０　ＩＩＩＭ
　ＭｇＣｌ２、１　ｍＭ　ＤＴＴを含有する制限緩衝液
Ｃ５０μｌ中、制限酵素ＮａｒＩ　　２０単位および５
ａｃ１１０単位により、３７℃で完全消化した。消化プ
ラスミドＤＮ＾を１％アガロースゲルで泳動し、臭化エ
チジウムでゲルを染色し、ＤＮＡバンドを長波ｕｖ先光
下可視化した。大きいＮａｒＩ　−５ａｃＩ断片を切り
出し、実施例５Ａと同様にして回収した。

Ｄ，プラスミドＴＰ＾２１の約０．９ｋｂ　Ｎａｒｌ−
５ａｃｌ断片のＪＩＬ離 天然ｔ−ＰＡと３°−非コード領域の一部とをコードす
るＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＴＰＡ２１約１０μ
ｇを、制限緩衝液Ｃ中、制限酵素Ｍａｒ１２０単位およ
び５ａｃ１１０単位により、３７℃で完全消化した。エ
タノール沈澱によりＤＮＡを濃縮したのち、１％アガロ
ースゲルにかけた。実施例５Ａと同様にして、約０．９
ｋｂのＮａｒｌ　−　５ａｃＩバンドを可視化し、切り
出し、回収した。（　ＮａｒＩ　−　５ａｃＩ断片のＤ
ＮＡ配列を第８図に示す）。

Ｅ．ライゲーションおよびＥ．　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ
の堅及 実施例６Ｃおよび６ｐで得た上記断片の各々約１１００
ｎを、反応混合物２０μｊ２中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
（３５０，０００車位／ｆｆ１１；宝酒造株式会社）に
より室温で４時間ライゲートした。ライゲーション混合
物を用いて、実施例５０と同様定して、旦、　ｃｏｌｔ
　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、それらの
アンピシリン耐性ならびにプラスミドｆｌＮＡの制限酵
素分析により同定した。得られた細胞を用いて、実施例
３と同様にして、プラスミドｐｓ７１０５Ｎを単離した
。

ｐｓ７１０５Ｎ　２０μｇを、制限Ｍ漬液＾５０μ文中
、制限酵素１５車位により、ゲル電気泳動分析によって
調べたときに部分消化のみを達成するべく予備インキュ
ベーション後、３７℃で４分間消化した。エタノール沈
澱によってＤＮＡを濃縮し、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，６
ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，９）、６ｍＭＭｇ（：
Ｌ　、６ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび１００
　Ａｔｇ／　ｍｊ２のＢＳＡを含有する制限酵素５ａｌ
Ｉ緩衝液５０μ℃に再懸濁し、そこへ２０単位の５ａｌ
Ｉを加えた。３０℃で２時間反応を行った。ＤＮＡをエ
タノール沈澱により濃縮し、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（
ｐＨ４，６）、５０　ｍＭ　ＮａＣ１１ｍＭ　ＺｎＣ！
、および５％グリセロールを含有するマングビーンヌク
レアーゼ緩衝液に再懸濁した。反応混合物を３７℃で３
０分間インキュベートし、フェノールとクロロホルムと
の（１：１）混合物、クロロホルムとイソアミルアルコ
ールとの（２４：１）混合物で抽出後、ＤＮＡ断片をエ
タノールで沈殿させ、水２゜μ℃に再懸濁した。

Ｂ、ライゲーション 実施例７Ａで得に上記ＤＮＡ断片約５０ｎｇを、６６ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．１゜１Ｍ２−メルカプトエタノールおよび０．
５ｍＭ　　ＡＴＰを含有する反応混合物２０μ℃中、リ
ガーゼ（宝酒造株式会社）３５０単位を用い、室温で４
時間自己ライゲートさせた。

Ｃ，Ｅ、　ｃｏｌｔ　８Ｂ１０１の形　転上記ライゲー
ション混合物を用い、実施例５Ｄト同様ニシテ、旦、　
ｃｏｉｌ　ＨＢＩＱＩを形質転換した。

形質転換混合物をアンピシリン５０μｇ／ａｆＬ含有Ｌ
プレートにブレーティングした。形質転換体をそれらの
アンピシリン耐性表現型ならびにそれらのプラスミドの
ｌｌｌ−５ａｌＩ制限酵素分析によって同定した。それ
ら形質転換体の一つから、実施例３と同様にして、プラ
スくドｐＳＴ１０６をＳａｔ。

た。

笈践里！ プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　ＡＴＣＣＮｏ、　３７１
４５約１０μｇを、制限Ｍｉ街液Ａ５０μ２中、制限酵
素Ｈ４ｎｄｌｌ！　２０単位および制限酵素ＢａｍＨ１
１０単位により、３７℃で２時間消化した。消化したプ
ラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で泳動し、ゲル
を臭化エチジウム染色し、長波Ｕｖ光で可視化した。大
きいＨｉｎｄｌｌ！　−Ｂａｍ　ＨＩ制限断片を切り出
し、実施例５Ａと同様にして回収した。

Ｂ、プラスミド５Ｔ１０６の約３．Ｏｋｂ　Ｈｉｎｄｌ
ｌＴ−Ｂａｍ　ＨＩ旦、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩからＪ
ＩＬＩ１１シたプラスミドｐｓＴ１０６約１０μｇを、
制限Ｎｉ衝漬液中、制限酵素旧ｎ　ｄ　ｌｌＩ２０単位
および制限酵素ＢａｍＨ１１０単位により、３７℃で完
全に消化した。１％アガロースゲルへかけるに先立ち、
　ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。約３．Ｏｋｂの■
庭ｌｌｌ−艷ＨＩバンドを、実施例５＾と同様にして可
視化し、切り出し、回収した。

Ｃ，ライゲーション 実施例８Ａおよび８Ｂで得た上記断片各駒１１００ｎを
反応混合物２０μ℃中Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（３５０
，０００ｉ位／ｌｌ１ｉ；宝酒造株式会社）０．５μ℃
を用いて、室温で４時間ライゲートした。

Ｄ、　Ｅ、　ｃａｌ（Ｈｌｌｌｏｌの形　転を上記ライ
ゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、
旦　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換混
合物をアンピシリン５０μｇ／ｒａｆｔ含有Ｌプレート
にブレーティングした。形質転換体をそれらのアンピシ
リン耐性表現型ならびにそれらのプラスミドのＢＪｉＩ
Ｉ　−Ｂ　ａｍ旧制限酵素分析によって同定した。それ
らの形質転換体の一つから、実施例３と同様にして、プ
ラスミドＩ）ＳＴ１０２をＪ＃離した。

プラス４１９ＭＩ２０５約５μｇを、制限１１Ｌ衝液Ａ
中、制限酵素Ｒａｍ　［１０ＲＬ位により、３７℃で完
全に消化した。プラスミドｐＭＩ２０５には単一のＲａ
ｍＨＩ部位が存在するので、このＲａｍ　ＨＩ消化ｐＭ
Ｉ２０５によって線状のＯＮ八へが生成する。　Ｂａｆ
ｆ１Ｈ１消化ｐＭＩ２０５をエタノールで沈澱させ、水
９４μＡ１アルカリホスファターゼ溶液（２５０４位／
ｌλ；宝酒造株式会社）１μ℃および１Ｍトリス−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ８，０）　５　　ｍｆＬ中に再懸濁し、３７
℃に１時間置いた。ＤＮＡをフェノールとクロロホルム
（ｔ：Ｂ混合物およびクロロホルムとイソアミルアルコ
ールの（２４：１）混合物とで抽出後、エタノールで沈
澱させ、水３０μ℃中に再懸濁した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ
の鮫魚 実施例６＾および９八で得た上記断片の各々約１１００
ｎを、反応混合物２０μＡ中で、Ｔ　４　［ＩＳＡリガ
ーゼ１７５４位により室温で４時間ライゲートした。ラ
イゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして
、旦、ミ且を形質転換した。形質転換体を、それらのア
ンピシリン耐性表現型ならびにプラスミドＯＮ＾の制限
酵素分析により同定した。得られた細胞を用いて、実施
例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１０１を単離した
。

