JP2589687B2 - ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチド - Google Patents
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ハイブリドプラスミノーゲンアクチベータ
ー様ポリペプチド、及び遺伝子工学的手法によるその製
造方法を提供するものである。製造されたハイブリドプ
ラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドは様々な
心血管障害又は心血管病の予防処置又は治療において使
用することができる。
ー様ポリペプチド、及び遺伝子工学的手法によるその製
造方法を提供するものである。製造されたハイブリドプ
ラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドは様々な
心血管障害又は心血管病の予防処置又は治療において使
用することができる。
プラスミノーゲンアクチベーターは血漿中に存在する
不活性型酵素プラスミノーゲンを限定的加水分解するこ
とによって活性型酵素プラスミンに変換する。プラスミ
ンは血管内に生じたフィブリン塊を分解する作用をも
ち、種々の原因によって生じた血栓を溶解する（線
溶）。プラスミンは血漿中のプラスミン阻害剤によりす
みやかに不活性されるため、プラスミノーゲンアクチベ
ーターが血栓溶解剤として臨床上用いられている。
不活性型酵素プラスミノーゲンを限定的加水分解するこ
とによって活性型酵素プラスミンに変換する。プラスミ
ンは血管内に生じたフィブリン塊を分解する作用をも
ち、種々の原因によって生じた血栓を溶解する（線
溶）。プラスミンは血漿中のプラスミン阻害剤によりす
みやかに不活性されるため、プラスミノーゲンアクチベ
ーターが血栓溶解剤として臨床上用いられている。
プラスミノーゲンアクチベーターとして、現在、ヒト
尿より分離されたウロキナーゼが臨床的に使用されてい
るが、ウロキナーゼは大量に投与した場合に全身性の出
血傾向をもたらすなどいくつかの問題をもっている。全
身性の出血傾向はプラスミノーゲンアクチベーターのも
つフィブリノーゲン分解活性とフィブリン分解活性の比
に存在する。言い換えると、これはプラスミノーゲンア
クチベーターのフィブリン親和性の有無に還元される。
このためフィブリンへの親和性のあるウロキナーゼを製
造する試みがすでにいくつかなされている。
尿より分離されたウロキナーゼが臨床的に使用されてい
るが、ウロキナーゼは大量に投与した場合に全身性の出
血傾向をもたらすなどいくつかの問題をもっている。全
身性の出血傾向はプラスミノーゲンアクチベーターのも
つフィブリノーゲン分解活性とフィブリン分解活性の比
に存在する。言い換えると、これはプラスミノーゲンア
クチベーターのフィブリン親和性の有無に還元される。
このためフィブリンへの親和性のあるウロキナーゼを製
造する試みがすでにいくつかなされている。
これに対して組織プラスミノーゲンアクチベーターと
呼ばれるものはそれ自体フィブリンへの親和性が高く、
ウロキナーゼに代わりうる血栓溶解剤として注目されて
いる。しかしながら、このものは、ウロキナーゼと比較
して酵素活性がそれほど高くないことや、血中での安定
性に問題がある。
呼ばれるものはそれ自体フィブリンへの親和性が高く、
ウロキナーゼに代わりうる血栓溶解剤として注目されて
いる。しかしながら、このものは、ウロキナーゼと比較
して酵素活性がそれほど高くないことや、血中での安定
性に問題がある。
従って、この発明は、フィブリンに対する十分な親和
性及び十分な酵素活性を共に有し、生体内で安定なプラ
スミノーゲンアクチベーターを提供しようとするもので
ある。
性及び十分な酵素活性を共に有し、生体内で安定なプラ
スミノーゲンアクチベーターを提供しようとするもので
ある。
上記の問題点は、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの少なくともフィブリン親和性領域を含むポリペプチ
ド部分とウロキナーゼの少なくとも酵素活性領域を含む
ポリペプチド部分の融合蛋白質であるハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーター様ポリペプチド、該ポリペプ
チドの製造方法、及びその手段としての遺伝子系を提供
することにより解決される。
ーの少なくともフィブリン親和性領域を含むポリペプチ
ド部分とウロキナーゼの少なくとも酵素活性領域を含む
ポリペプチド部分の融合蛋白質であるハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーター様ポリペプチド、該ポリペプ
チドの製造方法、及びその手段としての遺伝子系を提供
することにより解決される。
（Ａ） ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様
ポリペプチド 本発明において、ハイブリドプラスミノーゲンアクチ
ベーター様ポリペプチドとは、組織プラスミノーゲンア
クチベーターの少なくともフィブリン親和性領域を含む
ポリペプチド部分とウロキナーゼの少なくとも酵素活性
領域を含むポリペプチド部分とを含んで成る融合蛋白質
であって、有意なフィブリン親和性とフィブリン溶解活
性とを共に発揮する能力を有するものを言う。
ポリペプチド 本発明において、ハイブリドプラスミノーゲンアクチ
ベーター様ポリペプチドとは、組織プラスミノーゲンア
クチベーターの少なくともフィブリン親和性領域を含む
ポリペプチド部分とウロキナーゼの少なくとも酵素活性
領域を含むポリペプチド部分とを含んで成る融合蛋白質
であって、有意なフィブリン親和性とフィブリン溶解活
性とを共に発揮する能力を有するものを言う。
組織プラスミノーゲンアクチベーターはおよそ500個
のアミノ酸からなる蛋白質でありそのＮ−末端側にフィ
ブリン親和性領域を有する。本発明のハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドにおいては、
そのＮ−末端側部分として上記組織プラスミノーゲンア
クチベーターのＮ−末端側のフィブリン親和性領域を含
むポリペプチド部分を有する。ここで、“ポリペプチド
部分”とは、天然組織プラスミノーゲンアクチベーター
の全体ペプチド又は前記親和性を有するペプチド部分と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに１個
もしくは少数のアミノ酸が除去もしくは付加されている
か、又は１個もしくは少数のアミノ酸が他のアミノ酸に
置き換えられているが、なお天然組織プラスミノーゲン
の対応部分と同様のフィブリン親和性を保持しているポ
リペプチドを意味する。このＮ−末端部分の長さは、そ
れがハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリ
ペプチドに十分なフィブリン親和性を付与するものであ
り限り特に限定れない。例えば、本発明のポリペプチド
のＮ末端側部分は組織プラスミノーゲンアクチベーター
の全体であってもよい。本発明においては、その例とし
てヒト−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ−末
端のアミノ酸（１番目のアミノ酸）セリンから215番目
のシステインまで又は219番目のグリシンまでのおよそ
２クリングルから成る領域、Ｎ末端のアミノ酸セリンを
１番として128番目のセリンから215番目のシステインま
で又は219番目のグリシンまでのおよそ１クリングルか
ら成る領域、及びＮ末端のアミノ酸セリンを１番として
161番目のメチオニンから215番目のシステインまで又は
219番目のグリシンまでのおよそ半クリングルから成る
領域を用いて実際にハイブリドポリペプチドを調製して
このハイブリドポリペプチドのフィブリン親和性をフィ
ブリンセファロース法により調べたところ、いずれもフ
ィブリン親和性を有することが確認された。従って、本
発明のハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポ
リペプチドのフィブリン親和性領域としては、組織プラ
スミノーゲンアクチベーターのフィブリン親和性領域に
対応する、前記の具体例を含む種々の長さのペプチド部
分を用いることができる。なお、本発明において用いる
ヒト−組織プラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸
配列及びこれをコードする塩基配列を第１−１〜第１−
３図に示し、１番目のアミノ酸セリン、128番目のアミ
ノ酸セリン、161番目のアミノ酸メチオニン、215番目の
アミノ酸システイン、及び219番目のアミノ酸グリシン
を矢印で示す。
のアミノ酸からなる蛋白質でありそのＮ−末端側にフィ
ブリン親和性領域を有する。本発明のハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドにおいては、
そのＮ−末端側部分として上記組織プラスミノーゲンア
クチベーターのＮ−末端側のフィブリン親和性領域を含
むポリペプチド部分を有する。ここで、“ポリペプチド
部分”とは、天然組織プラスミノーゲンアクチベーター
の全体ペプチド又は前記親和性を有するペプチド部分と
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに１個
もしくは少数のアミノ酸が除去もしくは付加されている
か、又は１個もしくは少数のアミノ酸が他のアミノ酸に
置き換えられているが、なお天然組織プラスミノーゲン
の対応部分と同様のフィブリン親和性を保持しているポ
リペプチドを意味する。このＮ−末端部分の長さは、そ
れがハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリ
ペプチドに十分なフィブリン親和性を付与するものであ
り限り特に限定れない。例えば、本発明のポリペプチド
のＮ末端側部分は組織プラスミノーゲンアクチベーター
の全体であってもよい。本発明においては、その例とし
てヒト−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ−末
端のアミノ酸（１番目のアミノ酸）セリンから215番目
のシステインまで又は219番目のグリシンまでのおよそ
２クリングルから成る領域、Ｎ末端のアミノ酸セリンを
１番として128番目のセリンから215番目のシステインま
で又は219番目のグリシンまでのおよそ１クリングルか
ら成る領域、及びＮ末端のアミノ酸セリンを１番として
161番目のメチオニンから215番目のシステインまで又は
219番目のグリシンまでのおよそ半クリングルから成る
領域を用いて実際にハイブリドポリペプチドを調製して
このハイブリドポリペプチドのフィブリン親和性をフィ
ブリンセファロース法により調べたところ、いずれもフ
ィブリン親和性を有することが確認された。従って、本
発明のハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポ
リペプチドのフィブリン親和性領域としては、組織プラ
スミノーゲンアクチベーターのフィブリン親和性領域に
対応する、前記の具体例を含む種々の長さのペプチド部
分を用いることができる。なお、本発明において用いる
ヒト−組織プラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸
配列及びこれをコードする塩基配列を第１−１〜第１−
３図に示し、１番目のアミノ酸セリン、128番目のアミ
ノ酸セリン、161番目のアミノ酸メチオニン、215番目の
アミノ酸システイン、及び219番目のアミノ酸グリシン
を矢印で示す。
プロウロキナーゼはＮ−末端のセリンからＣ−末端の
ロイシンまでの411個のアミノ酸から成るポリペプチド
であり、そのＣ−末端側に酵素活性領域を有する。従っ
て、本発明のハイブリドプラスミノーゲンアクチベータ
ー様ポリペプチドは、その酵素活性領域として、そのＣ
末端側にプロウロキナーゼの酵素活性領域を含むポリペ
プチド部分を含む。ここで、“ポリペプチド”とは、天
然プロウロキナーゼの全体ポリペプチド又は前記活性を
有する部分と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、並びに１個もしくは少数のアミノ酸が除去もしくは
付加されているか、又は１個もしくは少数のアミノ酸が
他のアミノ酸に置き換えられているが、なおプロウロキ
ナーゼの対応部分と同様の生物学的活性を保持している
ポリペプチドを意味する。本発明においては遺伝子操作
の便宜上から、150番目のグルタミンからＣ−末端のロ
イシンまでの領域に対応するアミノ酸配列及び132番目
のアラニンから411番目のロイシンまで領域に対応する
アミノ酸配列、を用いてハイブリドポリペプチドを調製
した。また、本発明のポリペプチドのＣ末端側部分はプ
ロウロキナーゼの全体であってもよい。
ロイシンまでの411個のアミノ酸から成るポリペプチド
であり、そのＣ−末端側に酵素活性領域を有する。従っ
て、本発明のハイブリドプラスミノーゲンアクチベータ
ー様ポリペプチドは、その酵素活性領域として、そのＣ
末端側にプロウロキナーゼの酵素活性領域を含むポリペ
プチド部分を含む。ここで、“ポリペプチド”とは、天
然プロウロキナーゼの全体ポリペプチド又は前記活性を
有する部分と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、並びに１個もしくは少数のアミノ酸が除去もしくは
付加されているか、又は１個もしくは少数のアミノ酸が
他のアミノ酸に置き換えられているが、なおプロウロキ
ナーゼの対応部分と同様の生物学的活性を保持している
ポリペプチドを意味する。本発明においては遺伝子操作
の便宜上から、150番目のグルタミンからＣ−末端のロ
イシンまでの領域に対応するアミノ酸配列及び132番目
のアラニンから411番目のロイシンまで領域に対応する
アミノ酸配列、を用いてハイブリドポリペプチドを調製
した。また、本発明のポリペプチドのＣ末端側部分はプ
ロウロキナーゼの全体であってもよい。
なお、プロウロキナーゼは158番目のリジンと159番目
のイソロイシンの間の結合が切断されることにより活性
化されるから、この部分を切断されにくくすることによ
って、生体内で接続性を有するハイブリドプラスミノー
ゲンアクチベーター様ポリペプチドが得られると期待さ
れる。本発明者等は、プロウロキナーゼのＮ末端のセリ
ンを１位として157位のフェニルアラニンを酸性アミノ
酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸に置き換え
ることにより、プラスミン、トロンビン、トリプシン等
のプロテアーゼに対する耐性が強化されるという驚くべ
き事実を見出した。このため本発明のハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーターの好ましい態様においては、
157番目のフェニルアラニンが酸性アミノ酸であるアス
パラギン酸又はグルタミン酸により置き代えられてい
る。また、プロウロキナーゼにおいては、135番目のリ
ジンと136番目のリジンとの間のペプチド結合がトリプ
シン様プロテアーゼ、例えばプラスミンに対して感受性
である。従ってこのペプチド結合の開裂を防止するた
め、本発明の好ましい態様においては135番目のリジン
が塩基性アミノ酸以外のアミノ酸により置き換えられて
いる。この塩基性アミノ酸以外のアミノ酸として、目的
とするポリペプチドの生理的性質に悪影響を与えない任
意の中性アミノ酸又は酸性アミノ酸を使用することがで
き、この様なアミノ酸として例えば、アラニン、アスパ
ラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、
フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシ
ン、メチオニン、セリン、スレオキシ、バリン、トリプ
トファン、チロシン、及びプロリンが挙げられる。な
お、第２−１図〜第２−３図にヒトウロキナーゼのアミ
ノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を示し、132番
目のアラニン、135番目のリジン、150番目のグルタミ
ン、及び157番目のフェニルアラニンを矢印で示す。
のイソロイシンの間の結合が切断されることにより活性
化されるから、この部分を切断されにくくすることによ
って、生体内で接続性を有するハイブリドプラスミノー
ゲンアクチベーター様ポリペプチドが得られると期待さ
れる。本発明者等は、プロウロキナーゼのＮ末端のセリ
ンを１位として157位のフェニルアラニンを酸性アミノ
酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸に置き換え
ることにより、プラスミン、トロンビン、トリプシン等
のプロテアーゼに対する耐性が強化されるという驚くべ
き事実を見出した。このため本発明のハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーターの好ましい態様においては、
157番目のフェニルアラニンが酸性アミノ酸であるアス
パラギン酸又はグルタミン酸により置き代えられてい
る。また、プロウロキナーゼにおいては、135番目のリ
ジンと136番目のリジンとの間のペプチド結合がトリプ
シン様プロテアーゼ、例えばプラスミンに対して感受性
である。従ってこのペプチド結合の開裂を防止するた
め、本発明の好ましい態様においては135番目のリジン
が塩基性アミノ酸以外のアミノ酸により置き換えられて
いる。この塩基性アミノ酸以外のアミノ酸として、目的
とするポリペプチドの生理的性質に悪影響を与えない任
意の中性アミノ酸又は酸性アミノ酸を使用することがで
き、この様なアミノ酸として例えば、アラニン、アスパ
ラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、
フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシ
ン、メチオニン、セリン、スレオキシ、バリン、トリプ
トファン、チロシン、及びプロリンが挙げられる。な
お、第２−１図〜第２−３図にヒトウロキナーゼのアミ
ノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を示し、132番
目のアラニン、135番目のリジン、150番目のグルタミ
ン、及び157番目のフェニルアラニンを矢印で示す。
従って、本発明のハイブリドプラスミノーゲンアクチ
ベーター様ポリペプチドは、そのＮ−末端としての、組
織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ−末端側のフィ
ブリン親和性領域を含む種々の長さのポリペプチドと、
Ｃ−末端としての、ウロキナーゼのＣ−末端側の酸素活
性領域を含みウロキナーゼのＮ−末端のセリンを１番と
して135番目のリジンが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸
により置き換えられており、そして／又は157番目のフ
ェニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換えられてい
る場合がある種々のポリペプチドとを組合わせて成る各
種のハイブリドポリペプチドを包含する。これらの各種
のハイブリドポリペプチドが組織プラスミノーゲンアク
チベーターに比べて強い酵素活性を有することが、合成
基質を用いるアッセイにより確認された。また、前記15
7番目のフェニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換
えられたポリペプチドがトロンビン及びプラスミンによ
り消化されにくく、そして、135番目のリジンが塩基性
アミノ酸以外のアミノ酸により置き換えられているポリ
ペプチドがトリプシン等のプロテアーゼにより消化され
にくいことは特願昭60−159294明細書中に明らかにされ
ている。これらのハイブリドポリペプチドの構造を第３
−１図及び第３−２図に模式的に示す。
ベーター様ポリペプチドは、そのＮ−末端としての、組
織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ−末端側のフィ
ブリン親和性領域を含む種々の長さのポリペプチドと、
Ｃ−末端としての、ウロキナーゼのＣ−末端側の酸素活
性領域を含みウロキナーゼのＮ−末端のセリンを１番と
して135番目のリジンが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸
により置き換えられており、そして／又は157番目のフ
ェニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換えられてい
る場合がある種々のポリペプチドとを組合わせて成る各
種のハイブリドポリペプチドを包含する。これらの各種
のハイブリドポリペプチドが組織プラスミノーゲンアク
チベーターに比べて強い酵素活性を有することが、合成
基質を用いるアッセイにより確認された。また、前記15
7番目のフェニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換
えられたポリペプチドがトロンビン及びプラスミンによ
り消化されにくく、そして、135番目のリジンが塩基性
アミノ酸以外のアミノ酸により置き換えられているポリ
ペプチドがトリプシン等のプロテアーゼにより消化され
にくいことは特願昭60−159294明細書中に明らかにされ
ている。これらのハイブリドポリペプチドの構造を第３
−１図及び第３−２図に模式的に示す。
（Ｂ） 遺伝子系 本発明はさらに、前記ハイブリドプラスミノーゲンア
クチベーター様ポリペプチドを製造するための遺伝子
系、すなわち該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺
伝子を含有するプラスミド、及び該プラスミドにより形
質転換された微生物を提供する。
クチベーター様ポリペプチドを製造するための遺伝子
系、すなわち該ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺
伝子を含有するプラスミド、及び該プラスミドにより形
質転換された微生物を提供する。
（ハイブリドポリペプチドをコードする遺伝子） この遺伝子としては、前記ハイブリドプラスミノーゲ
ンアクチベーター様ポリペプチドをコードし、選択され
た任意の宿主中で現されるコドンから成るものであれば
よい。遺伝子作製の便宜の点から、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターのmRNAから得られるcDNA及びウロキナ
ーゼのmRNAから得られるcDNAの必要な部分を連結して得
るのが好ましく、１例として第１−１図〜第１−３図及
び第２−１図〜第２−３図にアミノ酸配列と共に示した
塩基配列の内該当部分が連結された遺伝子を挙げること
ができる。
ンアクチベーター様ポリペプチドをコードし、選択され
た任意の宿主中で現されるコドンから成るものであれば
よい。遺伝子作製の便宜の点から、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターのmRNAから得られるcDNA及びウロキナ
ーゼのmRNAから得られるcDNAの必要な部分を連結して得
るのが好ましく、１例として第１−１図〜第１−３図及
び第２−１図〜第２−３図にアミノ酸配列と共に示した
塩基配列の内該当部分が連結された遺伝子を挙げること
ができる。
（プラスミド） 本発明の新規プラスミノーゲンアクチベーター様ポリ
ペプチドを発現せしめるためには既知の方法で微生物、
酵母あるいは動物細胞を用いることも可能であるが、前
記コード領域と共に前記遺伝子を大腸菌中で発現せしめ
るために必要な発現制御領域及び大腸菌中で複製するた
めに必要な領域を含んでなるプラスミドを用いることが
好ましい。発現制御領域としては大腸菌中で外来性遺伝
子を発現するために有用な任意の系を用いることがで
き、例えば、tac、PL、lacUV5、PR、trp、lpp等のプロ
モーター／オペレーター系を使用することができ、tac
プロモーター／オペレーター系、trpプロモーター／オ
ペレーター系、及びPLプロモーター／オペレーターが好
ましい。またSD配列としては、例えば、メタピロカテカ
ーゼ遺伝子のSD配列（C230SD）（文献１）、lacSDなど
いづれかを使用することができる。
ペプチドを発現せしめるためには既知の方法で微生物、
酵母あるいは動物細胞を用いることも可能であるが、前
記コード領域と共に前記遺伝子を大腸菌中で発現せしめ
るために必要な発現制御領域及び大腸菌中で複製するた
めに必要な領域を含んでなるプラスミドを用いることが
好ましい。発現制御領域としては大腸菌中で外来性遺伝
子を発現するために有用な任意の系を用いることがで
き、例えば、tac、PL、lacUV5、PR、trp、lpp等のプロ
モーター／オペレーター系を使用することができ、tac
プロモーター／オペレーター系、trpプロモーター／オ
ペレーター系、及びPLプロモーター／オペレーターが好
ましい。またSD配列としては、例えば、メタピロカテカ
ーゼ遺伝子のSD配列（C230SD）（文献１）、lacSDなど
いづれかを使用することができる。
（形質転換菌） 本発明の宿主大腸菌としては、腸管寄生性のない無毒
大腸菌株、例えばエシェリシャ・コリ（Escherichia c
oli）Ｋ−12株に由来する任意の菌株を使用することが
でき、例えばJM83、JM103、JM105、RB791、SM32、N99、
RR1、W3110、x1776等を使用することができる。
大腸菌株、例えばエシェリシャ・コリ（Escherichia c
oli）Ｋ−12株に由来する任意の菌株を使用することが
でき、例えばJM83、JM103、JM105、RB791、SM32、N99、
RR1、W3110、x1776等を使用することができる。
（Ｃ） 遺伝子系の作製 本発明の遺伝子の作製に当っては、（１）組織プラス
ミノーゲンアクチベーターをコードする遺伝子を調製し
て、この遺伝子からフィブリン親和性を有するポリペプ
チド領域をコードするDNA断片を得、（２）ウロキナー
ゼをコードする遺伝子を調製して、この遺伝子から酵素
活性を有するポリペプチド領域をコードするDNA断片を
得、そして（３）これらのDNA断片を適当なプラスミド
中で連結することにより、ハイブリドプラスミノーゲン
アクチベーター様ポリペプチドをコードする遺伝子を作
製するのが便利である。前記ウロキナーゼの157番目の
フェニルアラニンを酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸
又はアスパラギン酸に変える場合には、前記（２）過程
で157番目のフェニルアラニンをコードするコドンを、
グルタミン酸のコドン又はアスパラギン酸のコドンに変
異せしめる。また、135番目のリジンを塩基性アミノ酸
以外のアミノ酸に変える場合も同様である。
ミノーゲンアクチベーターをコードする遺伝子を調製し
て、この遺伝子からフィブリン親和性を有するポリペプ
チド領域をコードするDNA断片を得、（２）ウロキナー
ゼをコードする遺伝子を調製して、この遺伝子から酵素
活性を有するポリペプチド領域をコードするDNA断片を
得、そして（３）これらのDNA断片を適当なプラスミド
中で連結することにより、ハイブリドプラスミノーゲン
アクチベーター様ポリペプチドをコードする遺伝子を作
製するのが便利である。前記ウロキナーゼの157番目の
フェニルアラニンを酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸
又はアスパラギン酸に変える場合には、前記（２）過程
で157番目のフェニルアラニンをコードするコドンを、
グルタミン酸のコドン又はアスパラギン酸のコドンに変
異せしめる。また、135番目のリジンを塩基性アミノ酸
以外のアミノ酸に変える場合も同様である。
酵素活性を有するポリペプチド部分をコードするDNA
領域の入手源としての、天然ヒト−プロウロキナーゼを
コードする遺伝子を含有するプラスミドpMUT4L（この明
細書においてpPE3とも称する）、及び157位のアミノ酸
が酸性アミノ酸であるアスパラギン酸で置き換えられた
安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドを
コードする遺伝子を含有するプラスミドpMUT4Lpm3（こ
の明細書において、pPE3pm3とも称する）の作製系統図
を第４図に示し、それらの具体的な作製方法を参考例４
〜15に記載する。
領域の入手源としての、天然ヒト−プロウロキナーゼを
