JPH03255099A - プロテイナーゼ阻害因子、それらの調製方法およびそれらを含有する薬物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトのビクニン（ｂｉｋｕｎｉｎ）の阻害活
性を有するドメインに基づくペプチド変異型（すなわち
、インターα−トリプシン阻害因子の阻害活性を有する
成分、または尿トリプシン阻害因子）、微生物（バクテ
リア、下等真核生物）を使用する遺伝子操作の方法によ
り前記ペプチドを調製する方法、ならびにこれらのペプ
チド変異型を含有する薬物に関する。これらの変異型は
、セリンプロテアーゼ、例えは、膵臓および顆粒球エラ
スターゼ、カテプシンＧまたは血漿カリクレインを阻害
するそれらの能力により特徴づけられる。

プロテアーゼは細胞外空間に到達すると、効力のある内
因性プロテイナーゼ、例えば、α、−プロテイナーゼ阻
害因子により通常急速に押捉される（Ｔｒａｖｉｓ　　
＆　　５ａｌｖｅｓｓｅｎ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、５２．６５５．１９８３）。ある場合において
、この保護機構は働かないか、あるいは少なくとも適切
に働かず、結局重大な病理学的状態、例えば、なかでも
、気腫、敗血症性ショック、ショック肺、ＡＲＤＳ１慢
性関節リウマチ、凝固疾患、腎臓および肝臓の不全の発
生であることができる。特定の作用をもつプロテイナー
ゼ阻害因子は、効力のある治療剤としてこれに関して特
別に重要である。ヒトにおける使用のため特に重要であ
るプロテイナーゼ阻害因子は、自然ヒト阻害因子に類似
するアミノ酸配列を有する。これは、とくに、長期間の
治療、例えば、毒性またはアレルギー性副作用を予防す
るためのα１−プロテイナーセ欠損（気腫の発生）の処
置適用される。

α１−プロテイナーゼ阻害因子は好中球性エラスターゼ
であり、その細胞外聞書は炎症の事象において主な目的
であるが、それはいくつかの理由で治療学的使用に最適
には適さない。５３，０００ｄのその比較的高い分子は
、非生理学的に大きい重量の使用を特徴とする請求され
る量は遺伝子操作の手段により得ることかできるが、生
理学的方法においてグリコジル化されない組み換えタン
パク質の循環において生物学的寿命が減少するので、な
おより大きい量の阻害因子を使用することは必要であろ
う［マテソン（Ｍａｔｈｅｓｅｎ）ら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、）、２６１．１０４０．１９８６］。いずれの
場合においても、阻害因子はタンパク質分解および酸化
を受は易いと見なされる。

両者性質は、さらに、活性種の濃度を減少する。

酸化を受は易さは、遺伝子操作手段により、阻害因子の
反応性中心におけるメチオニン残基（Ｐｉ位置）を、例
えば、ロイシンで置換することによって排除することが
できるであろう［マクコートネイ　（ＭｃＣｏｕｒｔｎ
ｅｙ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１３．１．
９８５　］。

本発明の目的は、例えば、ヒトの病気の処置のための明
確により低い分子量を有するヒト白血球エラスターゼ、
カテブシンＧまたは血漿カリクレインに対して、プロテ
イナーゼ阻害因子を発生することである。これに関して
、この目的は、現在知られているヒト阻害因子の修飾に
より所望の阻害スペクトルを有するようにプロティナー
ゼ阻害囚を調整することができるどうかを検査すること
であった。このための適当な基本的分子として、ヒトイ
ンター−α−トリゾシンＩＴＩ（Ｓｃｈｒｅｉｔｍｔｉ
ｌｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒｓ　３６８．１９
８７；Ｇｅｂｈａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｌ、
ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅ＋、３６９３．１９
８８；Ｇｅｂｈａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ。

、ＦＥＢＳ　　　ＩＥＴＴ、２２９．６３．１９８８；
Ｇｅｂｈａｒｄ　　　ｅｔ　　　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、印刷中）、これは以後ビクニンと呼
ぶ（第１図）、ならびに血清および尿中の同一構造のク
ニック（Ｋｕｎｉｔｚ）型トリプシン阻害因子［わずか
のアミノ酸残基の置換によりこれらの阻害因子の自然阻
害スペク１−ルを特異的に変更することができた場合（
第１図）］の阻阻害性のを有するサブユニットを考える
ことができるであろう。それらは単一の遺伝子の一次翻
訳産生物のタンパク質分解的成熟の結果であり（Ｋａｕ
ｍｅｙｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１４．７８３９Ｓ１、９８
６　）そしてトリプシンにより排除することができるＮ
末端ペプチド（アミノ酸残基ｌ〜２１）および２つの連
続の構造的に関係するドメイン（ドメインｌはＮ末端ド
メインであり、アミノ酸残基２２〜７７として定義され
、そしてドメイン２はタンパク質のＣ末端部分であり、
アミノ酸残基７８〜１□１７どして定義される）から成
り、そしてこれらは、また、トリプシンの処理により単
一に得ることができる。両者のドメインは異なる特異性
のプロテイナーゼ阻害活性を有する（Ｇｅｂｈａｒｄ　
　＆　　Ｈｏｃｈｓｔｒａｆｌｅｒ、　　プロテイナー
ゼ阻害因（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　　Ｉｎｈｉｔｏｒｓ
）、Ｂａｒｒｅｔｔ　　＆　　５ａｌｖｅｓｅｎ編、Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒｓ　　１９８６、ｐ、３７５）。