Ｃ，プラスミド５ＴＩＯＩ−にの　築 プラスミドｐｓＴ１０１約ｔμｇを、５０　ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１゜１０ＩＩＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、
　　１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、　　７　ｍＭ２−メルカプ
トエタノールからなる制限Ｍ荷液Ｂ　２０μ４！中、制
限酵素旧ｎｄ　ＨＴにより、３７℃で消化して、線状の
ＤＮＡを調製した。線状化したプラスミドを、０．３Ｍ
酢酸ナトリウムの存在下に２．５容量のエタノールで沈
澱させ、遠心分離によりＩ）ＮＡを集めた。　ＤＮＡベ
レットをニックトランスＬ／−シａンｌｌ荷液（５０ｍ
Ｍトリス−１４ＣＩ　、　ＰＨ７，２１０ｍＭ　　Ｍｇ
ＳＯ４，０，１ｍＭ　　ＤＴＴ、５０　　μｇ／　　Ｌ
ＩＩＡ　ＢＳＡ）４０μ互に再懸濁し、そこへ各ｄＮＴ
Ｐ（５ｍＭ　ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｃｌＧＴＰ）　　１μぶとク
レノー断片（宝酒造株式会社）２単位とを加えた。反応
を室温（２０℃）で３０分間実施し、６５℃、１０分間
の熱処理により停止させた。史Ｉリンカ−（５゜−ＣＧ
ＧＴＡＣＣＧ−３°、ニューイングランドバイオラブズ
製）１μ℃を、７０ｍＭトリス−ＨＣＩ（７，６）。

１０ｍＭ　ＭｇＣｈ、　　５ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５　
ｍＭ　ＡＴＰの２０μ℃中、ポリヌクレオチドキナーゼ
にューイングランドバイオラブズ）２０ＪＩＬ位を用い
てリン酸化した。リン酸化したＫｐｎ　Ｉ　リンカ−１
０μｇと上記平滑末端化した旧ｎ　ｄ　ＩＩ！断片１μ
ｇを、反応混合物２０μ℃中で、Ｔ　４　ＤＮＡリガー
ゼ３５０４１１位を用いてライゲートした。ライゲーシ
ョン混合物を用いてコンビ−テントＥ、　ｃｏｌｉ　Ｈ
ＢＩＯＩ細胞を形質転換した。形質転換体を、それらの
アンピシリン耐性表現型および制限酵素分析により同定
した。得られた細胞を用いて、実施例３と同様にして、
プラスミドｐｓＴ１０１−Ｋを単離した。

プラスミドｐｓＴ１０１”Ｋ約１μｇを、制限緩衝液Ａ
２０μ℃中、Ｒａｍ　ＨＩＩ　Ｏ単位により、３７℃で
２時間消化して、線状のＤＮＡを調製した。エタノール
沈澱により線状化したＤＮＡを濃縮した。ＤＮＡをニッ
クトランスレージａン緩衝液４０μ角に再懸濁し、そこ
へ各ｄＮＴＰ（５ｍＭ　ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、　ｄＣＴ
Ｐ。

ｄＧＴＰ）　１μ℃とクレノー断片（宝酒造株式会社）
２車位とを加えた０反応を室温（２０℃）で３０分間実
施し、６５℃、１０分間の熱処理により停止させた。実
施例９Ｃと同様にして、Ｋｐｎ　Ｉ　リンカ−（５°−
ＣＧＧＴＡＣＣＧ−３’　ニューイングランドバイオラ
ブズ製）をリン酸化し、平滑末端化したＲａｍ　Ｈ１断
片をライゲートした。ライゲーション混合物を用いてコ
ンピテントＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ　１ｔａｌ胞を
形質転換した。形質転換体を、それらのアンピシリン耐
性表現型および制限酵素分析により同定した。得られた
細胞を用いて、実施例３と同様にして、プラスミドｐｓ
Ｔ１０１−２にを単離した。

Ｂ、プラスミドｐｓＴ１０１−２にの約３．０ｋｂ　Ｋ
　ｎＩ断片の生態 プラスミドｐｓＴ１０１−２に約５μｇを、史工緩街液
（６ａ＋Ｍ　ＮａＣ１、６ｍＭトリス−ＨＣｌ　、　ｐ
）１７．５　、　６ｍＭ　ＭｇＣｈ、　　６［ＩＩＭ　
２−メルカプトエタノール）５０μ℃中、制限酵素臘１
２０！＃位はより、３７℃で２時間消化した。　ＤＮＡ
をエタノール沈澱により濃縮してから、分取用０．１％
アガロースゲルにかけた。約３．ＯｋｂのＫｐｎ、Ｉバ
ンドを、実施例５＾と同様にして可視化し、切り出し、
回収した。

Ｃ，プラスミドｐｓＴ１０３の構築 ｐｓＴ１０３を構築するために、プラスミドｐＫｓＶ１
０（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ）約２μｇを
制限酵素史１で消化し、細菌アルカリホスファターゼ（
宝酒造株式会社）１単位を用いて６５℃で２時間脱リン
酸化した。線状化ｐＫｓＶｌＯ断片を、実施例５Ｄと同
様にして実施例１０Ｂで単離した約３．０ｋｂの史■断
片にライゲートした。

実施例５Ｄと同様にして、プラスミドｐｓＴ１０３によ
り旦、■ｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換し、生じたＥｃｏ
ｌｔ　ＨＢＩＯＩ　（ｐｓ丁１０３）形質転換体をそれ
らのアンピシリン耐性表現型およびそれらのプラスミド
ＤＮＡの制限酵素による分析によって同定した。形質転
換体の一つから、プラスミドｐｓＴ１０３を単離した。

プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＡＴＣＣＮｏ、
　３７２２４約１ａｇを、Ｂａｍ　ＨＩ緩衝液（１５０
ｎ＋Ｍ　Ｎａ（：ｌ、６ｍＭｆ−リス−ＨＣｌ　、ｐＨ
７，９、６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ）　５０　ａｌｌ中、制限
酵素Ｂａｍ　）１１．ｆ１位により３７℃で完全消化し
た。

Ｂａｍ　）ＩＩ消化ｐｄＢＰＶ−ＭＭ丁ｎｅｏをエタノ
ールで沈澱させ、水２０μ℃中に再懸濁した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯｌ
の形（盈 上記実施例１１Ａで得たＤＮＡ約ｏ、ｉμｇを実施例５
Ｃと同様にして自己ライゲートさせ、た。ライゲーショ
ン混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にしてＦ−、ｃｏ
ｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、それ
らのアンピシリン耐性表現型およびプラスミドＤＮＡの
制限酵素分析によ・２て同定した。形質転換体の一つか
ら、実施例３と同様にして、プラスミドｐＭＭＴｎｅｏ
を！ＩＬ１！１１１した。

プラスミドｐＭＭＴｎｅｏ約５μｇを、Ｂ１０　ＩＮ緩
衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ）−リス−〇Ｃ
Ｉ　、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、１０ＩＩＩ
Ｍ２−メルカプトエタノール）１００μ℃中、制限酵素
工ＩＩ　５０ｊ１．位により３７℃で完全消化した。　
ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。

Ｂ、Ｂｉｌ＋末端のクレノー平滑末端化上記実施例９Ａ
で得たｐＭＭ丁ｎｅｏの工ＩＩ消化産物を、５０ｍＭト
リス−）ＩＣＩ　（ｐＨ７，２）、１０　ｍＭ　ＭｇＳ
Ｏ３、＋１．１ｍＭ　ＤＴＴ　、　　５０　ｕｇ／　ｍ
ｊ！ＢＳＡ　、　０．５ｍＭ　ｄＡＴＰ。