コードする遺伝子を含有するプラスミドpMUT4L（この明
細書においてpPE3とも称する）、及び157位のアミノ酸
が酸性アミノ酸であるアスパラギン酸で置き換えられた
安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドを
コードする遺伝子を含有するプラスミドpMUT4Lpm3（こ
の明細書において、pPE3pm3とも称する）の作製系統図
を第４図に示し、それらの具体的な作製方法を参考例４
〜15に記載する。
フィブリン親和性を有するポリペプチド部分をコード
するDNA領域の入手源としてのヒト−組織プラスミノー
ゲンアクチベーターをコードする遺伝子を含有するプラ
スミドpDPA3の作製方法は、参考例１〜３に詳細に記載
する。
するDNA領域の入手源としてのヒト−組織プラスミノー
ゲンアクチベーターをコードする遺伝子を含有するプラ
スミドpDPA3の作製方法は、参考例１〜３に詳細に記載
する。
本発明のハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター
様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドは、前記のプラスミドpDPA3、pMUT4L（pPE3）及びpMU
T4Lpm3（pPE3pm3）、並びにベクター用プラスミドpYTU3
及びpK12から出発して実施例１〜６に詳細に記載する方
法により作製することができる。この系統図を第５図に
示す。さらに、本発明の他のプラスミドは実施例11〜16
に詳細に記載する方法により作製することができる。
様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドは、前記のプラスミドpDPA3、pMUT4L（pPE3）及びpMU
T4Lpm3（pPE3pm3）、並びにベクター用プラスミドpYTU3
及びpK12から出発して実施例１〜６に詳細に記載する方
法により作製することができる。この系統図を第５図に
示す。さらに、本発明の他のプラスミドは実施例11〜16
に詳細に記載する方法により作製することができる。
なお、前記のプラスミドpYTU3はPLプロモーター及びC
230SD配列を含有するプラスミドであり、その作製方法
等は特願昭59−274478号明細書に詳細に記載されてお
り、このプラスミドを含有する大腸菌エシェリシャ・コ
リ（Escherichia coli）HB101/pYTU3は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第7992号（FERM P−799
2）として寄託されている。また、前記プラスミドpK12
はtacプロモーター／オペレーター及びC230SD配列を含
有するプラスミドであり、その作製方法等は特願昭59−
274478号明細書に詳細に記載されており、このプラスミ
ドを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia
coli）JM103/pK12は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第7996号（FERM P−7996）として寄託され
ている。
230SD配列を含有するプラスミドであり、その作製方法
等は特願昭59−274478号明細書に詳細に記載されてお
り、このプラスミドを含有する大腸菌エシェリシャ・コ
リ（Escherichia coli）HB101/pYTU3は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第7992号（FERM P−799
2）として寄託されている。また、前記プラスミドpK12
はtacプロモーター／オペレーター及びC230SD配列を含
有するプラスミドであり、その作製方法等は特願昭59−
274478号明細書に詳細に記載されており、このプラスミ
ドを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia
coli）JM103/pK12は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第7996号（FERM P−7996）として寄託され
ている。
実施例１により作製したプラスミドpDPAT2は、成熟ヒ
ト−組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする
遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC230SD配
列の制御のもとに含有するプラスミドであって、これ自
体、成熟ヒト−組織プラスミノーゲンを発現することが
でき、また以下に記載するこの発明のプラスミドのフィ
ブリン親和性部分をコードする遺伝子部分の給源として
使用される。このプラスミドを含有する大腸菌エシェリ
シャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pDPAT2は、ブ
タペスト条約に基く国際寄託として、Deutsche Sammlun
g von Mikroorganismen Gesellschaft fur Biotechnolo
gische Forchung mbH（DSM）にDSM3629として寄託され
ている。
ト−組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする
遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC230SD配
列の制御のもとに含有するプラスミドであって、これ自
体、成熟ヒト−組織プラスミノーゲンを発現することが
でき、また以下に記載するこの発明のプラスミドのフィ
ブリン親和性部分をコードする遺伝子部分の給源として
使用される。このプラスミドを含有する大腸菌エシェリ
シャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pDPAT2は、ブ
タペスト条約に基く国際寄託として、Deutsche Sammlun
g von Mikroorganismen Gesellschaft fur Biotechnolo
gische Forchung mbH（DSM）にDSM3629として寄託され
ている。
実施例２により作製されたプラスミドpHA00は、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから219位のグリシン
までのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト
−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として150
位のグルタミンから411位のロイシンまでのポリペプチ
ド部分をＣ末端側に有するハイブリドプラスミノーゲン
アクチベーター様ポリペプチド（HA00）をコードする遺
伝子をtacプロモーター及びC230SD配列の制御のもとに
含有する。大腸菌中で前記ハイブリドポリペプチドを発
現することができるプラスミドであり、これを含有する
大腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103
/pHA00は、ブタペスト条約に基く国際寄託としてDSM
に、DSM3628として寄託されている。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから219位のグリシン
までのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト
−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として150
位のグルタミンから411位のロイシンまでのポリペプチ
ド部分をＣ末端側に有するハイブリドプラスミノーゲン
アクチベーター様ポリペプチド（HA00）をコードする遺
伝子をtacプロモーター及びC230SD配列の制御のもとに
含有する。大腸菌中で前記ハイブリドポリペプチドを発
現することができるプラスミドであり、これを含有する
大腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103
/pHA00は、ブタペスト条約に基く国際寄託としてDSM
に、DSM3628として寄託されている。
実施例３により作製されたプラスミドpHA03は、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから219位のグリシン
までのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト
−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として150
位のグルタミンから411位のロイシンまでのポリペプチ
ド部分であって157位のフェニルアラニンがアスパラギ
ン酸により置き換えられているものをＣ末端側に有する
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプ
チド（HA03）をコードする遺伝子をtacプロモーター／
オペレーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、
大腸菌中で前記ハイブリドポリペプチドを発現すること
ができるプラスミドであり、これを含有する大腸菌エシ
ェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pHA03は、
ブタペスト条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3627と
して寄託されている。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから219位のグリシン
までのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト
−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として150
位のグルタミンから411位のロイシンまでのポリペプチ
ド部分であって157位のフェニルアラニンがアスパラギ
ン酸により置き換えられているものをＣ末端側に有する
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプ
チド（HA03）をコードする遺伝子をtacプロモーター／
オペレーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、
大腸菌中で前記ハイブリドポリペプチドを発現すること
ができるプラスミドであり、これを含有する大腸菌エシ
ェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pHA03は、
ブタペスト条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3627と
して寄託されている。
実施例４により作製されたプラスミドpHA20は、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから219位のグリシンまでのポリペプチド部分
をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼのＮ
末端のセリンを１位として150位のグルタミンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分をＣ末端側に有する
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプ
チド（HA20）をコードする遺伝子をtacプロモーター／
オペレーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、
大腸菌中で前記ポリペプチドを発現することができるプ
ラスミドであり、これを含有する大腸菌エシェリシャ・
コリ（Escherichia coli）JM103/pHA20は、ブタペスト
条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3626として寄託さ
れている。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから219位のグリシンまでのポリペプチド部分
をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼのＮ
末端のセリンを１位として150位のグルタミンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分をＣ末端側に有する
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプ
チド（HA20）をコードする遺伝子をtacプロモーター／
オペレーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、
大腸菌中で前記ポリペプチドを発現することができるプ
ラスミドであり、これを含有する大腸菌エシェリシャ・
コリ（Escherichia coli）JM103/pHA20は、ブタペスト
条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3626として寄託さ
れている。
実施例５により作製されたプラスミドpHA23は、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから219位のグリシンまでのポリペプチド部分
をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼのＮ
末端のセリンを１位として150位のグルタミンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分であって157位のフ
ェニルアラニンがアスパラギン酸により置き換えられて
いるものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミノーゲ
ンアクチベーター様ポリペプチド（HA23）をコードする
遺伝子をtacプロモーター及びC230SD配列の制御のもと
に含有する、大腸菌中で前記ポリペプチドを発現するこ
とができるプラスミドであり、これを含有する大腸菌エ
シェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pHA23
は、ブタペスト条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM36
25として寄託されている。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから219位のグリシンまでのポリペプチド部分
をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼのＮ
末端のセリンを１位として150位のグルタミンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分であって157位のフ
ェニルアラニンがアスパラギン酸により置き換えられて
いるものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミノーゲ
ンアクチベーター様ポリペプチド（HA23）をコードする
遺伝子をtacプロモーター及びC230SD配列の制御のもと
に含有する、大腸菌中で前記ポリペプチドを発現するこ
とができるプラスミドであり、これを含有する大腸菌エ
シェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pHA23
は、ブタペスト条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM36
25として寄託されている。
実施例６により作製されたプラスミドpHA13は、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として128位のセリンから219位のグリシンまで
のポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト−プ
ロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として150位の
グルタミンから411位のロイシンまでのポリペプチド部
分であって157位のフェニルアラニンがアスパラギン酸
に置き換えられているものをＣ末端側に有するハイブリ
ドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HA
13）をコードする遺伝子をtacプロモーター／オペレー
ター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中
で前記ポリペプチドを発現することできるプラスミドで
ある。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として128位のセリンから219位のグリシンまで
のポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト−プ
ロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として150位の
グルタミンから411位のロイシンまでのポリペプチド部
分であって157位のフェニルアラニンがアスパラギン酸
に置き換えられているものをＣ末端側に有するハイブリ
ドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HA
13）をコードする遺伝子をtacプロモーター／オペレー
ター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中
で前記ポリペプチドを発現することできるプラスミドで
ある。
実施例11により作製されたプラスミドpHA21Lは、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから215位のシステインまでのポリペプチド部
分をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼの
Ｎ末端のセリンを１位として132位のアラニンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分であって135位のリ
ジンがグルタミンに置き換えられているものをＣ末端側
に有するハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様
ポリペプチド（HPA21L）をコードする遺伝子をtacプロ
モーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、大腸
菌中で前記ハイブリドポリペプチドを発現することがで
きるプラスミドであり、これを含有する大腸菌エシェリ
シャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pHA21Lは、ブ
タペスト条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3951とし
て寄託されている。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから215位のシステインまでのポリペプチド部
分をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼの
Ｎ末端のセリンを１位として132位のアラニンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分であって135位のリ
ジンがグルタミンに置き換えられているものをＣ末端側
に有するハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様
ポリペプチド（HPA21L）をコードする遺伝子をtacプロ
モーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、大腸
菌中で前記ハイブリドポリペプチドを発現することがで
きるプラスミドであり、これを含有する大腸菌エシェリ
シャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pHA21Lは、ブ
タペスト条約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3951とし
て寄託されている。
実施例12により作製されたプラスミドpHA24Lは、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから215位のシステインまでのポリペプチド部
分をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼの
Ｎ末端のセリンを１位として132位のアラニンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分であって135位のリ
ジンがグルタミンにより置き換えられておりそして157
位のフェニルアラニンがアスパラギン酸により置き換え
られているものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミ
ノーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HPA24L）をコ
ードする遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC
230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で前記ハ
イブリドポリペプチドを発現することができるプラスミ
ドであり、これを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ
（Escherichia coli）JM103/pHA24Lは、ブタペスト条
約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3952として寄託され
ている。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位
のセリンから215位のシステインまでのポリペプチド部
分をＮ末端側に有し、そしてヒト−プロウロキナーゼの
Ｎ末端のセリンを１位として132位のアラニンから411位
のロイシンまでのポリペプチド部分であって135位のリ
ジンがグルタミンにより置き換えられておりそして157
位のフェニルアラニンがアスパラギン酸により置き換え
られているものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミ
ノーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HPA24L）をコ
ードする遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC
230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で前記ハ
イブリドポリペプチドを発現することができるプラスミ
ドであり、これを含有する大腸菌エシェリシャ・コリ
（Escherichia coli）JM103/pHA24Lは、ブタペスト条
約に基く国際寄託としてDSMに、DSM3952として寄託され
ている。
実施例13により作製されたプラスミドpHA11Lは、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として128位のセリンから215位のシステインま
でのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト−
プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として132位
のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド部
分であって135位のリジンがグルタミンにより置き換え
られているものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミ
ノーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HPA11L）をコ
ードする遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC
230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で前記ポ
リペプチドを発現することができるプラスミドである。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として128位のセリンから215位のシステインま
でのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト−
プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として132位
のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド部
分であって135位のリジンがグルタミンにより置き換え
られているものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミ
ノーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HPA11L）をコ
ードする遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC
230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で前記ポ
リペプチドを発現することができるプラスミドである。
実施例14により作製されたプラスミドpHA14Lは、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として128位のセリンから215位のシステインま
でのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト−
プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として132位
のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド部
分であって135位のリジンがグルタミンにより置き換え
られておりそして157位のフェニルアラニンがアスパラ
ギン酸により置き換えられているものをＣ末端側に有す
るハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペ
プチド（HPA14L）をコードする遺伝子をtacプロモータ
ー及びC230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で
前記ポリペプチドを発現することができるプラスミドで
ある。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として128位のセリンから215位のシステインま
でのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト−
プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として132位
のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド部
分であって135位のリジンがグルタミンにより置き換え
られておりそして157位のフェニルアラニンがアスパラ
ギン酸により置き換えられているものをＣ末端側に有す
るハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペ
プチド（HPA14L）をコードする遺伝子をtacプロモータ
ー及びC230SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で
前記ポリペプチドを発現することができるプラスミドで
ある。
実施例15により作製されたプラスミドpHA01Lは、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから215位のシステイ
ンまでのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒ
ト−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として13
2位のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド
部分であって135位のリジンがグルタミンに置き換えら
れているものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミノ
ーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HPA01L）をコー
ドする遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC23
0SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で前記ポリ
ペプチドを発現することができるプラスミドである。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから215位のシステイ
ンまでのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒ
ト−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として13
2位のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド
部分であって135位のリジンがグルタミンに置き換えら
れているものをＣ末端側に有するハイブリドプラスミノ
ーゲンアクチベーター様ポリペプチド（HPA01L）をコー
ドする遺伝子をtacプロモーター／オペレーター及びC23
0SD配列の制御のもとに含有する、大腸菌中で前記ポリ
ペプチドを発現することができるプラスミドである。
実施例16により作製されたプラスミドpHA01Lは、ヒト
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから215のシステイン
までのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト
−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として132
位のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド
部分であって135位のリジンがグルタミンにより置き換
えられておりそして157位のフェニルアラニンがアスパ
ラギン酸に置き換えられているものをＣ末端側に有する
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプ
チド（HA13）をコードする遺伝子をtacプロモーター／
オペレーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、
大腸菌中で前記ポリペプチドを発現することができるプ
ラスミドである。
−組織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリ
ンを１位として161位のメチオニンから215のシステイン
までのポリペプチド部分をＮ末端側に有し、そしてヒト
−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として132
位のアラニンから411位のロイシンまでのポリペプチド
部分であって135位のリジンがグルタミンにより置き換
えられておりそして157位のフェニルアラニンがアスパ
ラギン酸に置き換えられているものをＣ末端側に有する
ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプ
チド（HA13）をコードする遺伝子をtacプロモーター／
オペレーター及びC230SD配列の制御のもとに含有する、
大腸菌中で前記ポリペプチドを発現することができるプ
ラスミドである。
（Ｄ） 遺伝子の発現及びハイブリドポリペプチドの精
製 前記のプラスミドにより形質転換された大腸菌を、例
えば、100μg/mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス
中で培養し、菌体濃度が550nmにおける吸光度として、
0.3〜0.6となった時に誘導剤IPTG（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド）を例えば1mMとなるよう
に添加し、さらに数時間培養する。これによりハイブリ
ドポリペプチドが菌体内に蓄積する。
製 前記のプラスミドにより形質転換された大腸菌を、例
えば、100μg/mlのアンピシリンを含有するＬ−ブロス
中で培養し、菌体濃度が550nmにおける吸光度として、
0.3〜0.6となった時に誘導剤IPTG（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド）を例えば1mMとなるよう
に添加し、さらに数時間培養する。これによりハイブリ
ドポリペプチドが菌体内に蓄積する。
この菌体から目的とするハイブリドポリペプチドを回
収・精製するには、大腸菌の菌体中に生産されたポリペ
プチドを回収・精製するための常法を用いることができ
る。例えば、菌体を回収し、これを適当な手段により破
砕して遠心分離により沈澱を集める。目的ポリペプチド
はこの沈澱中に回収される。次に、この沈澱物を塩酸グ
アニジンで処理することにより目的ポリペプチドを可溶
化する。次に、このポリペプチド溶液を蛋白質精製の常
法、例えば、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
を適宜組合わせることにより精製することができる。こ
の具体例を実施例７に記載する。
収・精製するには、大腸菌の菌体中に生産されたポリペ
プチドを回収・精製するための常法を用いることができ
る。例えば、菌体を回収し、これを適当な手段により破
砕して遠心分離により沈澱を集める。目的ポリペプチド
はこの沈澱中に回収される。次に、この沈澱物を塩酸グ
アニジンで処理することにより目的ポリペプチドを可溶
化する。次に、このポリペプチド溶液を蛋白質精製の常
法、例えば、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
を適宜組合わせることにより精製することができる。こ
の具体例を実施例７に記載する。
（Ｅ） ハイブリドポリペプチドの性質 （１）電気泳動による分離 前記のようにして調製した発現生成物サンプルをSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、クマ
ジーブルー染色したパターンを調べた。この結果の一例
を第17図Ａに示す。図中、レーン１は大腸菌JM103/pPE3
から、レーン２は大腸菌JM103/pHA03から、そしてレー
ン３は大腸菌JM103/pDPAT2からの発現生成物の結果を示
す。
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、クマ
ジーブルー染色したパターンを調べた。この結果の一例
を第17図Ａに示す。図中、レーン１は大腸菌JM103/pPE3
から、レーン２は大腸菌JM103/pHA03から、そしてレー
ン３は大腸菌JM103/pDPAT2からの発現生成物の結果を示
す。
（２）次に、前記のようにして電気泳動により分離した
生成物と、抗−組織プラスミノーゲンアクチベーター抗
血清又は抗−ウロキナーゼ抗血清との反応性をニトロセ
ルロース膜上で試験し、第17図Ｂ及びＣに示すパターン
が得られた。この図から明らかな通り、本発明のハイブ
リドポリペプチドHA03は、上記両抗血清と反応すること
が確認される。
生成物と、抗−組織プラスミノーゲンアクチベーター抗
血清又は抗−ウロキナーゼ抗血清との反応性をニトロセ
ルロース膜上で試験し、第17図Ｂ及びＣに示すパターン
が得られた。この図から明らかな通り、本発明のハイブ
リドポリペプチドHA03は、上記両抗血清と反応すること
が確認される。
他のハイブリドポリペプチドについても同様の結果が
得られる。
得られる。
（３）フィブリンに対する親和性 フィブリンアフィニティーカラムを調製し、これに前
記の発現生成物サンプルを通し、これをまずTris−HCl
緩衝液（Ａ）で溶出し、次に、2M KSCNを含有するTris
−HCl緩衝液（Ｂ）で溶出する。溶出液を分取し、
（Ａ）により溶出される画分を非吸着画分とし、（Ｂ）
で溶出される画分を吸着画分とする。分取した各画分
を、プラスミノーゲン含有フィブリン平板上で、プラス
ミノーゲン活性化作用について測定する。この結果を第
18−１図〜第18−４図に示す。この図から明らかな通
り、市販のウロキナーゼ（UK）は非吸着画分中に溶出さ
れるのに対し、本発明のハイブリドポリペプチド、及び
市販の組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）
は、いずれも吸着画分中に溶出される。従って、本発明
のハイブリドポリペプチドは、天然組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと同等のフィブリン親和性を有するこ
とが明らかである。
記の発現生成物サンプルを通し、これをまずTris−HCl
緩衝液（Ａ）で溶出し、次に、2M KSCNを含有するTris
−HCl緩衝液（Ｂ）で溶出する。溶出液を分取し、
（Ａ）により溶出される画分を非吸着画分とし、（Ｂ）
で溶出される画分を吸着画分とする。分取した各画分
を、プラスミノーゲン含有フィブリン平板上で、プラス
ミノーゲン活性化作用について測定する。この結果を第
18−１図〜第18−４図に示す。この図から明らかな通
り、市販のウロキナーゼ（UK）は非吸着画分中に溶出さ
れるのに対し、本発明のハイブリドポリペプチド、及び
市販の組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）
は、いずれも吸着画分中に溶出される。従って、本発明
のハイブリドポリペプチドは、天然組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと同等のフィブリン親和性を有するこ
とが明らかである。
（４）合成基質Ｓ−2288によりKm値の測定 本発明の各種のハイブリドポリペプチドの酵素活性を
確認するため、合成基質Ｓ−2288（Ｈ−Ｄ−イソロイシ
ル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ド−ジヒドロクロリド）によるKm値の測定を行った。１
例として、フィブリン親和性領域としておよそ２クリン
グル、又はおよそ半クリングルを含み、他方酵素活性部
位として天然ヒト−プロウロキナーゼの酵素活性領域、
又は157位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に置換
えられた領域を含むものとして、プラスミドpHA03の発
現生成物HA03及びpHA20の発現生成物HA20（プラスミン
により活性化した後）のKm値を市販ウロキナーゼのそれ
と比較した。これら３者のKm値は2.0×10-4mol/で同
一であり、本発明のハイブリドポリペプチドが、プラス
ミンにより活性化された後、天然ウロキナーゼの酵素活
性領域と同等の酵素活性を発揮することが確認された。
確認するため、合成基質Ｓ−2288（Ｈ−Ｄ−イソロイシ
ル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリ
ド−ジヒドロクロリド）によるKm値の測定を行った。１
例として、フィブリン親和性領域としておよそ２クリン
グル、又はおよそ半クリングルを含み、他方酵素活性部
位として天然ヒト−プロウロキナーゼの酵素活性領域、
又は157位のフェニルアラニンがアスパラギン酸に置換
えられた領域を含むものとして、プラスミドpHA03の発
現生成物HA03及びpHA20の発現生成物HA20（プラスミン
により活性化した後）のKm値を市販ウロキナーゼのそれ
と比較した。これら３者のKm値は2.0×10-4mol/で同
一であり、本発明のハイブリドポリペプチドが、プラス
ミンにより活性化された後、天然ウロキナーゼの酵素活
性領域と同等の酵素活性を発揮することが確認された。
（５）プラスミン及びトロンビンに対する安定性 本発明のハイブリドポリペプチドの内、酵素活性領域
のヒトプロウロキナーゼの157位のフェニルアラニンが
アスパラギン酸により置き換えられているもの、すなわ
ちHA03、HA13、及びHA23は、前記の置換が行われていな
いものに比べてトロンビンにより不活性化されにくく、
プラスミンによる活性化の速度が遅い。
のヒトプロウロキナーゼの157位のフェニルアラニンが
アスパラギン酸により置き換えられているもの、すなわ
ちHA03、HA13、及びHA23は、前記の置換が行われていな
いものに比べてトロンビンにより不活性化されにくく、
プラスミンによる活性化の速度が遅い。
以上のごとく、本発明のハイブリドプラスミノーゲン
アクチベーター様ポリペプチドは、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと同等のフィブリン親和性を有し、同
時に、活性化された場合にウロキナーゼと同等の酵素活
性を有する。また、前記157位のフェニルアラニンが酸
性アミノ酸により置き換えられているハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドは、プラスミ
ン、トロンビン及びその他のプロテアーゼに対して安定
化されており、生体内に投与された場合に持続性のフィ
ブリン溶解活性を発揮すると予想される。
アクチベーター様ポリペプチドは、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと同等のフィブリン親和性を有し、同
時に、活性化された場合にウロキナーゼと同等の酵素活
性を有する。また、前記157位のフェニルアラニンが酸
性アミノ酸により置き換えられているハイブリドプラス
ミノーゲンアクチベーター様ポリペプチドは、プラスミ
ン、トロンビン及びその他のプロテアーゼに対して安定
化されており、生体内に投与された場合に持続性のフィ
ブリン溶解活性を発揮すると予想される。
このような性質を有するプラスミノーゲンアクチベー
ターは従来知られておらず、全く新しいタイプのプラス
ミノーゲンアクチベーターである。
ターは従来知られておらず、全く新しいタイプのプラス
ミノーゲンアクチベーターである。
次に、本発明を参考例及び実施例により具体的に説明
する。
する。
参考例1.ポリA+RNAの単離 ヒト咽頭ガン細胞デトロイト−562を、10％ウシ胎児
血清、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウ
ム、0.1％ラクトアルブミンを含むイーグル改変培地を
用い、５％CO2濃度においてプラスチックプレート上で
生育させた。コンフルエントな状態になったところで培
地を除いたのち、9cm径のプラスチックプレート一枚当
り2mlの変性用溶液（6Mグアニジウムチオシアネート、5
mMクエン酸ナトリウム、0.5％サルコシン、0.1M2−メル
カプトエタノール）を加えて細胞成分を変成させた。以
下のChirgwinらの方法（文献２）に従い、5.7M CsCl溶
液の上に上記抽出物を重層し、遠心分離によってRNAを
単離した。典型的には60枚のプラスチックプレートから
12mgのRNA標品を回収した。
血清、0.1mM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウ
ム、0.1％ラクトアルブミンを含むイーグル改変培地を
用い、５％CO2濃度においてプラスチックプレート上で
生育させた。コンフルエントな状態になったところで培
地を除いたのち、9cm径のプラスチックプレート一枚当
り2mlの変性用溶液（6Mグアニジウムチオシアネート、5
mMクエン酸ナトリウム、0.5％サルコシン、0.1M2−メル
カプトエタノール）を加えて細胞成分を変成させた。以
下のChirgwinらの方法（文献２）に従い、5.7M CsCl溶
液の上に上記抽出物を重層し、遠心分離によってRNAを
単離した。典型的には60枚のプラスチックプレートから
12mgのRNA標品を回収した。
次にオリゴdTセルロースクロマトグラフィー（文献
３）によりポリA+RNAの単離した。上記RNAから約600μ
ｇの標品が得られた。
３）によりポリA+RNAの単離した。上記RNAから約600μ
ｇの標品が得られた。
参考例2.cDNAライブラリーの作成 OkayamaとBergの方法（文献４）に従いcDNA合成反応
をおこなった。すなわち２μｇのベクタープライマーと
３μｇの上記ポリA+RNAを混合し、12Uの逆転写酵素を用
いて37℃、40分間cDNA伸張反応をおこなった。以下上記
文献に従いオリゴdC付加反応、Hind IIIによる消化、リ
ンカーDNAとのアニーリングと環化反応、およびRNA鎖置
換反応をおこなった。この最終反応溶液をcDNAライブラ
リーとして−20℃に保存した。これを用時融解し、大腸
菌の形質転換（文献５）に供することが可能である。典
型的には大腸菌x1776株を受容菌として用いた場合上記
スケールの反応溶液あたり約10万個の独立な形質転換菌
を得ることが可能であった。
をおこなった。すなわち２μｇのベクタープライマーと
３μｇの上記ポリA+RNAを混合し、12Uの逆転写酵素を用
いて37℃、40分間cDNA伸張反応をおこなった。以下上記
文献に従いオリゴdC付加反応、Hind IIIによる消化、リ
ンカーDNAとのアニーリングと環化反応、およびRNA鎖置
換反応をおこなった。この最終反応溶液をcDNAライブラ
リーとして−20℃に保存した。これを用時融解し、大腸
菌の形質転換（文献５）に供することが可能である。典
型的には大腸菌x1776株を受容菌として用いた場合上記
スケールの反応溶液あたり約10万個の独立な形質転換菌
を得ることが可能であった。
参考例3.スクリーニング 上記形質転換菌からプラスミノーゲンアクチベーター
様タンパク質をコードしている遺伝子をプラスミド上に
もつクローンを分離するために、合成DNA断片をプロー
ブとして用いた。この目的に供したDNAは下記に示す２
種類であり、これらはPennicaら（文献６）の報告して
いるメラノーマプラスミノーゲンアクチベーターcDNAの
部分配列（プローブI:前述文献中塩基番号154−173,プ
ローブII:塩基番号1099−1116）に相補的な配列であ
る。
様タンパク質をコードしている遺伝子をプラスミド上に
もつクローンを分離するために、合成DNA断片をプロー
ブとして用いた。この目的に供したDNAは下記に示す２
種類であり、これらはPennicaら（文献６）の報告して
いるメラノーマプラスミノーゲンアクチベーターcDNAの
部分配列（プローブI:前述文献中塩基番号154−173,プ
ローブII:塩基番号1099−1116）に相補的な配列であ
る。
これらを、32P−γ−ATPにより５′末端を標識し、チ
トロセルロース上で生育させたのちアルカリにより変性
させた形質転換大腸菌と、フィルター上でハイブリド形
成反応せしめた（900mM NaCl、90mMクエン酸ナトリウ
ム、10倍濃度デンハルト溶液（文献７）45℃、20時
間）。然る後、ニトロセルロースフィルターを45℃、30
0mM NaCl、30mMクエン酸ナトリウムの条件で洗浄したの
ち、Ｘ線フィルムに密着させてオートラジオグラムを撮
影し、ハイブリド形成陽性のクローンを検出した。プロ
ーブＩ及びIIを混合して用いることにより、約５万クロ
ーンの形質転換菌から十数種のハイブリド形成陽性のも
のが単離されたが、それらのうちの１つx1776（pDPA3）
は両方にハイブリド形成した。このクローンから常法に
従ってプラスミドpDPA3を得た。
トロセルロース上で生育させたのちアルカリにより変性
させた形質転換大腸菌と、フィルター上でハイブリド形
成反応せしめた（900mM NaCl、90mMクエン酸ナトリウ
ム、10倍濃度デンハルト溶液（文献７）45℃、20時
間）。然る後、ニトロセルロースフィルターを45℃、30
0mM NaCl、30mMクエン酸ナトリウムの条件で洗浄したの
ち、Ｘ線フィルムに密着させてオートラジオグラムを撮
影し、ハイブリド形成陽性のクローンを検出した。プロ
ーブＩ及びIIを混合して用いることにより、約５万クロ
ーンの形質転換菌から十数種のハイブリド形成陽性のも
のが単離されたが、それらのうちの１つx1776（pDPA3）
は両方にハイブリド形成した。このクローンから常法に
従ってプラスミドpDPA3を得た。
このプラスミドを含有する大腸菌x1776（pDPA3）は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第7931号
（FERMP−7931）として寄託されている。
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第7931号
（FERMP−7931）として寄託されている。
このプラスミドpDPA3の制限エンドヌクレアーゼ切断
地図を第13図に示す。この図中、太枠で示した円部分が
cDNA配列に相当する。このcDNA配列をMaxamとGilbertの
方法（文献８）により決定した結果を第１−１〜１−３
図に示す。このcDNA配列３′末端側のポリＡ配列部分を
除き2459塩基対よりなり、この内1548塩基対により、51
6個のアミノ酸がコードされている。このコード配列部
分は、熟成プラスミノーゲンアクチベーターのコード配
列（塩基配列261〜1703）のほかに、その上流にプレプ
ロ配列（塩基番号156〜260）を含む。このコード配列の
上流には５′非翻訳領域（塩基番号１〜155）を含有
し、そして下流に３′非翻訳領域（塩基番号1074〜245
9）を有する。
地図を第13図に示す。この図中、太枠で示した円部分が
cDNA配列に相当する。このcDNA配列をMaxamとGilbertの
方法（文献８）により決定した結果を第１−１〜１−３
図に示す。このcDNA配列３′末端側のポリＡ配列部分を
除き2459塩基対よりなり、この内1548塩基対により、51
6個のアミノ酸がコードされている。このコード配列部
分は、熟成プラスミノーゲンアクチベーターのコード配
列（塩基配列261〜1703）のほかに、その上流にプレプ
ロ配列（塩基番号156〜260）を含む。このコード配列の
上流には５′非翻訳領域（塩基番号１〜155）を含有
し、そして下流に３′非翻訳領域（塩基番号1074〜245
9）を有する。
（２）酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA
断片としてのプラスミドの作成 参考例4.mRNAの調製 J.M.チルグウインらの方法（文献２）に従い、グアニ
ジンチオシアナートを用いる方法によってmRNAを調製し
た。
断片としてのプラスミドの作成 参考例4.mRNAの調製 J.M.チルグウインらの方法（文献２）に従い、グアニ
ジンチオシアナートを用いる方法によってmRNAを調製し
た。
−80℃に凍結しておいた腎組織20gを液体窒素中でワ
ーリングブレンダーにて破砕し、5Mグアニジンチオシア
ナート溶液（5Mグアニジンチオシアナート、0.5％Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム、25mM酒石酸ナトリウ
ム、0.1Mメルカプトエタノール、0.1％アンチフォーム
Ａ）80mlに懸濁した。この液をテフロンホモゲナイザー
で均質化し、20G1/2注射針を用いてDNAを剪断した。5.7
M CsCl12mlに前記溶液24mlを重層し、ベックマン超遠心
機SW28ローターにより15℃にて24時間、25000rpmで遠心
後、全RNAを回収した。
ーリングブレンダーにて破砕し、5Mグアニジンチオシア
ナート溶液（5Mグアニジンチオシアナート、0.5％Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム、25mM酒石酸ナトリウ
ム、0.1Mメルカプトエタノール、0.1％アンチフォーム
Ａ）80mlに懸濁した。この液をテフロンホモゲナイザー
で均質化し、20G1/2注射針を用いてDNAを剪断した。5.7
M CsCl12mlに前記溶液24mlを重層し、ベックマン超遠心
機SW28ローターにより15℃にて24時間、25000rpmで遠心
後、全RNAを回収した。
２％酢酸カリウム溶液に粗全RNAを溶解し、２倍容量
のエタノールを加えて、−20℃にて一晩放置後、沈澱を
遠心により回収精製した。
のエタノールを加えて、−20℃にて一晩放置後、沈澱を
遠心により回収精製した。
ポリ（Ａ）+RNAはH,アビブらの方法（文献３）に従
い、オリゴ（dT）セルロースカラムクロマトグラフィー
により全RNAから単離精製した。
い、オリゴ（dT）セルロースカラムクロマトグラフィー
により全RNAから単離精製した。
腎組織10gからの収量は、全RNAは約3mgであり、その
２〜３％がポリ（Ａ）+RNAであった。
２〜３％がポリ（Ａ）+RNAであった。
参考例5.cDNAライブラリー（Ｉ）の作製 参考例４で得られたポリ（Ａ）+RNA40μｇを用いてcD
NA合成を行った。オリゴ（dT）12-1840μｇをプライマ
ーとし、逆転写酵素40ユニットを用いて、42℃にて２時
間反応させて第一鎖を合成し、鋳型のmRNAをアルカリ処
理で除き、第二鎖の合成を100ユニットのDNAポリメラー
ゼI Klenow断片を用いて行った。
NA合成を行った。オリゴ（dT）12-1840μｇをプライマ
ーとし、逆転写酵素40ユニットを用いて、42℃にて２時
間反応させて第一鎖を合成し、鋳型のmRNAをアルカリ処
理で除き、第二鎖の合成を100ユニットのDNAポリメラー
ゼI Klenow断片を用いて行った。
SIヌクレアーゼでヘアピン部をとり除き、末端デオキ
シヌクレオチジル転移酵素により、二重鎖cDNAの３′端
に（dC）10-20鎖を結合し、約400ngの（dC）テイルcDNA
を得た。これを市販の（dG）テイルpBR322（Pst I部）
（New England Nuclear製）800ngとアニールし、大腸菌
x1776に、ハナハンの方法（文献９）により形質転換
し、テトラサイクリン耐性で且つアンピシリン感受性の
形質転換菌約２×105個からなるcDNAライブラリー
（Ｉ）を得た。
シヌクレオチジル転移酵素により、二重鎖cDNAの３′端
に（dC）10-20鎖を結合し、約400ngの（dC）テイルcDNA
を得た。これを市販の（dG）テイルpBR322（Pst I部）
（New England Nuclear製）800ngとアニールし、大腸菌
x1776に、ハナハンの方法（文献９）により形質転換
し、テトラサイクリン耐性で且つアンピシリン感受性の
形質転換菌約２×105個からなるcDNAライブラリー
（Ｉ）を得た。
これらの形質転換菌についてアルカリ溶菌法による迅
速単離法（文献10）によりcDNA挿入断片の大きさを調べ
た。
速単離法（文献10）によりcDNA挿入断片の大きさを調べ
た。
参考例6.cDNAライブラリー検索用プローブとしての合成
DNAオリゴマーの調製 J.G.ステフェンス等（文献11）、ギュンツラー等（文
献12）により報告されたヒトウロキナーゼのアミノ酸配
列Asn169.Gln.Pro.Trp..Phe173に対応するmRNAの可能性
あるコドンに相補的な14塩基からなる下記のDNAオリゴ
マー16種類をホスホトリエステル法により合成した。
DNAオリゴマーの調製 J.G.ステフェンス等（文献11）、ギュンツラー等（文
献12）により報告されたヒトウロキナーゼのアミノ酸配
列Asn169.Gln.Pro.Trp..Phe173に対応するmRNAの可能性
あるコドンに相補的な14塩基からなる下記のDNAオリゴ
マー16種類をホスホトリエステル法により合成した。
これら16種類のDNAオリゴマーの混合物をUKプローブ
Ｉと称する。
Ｉと称する。
また、確認用プローブとしてMet283.Try.Asn.Asp.Pro
287に対応するmRNAの可能性あるコドンに相補的な14塩
基から成る下記のDNAオリゴマー８種類のDNAオリゴマー
を同様にして合成した。
287に対応するmRNAの可能性あるコドンに相補的な14塩
基から成る下記のDNAオリゴマー８種類のDNAオリゴマー
を同様にして合成した。
これら８種類のDNAオリゴマーの混合物をUKプローブI