０．５ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．５ｍＭ　ｄ［：ＴＰおよび
０．５ｍＭ　ｄＴＴＰの混合物中クレノー断片１．＠位
により平滑末端化した。

反応混合物を２０℃で３０分間インキュベー１・し、つ
ぎに酵素の熱不活化によって反応を停止した。　ＤＮＡ
をエタノール沈澱により回収した。

Ｃ，ＭＩＡＴプロモーター含　断　の単離上記実施例９
Ｂで得たＤＮＡを、制限緩衝液Ａ５０μｕ中、制限酵素
Ｒａｍ　）ＩＩ５０単位により３７℃で１時間消化した
。エタノール沈澱（よってＤＮＡを濃縮し、４．３ｋｂ
の断片を実施例５Ａと同様にして！＃離、回収した。

Ｄ、約３．Ｏｋｂ　ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ含有断片の単離
プラスミドｐｓＴ１０６約１０μｇを、）ｌｉｎｄｌｌ
１Ｍ衝ン夜（６０ｍＭ　ＮａＣ１、７ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ　、　ｐＨ７，５，７ｍＭ　Ｍｇ１ｌ：ｈ）　　２０
０　ｕ　ｆｌ中、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ　１００＠位
により３７℃で完全消化した。　ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、実施例９Ｂと同様にして平滑末端化した。エ
タノール沈１ｅよってＤＮＡを回収し、Ｒａｍ　Ｈｒ緩
衝液５０ＡｔＩｌ中に再懸濁し、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ
２０　単位により３７℃で１時間消化した。

ＤＮＡをエタノール沈澱によって濃縮し、約３；Ｏｋｂ
の断片を実施例５八と同様にしてａｍ、回収した。

Ｅ６ライゲーシヨンおよびＥ、　ｃｏｌｔ　）１８１０
１の堅曵 上記実施例９Ｃおよび９Ｄで得た断片の各々約１１００
ｎを、反応混合物２０μｍ１中、Ｔ４Ｄ？ｌ＾リガーゼ
１７５単位を用いて室温で４時間ライゲートした。ライ
ゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にしてＥ
、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体
を、それらのアンピシリン耐性表現型およびプラスミド
ＤＮＡの制限分析によって同定した。得られた細胞を用
いて、実施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１１２
を単離した。

プラス主ドｐｓＴ１１２約５μｇを、制限＆１衝荷液５
０μ℃中、制限酵素艷旧およびＳａｌ　Ｉ各２０−１位
で完全に二重消化した。フェノール−クロロホルム抽出
後、エタノールでＤＮＡを沈澱させた。

Ｂａｎ　Ｈｌ−５ａｌ　Ｉ消化産物を、実施例９Ｂと同
様にして、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片２単位に
よって平滑末端化した。ＤＮＡをエタノール沈澱によっ
て回収した。平滑末端化ＤＮＡ約１１００ｎを、実施例
５Ｃと同様にして自己ライゲートさせた。ライゲーショ
ン混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして、Ｅ、　ｃ
ｏｌｔ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体を、そ
れらのアンピシリン耐性表現型およびプラスミドＤＮＡ
の制限分析によって同定した。形質転換体の一つから、
実施例３と同様にして、プラスミドｐｓＴ１１８をＩＬ
１１ｉシた。

プラスミドｐｓＴ１１２約５μｇを、制限緩衝液＾５０
μｌ中、制限酵素狼旧１０Ｊ１．位により３７℃で完全
消化した。プラスミドｐｓＴ１１２中には艷旧部位が唯
一存在するので、このＢａｍ　ＩＩ消化は線状［ＩＮＡ
片を生成する。　Ｂａｍ　）ＩＩ消化ｐｓＴ１１２をエ
タノールで沈澱させ、水９４μＡ１アルカリホスファタ
ーゼ（２５ＯＪＩＬ位／１１１π；宝酒造株式会社）１
μ角および１Ｍトリス−）ＩＣＩ　（ｐＨａ、ｏ）　５
μ℃に再懸濁し、３７℃で１時間放置した。つぎにフェ
ノールとクロロホルムとの（１：　１）混合物およびク
ロロホルムとイソアミルアルコールとの（２４：１）混
合物での抽出ののち、［ｌＮ＾をエタノールで沈澱させ
。水３０μ℃に再沈澱した。

Ｂ、プラスミドｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏのＲａｍ　）Ｉ
Ｉ−ＰｖｕＩ　　化Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩから単
離したプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ　ＡＴＣＣ
Ｎｏ、　３７２２４約５ｕｇを、制限［液Ａ中、制限酵
素Ｒａｍ　Ｈｌ２０車位および±Ｉ２０単位により３７
℃で完全消化した。　Ｐｖｕ　Ｉ消化は所望しない組換
え体を除去してくれる。Ｉ）Ｎ＾をエタノールで沈澱さ
せ、水３０μ℃に再懸濁した。

Ｃ，ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｉ　）ＩＢＩＯ
Ｉの短長 上記実施例１４＾および１４Ｂに記載した断片の各々約
１１００ｎずつを、２０μ℃の反応混合物中、Ｔ　４　
ＤＮＡリガーゼ１７５車位を用いて室温で４時間ライゲ
ートした。ライゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄ
と同様にして、Ｅ−、ｃｏｌｔ　）ｉ８１０１を形質転
換した。形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現
型とプラスミドＤＮＡの制限分析により同定した。得ら
れた細胞を用いて、実施例３と同様にして、プラスミド
ｐｓＴ１１３７およびｐｓＴ１１３８を単離した。

プラスよド９ＵＣ９（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカ
ルズ）約２μｇを、制限緩衝液Ｂ中、制限酵素Ｈｌ　ｎ
　ｄ　ＩＩＩにより３７℃で消化して、線状ＤＮＡを生
ぜしめた。線状化プラスミドを、　０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウムの存在下に２．５容量のエタノールで沈澱させ、Ｄ
ＮＡを遠心分離により採取した。ｐＵｃ９の■何ＩＩＩ
消化物を、ニックトランスレーション緩衝液中で、クレ
ノー断片１単位を用いて平滑末端化した０反応は２０℃
で３０分間行い、ついで酵素の熱不活化により停止させ
た。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。８ｇｌｌ
ｌリンカ−（５゜−ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３°；宝酒造株
式会社）をリン酸化し、実施例９Ｃと同様にして、平滑
末端化した■ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片にライゲートした。ラ
イゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同様にして
、Ｅ、　ｃｏｉｌＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換
体を、それらのアンピシリン耐性表現型および制限酵素
分析により同定した。形質転換体から、実施例３と同様
にしてプラスミドｐｓＴＯ２を単離した。

プラスミドｐｓＴＯ２約５μｇを、５ｍＭ）−リス−Ｈ
Ｃ：ｊ２　（１）Ｈ７，１）　、５　ｍＭ　ＭｇＣｈ、
２ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．０１％ＢＳＡを
含有するＢｂｅ　Ｉ緩衝液５０μ℃中、制限酵素Ｂｂｅ
Ｉ２０単位により、３７℃で完全消化した。ＤＮＡをエ
タノール沈澱により回収し、制限緩衝液Ａ５０μｍに再
懸濁し、制限酵素型Ｉ＋　１０１１位により３７℃で完
全消化した。消化したプラスミドＤＮＡを１％アガロー
スゲルで泳動させ、大きいｍＩ　−■＋１バンドを、実
施例５Ａと同様にして切り出し、回収した。

Ｂ、プラスミド５Ｔ１０６の約３３０ｂ　　ＢｂｅＩ　
−Ｂ　ＩＩ＋断片の単離 プラスミドｐｓＴ１０６約２０μｇを、Ｂｂｅ　Ｉ　１
ｌａｊン夜１００μＪ２中、制限酵素ＢｂｅＩ２０！位
により３７℃で完全消化した。エタノール沈澱によって
ＤＮＡを回収し、制限緩衝液Ａ１００μ℃に再懸濁し、
制限酵素型Ｉ＋　２０単位により３７℃で完全消化した
。　ＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮してから、１．
５％アガロースゲルにかけた。約３３０ｂｐのＢｂｅＩ
−韮ＴＩバンドを、実施例５Ａと同様にして可視化し、
切り出し、回収した。