Iと称する。
Iと称する。
これら、UKプローブＩ及びUKプローブIIのそれぞれ20
0ngずつを、T4ポリヌクレチオドキナーゼを用いて3000C
i/mmoleγ−32PATPにより５′端放射能標識を行い、コ
ロニーハイブリダイゼーション用プローブとした。
0ngずつを、T4ポリヌクレチオドキナーゼを用いて3000C
i/mmoleγ−32PATPにより５′端放射能標識を行い、コ
ロニーハイブリダイゼーション用プローブとした。
参考例7.cDNAライブラリー（Ｉ）の検索 （１）検索 15μg/mlのテトラサイクリンを含有するLB寒天培地
に、オートクレーブ殺菌したニトロセルロースフィルタ
ー（0.45μm.TYPE TM−２）（東洋濾紙製）を置き、約2
000個の形質転換菌コロニーが育成するように、参考例
５において調製した形質転換菌を撒いた。37℃にて８時
間培養した後、２枚のニトロセルロースフィルターにレ
プリカ（複写）し、これをさらに37℃にて３時間培養し
た。最初のニトロセルロースフィルターをマスターフィ
ルターとし、後者の２枚を、15μg/mlのテトラサイクリ
ン及び100μg/mlのクロラムフェニコールを含有する。L
B寒天培地に移し、37℃にて一晩培養した。次に、グル
ンスタインホグネスの変法（文献13）に従って0.5M NaO
H及び1.5M NaCl上に３分間フィルターを置き、コロニー
の溶菌及びDNAの変性を行い、0.5M Tris−HCl（pH7.6）
及び1.5M NaCl上で中和し、フィルターを風乾し、そし
て80℃にて２時間焼付した。
に、オートクレーブ殺菌したニトロセルロースフィルタ
ー（0.45μm.TYPE TM−２）（東洋濾紙製）を置き、約2
000個の形質転換菌コロニーが育成するように、参考例
５において調製した形質転換菌を撒いた。37℃にて８時
間培養した後、２枚のニトロセルロースフィルターにレ
プリカ（複写）し、これをさらに37℃にて３時間培養し
た。最初のニトロセルロースフィルターをマスターフィ
ルターとし、後者の２枚を、15μg/mlのテトラサイクリ
ン及び100μg/mlのクロラムフェニコールを含有する。L
B寒天培地に移し、37℃にて一晩培養した。次に、グル
ンスタインホグネスの変法（文献13）に従って0.5M NaO
H及び1.5M NaCl上に３分間フィルターを置き、コロニー
の溶菌及びDNAの変性を行い、0.5M Tris−HCl（pH7.6）
及び1.5M NaCl上で中和し、フィルターを風乾し、そし
て80℃にて２時間焼付した。
次に、フィルターを４×SSC中で60℃にて30分間ずつ
洗浄し、続いて４×SSC、10×Denhardt及び50μg/ml変
性E.coli−DNA中で60℃にて１時間プレハイブリダイゼ
ーションを行い、さらに0.1mMATP及び放射能標識UKプロ
ーブＩ（約107cpm/フィルター）を加えて37℃にて16時
間ハイブリダイゼーションを行った。４×SSC中で39℃
にて６〜８回洗浄した後、フィルターを風乾し、オート
ラジオグラフィーにより、UKプローブＩとハイブリダイ
ズする形質転換菌を検索した。この方法により８×104
個のコロニーから21個の候補クローンを得た。これらの
クローンのプラスミドをpKYU1〜pKYU21と称する。
洗浄し、続いて４×SSC、10×Denhardt及び50μg/ml変
性E.coli−DNA中で60℃にて１時間プレハイブリダイゼ
ーションを行い、さらに0.1mMATP及び放射能標識UKプロ
ーブＩ（約107cpm/フィルター）を加えて37℃にて16時
間ハイブリダイゼーションを行った。４×SSC中で39℃
にて６〜８回洗浄した後、フィルターを風乾し、オート
ラジオグラフィーにより、UKプローブＩとハイブリダイ
ズする形質転換菌を検索した。この方法により８×104
個のコロニーから21個の候補クローンを得た。これらの
クローンのプラスミドをpKYU1〜pKYU21と称する。
得られた候補クローン21個を上記と同様に処理し、UK
プローブIIとハイブリダイズするクローンを得た。この
クローン中のプラスミドをpKU21と称する。（第６
図）。
プローブIIとハイブリダイズするクローンを得た。この
クローン中のプラスミドをpKU21と称する。（第６
図）。
（２）pKYU21プラスミドDNAの特性 pKYU21プラスミドDNAを各種の制限酵素で消化し、マ
キサム−ギルバート法（文献８）により、又はM13mp8に
サブクローン化した後ジデオキシチェインターミネーシ
ョン法（文献14）により、塩基配列の決定を行った。こ
れをウロキナーゼの公知のアミノ酸配列と対照した結
果、cDNAは低分子ウロキナーゼのコード領域を完全に含
むが、プロウロキナーゼのコード領域中の５′端領域の
約100bPのDNAが欠損していることが確認された。
キサム−ギルバート法（文献８）により、又はM13mp8に
サブクローン化した後ジデオキシチェインターミネーシ
ョン法（文献14）により、塩基配列の決定を行った。こ
れをウロキナーゼの公知のアミノ酸配列と対照した結
果、cDNAは低分子ウロキナーゼのコード領域を完全に含
むが、プロウロキナーゼのコード領域中の５′端領域の
約100bPのDNAが欠損していることが確認された。
参考例8.プライマー延長反応によるcDNAライブラリー
（II）の作製 参考例７（２）において決定した塩基配列に基づき、
89Ser.Asp.Ala.Leu.Glu93に対応するmRNAの配列に相捕
的15塩基から成るDNAオリゴマー： ５′CTGAAGAGCATCAGA3′ をホスホトリエステル法によって合成した。
（II）の作製 参考例７（２）において決定した塩基配列に基づき、
89Ser.Asp.Ala.Leu.Glu93に対応するmRNAの配列に相捕
的15塩基から成るDNAオリゴマー： ５′CTGAAGAGCATCAGA3′ をホスホトリエステル法によって合成した。
鋳型としてポリ（Ａ）+RNAを100μｇを用い、アガー
ワール等（文献15）、又はステワート等（文献16）の方
法に基づき、５′端32P−標識プライマー１μｇと共に
逆転写酸素100ユニットにより第１鎖cDNAを合成し、次
にDNAポリメラーゼI Klenow断片100ユニットを用いて第
２鎖を合成した。次にS1ヌクレアーゼにより一重鎖DNA
を消化し、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用い
て３′端に（dC）ｎ鎖を付加した。このdCテイルインサ
ート（cDNA）とdGテイルベクター（pBR322）とをアニー
ルした後、大腸菌x1776に形質転換して約５×104個の形
質転換体からなるcDNAライブラリー（II）を得た。
ワール等（文献15）、又はステワート等（文献16）の方
法に基づき、５′端32P−標識プライマー１μｇと共に
逆転写酸素100ユニットにより第１鎖cDNAを合成し、次
にDNAポリメラーゼI Klenow断片100ユニットを用いて第
２鎖を合成した。次にS1ヌクレアーゼにより一重鎖DNA
を消化し、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用い
て３′端に（dC）ｎ鎖を付加した。このdCテイルインサ
ート（cDNA）とdGテイルベクター（pBR322）とをアニー
ルした後、大腸菌x1776に形質転換して約５×104個の形
質転換体からなるcDNAライブラリー（II）を得た。
参考例9.cDNAライブラリー（II）の検索 参考例８において得た形質転換菌を、参考例７（１）
に記載した方法と同様にして処理しハイブリダイゼーシ
ョンを行った。この場合pKYU21からの150bp Pst I−Bgl
II5′端消化断片を、α−32P−dCTP（3000Ci/mmole）
を用いてニックトランスレーション法（文献９）により
放射機能標識したものをプローブとして用いた。ハイブ
リダイゼーションは60℃にて行った。
に記載した方法と同様にして処理しハイブリダイゼーシ
ョンを行った。この場合pKYU21からの150bp Pst I−Bgl
II5′端消化断片を、α−32P−dCTP（3000Ci/mmole）
を用いてニックトランスレーション法（文献９）により
放射機能標識したものをプローブとして用いた。ハイブ
リダイゼーションは60℃にて行った。
次に、２×SSCにより60℃にて２〜３回フィルターを
洗浄し、風乾し、オートラジオグラフィーにより上記プ
ローブとハイブリダイズするクローンを検索した。約３
×104個のクローンから８個の陽性クローンを得た。こ
れらのクローン中のプラスミドをpPE1〜pPE8と称する。
これらのプラスミドDNAを制限酵素PstＩで消化した結
果、プラスミドpPE3（第７図）が約420dpのcDNA挿入部
を含有することが確認された。
洗浄し、風乾し、オートラジオグラフィーにより上記プ
ローブとハイブリダイズするクローンを検索した。約３
×104個のクローンから８個の陽性クローンを得た。こ
れらのクローン中のプラスミドをpPE1〜pPE8と称する。
これらのプラスミドDNAを制限酵素PstＩで消化した結
果、プラスミドpPE3（第７図）が約420dpのcDNA挿入部
を含有することが確認された。
このプラスミドpPE3のDNAを制限酵素Pst Iで消化して
得られた断片をM13mp8にサブクローン化し、ジデオキシ
チェインターミネーション法、（文献14）により塩基配
列の決定を行ったところ、プロウロキナーゼ遺伝子の
５′端側の十分な長さのコード領域を含み、更に翻訳開
始コドンATGの上流に66bpから成る５′非翻訳領域を含
むことが確認された。
得られた断片をM13mp8にサブクローン化し、ジデオキシ
チェインターミネーション法、（文献14）により塩基配
列の決定を行ったところ、プロウロキナーゼ遺伝子の
５′端側の十分な長さのコード領域を含み、更に翻訳開
始コドンATGの上流に66bpから成る５′非翻訳領域を含
むことが確認された。
参考例10.プロウロキナーゼ遺伝子の作製（第６図） 低分子ウロキナーゼの完全なコード領域を含むプラス
ミドpKYU21のDNA5μｇをそれぞれ10ユニットずつの制限
酵素Bgl II及びHind IIIにより二重消化し、約5.7KbのD
NA断片と、同プラスミドpKYU21のDNAをそれぞれ10ユニ
ットずつのBgl II及びNco Iにより二重消化し、66bpのD
NA断片とを慣用の方法を用いて得た。また、参考例６に
おいて得たプラスミドpPE3のDNA5μｇをそれぞれ10ユニ
ットずつのNco I及びHind IIIにより二重消化して約1.1
KbDNA断片を得た。これら３種類のDNA断片をフェノール
／クロロホルム抽出をくり返し、２倍量のエタノールで
沈澱することにより精製回収した。これら３種類のDNA
断片をT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌x1776に形
質転換した。得られた形質転換体をアルカリ溶菌法によ
る迅速単離法により調べ、プロウロキナーゼの完全な遺
伝子を含むプラスミドpKYU22を有するクローンを得た。
このクローンエシェリシヤ・コリ（Escherichia acol
i）x1776/pKYU22は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第8041号（FERMP−8041）として寄託され、1
986年１月22日に微工研条寄第968号（FERM BP−968）と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。
ミドpKYU21のDNA5μｇをそれぞれ10ユニットずつの制限
酵素Bgl II及びHind IIIにより二重消化し、約5.7KbのD
NA断片と、同プラスミドpKYU21のDNAをそれぞれ10ユニ
ットずつのBgl II及びNco Iにより二重消化し、66bpのD
NA断片とを慣用の方法を用いて得た。また、参考例６に
おいて得たプラスミドpPE3のDNA5μｇをそれぞれ10ユニ
ットずつのNco I及びHind IIIにより二重消化して約1.1
KbDNA断片を得た。これら３種類のDNA断片をフェノール
／クロロホルム抽出をくり返し、２倍量のエタノールで
沈澱することにより精製回収した。これら３種類のDNA
断片をT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌x1776に形
質転換した。得られた形質転換体をアルカリ溶菌法によ
る迅速単離法により調べ、プロウロキナーゼの完全な遺
伝子を含むプラスミドpKYU22を有するクローンを得た。
このクローンエシェリシヤ・コリ（Escherichia acol
i）x1776/pKYU22は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第8041号（FERMP−8041）として寄託され、1
986年１月22日に微工研条寄第968号（FERM BP−968）と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。
参考例11.プラスミドpKYU22の挿入部の塩基配列の決定 プラスミドpKYU22の挿入部の塩基配列を、マキサム−
ギルバード法、及びM13mp8にサブクローン化した後のチ
ェインターミネーション法により決定した。この結果を
第２−１図〜第２−３図に示す。これらの図から明らか
なように、この挿入部は、66bpの５′の非翻訳領域、AT
G（Met）−GGC（Gly）のリーダー配列、AGC（Ser）−CT
C（Leu）プロウロキナーゼコード領域、TGA（XXX）翻訳
終止シグナル、及びその下流の３′非翻訳領域からな
る。
ギルバード法、及びM13mp8にサブクローン化した後のチ
ェインターミネーション法により決定した。この結果を
第２−１図〜第２−３図に示す。これらの図から明らか
なように、この挿入部は、66bpの５′の非翻訳領域、AT
G（Met）−GGC（Gly）のリーダー配列、AGC（Ser）−CT
C（Leu）プロウロキナーゼコード領域、TGA（XXX）翻訳
終止シグナル、及びその下流の３′非翻訳領域からな
る。
参考例12.5′端を変形したプロウロキナーゼ遺伝子の合
成（第８図） 次に、プロウロキナーゼの５′側コード領域における
天然cDNAのコドンを大腸菌中で高頻度で使用され、シュ
ードモナス由来のC230の遺伝子のSD配列のもとで大腸菌
中で効率よく発現されるように置き換え、且つプロウロ
キナーゼが直接発現されるようにプロウロキナーゼの第
１アミノ酸（Ser）のコドンAGCに隣接してその上流に翻
訳開始コドンATG（Met）を設け、さらにこのコード領域
を発現ベクターのSD配列の近傍に連結するために制御酵
素認識部位Aast IIを設ける。このために、第８図に示
す二重鎖DNAオリゴマーをホスホトリエステル法により
合成する。この合成二重鎖DNAは一端にベクターに挿入
するためのAat II部位が用意されており、そして他端に
切断されたプロウロキナーゼ遺伝子に連結するためのTa
q I部位を有する。
成（第８図） 次に、プロウロキナーゼの５′側コード領域における
天然cDNAのコドンを大腸菌中で高頻度で使用され、シュ
ードモナス由来のC230の遺伝子のSD配列のもとで大腸菌
中で効率よく発現されるように置き換え、且つプロウロ
キナーゼが直接発現されるようにプロウロキナーゼの第
１アミノ酸（Ser）のコドンAGCに隣接してその上流に翻
訳開始コドンATG（Met）を設け、さらにこのコード領域
を発現ベクターのSD配列の近傍に連結するために制御酵
素認識部位Aast IIを設ける。このために、第８図に示
す二重鎖DNAオリゴマーをホスホトリエステル法により
合成する。この合成二重鎖DNAは一端にベクターに挿入
するためのAat II部位が用意されており、そして他端に
切断されたプロウロキナーゼ遺伝子に連結するためのTa
q I部位を有する。
下記の、29塩基、15塩基及び20塩基からなる３種類の
端鎖DNAオリゴマーをホスホトリエステル法により合成
した。
端鎖DNAオリゴマーをホスホトリエステル法により合成
した。
次に、これら３種類の合成DNAオリゴマー１μｇずつ
を95℃にて２分間加熱処理した後、T4ポリヌクレオチド
キナーゼにより５′端燐酸化し、セップバック（C18）
カラム（Waters製造）により精製し、乾燥した後、20mM
Tris−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2の溶液50μに溶解
し、95℃にて２分間加熱した後室温まで徐冷し、12℃に
て一晩保持することによってアニールし、下記に示す二
重鎖DNAを得た。
を95℃にて２分間加熱処理した後、T4ポリヌクレオチド
キナーゼにより５′端燐酸化し、セップバック（C18）
カラム（Waters製造）により精製し、乾燥した後、20mM
Tris−HCl（pH7.6）、10mM MgCl2の溶液50μに溶解
し、95℃にて２分間加熱した後室温まで徐冷し、12℃に
て一晩保持することによってアニールし、下記に示す二
重鎖DNAを得た。
一方、プラスミドpKYU22のDNA5μｇを制限酵素Bgl II
及びAat IIにより二重消化し、約5.7KbのDNA断片と、同
じプラスミドpKYU22のDNA5μｇを制限酵素Pst I及びBgl
IIにより二重消化して得た約400bpのDNA断片をさらに
制限酵素Taq Iで消化して得た約260bpのDNA断片とを慣
用の方法を用いて回収した。これら２種類のDNA断片は
フェノール／クロロホルム抽出および２倍量のエタノー
ルで沈澱させることにより精製回収した。
及びAat IIにより二重消化し、約5.7KbのDNA断片と、同
じプラスミドpKYU22のDNA5μｇを制限酵素Pst I及びBgl
IIにより二重消化して得た約400bpのDNA断片をさらに
制限酵素Taq Iで消化して得た約260bpのDNA断片とを慣
用の方法を用いて回収した。これら２種類のDNA断片は
フェノール／クロロホルム抽出および２倍量のエタノー
ルで沈澱させることにより精製回収した。
これら２種類のDNA断片と、前記の合成二重鎖DNAオリ
ゴマーとをT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌x1776
に形質転換した。形質転換体をアルカリ溶菌法による迅
速単離法により調べ、変形された高分子ウロキナーゼ遺
伝子を含有するプラスミドpKMU1を有するクローン大腸
菌x1776（pKMU1）を得た。
ゴマーとをT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌x1776
に形質転換した。形質転換体をアルカリ溶菌法による迅
速単離法により調べ、変形された高分子ウロキナーゼ遺
伝子を含有するプラスミドpKMU1を有するクローン大腸
菌x1776（pKMU1）を得た。
このプラスミドpKMU1が導入された大腸菌エシェリシ
ャ・コリ（Escherichia coli）x1776/pKMU1は工業技術
院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第8040号（FERM
P−8040）として寄託されている。
ャ・コリ（Escherichia coli）x1776/pKMU1は工業技術
院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第8040号（FERM
P−8040）として寄託されている。
参考例13.プラスミドpMUT4Lの作成（第９図） ヒト−プロウロキナーゼをコードする遺伝子を含む前
記のプラスミドpKMU1と発現用プラスミドpTCM1とから、
点突然変異を有しないヒト−プロウロキナーゼ遺伝子を
含有する発現プラスミドpMUT4Lを作成する。前記プラス
ミドpTCM1はエシェリシャ・コリJM103に導入され、この
大腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103
/pTCM1は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌
寄第7779号（FERMP−7779）として寄託されている。
記のプラスミドpKMU1と発現用プラスミドpTCM1とから、
点突然変異を有しないヒト−プロウロキナーゼ遺伝子を
含有する発現プラスミドpMUT4Lを作成する。前記プラス
ミドpTCM1はエシェリシャ・コリJM103に導入され、この
大腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103
/pTCM1は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌
寄第7779号（FERMP−7779）として寄託されている。
５μｇのプラスミドpKMU1を制限酵素Aat II10ユニッ
トにより消化し、子牛消化管ホスファターゼ（CIP）で
処理し、単離した。他方、５μｇのプラスミドpTCM1を
制限酵素AatII10ユニットにより消化し、電気溶出法に
より約500bpのDNA断片を単離した。これら２種類のDNA
断片はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール
沈澱を繰り返すことによって精製回収した。
トにより消化し、子牛消化管ホスファターゼ（CIP）で
処理し、単離した。他方、５μｇのプラスミドpTCM1を
制限酵素AatII10ユニットにより消化し、電気溶出法に
より約500bpのDNA断片を単離した。これら２種類のDNA
断片はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール
沈澱を繰り返すことによって精製回収した。
両者をT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌JM103に
形質転換した。形質転換体をアルカリ溶菌法による迅速
単離法によって調べ、tacプロモータ／オペレータ及びC
230SD配列がプロウロキナーゼ遺伝子に対して正方向に
入ったプラスミドpMUT1Lを有するクローンを得た。
形質転換した。形質転換体をアルカリ溶菌法による迅速
単離法によって調べ、tacプロモータ／オペレータ及びC
230SD配列がプロウロキナーゼ遺伝子に対して正方向に
入ったプラスミドpMUT1Lを有するクローンを得た。
次にプラスミドpKK223−３（文献17,18および19）５
μｇを制限酵素Hind III10ユニットで消化し、子牛消化
管ホススァターゼ（P.L.Biochemicals）で処理した。
μｇを制限酵素Hind III10ユニットで消化し、子牛消化
管ホススァターゼ（P.L.Biochemicals）で処理した。
一方、前記のようにして得た１μｇのプラスミドpMUT
1Lを４ユニットの制限酵素Dra Iで消化し、この消化断
片と５′端燐酸化したHind III、リンカー（dCAAGCTTG1
μｇとをT4 DNAリガーゼにより連結し、次に12ユニット
の制限酵素Hind IIIで消化し、0.15M NaCl溶液とし、等
容量のフェノール／クロロホルムて抽出後、これに２倍
容量のエタノールを加えてDNAを沈澱せしめ、16000rp
m、４℃にて達して沈澱物を集め、これを乾燥した。
1Lを４ユニットの制限酵素Dra Iで消化し、この消化断
片と５′端燐酸化したHind III、リンカー（dCAAGCTTG1
μｇとをT4 DNAリガーゼにより連結し、次に12ユニット
の制限酵素Hind IIIで消化し、0.15M NaCl溶液とし、等
容量のフェノール／クロロホルムて抽出後、これに２倍
容量のエタノールを加えてDNAを沈澱せしめ、16000rp
m、４℃にて達して沈澱物を集め、これを乾燥した。
このpMUT1L消化断片と、前記のpKK223−３のHind III
消化断片とをT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌JM10
3を形質転換した。これらの形質転換菌をアルカリ溶菌
法による迅速単離法により調べ、プラスミドpMUT2Lを含
むクローンエシェリシャ・コリ（Escherichia coli）J
M103/pMUT2Lを得た。
消化断片とをT4 DNAリガーゼにより連結し、大腸菌JM10
3を形質転換した。これらの形質転換菌をアルカリ溶菌
法による迅速単離法により調べ、プラスミドpMUT2Lを含
むクローンエシェリシャ・コリ（Escherichia coli）J
M103/pMUT2Lを得た。
５μｇのプラスミドpMUT2Lを、10ユニットずつの制限
酵素Sph I及びTth III Iにより消化し、フェノール／ク
ロロホルム抽出後、エタノールで沈澱せしめ、回収した
DNAを0.1mMのdGTP、dCTP、dATP及びTTPの存在下でT4ポ
リメラーゼを用いて末端を平滑化し、T4 DNAリガーゼに
より再環化した。これを大腸菌JM103に形質転換し、50
μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天培地上にコロニ
ーを形成せしめ、アルカリ溶菌法による迅速単離法（文
献10）で調べ、プラスミドpMUT4Lを含むクローンエシェ
リシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pMUT4Lを得
た。
酵素Sph I及びTth III Iにより消化し、フェノール／ク
ロロホルム抽出後、エタノールで沈澱せしめ、回収した
DNAを0.1mMのdGTP、dCTP、dATP及びTTPの存在下でT4ポ
リメラーゼを用いて末端を平滑化し、T4 DNAリガーゼに
より再環化した。これを大腸菌JM103に形質転換し、50
μg/mlのアンピシリンを含有するLB寒天培地上にコロニ
ーを形成せしめ、アルカリ溶菌法による迅速単離法（文
献10）で調べ、プラスミドpMUT4Lを含むクローンエシェ
リシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/pMUT4Lを得
た。
参考例14.M13ファージを用いる特異的塩基置換変異の導
入 （１）１本鎖鋳型DNAの調製（第10図） プラスミドpKYU22及びファージM13mp8二本鎖DNAそれ
ぞれ１μｇずつを、10mM Tris−HCl（pH7.5）、7mM MgC
l2、7mMβ−メルカプトエタノール及び50mM NaClを含有
する溶液20μ中で５ユニットのPst Iを用いて37℃に
て１時間消化した。フェノール処理、エタノール沈澱に
よってそれぞれのDNA断片を回収した。両者を混合した
後、66mM Tris−HCl（pH7.5）、5mM MgCl2、5mM DTT及
び1mM ATPを含有する溶液20μ中で100ユニットのT4 D
NAリガーゼを用いて12℃にて16時間連結反応を行った。
反応後、反応液を用いてメッシング等の方法（文献19）
に従って大腸菌JM103を形質転換し、0.02％Ｘ−Gal及び
1mMIPTGを含有する寒天と共にプレートし、37℃にて一
晩培養した。組換え体によって形成された白いプラーク
より一本鎖DNAを調製した。
入 （１）１本鎖鋳型DNAの調製（第10図） プラスミドpKYU22及びファージM13mp8二本鎖DNAそれ
ぞれ１μｇずつを、10mM Tris−HCl（pH7.5）、7mM MgC
l2、7mMβ−メルカプトエタノール及び50mM NaClを含有
する溶液20μ中で５ユニットのPst Iを用いて37℃に
て１時間消化した。フェノール処理、エタノール沈澱に
よってそれぞれのDNA断片を回収した。両者を混合した
後、66mM Tris−HCl（pH7.5）、5mM MgCl2、5mM DTT及
び1mM ATPを含有する溶液20μ中で100ユニットのT4 D
NAリガーゼを用いて12℃にて16時間連結反応を行った。
反応後、反応液を用いてメッシング等の方法（文献19）
に従って大腸菌JM103を形質転換し、0.02％Ｘ−Gal及び
1mMIPTGを含有する寒天と共にプレートし、37℃にて一
晩培養した。組換え体によって形成された白いプラーク
より一本鎖DNAを調製した。
得れれた一本鎖DNAのいくつかを鋳型としてメッシン
グらの方法（文献20）に従ってジデオキシ法により塩基
配列を決定し、クローニングされた一本鎖DNAの配列を
確認した。第11図に示すようにコーティング鎖及びアン
チコーディング鎖が得られた。
グらの方法（文献20）に従ってジデオキシ法により塩基
配列を決定し、クローニングされた一本鎖DNAの配列を
確認した。第11図に示すようにコーティング鎖及びアン
チコーディング鎖が得られた。
（２）特異的塩基置換変異の導入（第11図） 前記のようにして得た組換え体M13ファージ一本鎖DNA
（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコーディング鎖がクロー
ニングされている。）を鋳型として新たなオリゴヌクレ
オチド変異剤による部位特異的変異導入をおこなった。