Ｃ，ライゲーションおよびＥ、　Ｃｏ１１　）１８１０
１の形鮫携 上記実施例１６Ａおよび１６Ｂに記載の各断片約ｉＱＯ
ｎｇずつを、２０μｊＱの反応混合物で、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（３５０，０００ｉ位／ＩＩ１．Ｑ；宝酒造株式
会社）０．５μ℃用いて室温で４時間かけてライゲート
した。ライゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同
様にして、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを形質転換した
。形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型およ
びプラスミドＯＮ＾の制限酵素分析によって同定した。

得られた細胞を用いて、実施例３と同様にして、プラス
ミド９ＳＴ１０７をｉｍｔ、た。

実施例１７ 片の単離 ｐｓＴ１０７約２０μｇを、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１
０ｍＭ）−リス−〇ＣＩ　（ｐＨ７，５）、１００１Ｍ
　ＭｇＣｌ２．１０＋ａＭ２−メルカプトエタノールを
含有するｍＩ　＆ｉｌ液１００μ℃中、制限酵素±Ｉ４
０単位により、ゲル電気泳動分析により調べるとき部分
消化のみが達成されるよう予備インキューベーションの
のち、３７℃で５分間消化した。ＤＮＡをエタノール沈
澱により濃縮し、１％アガロースゲルにて泳動させた。

　ｐｓＴ１０７の約２．１ｌｋｂ断片を、実施例５Ａと
同様はして切り出し、回収した。回収したＤＮＡを、制
限緩衝イ夜８１００μ℃中、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉにより
３７℃で完全消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により
ａ縮したのち、１％アガロースゲルにかけた。約２．７
ｋｂ工Ｉ−工■バンドを、実施例５Ａと同様にして切り
出し、回収した。

Ｂ、　ｍＴＰＡＩ　ＰｓｔＩ−５ｓ　Ｉ　　　の構築フ
ィンガードメイン領域中のｍＴＰＡＩ　と名付けた７５
７−および７９マーを、＾ＢＳ　３８０＾ＤＮ八シンセ
サイザー（アブライドバイオシステムズ社、８５０リン
、カンセンタードライブ、フォスター市、Ｃへ９４４Ｃ
４）を用いて合成した。上記合成デオキシヌクレオチド
の各々約１１００ｎを、６８ｍＭｔ−リス−１１ＣＩ（
ｐＨ７，５）　、６．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００１１
１１２−メルカプトエタノール、０．５ｄ八ＴＰおよび
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含有する反応液
２０μ℃中で、３７℃にて１時間リン酸化した。

各々の反応混合物を合わせ、９５℃で５分間加熱し、水
浴上で２時間かけてゆっくりと室温まで冷却して、両鏡
をアニーリングさせて、次式のｍＴＰ八ｌへ片を得た； ７Ｓマ　−：　　　　５°−ＧＣＧ人ＴＧＡＧＡＣＧＣ
ＡＧ人ＴＧＡＴ人ＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣ人ＧＴＣ
人ＴＧＧＣＴＧ７９マ　−・３°−ＡＣＧＴＣＧＣＴ人
ＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＡＴＡＴＧＧＴＣＧＴＴＧ
ＴＡＧＴＣＡＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴ
ＣＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＧＴＧＧ八人Ｔ−３゛ＣＴ
ＧＧＧ人　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ｃｃＴＴ人−５Ｃ，ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌ
ｌ　ＨＢＩＯＩの組曵 上記の実施例１７Ａおよび１７Ｂに記載した断片の各々
約１１００ｎずつを、反応混合物２０μ℃中で、Ｔ４Ｄ
Ｎ＾リガーゼ（３５０，０００単位／ｍｌｌ；宝酒造株
式会社）０．５μ℃を用い、室温で４時間ライゲートし
た。ライゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄと同様
にルて、旦、　二ｌｌ　ＨＢＩＯＩを形質転換した。形
質転換体を、それらのアンピシリン耐性表現型およびプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素解析により同定した。得られ
た細胞を用い、実施例３と同様にして、プラスミドｐｓ
Ｔ１０８を単離した。

型土］と４豊 プラスミドｐｓＴ１１Ｂ約１０μｇを、Ｂｂｅ　Ｉ緩衝
液５０μｕ中、制限酵素Ｂｂｅ１２０単位により３７℃
で完全消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し
、制限緩衝液Ａ５０μ角に再懸濁し、制限酵素型ＩＩ　
２０単位で完全消化した。消化したプラスミドＤＮＡを
１％アガロースゲルにて泳動させ、大きい±Ｉ　−出１
１断片を、実施例５八と同様にして切り出し、回収した
。

プラスξドｐｓＴ１０９約１０μｇを、Ｂｂｅ　Ｉ　ｌ
ｉｄ街液５０μ℃中、制限酵素±１２０単位により３７
℃で完全消化した。　ＤＮＡをエタノール沈澱により回
収し、制限緩衝液＾５０μＡに再懸濁し、制限酵素ＬＬ
Ｌ　ＩＩ　２０単位により３７℃で完全消化した。　Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱により濃縮したのち１．５％アガ
ロースゲルにかけた。約３３０ｂｐのＢＱ　ＩＩ　−Ｂ
ｂｅＩハンドを、実施例５＾と同様にして可視化し、回
収した。

Ｃ，ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ
の１曵 上記の実施例１８Ａおよび１８Ｂで得たＤＮＡ断片の各
々約１１００ｎずつを２０μ２の反応混合物中、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１７５単位を用いて、室温で４時間ライゲ
ートした。ライゲーション混合物を用いて、実施例５Ｄ
と同様にして、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩを形質転換
した。形質転換体をそれらりアンピシリン耐性表現型お
よびプラスミドＤＮ＾の制限酵素分析により同定した。

得られた細胞を用いて、プラスミドＤＮＡを分析した。

プラスミドＤＮＡ中の新規ｔ−ＰＡのｃＤＮＡの変異領
域は、Ｍｌｆｆシーケンシングキット（アマ−ジャム）
を用いてジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーシ
ョン法によってそれらの配列決定をすることにより、確
認した。得られた細胞を用いて、実施例３と同様にして
、プラスミドｐｓＴ１１９を５ｍ１ｔ、た。

実施例１９ Ｍ１３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮＡの調製 Ｍ１３ｍｐ８ファージ（アマージャム社販売）の単一プ
ラークを、２ＸＴＹブロス１．５＋ｎＪＺにとり、Ｅ、
　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３　　（アマージャム社販売）の
−夜培養１５μ℃を加えた。この培養物を３７℃で振盪
しながら６時間インキュベートした。遠心分離によって
細胞を採取し、培養上澄液ｆ　　１ａｆｅを、旦、■貝
ＪＭ１０３の一夜培養８ｍぶと共に、２ＸＴＹブロス４
００　ｍｆｔに接種した。培養物を３７℃で振盪しなが
ら６時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を
採取し、実施例３に記載のアルカリ法と同様にして、Ｒ
Ｆ　ＤＮＡを＊ｍｔ、た。

旦星量 プラスミドｐｓＴ１０６約１μｇを、５ｍＭトリス−Ｍ
ＣＩ　（ｐＨ７，１）、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２ｍＭ
２−メルカプトエタノールおよび０．０１％ＢＳＡの混
合物１０μ℃中、制限酵素±工５単位により３７℃で４
時間消化した。反応混合物に１Ｍトリス−ＭＣＩ　（ｐ
Ｈ７，６）および制限酵素ＥｃｏＲＩ５単位を加え、３
７℃で３時間インキュベーションを続けた。反応混合物
をフェノールとクロロホルムとの（１：　１）ン昆合物
で抽出し、水層を０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリラム（ｐ
Ｈ５，２）および２容量のエタノールで沈澱させた。回
収したＤＮＡを７５％エタノールで洗い、１０ｍＭトリ
ス−１＋（：１（ｐｌ（７，５）および１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡの５μ℃に溶解した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｉＪＭ１０３の
形短豫 Ｍ１３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮＡ約１μｇを、実施例　２Ｏ
Ａと同様にして、Ｂｂｅ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し
た。生じた６、９ｋｂのＢｂｅＩ　−ＥｃｏＲＩ制限断
片を、１０ｍＭ５ｔ　ｇ　Ｃｌ　２．１０　ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　　１　ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｕｇ／ｍ、ｉ！ＢＳＡ
および３５０車位の７４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式
会社）を含有する３５０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ　（ｐＨ
７，８）　１０μ℃中で、ｐｓＴｌｏＢからの２８４ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ−ＢｂｅＩ断片とライゲートした。ライ
ゲーション混合物を用いて、コンビ−テントなＥ、、　
ｃｏｌｔ　ＪＭ１０３をトランスフェクトし、トランス
フェクトントを、Ｘ−ｇａｌ（５−プロそ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクトシド）中でのそれらの
無色プラーク表現型ならびにそれらのファージ２本鎖Ｄ
ＮＡ　（すなわちＭ１３ｍｐ８ｆｕ３　ＲＦ　ＤＮＡ）
の制限酵素分析によって同定した。

この実施例では、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を
、Ｆｒ１ｔｚ　、　　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１．１
５１（１９８５）、ＩＲＩ　Ｐｒｅｓｓに記載の方法と
同様にして、実施した。

Ａ、−末鎖Ｍ１３ｍ８ｆ吐ＤＮＡ　ＯＡ％Ｍ１３ｍｐ８
ｆｕ３ファージの単一のプラークを、２ＸＴＹブロス１
．５ｍＪ２にとり、これには、Ｅ、　ｃｏｌｉＪＭＩＱ
３の一部培！！１５μ℃を加えたくこの一夜培養は、Ｐ
ｒｏ＾Ｂをも有するＦエビソームの保持を確保するため
に、最小培地ストックから接種した〉。培養物を３７℃
で振盪しながら６時間インキュベートした。細胞を遠心
分離によって採取し、培養上澄液１　ｒｎｉを、旦、二
且ＪＭ１０３の一夜培養８　ｒａｉｌと共に、２ＸＴＹ
ブロス４００ｍｊＺに接種した。培養物を３７℃で振盪
しながら６時間インキュベートした。上澄液を回収した
。上澄液４００シ℃に、２０％ポリエチレングリコール
６０００−２．５Ｍ　　ＮａＣ１を８０　ｍ角加え、溶
液を振りまぜ、１時間放置した。溶液を８９００ｇ　、
　４℃で３０分間遠心分離し、上澄液を捨てた。ファー
ジベレットを、ＩｏｏｌＭ）−リス−１（Ｃ１（ｐＨ７
，５）　−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　　２０ｍＪＺに懸濁させ
、１０ｍＭｆ−リス−）ＩＣＩ　（ｐｈ７．５）および
１　ｍＭ　ＥＤＴＡで飽和したフェノール２０ｍｕで１
０分間抽出した。溶液を９０００ｇ、２０℃で１０分間
遠心分離し、水層を回収した。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５，２）　２　ｍｆｌおよびエタノール５０ｍＪ２を
加え、得られた溶液を一２０℃で一夜放置した。１１，
０００ｇ、４℃での１０分間の遠心分離により、−末鎖
ＤＮＡを採取した。上澄液を捨て、ＤＮＡベレットを７
０％エタノールで洗い、真空乾燥量中で５分間乾燥した
。つぎに、ベレットをＴＥ緩街：（ｉ［１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ　＜ｐＨ７，５）および１　ｍＭ　ＥＤＴＡ］
１　　ｏｆｔに懸濁させた。

Ｍ１３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮＡ２０１１ｇを、６０　ｍＭ
　ＮａＣ１。

１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍ
Ｍ、ＪＢ（：ｌ、、６ｍＭ２−メルカプトエタノール、
１００　μｇ／口２ＢＳ＾の２００μｎ中、制限酵素Ｐ
ｖｕｌｌ　５０単位により３７℃で３時間消化した。エ
タノール沈ＩＲ後、消化ＤＮＡをＴＥ緩衝荷液０μ℃に
溶かし、セファクリルＳ−１０００を使用し、１０ｍＭ
トリス−１４Ｃ１（ｐＨ７，５）、１　ｍｈｌ　ＥＤＴ
Ａおよび２ＱＯｍｉＡ　Ｍａｉｌの混合を用いて溶出を
行うゲル濾過によって分離した。　Ｍ１３ｍｐＨＲＦ　
ＤＮＡの精製６．８ｋｂｐ　ＰｖｕｌＩ断片を含む溶出
液を、０．８％アガロースゲル電気泳動によって同定し
、採取した。

Ｍ１３ｍｐ８ｆｕ３の一木ｇｉＤＮＡ　６０　ｔｔ　ｇ
を、採取したＭ１３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮＡの６．８ｋｂ
　　Ｐｖｕｌｌ断片は加え、混合ＤＮＡをエタノールで
沈澱させた。　ＤＮＡベレットを１５０　ｍＭ　ＮａＣ
１および１５ｍＭクエン酸ナトリウムの２００μ℃に溶
かした。このＤＮＡ溶液を７分間煮沸し、６５℃の水浴
へ１０分間移し、氷上で冷却した。生じたギャップＤＮ
Ａを、上記のようにセファクリルＳ　−１０００を用い
るゲル′ａＡによって分解した。このギャップをもつＤ
ＮＡを以下の変異誘発実施例で鋳型として用いた。

Ｃ１部位　異的　　誘 ５°−Ｇ（：（：ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＴＧ
ＧＣＴＣＣＴＣＣＣＣＧｆ；ＴＧ丁ＡＧＧＧＣＴＣＣＴ
ＧＧＧＣ−３’ （４８−ｍａｒ）なる配列をもつオリゴヌクレオチドを
合成した。これは、所望のアミノ酸置換を行なうと共に
Ｘｈｏ１部位をつくり出すために設計したものである。

この４８マーを実施例４Ｂと同様にして、ＡＴＰおよび
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。ギ
ャップＤＮＡ　１１００ｎとリン酸化した４８７−１０
ｎｇとを、１５０ｍＭ　ＫＣＩおよび１０ｍＭトリス−
ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）を含有する反応混合物１０μｍ
中、６５℃で７分間アニールしたのち、４℃で冷却した
。アニールしたギャップＤＮＡを、８０ｍＭ　ＫＣＩ、
　　３０ｍＭトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）、１５ｍ
ＭＭｇＣ１，，２ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５ｍＭ　ＡＴＰ
および４　ｆｉｌのデオキシヌクレオチド三リン酸の各
々２５ｎＭを含む液４０μ℃中で、クレノー断片（０，
５単位）およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｌｏｏＪＬ位）を
用いて埋めた（ｆｉｌｌｅｄ　ｉｎ）、混合物を室温で
２時間インキエベートし、コンピテントなＥ、　ｃａｌ
ｌ　ＪＭ１０３の形質転換に用いた。トランスフェクタ
ントのうち４８株から上記のようにしてファージＲＦ　
ＤＮＡを調製し、制限酵素ＸｈｏＩで消化した。ファー
ジＲＦ　ＤＮＡの２標本が所望の単一Ｘｈｏ１部位を含
んでいた。これらのファージの一方を用いて、実施例１
９と同様にして、Ｍ１３ｍｐ８ｆｕ４　ＤＮＡを単離し
た。