但し、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオチド ５′ GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を用いた。この18塩基のオリゴヌクレオチドは一本鎖鋳
型DNA中のウロキナーゼ遺伝子と相補的であるがフェニ
ルアラニンコドンTTTがアスパラギン酸コドンGATへと二
塩基が変化している。
（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコーディング鎖がクロー
ニングされている。）を鋳型として新たなオリゴヌクレ
オチド変異剤による部位特異的変異導入をおこなった。
但し、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオチド ５′ GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を用いた。この18塩基のオリゴヌクレオチドは一本鎖鋳
型DNA中のウロキナーゼ遺伝子と相補的であるがフェニ
ルアラニンコドンTTTがアスパラギン酸コドンGATへと二
塩基が変化している。
このオリゴヌクレオチドをプライマーとして試験管内
で二本鎖DNAを合成した。すなわち、鋳型一本鎖DNA0.5p
moleに５′末端をリン酸化したプライマー2pmoleを加
え、そして7mM Tris−HCl（pH7.5）、0.1mMEDTA、20mM
NaCl及び7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で、60℃に
て20分間インキュベートし、続いて23℃にて20分間イン
キュベートした。さらにこの反応混合物にdATP,dGTP,dT
TP、及びdCTPをそれぞれ0.5mMになるように加え、全体
を20μとしてDNAポリメラーゼKIenow断片２ユニット
を加え、そして23℃にて20分間インキュベートした。続
いて10mM ATPを１μ及びT4 DNAリガーゼ１ユニットを
加え、12℃にて一晩インキュベートした。上記反応液を
直接、メッシング等の方法（文献20）に従って大腸菌JM
103に形質転換した。このようにして上記反応液１μ
当たり約１万個のファージプラークが得らた。
で二本鎖DNAを合成した。すなわち、鋳型一本鎖DNA0.5p
moleに５′末端をリン酸化したプライマー2pmoleを加
え、そして7mM Tris−HCl（pH7.5）、0.1mMEDTA、20mM
NaCl及び7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で、60℃に
て20分間インキュベートし、続いて23℃にて20分間イン
キュベートした。さらにこの反応混合物にdATP,dGTP,dT
TP、及びdCTPをそれぞれ0.5mMになるように加え、全体
を20μとしてDNAポリメラーゼKIenow断片２ユニット
を加え、そして23℃にて20分間インキュベートした。続
いて10mM ATPを１μ及びT4 DNAリガーゼ１ユニットを
加え、12℃にて一晩インキュベートした。上記反応液を
直接、メッシング等の方法（文献20）に従って大腸菌JM
103に形質転換した。このようにして上記反応液１μ
当たり約１万個のファージプラークが得らた。
得られたプラークを軟寒天培地からベントン・デイビ
ス等の方法（文献21）に従ってニトロセルロースフィル
ターに移したのち、真空中80℃にて２時間ベーキングし
た。このニトロセルロースフィルターを６×SSC、10×D
enhardt溶液中で32Pで標識したプライマーオリゴヌクレ
オチドをプローブとして37℃にて一晩ハンブリダイゼー
ションを行った。次にこのフィルターを６×SSC中で52
℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフィーを行い陽
性シグナルを示す変異体ファージプラークを単離した。
この変異体ファージから変異体２本鎖ファージDNA（pm
3）を得た。変異体DNAの塩基配列は、変異体ファージDN
Aを鋳型とするジデオキシ法により塩基配列を決定し、
目的とする一塩基置換変異が生じたことを確認した。
ス等の方法（文献21）に従ってニトロセルロースフィル
ターに移したのち、真空中80℃にて２時間ベーキングし
た。このニトロセルロースフィルターを６×SSC、10×D
enhardt溶液中で32Pで標識したプライマーオリゴヌクレ
オチドをプローブとして37℃にて一晩ハンブリダイゼー
ションを行った。次にこのフィルターを６×SSC中で52
℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフィーを行い陽
性シグナルを示す変異体ファージプラークを単離した。
この変異体ファージから変異体２本鎖ファージDNA（pm
3）を得た。変異体DNAの塩基配列は、変異体ファージDN
Aを鋳型とするジデオキシ法により塩基配列を決定し、
目的とする一塩基置換変異が生じたことを確認した。
なお、前記の段階（２）において、変異剤として次の
オリゴヌクレオチド： ５′ GGCCCCGCGAAAAGATTA 3′ を用いて、157番目のアミノ酸フェニルラニンのコドンT
TTをグルタミン酸のコドンGAAに置き換えることもでき
る。
オリゴヌクレオチド： ５′ GGCCCCGCGAAAAGATTA 3′ を用いて、157番目のアミノ酸フェニルラニンのコドンT
TTをグルタミン酸のコドンGAAに置き換えることもでき
る。
参考例15.プラスミドpMUT4Lpm3の作製（第12図） 大腸菌tacプロモーターの下流に上記点突然変異を有
するヒトウロキナーゼ構造遺伝子を挿入した発現型プラ
スミドpMUT4Lpm3を以下のようにして作製した。
するヒトウロキナーゼ構造遺伝子を挿入した発現型プラ
スミドpMUT4Lpm3を以下のようにして作製した。
10μｇの変異体M13二本鎖DNA（pm3）をPst Iにより完
全消化し、約1.2Kb断片を単離した。一方、10μｇのプ
ラスミドpMUT4LをPst Iにより部分消化し、約1.2Kb断片
のみが除去された約4.6Kbpの断片を単離した。
全消化し、約1.2Kb断片を単離した。一方、10μｇのプ
ラスミドpMUT4LをPst Iにより部分消化し、約1.2Kb断片
のみが除去された約4.6Kbpの断片を単離した。
これらのそれぞれをフェノール処理およびエタノール
沈澱により回収した後混合し、T4 DNAリガーゼを用いて
12℃にて一晩連結反応を行い、反応混合物を用いて大腸
菌HB101を形質転換し、形成されたコロニーをアルカリ
溶菌法による迅速単離法によりスクリーニングし、pMUT
4Lpm3を含むクローンを得た。この大腸菌は、その取扱
にP2レベルの設備を必要とし工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託することはできない。このため、プラスミ
ドpMUT4Lpm3が導入された大腸菌エシェリシャ・コリ（E
scherichia coli）x1776/pMU4Lpm3が工業技術院微生物
工業技術研究所に．微工研菌寄第8341号（FERMP−834
1）として寄託され、1986年１月22日に微工研条寄第971
号（FERMBP−971）としてブタペスト条約に基く国際寄
託に移管された。
沈澱により回収した後混合し、T4 DNAリガーゼを用いて
12℃にて一晩連結反応を行い、反応混合物を用いて大腸
菌HB101を形質転換し、形成されたコロニーをアルカリ
溶菌法による迅速単離法によりスクリーニングし、pMUT
4Lpm3を含むクローンを得た。この大腸菌は、その取扱
にP2レベルの設備を必要とし工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託することはできない。このため、プラスミ
ドpMUT4Lpm3が導入された大腸菌エシェリシャ・コリ（E
scherichia coli）x1776/pMU4Lpm3が工業技術院微生物
工業技術研究所に．微工研菌寄第8341号（FERMP−834
1）として寄託され、1986年１月22日に微工研条寄第971
号（FERMBP−971）としてブタペスト条約に基く国際寄
託に移管された。
参考例16.pMUT4Lpm1の作製 参考例14と同様の方法により、但しプライマーとして
次の合成ヌクレオチド： ５′ GATGGACAAAAGCCC 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグルタミンの
コドンCAAに変異しているDNA断片が挿入された変異２本
鎖型ファージM13RFpm1を得た。変異体DNAの塩基配列
は、変異体ファージDNAを鋳型とするジデオキシ法によ
り塩基配列を決定し、目的とする一塩基置換変異が生じ
たことを確認した。
次の合成ヌクレオチド： ５′ GATGGACAAAAGCCC 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグルタミンの
コドンCAAに変異しているDNA断片が挿入された変異２本
鎖型ファージM13RFpm1を得た。変異体DNAの塩基配列
は、変異体ファージDNAを鋳型とするジデオキシ法によ
り塩基配列を決定し、目的とする一塩基置換変異が生じ
たことを確認した。
次に、このM13RFpm1とpMUT4Lとから、参考例15に記載
した方法と同様にしてpMUT4Lpm1を得た。
した方法と同様にしてpMUT4Lpm1を得た。
参考例17.pMUT4Lpm4の作製 参考例14と同様の方法により、但しプライマーとして
次の合成オリゴヌクレオチド： ５′ GATGGACAAAAGCCC 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグルタミンの
コドンCAAに変異しているDNA断片が挿入された変異２本
鎖型ファージを得た。
次の合成オリゴヌクレオチド： ５′ GATGGACAAAAGCCC 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグルタミンの
コドンCAAに変異しているDNA断片が挿入された変異２本
鎖型ファージを得た。
次にこのファージから、実施例14に記載されている方
法と同様にして１本鎖ファージDNAを得、上記と同様に
して、但し、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオ
チド： ５′ GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を使用して、157位のフェニルアラニンのコドンTTTをア
スパラギン酸のコドンGATに変異させることにより、135
位のリジンのコドンAAAがグルタミンのコドンCAAに変異
しており、且つ157位のフェニルアラニンのコドンTTTが
アスパラギン酸のコドンGATに変異しているDNA断片が挿
入された変異２本鎖ファージM13RFpm4を得た。
法と同様にして１本鎖ファージDNAを得、上記と同様に
して、但し、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオ
チド： ５′ GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を使用して、157位のフェニルアラニンのコドンTTTをア
スパラギン酸のコドンGATに変異させることにより、135
位のリジンのコドンAAAがグルタミンのコドンCAAに変異
しており、且つ157位のフェニルアラニンのコドンTTTが
アスパラギン酸のコドンGATに変異しているDNA断片が挿
入された変異２本鎖ファージM13RFpm4を得た。
次に、このM13RFpm4とpMUT4Lとから、参考例15に記載
した方法と同様にしてプラスミドpMUT4Lpm4を得た。
した方法と同様にしてプラスミドpMUT4Lpm4を得た。
参考例18.pMUT9Lpm1の作製（第19図） 参考例13で作製したプラスミドpMUT4L 5μｇを緩衝液
（10mM Tris−CHl pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM
β−メルカプトエタノール）100μ中、50ユニットの
Sca I及び100ユニットのAat IIと37℃で６時間反応させ
た。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動にか
け、約5500塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。一方同じプラスミドpMUT4L 10μｇを緩衝液（10mM
Tris−HCl pH7.5、7mM MgCl2、60mM KCl、7mM β−メル
カプトエタノール）100μ中、50ユニットのAat II及
び50ユニットのSma Iと37℃で６時間反応させた。この
反応液を2.0％アガロースゲル電気泳動にかけ、55塩基
対のDNA断片を慣用手段により回収した。このようにし
て得られた２つのDNA断片を緩衝液（66mM Tris−HCl pH
7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP）10μ中でT4
DNAリガーゼ５ユニットと12℃で15時間反応させた。こ
の反応液を用いて、エシェリシア・コリJM103を慣用の
方法で形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第19図
に示したプラスミドpMUT8Lをもつコロニーをスクリーニ
ングし、慣用手段によりプラスミドを単離した。
（10mM Tris−CHl pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM
β−メルカプトエタノール）100μ中、50ユニットの
Sca I及び100ユニットのAat IIと37℃で６時間反応させ
た。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動にか
け、約5500塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。一方同じプラスミドpMUT4L 10μｇを緩衝液（10mM
Tris−HCl pH7.5、7mM MgCl2、60mM KCl、7mM β−メル
カプトエタノール）100μ中、50ユニットのAat II及
び50ユニットのSma Iと37℃で６時間反応させた。この
反応液を2.0％アガロースゲル電気泳動にかけ、55塩基
対のDNA断片を慣用手段により回収した。このようにし
て得られた２つのDNA断片を緩衝液（66mM Tris−HCl pH
7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP）10μ中でT4
DNAリガーゼ５ユニットと12℃で15時間反応させた。こ
の反応液を用いて、エシェリシア・コリJM103を慣用の
方法で形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第19図
に示したプラスミドpMUT8Lをもつコロニーをスクリーニ
ングし、慣用手段によりプラスミドを単離した。
このようにして得られたプラスミドpMUT8L 5μｇを緩
衝液（10mM Tris−HCl pH7.5、7mM MgCl2、60mM NaCl）
100μ中、50ユニットのHind IIIと37℃で２時間反応
させた。フェノール処理後、エタノール沈澱を行い、こ
の沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgC
l2、0.1mM DTT、80μM dNTP）20μ中、Klenow断片１
ユニットと22℃で30分間反応させた。フェノール処理
後、エタノール沈澱し、沈澱物を１μｇのpPst Iリンカ
ーを含む緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgC
l2、10mM DTT、1M ATP）20μ、T4 DNAリガーゼ５ユニ
ットと12℃で２時間反応させた。フェノール処理後、エ
タノール沈澱し、沈澱物を緩緩液（20mM Tris−HCl pH
7.5、10mM MgCl2、100mM NaCl）100μ中50のユニット
のPst Iと37℃で２時間反応させた。この反応液を0.7％
アガロースゲル電気泳動にかけ約3500塩基対のDNA断片
を慣用手段により回収した。
衝液（10mM Tris−HCl pH7.5、7mM MgCl2、60mM NaCl）
100μ中、50ユニットのHind IIIと37℃で２時間反応
させた。フェノール処理後、エタノール沈澱を行い、こ
の沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgC
l2、0.1mM DTT、80μM dNTP）20μ中、Klenow断片１
ユニットと22℃で30分間反応させた。フェノール処理
後、エタノール沈澱し、沈澱物を１μｇのpPst Iリンカ
ーを含む緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgC
l2、10mM DTT、1M ATP）20μ、T4 DNAリガーゼ５ユニ
ットと12℃で２時間反応させた。フェノール処理後、エ
タノール沈澱し、沈澱物を緩緩液（20mM Tris−HCl pH
7.5、10mM MgCl2、100mM NaCl）100μ中50のユニット
のPst Iと37℃で２時間反応させた。この反応液を0.7％
アガロースゲル電気泳動にかけ約3500塩基対のDNA断片
を慣用手段により回収した。
一方、参考例16で作製したプラスミドpMU4Lpm1 5μｇ
を緩衝液（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100mM
NaCl）100μ中50ユニットのPst Iと37℃で２時間反
応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約1200塩基対のDNA断片を慣用手段により回収
した。
を緩衝液（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100mM
NaCl）100μ中50ユニットのPst Iと37℃で２時間反
応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約1200塩基対のDNA断片を慣用手段により回収
した。
上記の方法で得た２種類のDNA断片を混合し、緩衝液
（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、10m
M ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガーゼと12℃で1
5時間反応させた。この反応液を用いてエシェリシア・
コリJM103を慣用の方法で形質転換し、アンピシリン耐
性菌の中から第19図に示したプラスミドpMUT9Lpm1をも
つコロニーをスクリーニングし、慣用手段によりプラス
ミドpMUT9Lpm1を単離した。
（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、10m
M ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガーゼと12℃で1
5時間反応させた。この反応液を用いてエシェリシア・
コリJM103を慣用の方法で形質転換し、アンピシリン耐
性菌の中から第19図に示したプラスミドpMUT9Lpm1をも
つコロニーをスクリーニングし、慣用手段によりプラス
ミドpMUT9Lpm1を単離した。
実施例1.プラスミドpDPAT2の作製 pDPA3プラスミド50μｇを緩衝液（10mM Tris−HCl pH
7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエタ
ノール）200μ中、75ユニットのBgl IIと37℃で４時
間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（50
mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM DTT、80μM d
NTP）50μ中、クレノウ断片５ユニットと22℃30分間
反応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳
動にかけ約1800塩基対のDNA断片を慣用手段により回収
した。このDNA断片をDNA断片〔Ａ〕とする。
7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエタ
ノール）200μ中、75ユニットのBgl IIと37℃で４時
間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（50
mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM DTT、80μM d
NTP）50μ中、クレノウ断片５ユニットと22℃30分間
反応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳
動にかけ約1800塩基対のDNA断片を慣用手段により回収
した。このDNA断片をDNA断片〔Ａ〕とする。
一方、10μｇのpYTU3を緩衝液（10mM Tris−HCl pH7.
5、7mM MgCl2、150mM NaCl、0.2mM EDTA、7mM β−メル
カプトエタノール）50μ中、20ユニットのSal Iと37
℃４時間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝
液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM DTT、8
0μM dNTP）20μ中クレノウ断片２ユニットと22℃30
分間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（50mM Tris−HCl pH9.0、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、1m
Mスペルミジン）20μ中、アルカリホスファターゼ
（ウシ腸）１ユニットと37℃で30分間反応させた。フェ
ノール処理後、エタノール沈澱させた。沈澱物を100mM
Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA溶液20μに溶解した。こ
の溶液には、１μあたり0.5μｇのDNAが含まれてい
る。このDNA5μｇと前述のDNA断片〔Ａ〕５μｇを緩衝
液（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、1
mMATP）30μ中、T4DNAリガーゼ10ユニットと15℃で15
時間反応たせた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（6mM Tris−HCl pH7.9、6mM MgCl2、50mM NaCl）30μ
中、Cla I15ユニットと37℃で４時間反応させた。エ
タノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl pH
8.0、7mM MgCl2、100mM NaCl、2mM β−メルカプトエタ
ノール）30μ中15ユニットのBamH Iと37℃で４時間反
応させた。このDNA反応液をエタノール沈澱後、沈澱物
を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM
DTT、80μＭ、dNTP）30μ中のクレノウ断片２ユニッ
トと22℃30分間反応させた。この反応液を0.7％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ約2000塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｂ〕とす
る。
5、7mM MgCl2、150mM NaCl、0.2mM EDTA、7mM β−メル
カプトエタノール）50μ中、20ユニットのSal Iと37
℃４時間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝
液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM DTT、8
0μM dNTP）20μ中クレノウ断片２ユニットと22℃30
分間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（50mM Tris−HCl pH9.0、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、1m
Mスペルミジン）20μ中、アルカリホスファターゼ
（ウシ腸）１ユニットと37℃で30分間反応させた。フェ
ノール処理後、エタノール沈澱させた。沈澱物を100mM
Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA溶液20μに溶解した。こ
の溶液には、１μあたり0.5μｇのDNAが含まれてい
る。このDNA5μｇと前述のDNA断片〔Ａ〕５μｇを緩衝
液（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、1
mMATP）30μ中、T4DNAリガーゼ10ユニットと15℃で15
時間反応たせた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（6mM Tris−HCl pH7.9、6mM MgCl2、50mM NaCl）30μ
中、Cla I15ユニットと37℃で４時間反応させた。エ
タノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl pH
8.0、7mM MgCl2、100mM NaCl、2mM β−メルカプトエタ
ノール）30μ中15ユニットのBamH Iと37℃で４時間反
応させた。このDNA反応液をエタノール沈澱後、沈澱物
を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM
DTT、80μＭ、dNTP）30μ中のクレノウ断片２ユニッ
トと22℃30分間反応させた。この反応液を0.7％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ約2000塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｂ〕とす
る。
一方、２μｇのpK12プラスミドを緩衝液（10mM Tris
−HCl pH7.5、7mM MgCl2、150mM NaCl、0.2mMEDTA、7mM
β−メルカプトエタノール）20μ中、10ユニットのS
al Iと37℃で４時間反応させた。エタノール沈澱後、沈
澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.
1mM DTT、80μM dNTP）20μ中、クレノウ断片２ユニ
ットと22℃にて30分間反応させた。エタノール沈澱後、
沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH9.0、1mM MgCl2、
0.1mM ZnCl2、1mMスペルミジン）20μ中、アルカリホ
スファターゼ（ウシ腸）１ユニットと37℃で30分間反応
させた。フェノール処理後エタノール沈澱させた。沈澱
物を10mM Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA溶液20μ中に溶
解した。この溶液には１μあたり0.1μｇのDNAが含ま
れている。このDNA1μｇと前述のDNA断片〔Ｂ〕１μｇ
を緩衝液（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM
DTT、1mM ATP）20μ中T4DNAリガーゼ1.5ユニットと15
℃で15時間反応させた。この反応液を用いて、エシェリ
シャ・コリJM103を慣用の方法で形質転換し、アンピシ
リン耐性菌の中から第13図に示したpDPAT2プラスミドを
もつコロニーをスクリーニングし、慣用手段によりプラ
スミドを単離した。
−HCl pH7.5、7mM MgCl2、150mM NaCl、0.2mMEDTA、7mM
β−メルカプトエタノール）20μ中、10ユニットのS
al Iと37℃で４時間反応させた。エタノール沈澱後、沈
澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.2、10mM MgCl2、0.