１厘 Ｍ１３ＩＩｌｐ８ｆｕ４　ＲＦ　ＤＮＡ約１０μｇを、
Ｓ　ｍＭ　ＭｇＣｈ、２ｍＭ　２−メルカプトエタノー
ルおよび０．０１％ＢＳ＾を含有する５ＩＩＩＭトリス
ーＨＣｌ　（ｐＨ７，１）　５０μ文中、制限酵素±Ｉ
２０単位により３７℃で４時間消化した。　ＤＮＡをエ
タノール沈澱により回収し、５０　ｍＭ　ＮａＣ１，１
００ｍＭ　　）−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、５ｍ
ＭＭｇＣｌ、および０．Ｏ１％ＢＳＡを含む液５０μ２
に再懸濁し、制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩ２０単位により３７
℃で２時間消化した。消化ＤＮＡをエタノール沈澱によ
って濃縮したのち、１．５％アガロースゲルにかけた。

実施例５Ａと同様にして、２８４ｂｐのＥｃｏ　ＲＩ−
±Ｉバンドを可視化し、切り出し、回収した。

Ｂ、ライゲーションおよびＥ、　ｃｏｌｉ　）１８１０
１の販迫 プラスミド９ＳＴ１１Ｂ約１０μ３を、５ｍＭ　ＪＣ１
２，２ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．Ｏ１
％ＢＳ＾を含有する５ｍＭトリス−）ＩＣＩ　（ＰＨ７
，１）　５０μ℃中、制限酵素±Ｉ２０車位により３７
℃で４時間完全消化した。　ＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収し、５０　ｍＭ　ＮａＣ１、１００ｍＭ　）−
リス−）ＩＣＩ　（９）１７．５）、５　［ＯＭ　Ｍｇ
Ｃ１＊および０．０１％Ｏ５八を含む液５０ｔｔｌに再
懸濁した。ＤＮＡを３７℃で１０分間ブレインキュベー
トし、制限酵素ＥｃｏＲＩ５＄位により３７℃で５分間
部分消化した。直ちに０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ５μ℃を加
え、　ＤＮＡをエタノール沈澱によっ濃縮したのち、０
．８％アガロースゲルにかけた。約６．８ｋｂのバンド
を、実施例５八と同様にして可視化し、切り出し、回収
した。プラスミドｐｓＴ１１８からの６．８　ｋｂ　Ｅ
ｃｏ　Ｒ１−Ｂｂｅ　Ｔ断片約１１００ｎとＭ１３ｍｐ
８ｆｕ４　ＲＦ　ＤＮＡからの２８４ｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉ−Ｂｂｅ　Ｉ断片５００　ｎｇとを、Ｔ４ＤＮ＾リガ
ーゼ１７５４位を含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ
７，８）、１０　ｍＭ　ＭｇＣｈ、２０ＩＩＩＭ　ＤＴ
Ｔ、　　１　ｍＭ　ＡＴＰおよび５０　μｇ／　ｌｌ１
ｌｌ　　ＢＳＡの溶液２０μ℃中、８℃で１２時間ライ
ゲートした。ライゲーション混合物を用いて、実施例５
Ｄと同様にして、旦、　ｃｏｌｌ　１１８１０１を形質
転換した。形質転換体を、それらのアンピシリン耐性表
現型およびそれらのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
よって同定した。得られたｍ胞を用いて、実施例３と同
様にして、プラス主ドｐＦｔｌ１６１を単離した。

Ａ３国庭立且玉 Ｌ−９２９細胞系培養物がこの実施例で用いられるが、
Ｌ−９２９ｉ胞はＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　−１として人手で
きる。この細胞をカナマイシンと１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎
児血清を含むＤＭＥＭ中３７℃で５％ＣＯ，条件下で維
持した。この細胞を形質転換の前日Ｌｏａｍのベトリ皿
１個につき５Ｘ１０’細胞数の細胞濃度でブレートし、
形質転換日に５０−６０％コンフルエンシーを得た。培
地は形質転換３時間前に交換した。２つの１０ｃｍへト
リ皿を各形質転換に用いた。

Ｂ、肚Ｘ塑型 プラスミドＤＮＡを用いてゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）法
［ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎｇ　ＩＩ　、　１４３　　（１
９８５）、　ＩＲＬｐｒｅｓｓｌ　　と同様にしてリン
酸カルシウム手法によりＬ−９２９細胞を形質転換した
。

発現プラスミド（ｐｓＴ１１９またはｐＦ０１６１）　
　３　。

ｕｇとプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ　ＡＴＣＣＮｏ、　３
７１４９３μｇを２Ｍ　ＣａＣ１ｚ　１８８　ｕ　ｌと
水１．３ｍＩＬに加えた。ｌ１ＮＡ溶液１．５ｍｌを２
　Ｘ　ＨＢＳ　（１，６３％ＮａＣ１，１，１９％Ｈｅ
ｐｅｓ　。

０．０４％ＮａＪＰ０４．　ｐ）１７　、１２）　１　
、５　ｍｌＬにバブリングしながら滴下した。混合物を
細胞に接触させる前に室温で３０分間放置した。

Ｃ９細　のトランスフェクション 実施例２３Ｂで調製したＤＮＡ溶液０．６ｍｊ２をゆる
く攪拌しながらＬ　−９２９細胞の１０ｃ＋＋＋ベトリ
皿に加え、３７℃でＣＯ□気流中１８時間加温した。細
胞をＤＭＥＭで２回洗った。１０％ＦＣ５を含む完全な
新鮮成育培地を次に加え、細胞をＣＯ２気流中３７℃で
２４時間加温した。細胞をトリプシン処理し、３００　
μｇ／ｍ　ｆｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ
Ｇ４１Ｂ）および１０％ＦＣ５を含むＤＭＥＭからなる
選択培地中で１：１０のサブカルチュアをした。

ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ遺伝子産物）を発現
する細胞が選択培地中で生存し、コロニを形成すること
ができる。培地を３−４日ごとに交換し、コロニーを１
２−１４日後にＪＩＢ離した。

Ｇ４１８抵抗性コロニーを小シリンダー中おだやかなト
リプシン処理により採取し、培養塊になるまで増殖させ
、変異ｔ−ｐ＾の分泌について試験した。細胞を直接１
．７ｃｍの３ＩｌｌＩＬの培地を入れたマルチ・ウェル
・プレート皿中で約３　Ｘ　１０’細胞数になるまで増
殖させた。培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。細胞を０
．０４ｍＭ　ＺｎＳＯ４，１０１Ｍ酪酸ナトリウム、２
％ＦＣ５を含む、ＤＭＥＭからなる誘導培養培地１＋ｎ
ｆ！。

中３７℃で２４時間培養し、培地中の変異ｔ−ＰＡをＳ
　２２５１を用いる間接吸光分析法［Ｔｒｏｍｂｏｓｉ
ｓＲｅｓｒａｒｃｈ　３１．４２７　（１９８３）参照
］により定量した。