1mM DTT、80μM dNTP）20μ中、クレノウ断片２ユニ
ットと22℃にて30分間反応させた。エタノール沈澱後、
沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH9.0、1mM MgCl2、
0.1mM ZnCl2、1mMスペルミジン）20μ中、アルカリホ
スファターゼ（ウシ腸）１ユニットと37℃で30分間反応
させた。フェノール処理後エタノール沈澱させた。沈澱
物を10mM Tris−HCl pH7.5、1mM EDTA溶液20μ中に溶
解した。この溶液には１μあたり0.1μｇのDNAが含ま
れている。このDNA1μｇと前述のDNA断片〔Ｂ〕１μｇ
を緩衝液（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM
DTT、1mM ATP）20μ中T4DNAリガーゼ1.5ユニットと15
℃で15時間反応させた。この反応液を用いて、エシェリ
シャ・コリJM103を慣用の方法で形質転換し、アンピシ
リン耐性菌の中から第13図に示したpDPAT2プラスミドを
もつコロニーをスクリーニングし、慣用手段によりプラ
スミドを単離した。
実施例2.pHA00の作製（参考例） pPE3プラスミド（pMUT4Lと同一である）５μｇを緩衝
液（10mM Tris−HCl pH8.0、7mM MgCl2、150mM KCl、7m
M β−メルカプトエタノール）50μ中、10ユニットの
Pvu Iを加え、37℃で５時間反応させた。エタノール沈
澱後、沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.5、7mM Mg
Cl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノール）50
μ中、10ユニットのEcoR Iを加え、37℃で２時間反応
させた。この反応液を1.2％アガロースゲル電気泳動に
かけて、約2000塩基対のDNA断片を慣用手段により回収
した。回収したDNA断片をDNA断片〔Ａ〕とする。
液（10mM Tris−HCl pH8.0、7mM MgCl2、150mM KCl、7m
M β−メルカプトエタノール）50μ中、10ユニットの
Pvu Iを加え、37℃で５時間反応させた。エタノール沈
澱後、沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl pH7.5、7mM Mg
Cl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノール）50
μ中、10ユニットのEcoR Iを加え、37℃で２時間反応
させた。この反応液を1.2％アガロースゲル電気泳動に
かけて、約2000塩基対のDNA断片を慣用手段により回収
した。回収したDNA断片をDNA断片〔Ａ〕とする。
次に、pPE3プラスミド10μｇを緩衝液（10mM Tris−H
Cl、pH8.0、7mM MgCl2、150mM KCl、7mM β−メルカプ
トエタノール）50μ中15ユニットのPvu Iを加え37℃
で５時間反応させた。エタノール沈澱跡、沈澱物を緩衝
液（10mM Tris−HCl、pH8.0、7mM MgCl2、100mM NaCl、
2mM β−メルカプトエタノール）50μ中、15ユニット
のBamH Iと30℃で３時間反応させた。この反応液を1.2
％アガロースゲル電気泳動にかけて約2300塩基対のDNA
断片と約1346塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。回収した約2300塩基体のDNA断片をDNA断片〔Ｂ〕と
する。回収した約1346塩基対のDNA断片２μｇを緩衝液
（20mM Tris−HCl、pH8.5、7mM MgCl2、7mM β−メルカ
プトエタノール）30μ中、５ユニットのBal Iと37℃
で８時間反応させた。反応液を1.2％アガロースゲル電
気泳動にかけて慣用的手法により約750塩基対のDNA断片
をゲルより回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｃ〕とす
る。
Cl、pH8.0、7mM MgCl2、150mM KCl、7mM β−メルカプ
トエタノール）50μ中15ユニットのPvu Iを加え37℃
で５時間反応させた。エタノール沈澱跡、沈澱物を緩衝
液（10mM Tris−HCl、pH8.0、7mM MgCl2、100mM NaCl、
2mM β−メルカプトエタノール）50μ中、15ユニット
のBamH Iと30℃で３時間反応させた。この反応液を1.2
％アガロースゲル電気泳動にかけて約2300塩基対のDNA
断片と約1346塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。回収した約2300塩基体のDNA断片をDNA断片〔Ｂ〕と
する。回収した約1346塩基対のDNA断片２μｇを緩衝液
（20mM Tris−HCl、pH8.5、7mM MgCl2、7mM β−メルカ
プトエタノール）30μ中、５ユニットのBal Iと37℃
で８時間反応させた。反応液を1.2％アガロースゲル電
気泳動にかけて慣用的手法により約750塩基対のDNA断片
をゲルより回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｃ〕とす
る。
一方、実施例１で作製したpDPAT2プラスミド10μｇを
緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM Na
Cl、7mM β−メルカプトエタノール）100μ中15ユニ
ットのEcoR Iを加え37℃で３時間反応させた。この反応
液を1.2％アガロースゲル電気泳動にかけて約472塩基対
のDNA断片を慣用手段により回収した。回収したDNA断片
２μｇを緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、
60mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノール）50μ中
１ユニットのHae IIIを加え37℃で30分間反応させた。
この反応液を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて約181塩基対のDNA断片を慣用手段により回収した。
このDNA断片１μｇと前述のDNA断片〔Ｃ〕１μｇを緩衝
液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、
1mM ATP）20μ中、T4DNAリガーゼ１ユニットと15℃で
12時間反応させた。反応液を1.2％アガロースゲル電気
泳動にかけて約931塩基対のDNA断片を慣用手段により回
収した。このDNA断片１μｇと前述のDNA断片〔AS〕１μ
ｇおよびDNA断片〔Ｂ〕１μｇを緩衝液（66mM Tris−HC
l、pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP）20μ
中、T4DNAリガーゼ２ユニットと15℃で12時間反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌JM103を慣用の方法で形
質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第14図に示した
pHA00プラスミドをもつコロニーをスクリーニングし、
慣用手段によりプラスミドを単離した。
緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM Na
Cl、7mM β−メルカプトエタノール）100μ中15ユニ
ットのEcoR Iを加え37℃で３時間反応させた。この反応
液を1.2％アガロースゲル電気泳動にかけて約472塩基対
のDNA断片を慣用手段により回収した。回収したDNA断片
２μｇを緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、
60mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノール）50μ中
１ユニットのHae IIIを加え37℃で30分間反応させた。
この反応液を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けて約181塩基対のDNA断片を慣用手段により回収した。
このDNA断片１μｇと前述のDNA断片〔Ｃ〕１μｇを緩衝
液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、
1mM ATP）20μ中、T4DNAリガーゼ１ユニットと15℃で
12時間反応させた。反応液を1.2％アガロースゲル電気
泳動にかけて約931塩基対のDNA断片を慣用手段により回
収した。このDNA断片１μｇと前述のDNA断片〔AS〕１μ
ｇおよびDNA断片〔Ｂ〕１μｇを緩衝液（66mM Tris−HC
l、pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP）20μ
中、T4DNAリガーゼ２ユニットと15℃で12時間反応させ
た。この反応液を用いて大腸菌JM103を慣用の方法で形
質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第14図に示した
pHA00プラスミドをもつコロニーをスクリーニングし、
慣用手段によりプラスミドを単離した。
実施例3.pHA03の作製（参考例） 実施例２で示したpHA00の作製に用いたプラスミドpPE
3の代りにpPE3pm3プラスミド（pMUT4Lpm3と同一）を用
いて実施例２と全く同様な手段でpHA03プラスミドを作
製した（第14図）。
3の代りにpPE3pm3プラスミド（pMUT4Lpm3と同一）を用
いて実施例２と全く同様な手段でpHA03プラスミドを作
製した（第14図）。
実施例4.pHA20の作製 実施例２で作製したpHA00プラスミド５μｇを緩衝液
（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、50mM（NH4）2S
O4）20μ中、７ユニットのPst Iと37℃で４時間反応
させた。反応液をエタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7m
M β−メルカプトエタノール）20μ中、10ユニットの
Sca Iと37℃で８時間反応させた。この反応液を1.2％ア
ガロースゲル電気泳動にかけて約1100塩基対のDNA断片
を慣用手段により回収した。このDNA断片をDNA断片
〔Ａ〕とする。
（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、50mM（NH4）2S
O4）20μ中、７ユニットのPst Iと37℃で４時間反応
させた。反応液をエタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7m
M β−メルカプトエタノール）20μ中、10ユニットの
Sca Iと37℃で８時間反応させた。この反応液を1.2％ア
ガロースゲル電気泳動にかけて約1100塩基対のDNA断片
を慣用手段により回収した。このDNA断片をDNA断片
〔Ａ〕とする。
pHA00プラスミド５μｇを緩衝液（20mM Tris−HCl、p
H7.5、10mM MgCl2、50mM（NH4）2SO4）20μ中、７ユ
ニットのPst Iと37℃で４時間反応させた。反応液をエ
タノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl、pH
7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、9mM β−メルカプトエタ
ノール）20μ中10ユニットのEcoR Iと37℃で３時間反
応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を0.7％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約3500塩基対のDNA断片を慣用手
段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｂ〕とす
る。
H7.5、10mM MgCl2、50mM（NH4）2SO4）20μ中、７ユ
ニットのPst Iと37℃で４時間反応させた。反応液をエ
タノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl、pH
7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、9mM β−メルカプトエタ
ノール）20μ中10ユニットのEcoR Iと37℃で３時間反
応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を0.7％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約3500塩基対のDNA断片を慣用手
段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｂ〕とす
る。
一方、実施例１で作製したpDPAT2プラスミド15μｇを
緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM Na
Cl、7mM β−メルカプトエタノール）100μ中、20ユ
ニットのBgl IIと37℃で４時間反応させた。エタノール
沈澱後、沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM
MgCl2、125mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノール）
100μ中、25ユニットのSca Iと37℃で10時間反応させ
た。この反応液を1.2％アガロースゲル電気泳動にかけ
て約625塩基対のDNA断片を慣用手段により回収した。こ
のDNA断片をDNA断片〔Ｃ〕とする。
緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM Na
Cl、7mM β−メルカプトエタノール）100μ中、20ユ
ニットのBgl IIと37℃で４時間反応させた。エタノール
沈澱後、沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM
MgCl2、125mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノール）
100μ中、25ユニットのSca Iと37℃で10時間反応させ
た。この反応液を1.2％アガロースゲル電気泳動にかけ
て約625塩基対のDNA断片を慣用手段により回収した。こ
のDNA断片をDNA断片〔Ｃ〕とする。
pDPAT2プラスミド10μｇを緩衝液（10mM Tris−HCl、
pH7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエ
タノール）100μ中、15ユニットのBal IIと37℃で４
時間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（50mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、9m
M β−メルカプトエタノール）50μ中、10ユニットの
EcoR Iと37℃で３時間反応させた。反応液を５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて約150塩基対のDNA断
片を常法に従い回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｄ〕
とする。
pH7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエ
タノール）100μ中、15ユニットのBal IIと37℃で４
時間反応させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液
（50mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、9m
M β−メルカプトエタノール）50μ中、10ユニットの
EcoR Iと37℃で３時間反応させた。反応液を５％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけて約150塩基対のDNA断
片を常法に従い回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｄ〕
とする。
前述したDNA断片〔Ａ〕１μｇ、DNA断片〔Ｂ〕１μ
ｇ、DNA断片〔Ｃ〕１μｇ、及びDNA断片〔Ｄ〕１μｇを
緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6mM MgCl2、10mM DT
T、1mM ATP）30μ中、T4DNAリガーゼ４ユニットと15
℃で16時間反応させた。この反応液を用いて、大腸菌JM
103を慣用の方法で形質転換し、アンピシリン耐性菌の
中から第15図に示したpHA20プラスミドをもつコロニー
をスクリーニングし慣用手段によりプラスミドを単離し
た。
ｇ、DNA断片〔Ｃ〕１μｇ、及びDNA断片〔Ｄ〕１μｇを
緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6mM MgCl2、10mM DT
T、1mM ATP）30μ中、T4DNAリガーゼ４ユニットと15
℃で16時間反応させた。この反応液を用いて、大腸菌JM
103を慣用の方法で形質転換し、アンピシリン耐性菌の
中から第15図に示したpHA20プラスミドをもつコロニー
をスクリーニングし慣用手段によりプラスミドを単離し
た。
実施例5.pHA23の作製 実施例４で示したpHA20の作製に用いたプラスミドpHA
00の代りに実施例３で示したpHA03を用いて実施例４と
同様な手法でpHA23プラスミドを作製した（第15図）。
00の代りに実施例３で示したpHA03を用いて実施例４と
同様な手法でpHA23プラスミドを作製した（第15図）。
実施例6.pHA13の作製 実施例５で作製したpHA23プラスミド25μｇを緩衝液
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、7m
M β−メルカプトエタノール）200μ中30ユニットのB
gl IIと37℃で４時間反応させた。エタノール沈澱後、
沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.2、10mM MgC
l2、0.1mM DTT、80μM dNTP）50μ中、クレノウ断片
４ユニットと22℃30分間反応させた。フェノール処理
後、エタノール沈澱させた。沈澱物を緩衝液（20mM Tri
s−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、50mM（NH4）2SO4）100μ
中、30ユニットのPst Iと37℃で４時間反応させた。
反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ約3500塩
基対のDNA断片（このDNA断片を〔Ａ〕とする）と約1700
塩基対のDNA断片（このDNA断片を〔Ｂ〕とする）を慣用
手段により回収した。DNA断片〔Ｂ〕７μｇを緩衝液（1
0mM Tris−HCl、pH8.0、10mM MgCl2、50mM NaCl、7mM
β−メルカプトエタノール）５μ中、10ユニットのRs
a Iと37℃で６時間反応させた。反応液を1.2％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約1100塩基対のDNA断片（このDNA
断片を〔Ｃ〕とする）と約626塩基対のDNA断片（このDN
A断片を〔Ｄ〕とする）を慣用手段により回収した。
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、100mM NaCl、7m
M β−メルカプトエタノール）200μ中30ユニットのB
gl IIと37℃で４時間反応させた。エタノール沈澱後、
沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.2、10mM MgC
l2、0.1mM DTT、80μM dNTP）50μ中、クレノウ断片
４ユニットと22℃30分間反応させた。フェノール処理
後、エタノール沈澱させた。沈澱物を緩衝液（20mM Tri
s−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、50mM（NH4）2SO4）100μ
中、30ユニットのPst Iと37℃で４時間反応させた。
反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ約3500塩
基対のDNA断片（このDNA断片を〔Ａ〕とする）と約1700
塩基対のDNA断片（このDNA断片を〔Ｂ〕とする）を慣用
手段により回収した。DNA断片〔Ｂ〕７μｇを緩衝液（1
0mM Tris−HCl、pH8.0、10mM MgCl2、50mM NaCl、7mM
β−メルカプトエタノール）５μ中、10ユニットのRs
a Iと37℃で６時間反応させた。反応液を1.2％アガロー
スゲル電気泳動にかけ約1100塩基対のDNA断片（このDNA
断片を〔Ｃ〕とする）と約626塩基対のDNA断片（このDN
A断片を〔Ｄ〕とする）を慣用手段により回収した。
DNA断片〔Ｄ〕２μｇを緩衝（100mM Tris−HCl、pH7.
5、5mM MgCl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノ
ール）20μ中、５ユニットのDde Iと37℃で８時間反
応させた。エタノール沈澱跡、沈澱物を緩衝液（50mM T
ris−HCl、pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM DTT、80μM dNT
P）20μ中クレノウ断片１ユニットと22℃で30分間反
応させた。フェノール処理後エタノール沈澱し、沈澱物
を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて約241
塩基対のDNA断片を常法により回収した。このDNA断片１
μｇとDNA断片〔Ａ〕0.5μｇ、およびDNA断片〔Ｃ〕0.5
μｇを緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、
10mMDTT、1mM ATP）20μ中、T4DNAリガーゼ３ユニッ
トと15℃で15時間反応させた。この反応液を用いて大腸
菌JM103を慣用の方法で形質転換しアンピシリン耐性菌
の中から第16図に示すpHA13プラスミドをもつコロニー
をスクリーニングし、慣用手段によりプラスミドを単離
した。
5、5mM MgCl2、100mM NaCl、7mM β−メルカプトエタノ
ール）20μ中、５ユニットのDde Iと37℃で８時間反
応させた。エタノール沈澱跡、沈澱物を緩衝液（50mM T
ris−HCl、pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM DTT、80μM dNT
P）20μ中クレノウ断片１ユニットと22℃で30分間反
応させた。フェノール処理後エタノール沈澱し、沈澱物
を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて約241
塩基対のDNA断片を常法により回収した。このDNA断片１
μｇとDNA断片〔Ａ〕0.5μｇ、およびDNA断片〔Ｃ〕0.5
μｇを緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、
10mMDTT、1mM ATP）20μ中、T4DNAリガーゼ３ユニッ
トと15℃で15時間反応させた。この反応液を用いて大腸
菌JM103を慣用の方法で形質転換しアンピシリン耐性菌
の中から第16図に示すpHA13プラスミドをもつコロニー
をスクリーニングし、慣用手段によりプラスミドを単離
した。
実施例7.遺伝子産物の発現及び抽出 （ａ）前記の実施例1.〜6.及び参考例15で作製した各大
腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/p
DPAT2、JM103/pHA00、JM103/pHA03、JM103/PHA20、JM10
3/pHA23、JM103/pHA13、及びJM103/pMUT4LをLB培地（10
0μg/mlアンピシリンを含む）100ml中で振とう培養し
（37℃）、培養液のOD600が0.6になった時点でIPTG（イ
ソプロピル−β,D−チオガラクトピラノシド）を最終濃
度1mMとなるように加え、さらに５時間培養を継続し
た。培養液を永浴中に移し、3000rpm、10分間、４℃で
の遠心により菌体を集め、50mlの50mM Tris−HCl（pH7.
5）、100mM NaClに懸濁したのち同上の遠心操作により
菌体を集め、上記緩衝液10mlに懸濁した。次に超音波処
理により菌体を破砕し、15000rpm、10分間４℃での遠心
分離をおこない沈澱物を得た。
腸菌エシェリシャ・コリ（Escherichia coli）JM103/p
DPAT2、JM103/pHA00、JM103/pHA03、JM103/PHA20、JM10
3/pHA23、JM103/pHA13、及びJM103/pMUT4LをLB培地（10
0μg/mlアンピシリンを含む）100ml中で振とう培養し
（37℃）、培養液のOD600が0.6になった時点でIPTG（イ
ソプロピル−β,D−チオガラクトピラノシド）を最終濃
度1mMとなるように加え、さらに５時間培養を継続し
た。培養液を永浴中に移し、3000rpm、10分間、４℃で
の遠心により菌体を集め、50mlの50mM Tris−HCl（pH7.
5）、100mM NaClに懸濁したのち同上の遠心操作により
菌体を集め、上記緩衝液10mlに懸濁した。次に超音波処
理により菌体を破砕し、15000rpm、10分間４℃での遠心
分離をおこない沈澱物を得た。
（ｂ）前記（ａ）において調製した沈澱物を7.5M塩酸グ
アニジン及び50mM Tris−HCl（pH7.5）を含有する溶液1
0mlに懸濁し、室温にて90分間放置した。次に、この懸
濁液を10000rpm、10分間遠心分離し、上清を1M塩酸グア
ニジン、0.05M Tris−HCl（pH7.5）、2mM還元型グルタ
チオン及び0.2mM酸化型グルタチオンを含有する溶液5ml
に希釈し、そして室温にて一晩インキュベートした。次
にこれを、10mM Tris−HCl（pH7.4）及び0.4M NaClを含
有する溶液100倍容量に対して４℃にて４時間透析し、
さらに10mM Tris−HCl（pH7.4）及び0.1M Naclを含有す
る溶液100倍容量に対して２時間透析した。このように
して抽出物を得た。
アニジン及び50mM Tris−HCl（pH7.5）を含有する溶液1
0mlに懸濁し、室温にて90分間放置した。次に、この懸
濁液を10000rpm、10分間遠心分離し、上清を1M塩酸グア
ニジン、0.05M Tris−HCl（pH7.5）、2mM還元型グルタ
チオン及び0.2mM酸化型グルタチオンを含有する溶液5ml
に希釈し、そして室温にて一晩インキュベートした。次
にこれを、10mM Tris−HCl（pH7.4）及び0.4M NaClを含
有する溶液100倍容量に対して４℃にて４時間透析し、
さらに10mM Tris−HCl（pH7.4）及び0.1M Naclを含有す
る溶液100倍容量に対して２時間透析した。このように
して抽出物を得た。
実施例8. 実施例７（ａ）において得た、各形質転換体からの沈
澱物（培養液1ml相当）に、サンプリング溶液（3M尿素
及び0.08Mジチオスレイトール、１％SDS）20μを加
え、95℃分間加熱処理した。不溶物を遠心除去後、SDS
−ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Nature 292 1
28,1981）に上記試料（８μ）をのせ、50Vにて１夜間
電気泳動を行なった。泳動終了後、ゲルを染色液（0.1
％クマシーブルー−10％酢酸−25％イソプロパノール−
水）に1.5時間浸漬して染色し、ついで脱色液（10％酢
酸−10％イソプロパノール−水、２時間;5％メタノール
−７％酢酸−水、２時間）に浸漬した。得られたゲルパ
ターンの一例を第17図Ａに示す。第17図は大腸菌JM103/
pHA03からの発現生成物サンプル（レーン２）を、天然
ヒト−プロウロキナーゼ（UK）を生産する大腸菌JM103/
pPE3（pMUT4L）からの発現生成物サンプル（レーン１）
及び天然ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ
−PA）を生産する大腸菌JM103/pDPAT2（レーン３）と比
較した電気泳動図である。
澱物（培養液1ml相当）に、サンプリング溶液（3M尿素
及び0.08Mジチオスレイトール、１％SDS）20μを加
え、95℃分間加熱処理した。不溶物を遠心除去後、SDS
−ポリアクリルアミドグラジエントゲル（Nature 292 1
28,1981）に上記試料（８μ）をのせ、50Vにて１夜間
電気泳動を行なった。泳動終了後、ゲルを染色液（0.1
％クマシーブルー−10％酢酸−25％イソプロパノール−
水）に1.5時間浸漬して染色し、ついで脱色液（10％酢
酸−10％イソプロパノール−水、２時間;5％メタノール
−７％酢酸−水、２時間）に浸漬した。得られたゲルパ
ターンの一例を第17図Ａに示す。第17図は大腸菌JM103/
pHA03からの発現生成物サンプル（レーン２）を、天然
ヒト−プロウロキナーゼ（UK）を生産する大腸菌JM103/
pPE3（pMUT4L）からの発現生成物サンプル（レーン１）
及び天然ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ
−PA）を生産する大腸菌JM103/pDPAT2（レーン３）と比
較した電気泳動図である。
一方、各サンプルを上記実験と同じように、SDS−ポ
リアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動した後、ニ
トロセルロース膜に蛋白質を移し、控訴抗体染色（田部
一史、細胞工学、２巻、1061頁（1983））を行なった。
SDS−ポリアクリルアミドゲルより蛋白質を移したニト
ロセルロース膜を非特異的吸着を防ぐ為に、３％ゼラチ
ン/TBS（20mM Tris−HCl pH7.5、500mM NaCl）中に浸漬
した後、組織プラスミノーゲンアクチベーターで免疫し
た家兎より得た組織プラスミノーゲンアクチベーター抗
血清中に２時間浸漬した。よくTBS溶液で洗浄した後、
西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（ヒツ
ジ）溶液中に１時間浸漬した。よく洗浄した後、発色液
（20mM Tris−HCl pH7.5、500mM NaCl、0.06％４−クロ
ロ−１−ナフトール、0.015％H2O2）に５分間浸漬し発
色させた。第17図Ｃにそのパターンの一例を示す。同様
にウロキナーゼで免疫した家兎より得たウロキナーゼ抗
血清による同様の実験結果の一例を第17図Ｂに示した。
リアクリルアミドグラジエントゲル電気泳動した後、ニ
トロセルロース膜に蛋白質を移し、控訴抗体染色（田部
一史、細胞工学、２巻、1061頁（1983））を行なった。
SDS−ポリアクリルアミドゲルより蛋白質を移したニト
ロセルロース膜を非特異的吸着を防ぐ為に、３％ゼラチ
ン/TBS（20mM Tris−HCl pH7.5、500mM NaCl）中に浸漬
した後、組織プラスミノーゲンアクチベーターで免疫し
た家兎より得た組織プラスミノーゲンアクチベーター抗
血清中に２時間浸漬した。よくTBS溶液で洗浄した後、
西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗ウサギIgG（ヒツ
ジ）溶液中に１時間浸漬した。よく洗浄した後、発色液
（20mM Tris−HCl pH7.5、500mM NaCl、0.06％４−クロ
ロ−１−ナフトール、0.015％H2O2）に５分間浸漬し発
色させた。第17図Ｃにそのパターンの一例を示す。同様
にウロキナーゼで免疫した家兎より得たウロキナーゼ抗
血清による同様の実験結果の一例を第17図Ｂに示した。
これらのことから、作製したこの発明の融合蛋白質は
ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲンアクチベーター
の双方の抗原性を有していた。
ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲンアクチベーター
の双方の抗原性を有していた。
実施例9.フィブリンアフィニティーセファロースカラム
の作製 第一化学薬品工業製フィブリノーゲン（タイプ２）
（プラスミノーゲンフリー）3gを結合反応用緩衝液（0.
1M NaHCO3、pH8.3、0.5M NaCl）100mlに溶解した。不溶
物は10,000g 10分間の遠心操作によって除去し、上清を
以下の反応操作に用いた。
の作製 第一化学薬品工業製フィブリノーゲン（タイプ２）
（プラスミノーゲンフリー）3gを結合反応用緩衝液（0.
1M NaHCO3、pH8.3、0.5M NaCl）100mlに溶解した。不溶
物は10,000g 10分間の遠心操作によって除去し、上清を
以下の反応操作に用いた。
ファルマシア製CNBr−Activated Sepharose 4B 2gを1
mM HCl30mlで膨潤させ膨潤体積約7mlの担体を得た。こ
れをグラスフィルター（G3）上で100mlの1mM HClで25ml
ずつ４回に分けて洗浄した。更に結合反応用緩衝液20ml
で洗浄し同じ緩衝液20mlに拡散させた。これを直ちに先
のフィブリノーゲン溶液に加え室温で２時間攪拌し反応
させた。反応後上清を除去し0.2Mグリシン（pH8.0）溶
液50mlを加え室温で２時間攪拌し残りの活性基を不活性
化した。上清を除去したあと0.2Mグリシン（pH8.0）溶
液及び酢酸緩衝液〔0.1M NaOAc（PH5.0）、0.5M NaCl〕
で20mlづつ交互に５回グラスフィルター上で洗浄し最終
的にフィブリノーゲンの結合した担体を約7ml得た。こ
れをカラム（φ16mm×70mm）に充填した。持田製薬製ウ
シトロンビン300ユニットを蒸留水3mlに溶解させ室温で
先のカラムに２時間かけて、ゆっくり流入し、フィブリ
ノーゲンをフィブリンに変換させた。このカラムを100m
lのトリス塩酸緩衝液（0.02Mトリス塩酸pH7.4 0.15M Na
Cl、0.05％TritonX−100）で平衡化させた。
mM HCl30mlで膨潤させ膨潤体積約7mlの担体を得た。こ
れをグラスフィルター（G3）上で100mlの1mM HClで25ml
ずつ４回に分けて洗浄した。更に結合反応用緩衝液20ml
で洗浄し同じ緩衝液20mlに拡散させた。これを直ちに先
のフィブリノーゲン溶液に加え室温で２時間攪拌し反応
させた。反応後上清を除去し0.2Mグリシン（pH8.0）溶
液50mlを加え室温で２時間攪拌し残りの活性基を不活性
化した。上清を除去したあと0.2Mグリシン（pH8.0）溶
液及び酢酸緩衝液〔0.1M NaOAc（PH5.0）、0.5M NaCl〕
で20mlづつ交互に５回グラスフィルター上で洗浄し最終
的にフィブリノーゲンの結合した担体を約7ml得た。こ
れをカラム（φ16mm×70mm）に充填した。持田製薬製ウ
シトロンビン300ユニットを蒸留水3mlに溶解させ室温で
先のカラムに２時間かけて、ゆっくり流入し、フィブリ
ノーゲンをフィブリンに変換させた。このカラムを100m
lのトリス塩酸緩衝液（0.02Mトリス塩酸pH7.4 0.15M Na
Cl、0.05％TritonX−100）で平衡化させた。
実施例10. 実施例７（ｂ）に記載の方法により製造した試料につ
いて５μｇ相当の溶液を分取し最終的に緩衝液の組成が
0.02Mトリス塩酸pH7.4、0.15M NaCl、0.05％TritonX−1
00にし、かつ液量を500μに調製した。この溶液を実
施例９で得たカラムに0.5ml/分の流速で流入させ、カラ
ム内のフィブリンと反応させつつ、カラムに40mlのトリ
ス塩酸緩衝液（0.02Mトリス塩酸pH7.4、0.15M NaCl、0.
05％TritonX−100）を続けて上述の流速で流入させた。
さらにカラムに溶出用緩衝液（2M KSCN、0.02Mトリス塩
酸pH7.4、0.05％TritonX−100）を流入させた。流出す
る液すべてをフラクションコレクターに2mlづつ分取
し、各フラクションのプラスミノーゲン活性化作用をプ
ラスミノーゲン含有フィブリン平板溶解活性で測定し
た。尚実施例における活性の測定法は以下の通りであ
る。フィブリン平板法;0.1gのフィブリノーゲン（第１
化学薬品製フィブリノーゲンタイプ１）を0.06Mリン酸
緩衝液5mlに溶かした溶液と0.025gのアガロース（シグ
マ社製）を同緩衝液5mlに溶かした溶液を混合する。こ
れに最終1mM、最終的3NIH単位/mlの牛トロンビン（持田
製薬社製）を加え攪拌後シャーレ（内径8.5cm）にま
き、フィブリン平板を調整する。各プラスミノーゲンア
クチベーター10μを上記フィブリン平板にスポット
し、37℃にて14時間反応後、溶解円の径を測定する。活
性測定法は、市販尿由来ウロキナーゼ（UK）を先述の方
法に準じて作成したフィブリン平板に10μスポットし
37℃14時間反応させ、溶解円の径を求め、活性と径との
検量線を作成し、前記の各種プラスミノーゲンアクチベ
ーターの径の値から、活性を算出する。
いて５μｇ相当の溶液を分取し最終的に緩衝液の組成が
0.02Mトリス塩酸pH7.4、0.15M NaCl、0.05％TritonX−1
00にし、かつ液量を500μに調製した。この溶液を実
施例９で得たカラムに0.5ml/分の流速で流入させ、カラ
ム内のフィブリンと反応させつつ、カラムに40mlのトリ
ス塩酸緩衝液（0.02Mトリス塩酸pH7.4、0.15M NaCl、0.
05％TritonX−100）を続けて上述の流速で流入させた。
さらにカラムに溶出用緩衝液（2M KSCN、0.02Mトリス塩
酸pH7.4、0.05％TritonX−100）を流入させた。流出す
る液すべてをフラクションコレクターに2mlづつ分取
し、各フラクションのプラスミノーゲン活性化作用をプ
ラスミノーゲン含有フィブリン平板溶解活性で測定し
た。尚実施例における活性の測定法は以下の通りであ
る。フィブリン平板法;0.1gのフィブリノーゲン（第１
化学薬品製フィブリノーゲンタイプ１）を0.06Mリン酸
緩衝液5mlに溶かした溶液と0.025gのアガロース（シグ
マ社製）を同緩衝液5mlに溶かした溶液を混合する。こ
れに最終1mM、最終的3NIH単位/mlの牛トロンビン（持田
製薬社製）を加え攪拌後シャーレ（内径8.5cm）にま
き、フィブリン平板を調整する。各プラスミノーゲンア
クチベーター10μを上記フィブリン平板にスポット
し、37℃にて14時間反応後、溶解円の径を測定する。活
性測定法は、市販尿由来ウロキナーゼ（UK）を先述の方
法に準じて作成したフィブリン平板に10μスポットし
37℃14時間反応させ、溶解円の径を求め、活性と径との
検量線を作成し、前記の各種プラスミノーゲンアクチベ
ーターの径の値から、活性を算出する。
前半の2M KSCNを含まない画分を非吸着画分とし、後
半の2M KSCNを含む画分を吸着画分としたとき各試料は
第18−１図〜第18−４図にみられる様な曲線を示した。
対照として市販組織プラスミノーゲンアクチベーター、
市販尿由来ウロキナーゼ（UK）、大腸菌由来組織プラミ
ノーゲンアクチベーター（DPA T2）の同じ実験操作によ
って得られた曲線を付記した。
半の2M KSCNを含む画分を吸着画分としたとき各試料は
第18−１図〜第18−４図にみられる様な曲線を示した。
対照として市販組織プラスミノーゲンアクチベーター、
市販尿由来ウロキナーゼ（UK）、大腸菌由来組織プラミ
ノーゲンアクチベーター（DPA T2）の同じ実験操作によ
って得られた曲線を付記した。
図で示される様に組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーのクリングル領域を全部もしくは一部有するこの発明
の融合蛋白質は市販組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー及び大腸菌由来の組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーと同等のフィブリンセファロースへの結合能力を保有
していた。
ーのクリングル領域を全部もしくは一部有するこの発明
の融合蛋白質は市販組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー及び大腸菌由来の組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーと同等のフィブリンセファロースへの結合能力を保有
していた。
実施例11−2.合成基質Ｓ−2288によるKm値の測定 カビ社製S2288粉末を反応用緩衝液（0.1Mトリス塩酸p
H8.0、0.01％トリトンX100、0.5M NaCl）に溶解させ最
終的にＳ−2288が0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM
の各濃度になるように調整した。
H8.0、0.01％トリトンX100、0.5M NaCl）に溶解させ最
終的にＳ−2288が0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM
の各濃度になるように調整した。
実施例７の（ｂ）に記載の方法により製造したHA03、
HA20及び市販ウロキナーゼ（UK）をそれぞれ10μ分取
し、反応用緩衝液と混合して最終的に400μとした。
これにシグマ社プラスミン（1mg/ml）を２μ添加し直
ちに37℃の恒温器中で１時間静置した。その後反応液を
氷水中に素早く移し、シグマ社製STI（大豆トリプシン
インヒビター）（5mg/ml）を２μ加え、攪拌してプラ
スミンによる反応を停止させた。更に先述の各濃度のS2
288溶液をそれぞれ別々に添加し、37℃の恒温器中で１
時間静置した。反応後直ちに氷水中に移し、10％酢酸水
溶液を50μ加え、反応を停止させた。対照として反応
用緩衝液400μで上述と同様の操作を行なったものを
用いた。
HA20及び市販ウロキナーゼ（UK）をそれぞれ10μ分取
し、反応用緩衝液と混合して最終的に400μとした。
これにシグマ社プラスミン（1mg/ml）を２μ添加し直
ちに37℃の恒温器中で１時間静置した。その後反応液を
氷水中に素早く移し、シグマ社製STI（大豆トリプシン
インヒビター）（5mg/ml）を２μ加え、攪拌してプラ
スミンによる反応を停止させた。更に先述の各濃度のS2
288溶液をそれぞれ別々に添加し、37℃の恒温器中で１
時間静置した。反応後直ちに氷水中に移し、10％酢酸水
溶液を50μ加え、反応を停止させた。対照として反応
用緩衝液400μで上述と同様の操作を行なったものを
用いた。
分光光度計で405nmの吸収をそれぞれ測定し対照の吸
収の値を引いたものをそれぞれ酸素の吸収の値Ａとし
た。反応速度ｖ＝A/60とし、1/v＝60/Aとした。60は反
応時間で60分である。Ｓは基質濃度（Ｍ）であり縦軸に
1/v横軸に1/SをとりLineweaver−Burkの逆プロット図を
得、これから表１に示す様なKm値を求めた。このKmから
本発明の融合蛋白質HA03、及びHA20はそれぞれ市販ウロ
キナーゼと同じKm値を示した。これらから、クリングル
を全部又は１部含んでいた場合、又はセリンプロテアー
ゼ領域の点突然変異の有無にかかわらず、本発明のハイ
ブリドポリペプチドはウロキナーゼの活性部位の特性を
有していた。
収の値を引いたものをそれぞれ酸素の吸収の値Ａとし
た。反応速度ｖ＝A/60とし、1/v＝60/Aとした。60は反
応時間で60分である。Ｓは基質濃度（Ｍ）であり縦軸に
1/v横軸に1/SをとりLineweaver−Burkの逆プロット図を
得、これから表１に示す様なKm値を求めた。このKmから
本発明の融合蛋白質HA03、及びHA20はそれぞれ市販ウロ
キナーゼと同じKm値を示した。これらから、クリングル
を全部又は１部含んでいた場合、又はセリンプロテアー
ゼ領域の点突然変異の有無にかかわらず、本発明のハイ
ブリドポリペプチドはウロキナーゼの活性部位の特性を
有していた。
実施例11.プラスミドpHA21Lの作製（第20図） 実施例４で作製したpHA20プラスミド10μｇを緩衝液
（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100mM NaCl）2
00μ中、100ユニットのBal II及び96ユニットのPst I
と37℃で２時間反応させた。この反応液を0.7％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ約3400塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｅ〕とす
る。
（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100mM NaCl）2
00μ中、100ユニットのBal II及び96ユニットのPst I
と37℃で２時間反応させた。この反応液を0.7％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ約3400塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｅ〕とす
る。
一方、同じpHA20プラスミド５μｇを緩衝液（10mM Tr
is−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM β−メ
ルカプトエタノール）200μ中、100ユニットのBgl II
及び120ユニットのSca Iと37℃で４時間反応させた。こ
の反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ約630塩
基対のDNA断片を慣用手段により回収した。このDNA断片
をDNA断片〔Ｆ〕とする。
is−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM β−メ
ルカプトエタノール）200μ中、100ユニットのBgl II
及び120ユニットのSca Iと37℃で４時間反応させた。こ
の反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ約630塩
基対のDNA断片を慣用手段により回収した。このDNA断片
をDNA断片〔Ｆ〕とする。
一方、参考例18で作製したプラスミドpMUT9Lpm1 5μ
ｇを緩衝液（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100
mM NaCl）100μ中50ユニットのPst Iと37℃で２時間
反応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳
動にかけ、約1200塩基対のDNA断片を慣用手段により回
収した。このDNA断片を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.
4、10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM β−メルカプトエタ
ノール）100μ中40ユニットのFsp Iと37℃で10分間反
応させて部分消化した。この反応液を1.2％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約1100塩基対のDNA断片を慣用手
段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｇ〕とす
る。
ｇを緩衝液（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100
mM NaCl）100μ中50ユニットのPst Iと37℃で２時間
反応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳
動にかけ、約1200塩基対のDNA断片を慣用手段により回
収した。このDNA断片を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.
4、10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM β−メルカプトエタ
ノール）100μ中40ユニットのFsp Iと37℃で10分間反
応させて部分消化した。この反応液を1.2％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約1100塩基対のDNA断片を慣用手
段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｇ〕とす
る。
また、ホスファイト法により次のような２種類の合成
オリゴヌクレオチド： を作製した。この２種類の合成オリゴヌクレチオド各１
μｇを混合し、緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.6、10mM
MgCl2、10mM β−メルカプトエタノール、10mM ATP）30
μ中70℃で５分間加熱した後、冷却した。この反応液
に20ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを加え、37
℃で１時間反応させて５′末端をリン酸化した。この反
応液を70℃で２分間加熱した後室温に５分間放置して２
種類の合成オリゴヌクレオチドをアニールさせた。エタ
ノール沈澱後、沈澱物とDNA断片〔Ｆ〕を混合し、緩衝
液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、
10mM ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガーゼと12℃
で15時間反応させた。フェノール処理後、エタノール沈
澱を行い、この沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.
4、10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM β−メルカプトエタ
ノール）50μ中10ユニットのFsp I及び20ユニットのB
al IIと37℃で４時間反応させた。この反応液を1.0％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ約650塩基対のDNA断片を慣
用手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｈ〕と
する。
オリゴヌクレオチド： を作製した。この２種類の合成オリゴヌクレチオド各１
μｇを混合し、緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.6、10mM
MgCl2、10mM β−メルカプトエタノール、10mM ATP）30
μ中70℃で５分間加熱した後、冷却した。この反応液
に20ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを加え、37
℃で１時間反応させて５′末端をリン酸化した。この反
応液を70℃で２分間加熱した後室温に５分間放置して２
種類の合成オリゴヌクレオチドをアニールさせた。エタ
ノール沈澱後、沈澱物とDNA断片〔Ｆ〕を混合し、緩衝
液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT、
10mM ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガーゼと12℃
で15時間反応させた。フェノール処理後、エタノール沈
澱を行い、この沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.
4、10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM β−メルカプトエタ
ノール）50μ中10ユニットのFsp I及び20ユニットのB
al IIと37℃で４時間反応させた。この反応液を1.0％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ約650塩基対のDNA断片を慣
用手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｈ〕と
する。
このようにして得たDNA断片〔Ｅ〕、〔Ｇ〕及び
〔Ｈ〕を混合し、緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6
mM MgCl2、10mM DTT、10mM ATP）20μ中、５ユニット
のT4 DNAリガーゼと12℃で15時間反応させた。この反応
液を用いてエシェリシア・コリJM103を慣用手段により
形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第20図に示す
プラスミドpHA21Lをもつコロニーをスクリーニングし、
慣用手段によりプラスミドpHA21Lを単離した。
〔Ｈ〕を混合し、緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6
mM MgCl2、10mM DTT、10mM ATP）20μ中、５ユニット
のT4 DNAリガーゼと12℃で15時間反応させた。この反応
液を用いてエシェリシア・コリJM103を慣用手段により
形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第20図に示す
プラスミドpHA21Lをもつコロニーをスクリーニングし、
慣用手段によりプラスミドpHA21Lを単離した。
実施例12.プラスミドpHA24Lの作製 参考例17で作製した。pMUT4Lpm4プラスミド５μｇを
緩衝液（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100mM N
aCl）100μ中50ユニットのPst Iと37℃で２時間反応
させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約1200塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。このDNA断片を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.4、10
mM MgCl2、50mM NaCl、10mM β−メルカプトエタノー
ル）100μ中40ユニットのFsp Iと37℃で10分間反応さ
せて部分消化した。この反応液を1.2％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約1100塩基対のDNA断片を慣用手段に
より回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｉ〕とする。
緩衝液（20mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、100mM N
aCl）100μ中50ユニットのPst Iと37℃で２時間反応
させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約1200塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。このDNA断片を緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.4、10
mM MgCl2、50mM NaCl、10mM β−メルカプトエタノー
ル）100μ中40ユニットのFsp Iと37℃で10分間反応さ
せて部分消化した。この反応液を1.2％アガロースゲル
電気泳動にかけ、約1100塩基対のDNA断片を慣用手段に
より回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｉ〕とする。
一方、実施例11と全く同様の方法によりDNA断片
〔Ｅ〕及び〔Ｇ〕を得た。DNA断片〔Ｅ〕、〔Ｇ〕及び
〔Ｉ〕を混合し、緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6
mM MgCl2、10mM DTT、10mM ATP）20μ中５ユニットT4
DNAリガーゼと12℃で15時間反応させた。この反応液を
用いてエシェリシア・コリJM103を慣用手段により形質
転換し、アンピシリン耐性菌の中から第20図に示すpH24
Lプラスミドをもつコロニーをスクリーニングし、慣用
手段によりプラスミドpHA24Lを単離した。
〔Ｅ〕及び〔Ｇ〕を得た。DNA断片〔Ｅ〕、〔Ｇ〕及び
〔Ｉ〕を混合し、緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6
mM MgCl2、10mM DTT、10mM ATP）20μ中５ユニットT4
DNAリガーゼと12℃で15時間反応させた。この反応液を
用いてエシェリシア・コリJM103を慣用手段により形質
転換し、アンピシリン耐性菌の中から第20図に示すpH24
Lプラスミドをもつコロニーをスクリーニングし、慣用
手段によりプラスミドpHA24Lを単離した。
実施例13.プラスミドpHA11Lの作製（第21図） 実施例11で作製したプラスミドpHA21L 5μｇを緩衝液
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7m
M β−メルカプトエタノール）100μ中、50ユニット
のSca I及び50ユニットのPst Iと37℃で６時間反応させ
た。この反応液を1.0％アガロースゲル電気泳動にか
け、約1100塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。このDNA断片をDNA断片〔Ｊ〕とする。
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7m
M β−メルカプトエタノール）100μ中、50ユニット
のSca I及び50ユニットのPst Iと37℃で６時間反応させ
た。この反応液を1.0％アガロースゲル電気泳動にか
け、約1100塩基対のDNA断片を慣用手段により回収し
た。このDNA断片をDNA断片〔Ｊ〕とする。
また、同じプラスミドpHA21L 10μｇを緩衝液（10mM
Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、150mM NaCl、7mM β−
メルカプトエタノール）200μ中100ユニットのDde I
と37℃で15時間反応させた。この反応液を4.0％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約330塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｋ〕とす
る。
Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、150mM NaCl、7mM β−
メルカプトエタノール）200μ中100ユニットのDde I
と37℃で15時間反応させた。この反応液を4.0％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約330塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｋ〕とす
る。
さて、ホスファイト法により次のような２種類の合成
オリゴヌクレオチド： を作製した。この２種類の合成オリゴヌクレオチド各２
μｇを混合し、実施例11と同様の方法により５′末端の
リン酸化及びアニーリングを行った。エタノール沈澱
後、沈澱物とDNA断片〔Ｋ〕を混合し、連結を行った
後、エタノール沈澱を行った。この沈澱物を緩衝液（10
mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM 2
−メルカプトエタノール）100μ中、100ユニットのSc
a I及び100ユニットのAat IIと37℃で15時間反応させ
た。この反応液を4.0％アガロースゲル電気泳動にかけ
約250塩基対のDNA断片を慣用手段により回収した。この
DNA断片をDNA断片〔Ｌ〕とする。
オリゴヌクレオチド： を作製した。この２種類の合成オリゴヌクレオチド各２
μｇを混合し、実施例11と同様の方法により５′末端の
リン酸化及びアニーリングを行った。エタノール沈澱
後、沈澱物とDNA断片〔Ｋ〕を混合し、連結を行った
後、エタノール沈澱を行った。この沈澱物を緩衝液（10
mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM 2
−メルカプトエタノール）100μ中、100ユニットのSc
a I及び100ユニットのAat IIと37℃で15時間反応させ
た。この反応液を4.0％アガロースゲル電気泳動にかけ
約250塩基対のDNA断片を慣用手段により回収した。この
DNA断片をDNA断片〔Ｌ〕とする。
一方、参考例18で作製したプラスミドpMUT9Lpm1 5μ
ｇを緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、60mM
KCl、7mM β−メルカプトエタノール）100μ中、50
ユニットのAat II及び50ユニットのPst Iと37℃で４時
間反応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気
泳動にかけ、約3000塩基対のDNA断片を慣用手段により
回収した。このDNA断片でDNA断片〔Ｍ〕とする。
ｇを緩衝液（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、60mM
KCl、7mM β−メルカプトエタノール）100μ中、50
ユニットのAat II及び50ユニットのPst Iと37℃で４時
間反応させた。この反応液を0.7％アガロースゲル電気
泳動にかけ、約3000塩基対のDNA断片を慣用手段により
回収した。このDNA断片でDNA断片〔Ｍ〕とする。
得られたDNA断片〔Ｊ〕、〔Ｌ〕及び〔Ｍ〕を混合
し、緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、10
mM DTT、10mM ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガー
ゼと12℃で15時間反応させた。この反応液を用い、エシ
ェリシア・コリ（Escheriａ coli）JM103を慣用手段に
より形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第21図に
示したpHA11Lプラスミドをもつコロニーをスクーリニン
グし、慣用手段によりプラスミドpHA11Lを単離した。
し、緩衝液（66mM Tris−HCl、pH7.6、6.6mM MgCl2、10
mM DTT、10mM ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガー
ゼと12℃で15時間反応させた。この反応液を用い、エシ
ェリシア・コリ（Escheriａ coli）JM103を慣用手段に
より形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から第21図に
示したpHA11Lプラスミドをもつコロニーをスクーリニン
グし、慣用手段によりプラスミドpHA11Lを単離した。
実施例14.プラスミドpH141Lの作製 実施例12で作製したプラスミドpHA24L 5μｇを緩衝液
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7m
M 2−メルカプトエタノール）100μ中、50ユニットの
Sca I及び50ユニットのPst Iと37℃で６時間反応させ
た。この反応液を1.0％アガロースゲル電気泳動にか
け、約1100塩基対のDNA断片と慣用手段により回収し
た。このDNA断片をDNA断片〔Ｎ〕とする。
（10mM Tris−HCl、pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7m
M 2−メルカプトエタノール）100μ中、50ユニットの
Sca I及び50ユニットのPst Iと37℃で６時間反応させ
た。この反応液を1.0％アガロースゲル電気泳動にか
け、約1100塩基対のDNA断片と慣用手段により回収し
た。このDNA断片をDNA断片〔Ｎ〕とする。
一方、実施例13と全く同様の方法によりDNA断片
〔Ｌ〕及び〔Ｍ〕を得た。DNA断片〔Ｌ〕、〔Ｍ〕及び
〔Ｎ〕を混合し、緩衝液（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6m
M MgCl2、10mM DTT、10mM ATP）20μ中５ユニットのT
4 DNAリガーゼと12℃で15時間反応させた。この反応液
を用いてエシェリシア・コリJM103を慣用手段により形
質転換し、アンピシリン耐性菌の中からプラスミドpHA1
4Lをもつコロニーをスクリーニングし、慣用手段により
プラスミドpHA14Lを単離した。
〔Ｌ〕及び〔Ｍ〕を得た。DNA断片〔Ｌ〕、〔Ｍ〕及び
〔Ｎ〕を混合し、緩衝液（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6m
M MgCl2、10mM DTT、10mM ATP）20μ中５ユニットのT