大１凶【巳 ａＦＰ＾およびａＫｌ−１２４の精製 実施例２３で得たプラスミドｐｓＴ１１９またはｐＦＩ
＋１６１含有Ｌ−９２９クローンの培養ブロスから変異
蛋白質ａＦＰＡ及びａＫｌ−１２４を精製した。変異蛋
白！Ｉｔ精製の最初の工程は、モノクローナル抗ｔ−Ｐ
＾抗体結合セファロース４Ｂカラム（１，６ｃｍ　’ｘ
　３　ｃｍ）　［メーカーの指示に従い、モノクローナ
ル抗ｔ−ＰＡ抗体（その調製法は、たとえばカイズ・ッ
トムら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４
０．９ｌ−９９（１９８５）　　に開示されている）を
（：ＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させたコでの
７フイニテイクロマトグラフイーであった。カラム（０
，７Ｘ　２．５ｃｍ　）を、０．０１％トゥイーン８０
および１０に■Ｕ／ｌ１ｌｉのアプロチニンを含有する
０、１Ｍトリス−ＨＣｌで平衡化した。各培養プロスを
通し、カラムを１０カラム容の平衡化１１１衝液で洗っ
た。脱着は、０．０１％トウィーン８０および１０　Ｋ
ｌｔｌ／　ｃａｌｌのアプロチニンを含有する０、１Ｍ
塩酸グリシン（ｐＨ２，５）で行った。脱着画分を直ち
ＩＣ１Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，０）で中和し、ｔ
−ＰＡ活性を含むものをプールした。精製の次の工程は
、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，００５％トウィーン８０
および１０　ＫＩｔｌ／　ｍｌＬの　アプロチニンを含
有する０、０５Ｍトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）で平衡
化したベンズアよジンセファロース４Ｂ　　（ファルマ
シア）カラム（０，４５ｘ　３　ｃｍ）でのアフイニテ
イクロマトグラフィーであった。第一工程でプールした
画分をベンズアミジンセファロースカラムはかけた。カ
ラムを、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，０，００５％トウィーン８
０および１０ＫＩＵ／　ｍＪ２のアプロチニンを含有す
る０、０５Ｍ　）−リス−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　１
０カラム容で洗い、１Ｍアルギニンを含有する洗浄用緩
衝液を用いて行った。

ｔ−ＰＡ活性含有画分をプールし、０．１Ｍ　（Ｎｔ１
４）　２ｃＯ３，０，１５Ｍ　Ｎａ１ｌ、０．０５％ト
ウィーン８０に対して透析した。この操作での変異蛋白
質の収量をローリ−法によって求めた。

結果を法要に示す。

変異ｔ−ＰＡであるａＦＰ＾およびａＫＩ−１２４のプ
ラスミノーゲン活性化因子活性を、間接吸光分析法［Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３１．４２７
　（１９８３）参照］によって求めた。すなわち、各変
異ｔ−ｐ＾の種々量を、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび
０．０１％（Ｖ／Ｖ）　トライトンＸ　−１００を含有
する５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，８）中でＷｉ
ｍａｎらの方法［Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、＾ｃｔａ　　１
２７゜２７９　（１９８３）参照］により調製した、０
．２μＭヒトプラス主ノーゲン（ミドリ十字、大阪）　
１．０．９ｍＭ）１−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−ｐ
−ニトロアニリド、２８ＣＩ　（Ｓ−２２５１、ＢＡＣ
）ＩＥＭ）及び７０μｇ／　ｍｌｔの可溶化フィブリン
の混合物に加えた。反応混合物を３７℃で３時間インキ
ベユートした。マイクロプレートリーダー（タイターチ
ック・マルチスキャン、フローラボラトリーズ社、米国
）を用いて、活性化因子なしのブランクと対照して、４
０５μｍでの吸光度を測定した。天然ｔ−Ｐ八［国際標
準（ＷＨＯ）　］の標準曲線を参照して、変異ｔ−ＰＡ
のプラスミノーゲン活性化因子活性［ｔ−Ｐ＾国際車単
位Ｉυ）］を求めた。変異ｔ−ｐ＾の蛋白質濃度をロー
リ−法によって求めた。

結果を法要に示す。

（以下余白） ８、　　　ｔ−ＦＡの半　　に関する生体内　験ａ）址
旦 動物：全ての実験は、ネンブタール（５０Ｂ／ｋｇ、　
ｉ、ｐ、）で麻酔した雄性スプラグドーリ−ラット（２
２０−２４５ｇ）を用いて行った。

ｔ−Ｐ＾：ヒトメラノマ（Ｂｏｗｅｓ）細胞培養培地か
ら実施例１６と同様にして天然ｔ−ＰＡ　（単鎖、〉８
０％）を精製した０組換え変異ｔ−ｐ＾（ｆＦＰＡ）は
実施例１６で得た。

その他の材料：アプロチニン（ベーリンガー・マンハイ
ム社）、ヘパリン（和光純薬工業、日本）。

ｂ）立並： 食塩水充填カニユーレを試験動物の大腿静脈に挿入して
、ｔ−ｐ＾（１００μｇ／ｋｇ）を注射した。試験動物
の左頚ＩＩＪ脈にポリエチレンチューブを挿入し、これ
にはヘパリン（１００ｊＩＬ位／ｍｆＬ）　を満たして
おき、ｔ−ＰＡ注射後１．２．３．５．７．１０．１５
および２０分に、酢酸ナトリウム（３，２％、ｗ／ｖ）
　２０　μｍおよびアブロチニン（［１００（ＩＫＩＩ
Ｊ／　ｎｕ）　　５０　ｕ　Ａを入れたポリエチレン管
に血液試料（２０ｏμ℃）を採取した。血液試料を１０
．ＯＯＱｒｐｍで２分間遠心分離して、血漿を回収した
。血漿中のｔ−ＰＡレベルをｔ−ｐＡ用ＥＬＩＳＡ［た
とえば、カイズら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒａｓ、　
４０．９１（１９８５）参照］を利用して測定した。

Ｃ）結果 結果を法要に示す。

上記実施例で得た発現プラスミドｐｓＴ１１９およびｐ
ＦＵ１６１をＥｓｃｈｅｒｉｅｈｌａ　ｃｏｌｉ　８８
１０１に挿入し、得られた下記の形質転換株を、ブダペ
スト条約に基く国際寄託機関の一つである日本国３０５
茨城県つくば市谷田部町東１丁目１−３工業技術院微生
物工業技術研究所（ＦＲＩ）に１９８８年６月２３日に
寄託ずみである。

思叉藍旦旦名　　　　　　　　　　寄託番号Ｅｓｃｈｅ
ｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　１（ＢＩＯＩ（ｐｓＴ１１９
）　　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９１８Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｊ　ＨＢＩＯＩ（ｐＦＵＩＩｌｔｌ）　　Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−１９２３４、図面の簡単な説明 第１図は、新規ｔ−ＰＡ発現ベクターの構築を示す。

第２図は、プラスミドｐＭＩ２００の制限部位・機能地
図を示す。

第３図は、プラスくドｐＭＩ２００のｃＤＮＡ挿入断片
のＤＮＡ配列を示す。

第４図は、プラスミドｐＴＰＡ１０２　（Ｌｙｓ２７７
−１１ｅ）の１１ｇ１ｌｌ　　ＤＮＡ断片（１９７４ｂ
ｐ）のＤＮＡ配列を示す。

第５図は、プラスミドｐＭ１２０５の制限部位・機能地
図を示す。

第６図は、プラスくドｐｓＴ１０４の制限部位・機能地
図を示す。

第７図は、プラスミドｐｓＴ１０５の制゛限部位・機能
地図を示す。

第８図は、ＮａｒＩ　−５ａｅＩ断片（〜０．９ｋｂｐ
）のＤＮＡ配列を示す。

第９図は、プラスミドｐｓ７１０５Ｎの制限部位・機能
地図を示す。

第１０図は、プラスミド１ｌｓＴ１０６の制限部位・機
能地図を示す。

第１１図は、プラスミドｐｓＴ１０２の制限部位・機能
地図を示す。

第１２図は、プラスミドｐｓＴ１０１の制限部位・機能
地図を示す。

第１３図は、プラスミドｐｓＴ１０１−Ｘの制限部位・
機能地図を示す。

第１４図は、プラスミドｐｓＴ１０１−２に制限部位・
機能地図を示す。

第１５図は、プラスミドｐｓＴ１０３の制限部位・機能
地図を示す。

第１６図は、プラスミドｐＭＭＴ　ｎｅｏの制限部位・
機能地図を示す。

第１７図は、プラスミドｐｓＴｌ１２の制限部位・機能
地図を示す。

′ｓ１８図は、プラスミドｐｓＴ１１８の制限部位・機
能地図を示す。

第１９図は、プラスミドｐｓＴ１１３７の制限部位・機
能地図を示す。

第２０図は、プラスミドｐｓＴ１１３８の制限部位・機
能地図を示す。

第２１図は、プラスミドｐｓＴＯ２の制限部位・機能地
図を示す。

第２２図は、プラスミドｐｓＴ１０７の制限部位・機能
地図を示す。

第２３図は、プラスよドｐｓＴ１０８の制限部位・機能
地図を示す。

第２４図は、プラスミドｐｓＴ１１９の制限部位・機能
地図を示す。

第２５図は、プラスミドＭ１３ｍｌ１８ｆｕ３　ＲＦ　
ＤＮＡの制限部位・機能地図を示す。

第２６図は、プラスミドＭ１３ｍｐ８ｆｕ４　ＲＦ　Ｄ
ＮＡのＩＩＪ限部位・機能地図を示す。

第２７図は、プラスミドｐＦｕｌ１６１の制限部位・機
能地図を示す。

第２８図は、ａＦＰＡをコードする変異ｔ−ＰＡ　　ｃ
ＤＮＡのＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配列を示す
。