4 DNAリガーゼと12℃で15時間反応させた。この反応液
を用いてエシェリシア・コリJM103を慣用手段により形
質転換し、アンピシリン耐性菌の中からプラスミドpHA1
4Lをもつコロニーをスクリーニングし、慣用手段により
プラスミドpHA14Lを単離した。
実施例15.プラスミドpHA01Lの作製（参考例）（第22
図） 実施例11で作製したプラスミドpHA21L 5μｇを緩衝液
（20mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl2、100mM NaCl）10
0μ中、50ユニットのEcoR I及び50ユニットのPst Iと
37℃で４時間反応させた。この反応液を0.7％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約3300塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｏ〕とす
る。
図） 実施例11で作製したプラスミドpHA21L 5μｇを緩衝液
（20mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl2、100mM NaCl）10
0μ中、50ユニットのEcoR I及び50ユニットのPst Iと
37℃で４時間反応させた。この反応液を0.7％アガロー
スゲル電気泳動にかけ、約3300塩基対のDNA断片を慣用
手段により回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ｏ〕とす
る。
同じプラスミドpHA21L 5μｇを緩衝液（10mM Tris−H
Cl pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM 2−メルカプト
エタノール）100μ中、50ユニットのSca I及び50ユニ
ットのPst Iと37℃で15時間反応させた。この反応液を
0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ、約1100塩基対のD
NA断片を慣用手段により回収した。このDNA断片をDNA断
片〔Ｐ〕とする。
Cl pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM 2−メルカプト
エタノール）100μ中、50ユニットのSca I及び50ユニ
ットのPst Iと37℃で15時間反応させた。この反応液を
0.7％アガロースゲル電気泳動にかけ、約1100塩基対のD
NA断片を慣用手段により回収した。このDNA断片をDNA断
片〔Ｐ〕とする。
同じプラスミドpHA21L 10μｇを緩衝液（10mM Tris−
HCl pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM 2−メルカプ
トエタノール）100μ中50ユニットのEcoR I及び50ユ
ニットのSca Iと37℃で15時間反応させた。この反応液
を2.0％アガロースゲル電気泳動にかけ、約150塩基対の
DNA断片を慣用手段により回収した。このDNA断片をDNA
断片〔Ｑ〕とする。
HCl pH7.5、7mM MgCl2、125mM NaCl、7mM 2−メルカプ
トエタノール）100μ中50ユニットのEcoR I及び50ユ
ニットのSca Iと37℃で15時間反応させた。この反応液
を2.0％アガロースゲル電気泳動にかけ、約150塩基対の
DNA断片を慣用手段により回収した。このDNA断片をDNA
断片〔Ｑ〕とする。
DNA断片〔Ｏ〕、〔Ｐ〕及び〔Ｑ〕を混合し、緩衝液
（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT,10mM
ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガーゼと12℃で15
時間反応させた。この反応液を用いてエシェリシア・コ
リJM103を慣用手段により形質転換し、アンピシリン耐
性菌の中から第22図に示すpHA01Lプラスミドをもつコロ
ニーをスクリニーングし、慣用手段によりプラスミドpH
A01Lを回収した。
（66mM Tris−HCl pH7.6、6.6mM MgCl2、10mM DTT,10mM
ATP）20μ中５ユニットのT4 DNAリガーゼと12℃で15
時間反応させた。この反応液を用いてエシェリシア・コ
リJM103を慣用手段により形質転換し、アンピシリン耐
性菌の中から第22図に示すpHA01Lプラスミドをもつコロ
ニーをスクリニーングし、慣用手段によりプラスミドpH
A01Lを回収した。
実施例16.プラスミドpHA04Lの作製（参考例） プラスミドpHA21Lの代りに実施例12で作製したプラス
ミドpHA24Lを用い、実施例15と全く同様の方法によりプ
ラスミドpHA04Lを作製した。
ミドpHA24Lを用い、実施例15と全く同様の方法によりプ
ラスミドpHA04Lを作製した。
実施例17.ハイブリド・プラスミノーゲン・アクティベ
ーターHPA24Lの発現及び抽出 実施例12で作製したプラスミドpHA24Lを用いて、エシ
ェリシア・コリKY1436株を慣用手段により形質転換し、
得られた形質転換菌を50μg/ml濃度のアンピシリンを含
むＬ培地5mlの入った試験管中で、300℃にて終夜振盪培
養した。この培養液2mlを新たな50μg/ml濃度のアンピ
シリンを含むＬ培地１の入った５容フラスコに加
え、30℃でエアーシェーカーを用いて（250rpm）振盪培
養した。600nmにおける吸光度が約0.4になったとき、三
角フラスコを37℃の恒温槽に移し、さらに５時間37℃に
て振盪培養を行い、ハイブリド・プラスミノーゲン・ア
クティベーターHPA24L遺伝子を発現せしめた。
ーターHPA24Lの発現及び抽出 実施例12で作製したプラスミドpHA24Lを用いて、エシ
ェリシア・コリKY1436株を慣用手段により形質転換し、
得られた形質転換菌を50μg/ml濃度のアンピシリンを含
むＬ培地5mlの入った試験管中で、300℃にて終夜振盪培
養した。この培養液2mlを新たな50μg/ml濃度のアンピ
シリンを含むＬ培地１の入った５容フラスコに加
え、30℃でエアーシェーカーを用いて（250rpm）振盪培
養した。600nmにおける吸光度が約0.4になったとき、三
角フラスコを37℃の恒温槽に移し、さらに５時間37℃に
て振盪培養を行い、ハイブリド・プラスミノーゲン・ア
クティベーターHPA24L遺伝子を発現せしめた。
600nmにおける吸光度を測定し、吸光度６に相当する
培養液をプラスティック製遠心管に移し、遠心分離して
菌体を集めた。この菌体を緩衝液（0.1M NaCl、50mM Tr
is−HCl pH8.0）1.0mlに懸濁し、懸濁液を超音波処理し
て菌体を破砕した後、遠心分離を行って不溶性画分を回
収した。この不溶性画分の600nmにおける吸光度１相当
分を慣用手段によるSDS−ポリアクリルアミド−ゲル電
気泳動に供した。結果を第23図に示した。
培養液をプラスティック製遠心管に移し、遠心分離して
菌体を集めた。この菌体を緩衝液（0.1M NaCl、50mM Tr
is−HCl pH8.0）1.0mlに懸濁し、懸濁液を超音波処理し
て菌体を破砕した後、遠心分離を行って不溶性画分を回
収した。この不溶性画分の600nmにおける吸光度１相当
分を慣用手段によるSDS−ポリアクリルアミド−ゲル電
気泳動に供した。結果を第23図に示した。
また、600nmにおける吸光度４相当分の不溶性画分を6
M塩酸グアニジン及び25mM Tris−HCl（pH8.0）を含有す
る溶液160mlに懸濁し、室温にて30分間放置した。次
に、この懸濁液を終濃度50mM Tris−HCl pH8.0、1M Gu
−HCl、2mM還元型グルタチオン、0.2mM酸化型グルタチ
オン、1mM EDTA、0.01％Tween80となるように希釈し、
室温にて15時間放置し、菌体粗抽出物を得た。
M塩酸グアニジン及び25mM Tris−HCl（pH8.0）を含有す
る溶液160mlに懸濁し、室温にて30分間放置した。次
に、この懸濁液を終濃度50mM Tris−HCl pH8.0、1M Gu
−HCl、2mM還元型グルタチオン、0.2mM酸化型グルタチ
オン、1mM EDTA、0.01％Tween80となるように希釈し、
室温にて15時間放置し、菌体粗抽出物を得た。
実施例18.HPA24L粗抽出物の合成基質Ｓ−2444を用る活
性測定 実施例17で得たHPA24L粗抽出液10μを緩衝液（0.1M
Tris−HCl、pH8.0、0.01％Triton×−100）に加えて99
μとし、これに１μg/μ濃度のプラスミン溶液１μ
を加え、37℃で15分間インキュベートした後、５μg/
μ濃度の大豆トリプシン・インヒビター溶液１μを
加えてよく攪拌した。これに合成基質Ｓ−2444 2mMを含
む緩衝液（0.1M Tris−HCl、pH8.0、0.01％Triton×−1
00）0.7mlを加え、37℃にて30分間インキュベートした
後、100mlの氷酢酸を加えて反応を止めた。
性測定 実施例17で得たHPA24L粗抽出液10μを緩衝液（0.1M
Tris−HCl、pH8.0、0.01％Triton×−100）に加えて99
μとし、これに１μg/μ濃度のプラスミン溶液１μ
を加え、37℃で15分間インキュベートした後、５μg/
μ濃度の大豆トリプシン・インヒビター溶液１μを
加えてよく攪拌した。これに合成基質Ｓ−2444 2mMを含
む緩衝液（0.1M Tris−HCl、pH8.0、0.01％Triton×−1
00）0.7mlを加え、37℃にて30分間インキュベートした
後、100mlの氷酢酸を加えて反応を止めた。
この反応液の405nmにおける吸光度を測定した。活性
値は、反応液中の酵素活性（国際単位、IU）＝（OD405/
0.395）×6.5の計算式により求めた結果約120Iuであっ
た。
値は、反応液中の酵素活性（国際単位、IU）＝（OD405/
0.395）×6.5の計算式により求めた結果約120Iuであっ
た。
実施例19.他のプラスミドの発現 同様にして、プラスミドpHA21L、pHA11L、pHA14L、pH
A01L、及びpHA04Lの発現を確認した。
A01L、及びpHA04Lの発現を確認した。
参考文献 （１） 特願昭59−97106号明細書 （２） J.M.チルグウイン等，バイオケミストリー（Bi
ochemistry），18,5294（1979）。
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（３） H.アビブ等，プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A）69,1408（1977）。
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A）69,1408（1977）。
（４） H.オカヤマ等、モレキュラー、セル・バイオロ
ジー（Molec. Cell. Biol.）２,161−170（1982）。
ジー（Molec. Cell. Biol.）２,161−170（1982）。
（５） M.V.ノルガード等、ジーン（Gene）３,279−29
2（1978）。
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4−221（1983）。
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m. Biophys. Res. Commun.）23,643−646（1966）。
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thods in Enzymology），65,499（1980）.15 （９） T.マニアチス等，モレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）コールドスプリングハーバー研
究所・ニューヨーク（1982）254頁。
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（10） H.C.バーンボイム等，ニュークレイック・アシ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），７,1513（197
9）。
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9）。
（11） G.J.ステフェンス等，ホッペーデイラース・ツ
アイトシュリスト・フュール・フィジオロギッシュ・ケ
ミー（Hoppe−Seyley's Z.Physiol.Chem.）,363,1043
（1982）。
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（1982）。
（12） W.A.ギュンツラー等，同上1055（1982）。
（13） M.グルンスタイン等，プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.），72,3961（1975）。
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシス
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ
（Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.），72,3961（1975）。
（14） J.メッシング，ニュークレイック・アシズ・リ
サーチ（Nucleic Acids Res.），９,309,（1981）。
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（15） K.L.アガーワル等，ジャーナル・オブ・ビオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），256,1023。
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（16） A.G.ステワート等，ニュークレイック・アシド
・リサーチ（Nucleic Acids Res.），11,6579（198
3）。
・リサーチ（Nucleic Acids Res.），11,6579（198
3）。
（17） J.ブロウシウス等，プラスミド（Plasmid）６,
112（1981）。
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（18） J.ブロウシウス，ジーン（Gene）27,151（198
4）。
4）。
（19） J.ブロウシウス，ジーン（Gene）27,161（198
4）。
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（20） J.メッシング（1983），メソズ・イン・エンチ
モロジー（Methods in Enzymology）101,20−78。
モロジー（Methods in Enzymology）101,20−78。
（21） W.D.ベントン,R.W.デビス（1977），サイエン
ス（Science），196 180。
ス（Science），196 180。
第１−１図〜第１−３図は、プラスミドpDPA3中の、ヒ
ト−組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする
cDNA挿入部の塩基配列及び、それに含まれるオープンリ
ーディグクレーム中の対応するアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸配列中小文字で示す部分はリーダー配列であり、
大文字で示す部分が組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーのアミノ酸配列である。 第２−１図〜第２−３図は、プラスミドpKU22中の、ヒ
ト−プロウロキナーゼの全コード領域を含むcDNAの塩基
配列、及びこれに含まれるオープンリーディングフレー
ム中の対応するアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列中小
文字で示す部分はリーダー配列であり、大文字で示す部
分がヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列である。 第３−１図及び第３−２図は、この発明のハイブリドポ
リペプチドの例を模式的に示す。 第４図は、ヒト−プロウロキナーゼをコードする遺伝子
を含有するプラスミドの作製の系統図である。 第５図は、本発明のハイブリドポリペプチドを含有する
各種のプラスミドの作製の系統図である。 第６図は、プラスミドpPE3とプラスミドpKYU21からのプ
ラスミドpKYU22の作製を示す。 第７図は、プラスミドpPE3の制限酵素地図を示す。 第８図は、プラスミドpKYU22と合成DNAオリゴマーから
のプラスミドpKMU1の作製を示す。 第９図はプラスミドpMUT4Lの作製を示す。 第10図は、プラスミドpKYU22及びファージM13pm8RFDNA
からの1200bp挿入部を有する一本鎖ファージDNAの作製
を示す。 第11図はプライマーを用いる点変異形成の方法。 第12図は変異体ファージM13二本鎖DNA（pm3）及びプラ
スミドpMUT4LからのプラスミドpMUT4Lpm3の作製を示
す。 第13図はプラスミドpYUT3、pDPA3、及びpK12からのプラ
スミドpDPAT2の作製を示す。 第14図はプラスミドpDPAT2、とpMUT4L（pPE3pとも称す
る）又は、pMUT4Lpm3（pPE3pm3とも称する）とからのプ
ラスミドpHA00又はpHA03の作製を示す。 第15図はプラスミドpDPAT2と、プラスミドpHA00又はpHA
03からのプラスミドpHA20又はpHA23の作製を示す。 第16図はプラスミドpHA23からのプラスミドpHA13の作製
を示す。 第17図は大腸菌JM103/pHA03からの発現生成物サンプル
（レーン２）を、天然ヒト−プロウロキナーゼ（UK）を
生産する大腸菌JM103/pPE3（pMUT4L）からの発現生成物
サンプル（レーン１）及び天然ヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター（ｔ−PA）を生産する大腸菌JM103/pD
PAT2（レーン３）と比較した電気泳動図である。図中、
Ａはクマシーブルー染色による蛋白質組成を示し、Ｂは
抗ウロキナーゼ抗体と反応する生成物を酵素染色法によ
り示したものであり、Ｃは抗組織プラスミノーゲンアク
チベーター抗体と反応する生成物を酵素染色法により示
したものである。 第18−１図〜第18−４図は、種々のプラスミノーゲンア
クチベーター類のフィブリン親和性を示すアフィニティ
ークロマトグラフイーの溶出のプロフィールを示す。 第19図はプラスミドpMUT4L及びpMUT4Lpm1からのプラス
ミドpMUT59Lpm1の作製を示す。 第20図はプラスミドpHA20及びpMUT9Lpm1からのプラスミ
ドpHA21Lの作製、並びにプラスミドpHA20及びpMUT4Lpm4
からのプラスミドpHA24Lの作製を示す。 第21図はプラスミドpHA21L及びpMUT9Lpm1からのプラス
ミドpHA11Lの作製を示す。 第22図はプラスミドpHA21LからのプラスミドpHA01Lの作
成を示す。 第23図はプラスミドpHA24Lの発現生成物の不溶性画分
（レーン２）及び上清（レーン１）のSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果を示す。
ト−組織プラスミノーゲンアクチベーターをコードする
cDNA挿入部の塩基配列及び、それに含まれるオープンリ
ーディグクレーム中の対応するアミノ酸配列を示す。ア
ミノ酸配列中小文字で示す部分はリーダー配列であり、
大文字で示す部分が組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーのアミノ酸配列である。 第２−１図〜第２−３図は、プラスミドpKU22中の、ヒ
ト−プロウロキナーゼの全コード領域を含むcDNAの塩基
配列、及びこれに含まれるオープンリーディングフレー
ム中の対応するアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列中小
文字で示す部分はリーダー配列であり、大文字で示す部
分がヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列である。 第３−１図及び第３−２図は、この発明のハイブリドポ
リペプチドの例を模式的に示す。 第４図は、ヒト−プロウロキナーゼをコードする遺伝子
を含有するプラスミドの作製の系統図である。 第５図は、本発明のハイブリドポリペプチドを含有する
各種のプラスミドの作製の系統図である。 第６図は、プラスミドpPE3とプラスミドpKYU21からのプ
ラスミドpKYU22の作製を示す。 第７図は、プラスミドpPE3の制限酵素地図を示す。 第８図は、プラスミドpKYU22と合成DNAオリゴマーから
のプラスミドpKMU1の作製を示す。 第９図はプラスミドpMUT4Lの作製を示す。 第10図は、プラスミドpKYU22及びファージM13pm8RFDNA
からの1200bp挿入部を有する一本鎖ファージDNAの作製
を示す。 第11図はプライマーを用いる点変異形成の方法。 第12図は変異体ファージM13二本鎖DNA（pm3）及びプラ
スミドpMUT4LからのプラスミドpMUT4Lpm3の作製を示
す。 第13図はプラスミドpYUT3、pDPA3、及びpK12からのプラ
スミドpDPAT2の作製を示す。 第14図はプラスミドpDPAT2、とpMUT4L（pPE3pとも称す
る）又は、pMUT4Lpm3（pPE3pm3とも称する）とからのプ
ラスミドpHA00又はpHA03の作製を示す。 第15図はプラスミドpDPAT2と、プラスミドpHA00又はpHA
03からのプラスミドpHA20又はpHA23の作製を示す。 第16図はプラスミドpHA23からのプラスミドpHA13の作製
を示す。 第17図は大腸菌JM103/pHA03からの発現生成物サンプル
（レーン２）を、天然ヒト−プロウロキナーゼ（UK）を
生産する大腸菌JM103/pPE3（pMUT4L）からの発現生成物
サンプル（レーン１）及び天然ヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター（ｔ−PA）を生産する大腸菌JM103/pD
PAT2（レーン３）と比較した電気泳動図である。図中、
Ａはクマシーブルー染色による蛋白質組成を示し、Ｂは
抗ウロキナーゼ抗体と反応する生成物を酵素染色法によ
り示したものであり、Ｃは抗組織プラスミノーゲンアク
チベーター抗体と反応する生成物を酵素染色法により示
したものである。 第18−１図〜第18−４図は、種々のプラスミノーゲンア
クチベーター類のフィブリン親和性を示すアフィニティ
ークロマトグラフイーの溶出のプロフィールを示す。 第19図はプラスミドpMUT4L及びpMUT4Lpm1からのプラス
ミドpMUT59Lpm1の作製を示す。 第20図はプラスミドpHA20及びpMUT9Lpm1からのプラスミ
ドpHA21Lの作製、並びにプラスミドpHA20及びpMUT4Lpm4
からのプラスミドpHA24Lの作製を示す。 第21図はプラスミドpHA21L及びpMUT9Lpm1からのプラス
ミドpHA11Lの作製を示す。 第22図はプラスミドpHA21LからのプラスミドpHA01Lの作
成を示す。 第23図はプラスミドpHA24Lの発現生成物の不溶性画分
（レーン２）及び上清（レーン１）のSDSポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＤＳＭ ３６２９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７７７９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７９３１ (73)特許権者 999999999 日産化学工業株式会社 東京都千代田区神田錦町３丁目７番地１ (73)特許権者 999999999 東洋曹達工業株式会社 山口県新南陽市大字富田4560番地 (72)発明者 田川 道人 相模原市栄町３−16 (72)発明者 和田 政勝 東京都杉並区阿佐ケ谷北３−24−25 (72)発明者 山田 正幸 相模原市西大沼４−４−１ (72)発明者 横山 みどり 相模原市相模大野５−４−７ 第１立花 荘201 (72)発明者 沼尾 長徳 相模原市南台１−９−２
Claims (9)
- 【請求項１】ヒト−組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーのＮ末端のセリンを１位として少なくとも128位のセ
リンから215位のシステインまでを含んで成るフィブリ
ン親和性領域を含むポリペプチド部分とヒト−プロウロ
キナーゼの少なくとも酵素活性領域を含むポリペプチド
部分とを含んで成るハイブリドプラスミノーゲンアクチ
ベーター様ポリペプチド。 - 【請求項２】前記組織プラスミノーゲンアクチベーター
のフィブリン親和性領域を含むペプチド部分がヒト−組
織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端の１位のセ
リンから215位のシステインまで又は219位のグリシンま
でのポリペプチドである特許請求の範囲第１項記載のポ
リペプチド。 - 【請求項３】前記組織プラスミノーゲンアクチベーター
のフィブリン親和性領域を含むペプチド部分がヒト−組
織プラスミノーゲンアクチベーターのＮ末端のセリンを
１位として128位のセリンから215位のシステインまで又
は219位のグリシンまでのポリペプチドである特許請求
の範囲第１項記載のポリペプチド。 - 【請求項４】前記プロウロキナーゼの酵素活性領域を含
むペプチドがヒト−プロウロキナーゼのＣ末端側の酵素
活性領域である特許請求の範囲第１項に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項５】前記プロウロキナーゼの酵素活性領域を含
むペプチド部分に少なくとも１個のアミノ酸置換部分を
有する特許請求の範囲第１項又は第４項に記載のポリペ
プチド。 - 【請求項６】前記酵素活性領域を含むポリペプチドがヒ
ト−プロウロキナーゼのＮ末端のセリンを１位として15
0位のグルタミンからＣ末端の411位のロイシンまでのア
ミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するか又はその15
7位のフェニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換え
られているポリペプチドである特許請求の範囲第４項記
載のポリペプチド。 - 【請求項７】前記酵素活性領域を含むポリペプチドがＮ
末端のセリンを１位として132位のアラニンから411位の
ロイシンまでのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有
するか、あるいはその157位のフェニルアラニンが酸性
アミノ酸によって置き換えられておりそして／又は135
位のリジンが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸によって置
き換えられているポリペプチドである特許請求の範囲第
４項記載のポリペプチド。 - 【請求項８】前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸であ
り、そして前記塩基性アミノ酸以外のアミノ酸がグルタ
ミンである特許請求の範囲第６項又は第７項記載のポリ
ペプチド。 - 【請求項９】ヒト−組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの少なくともＮ末端のセリンを１位として少なくとも
128位のセリンから215位のシステインまでを含んで成る
フィブリン親和性領域を含むポリペプチド部分とヒト−
プロウロキナーゼの少なくとも酵素活性領域を含むポリ
ペプチド部分とを含んで成るハイブリドプラスミノーゲ
ンアクチベーター様なポリペプチドをコードするDNAセ
グメントを含有し、該ポリペプチドを発現することがで
きるプラスミドにより形質転換された大腸菌を培養し、
この培養物から前記ポリペプチドを採取することを特徴
とする前記ポリペプチドの製造方法。
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| JP1773486 | 1986-01-31 |
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| JPS62272975A JPS62272975A (ja) | 1987-11-27 |
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| JP62018626A Expired - Fee Related JP2589687B2 (ja) | 1986-01-31 | 1987-01-30 | ハイブリドプラスミノーゲンアクチベーター様ポリペプチド |
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- 1987-01-30 WO PCT/JP1987/000065 patent/WO1987004720A1/en unknown
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