第２９図は、ａｋｌ−１２４をコードする変異ｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および相当するアミノ酸配列を示
す。

第１ 図（１） 第１図（２） 第１ 図（３） 第４ 図 （１） 第４図（２） 第４図（３） ＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ
ＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＣＴＡＣＡＧ
ＧＡＧ；、ＧＧＧＡＡＧ八ＧＴＧＣへＴＴＴＴへＣＣＡ
Ｇ、ｔＴＡｃＴＴｃｃｃ＾丁ＴＴＴＧＧＡＡＧＴ丁ＴＴ
ＣＡＧＧＡＣＴ丁ＧＧＴＣ丁Ｇ八ＴＴＴＣＡＧＧ＾へ八
ＣＴＣＴＧＴＣＡへＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＧ八八丁
ＧＣＡＣＡＣへへＧＣＣＴＣ丁ＣＣ八ＧＧＡＡＴｆ：Ｃ
へＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＯＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＣＡ丁
ｃｃＣＡｃｃｃＴｃ丁丁丁ＴＣＧＣＴＡＡＡＧＣＣＣＡ
　ＡＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧ’ＡＧ
ＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＣ：ＣＡＣＡＡ＾
＾＾ＴＧＡＡ八ＧＣＡ丁ＧＴＣＴＣＡへＴ　ＡＧＴ八／
へＡへへＡへへＣ（勾１：ｌ：Ｉｌ 八八ＧＡ−３ 第８図（２） Ｐｒｏ八５ｐＴｒｐＴｈｒＧｌｕｔ＋ｙｇｕ＋ｕ４工０ 第２９図（１） ５’−Ｔ丁＾＾ＧＧＧＡＣＧＣＴＯＴＧ＾ＡＧＣＡＡＴ
Ｃ＞Ｉ！ｒＡｌａｌｙｒ八ｒｇＬｉ１ｙ１へ１ｒＨＩＳ
５ｅｒＬ！ｕＴｈｒｏｌｕｓＩ！ｒＧｌｙ＾１ａｓｅｒ
ｃｙｓＬｅｕＰｒｏ丁ｒｐ＾ｓｎ第２９図（３） ＾　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＭ：
ＡＴＡＣＴＴＣＣＣ八ＴＴＴＴＯＧＡへＧτＴＴ丁ＣＡ
ＧＧＡＣＴτＧＧ丁Ｃ丁（＋ＡＴＴτＣＡＧＯＡＴＡＣ
ＴＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＣ八ＴＣ八＾ＴＧ
ＣＡＣＡＣＴＡＯＣＣＴＣＴＣＣＡＧＯ＾＾ＴＧＣへＴ
ＣへＴＣＣＣＴＧＯＧＣＡＧ八ＡＧＴＣＯＣＣＡＴＧＣ
ＣＡＣＣＣτＧＴＴＴＴＣ（：ＣＴ　　へ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣ
ＡＣｉＣＴＴＴＧＧ＾＾＾ＣＡＧＧ八ＣＣＡＣ八＾＾＾
＾ＴＯ八＾＾０ＣＡＴＧＴＣ丁Ｃ＾へτ八ＧＴへ＾ＡＡ
Ｇ＾八へＣＡＡＧ八−３１勺 １．事件の表示 平成ロ１年特許願第１６３５９９号 ２８発明の名称 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、代 理 人 住 所 大阪市北区堂島２丁目３番７号 シシコーＴ：′ル４０ 図面 補正の内容 第１図を別紙第１図に差し替えます。

第１図 （１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）負の電荷をもつフィンガードメインおよび／または
   クリングル１ドメインを有するｔ−ＰＡ。 ２）下記アミノ酸配列をもつ請求項１記載のｔ−ＰＡＲ
   ＾１−Ａ＾２＾−＾６−Ｒ＾２−Ａ＾３＾１＾−＾１＾
   ２＾３−ｒ＾５−Ａ＾１＾３＾６＾−＾５＾２＾７（
   I ）（式中、Ｒ＾１はＳｅｒ−またはＧｌｙＡｌａＡｒ
   ｇＳｅｒ−、Ｒ＾２は−ＡｒｇＡｓｐＧｌｕＬｙｓＴｈ
   ｒＧｌｎＭｅｔＩｌｅＴｙｒＧｌｎＧｌｎＨｉｓＧｌｎ
   ＳｅｒＴｒｐＬｅｕＡｒｇＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇＳ
   ｅｒＡｓｎＡｒｇ−または −ＳｅｒＡｓｐＧｌｕＴｈｒＧｌｎＭｅｔＩｌｅＴｙｒ
   ＧｌｎＧｌｎＨｉｓＧｌｎＳｅｒＴｒｐＬｅｕＡｓｐＰ
   ｒｏＶａｌＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｓｎＧｌｕ−、Ｒ＾３
   は−ＬｙｓＰｒｏＴｙｒＳｅｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＰｒ
   ｏＡｓｐＡｌａＩｌｅＡｒｇ−または −ＧｌｕＰｒｏＴｙｒＳｅｒＧｌｙＧｌｕＧｌｕＰｒｏ
   ＡｓｐＡｌａＬｅｕＧｌｕ−、Ａ＾２＾−＾６は天然ｔ
   −ＰＡのＴｙｒ＾２からＣｙｓ＾６までと同じアミノ酸
   配列、 Ａ＾３＾１＾−＾１＾２＾３は天然ｔ−ＰＡのＶａｌ＾
   ３＾１からＧｌｎ＾１＾２＾３までと同じアミノ酸配列
   、 Ａ＾１＾３＾６＾−＾５＾２＾７は天然ｔ−ＰＡのＬｅ
   ｕ＾１＾３＾６からＰｒｏ＾５＾２＾７までと同じアミ
   ノ酸配列を示す。） ３）請求項１で定義したｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ。 ４）請求項２で定義したｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコー
   ドするＤＮＡ。 ５）請求項３で定義したＤＮＡを含有する発現ベクター
   。 ６）請求項４で定義したＤＮＡを含有する発現ベクター
   。 ７）請求項５で定義した発現ベクターによって形質転換
   された宿主細胞。 ８）請求項６で定義した発現ベクターによって形質転換
   された宿主細胞。 ９）請求項１のｔ−ＰＡをコードするＤＮＡを含有する
   発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培地に
   培養し、生じたｔ−ＰＡを培養物から採取することを特
   徴とする、請求項１のｔ−ＰＡの製造法。 １０）請求項２のｔ−ＰＡのアミノ酸配列をコードする
   ＤＮＡを含有する発現ベクターによって形質転換された
   宿主細胞を培地に培養し、生じたｔ−ＰＡを培養物から
   採取することを特徴とする、請求項２のｔ−ＰＡの製造
   法。 １１）請求項１のｔ−ＰＡと医薬として許容しうる担体
   とを含有する医薬組成物。