とくに生理学的場合に依存して、急性期のタンパク質ビ
クニンは複合した形態（ＩＴＩまたは免疫グロブリンと
複合してで）および複合しない形態（これは次いでＳＴ
Ｉとして検出可能である）の両者で存在することができ
る。ＵＴＩは腎臓の濾過を実施した実施したＳＴＩであ
る。したがって、個々の阻害因子は、それらが他のタン
パク質が関連する否か、あるいは異なる体液中で検出さ
れることにおいてのみ異なる。

例えば、ビクニンドメインに基づく好中球性エラスター
ゼ、カテゾシンＧまたは血漿カリクレインの特異的また
はタンパク質の阻害因子は、阻害因子のドメインＩまた
はドメインＩＩの反応性中心の位置Ｐ１におけるアミノ
酸残基の置換により得ることかできるであろう。さらに
、ドメイン、例えば、とくにＰ２′位置において追加の
置換は、阻害性質をさらに改良することができる。

したかって、本発明は、一般に、その阻害スペクトルか
、位置Ｐ１においてｆゴかりでなく、かつまた反応性中
心のｐ＋２位置において、自然アミノ酸残基か、他の自
然アミノ酸残基で置換されている、クニツ型阻害因子に
関し、ことにヒトのビクニンの単一のドメイン、または
互いに結合したドメインに基づいて得られた阻害因子に
関し、ただし自然阻害因子またはその個々のドメインの
阻害性質が、一方または双方の反応性中心の位置Ｐ。

および／またｉ：ｊＰ２’　の自然アミノ酸残基が任意
の自然アミノ酸により、とくにＡｌａＳ　Ｇｌｙ。

１１ｅ、Ａｒｇ％丁〕ｈｅ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐお
よびＬｙＳからなる群からのアミノ酸による置換により
変更および／または改良されていることを条件とする。

さらに、本発明は、まＩこ、合成ＤＮＡをもつ自然ｃＤ
ＮＡの領域のコドンおよび結合の特定の選択に無関係に
、阻害因子の変異型のための基準を形成する遺伝子構成
体に関する。

さらに、本発明は、また、一方または双方のＰ１位置な
らびに一方または双方のＰ２′　における置換の外に、
また、他の位置において他の置換が存在する。この型の
追加の置換は所望の阻害性質を改良することができ、よ
り好適な薬力学挙動を生じ、生体内の半減期を延長する
か、あるいはより好適である工業的調製を生ずる。

最後に、本発明は、また、性質および程度が、基本構造
の形成に必要な位置２６および７６（阻害因子のドメイ
ン１）および８２および１３２（阻害因子のドメイン２
）におけるシスティン残基を除外して、異なるＮ末端お
よびＣ末端のペプチドのセグメントを有するビクニンに
関する。本来定義されたドメインの限界（阻害因子のド
メイン１の１−ｙｓ２２およびＡ　ｒ　ｇ　”および阻
害因子のドメイン２のＴｈｒ”およびＡ、　ｓ　ｎ　”
７）は、トリプシンを使用して遠戚することができる機
能的ペプ一 チドへの分割を基準にして定められ、そして今回決定さ
れたエクソン領域と正確に一致しない（Ｖｅｔｒ　　ｅ
ｔ　　ａｔ、、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ、、印刷中、１９
８９）。これに従い、２つの阻害因子のドメインは、そ
れぞれ、アミノ酸残基Ａｓｐ２１およびＶａ、１７９、
およびＡｌａ”およびＡｓｐ１３７により制限されるで
あろう。使用する発現系に依存して、個々の遺伝子の構
成体は、これらが阻害因子の変異型中に、全体でまたは
一部分で、保持されるかどうかおよび前駆体タンパク質
の一部分として単に一時的に機能するかどうか、および
これらの発現を自然ビクニンまたは外米タンパク質に割
り当てるかどうかに無関係に、Ｎ末端またはＣ末端の遺
伝情報を指定することができる。

例えば、Ｍｅｔ残基を除外してビクニンの自然アミノ酸
配列と同一である、Ｎ末端配列Ｍｅｔ”Ｔｈ　ｒＩ９−
Ｖａ　１２０−Ｌｙ　ｓ”は、トリプシンを使用する切
断により、本来定められるドメインｌの組成に相当する
単一の産生物を、有利に得ることかできる。また、この
ようにして、ビクニンをＮ末端の外来タンパク質のセグ
メントをもつ構成体からビクニンのドメインを円滑に除
去することができる。直接の発現（Ｎ末端の外来タンパ
ク質セグメントをもだない）のとき、また、ある種の条
件下に、Ｎ末端メチオニンの部分的排除または完全な排
除さえを期待することができる。治療の応用においてド
メイン１の単一ヘッドの構成体上のＣ末端のアルギニン
の除去の可能性を防止するために、ある場合において、
Ｃ末端の伸長は好ましい。

ビクニンの変異型またはビクニンの変異型の断片の発現
は、バクテリアまたは真核生物の系を使用して連続的に
実施することができる。こうして、バクテリア系のうち
で、例えば、次のものが適当である：大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ。

１ｉ）Ｋ１２菌株中の発現系；細胞質中の非融合形態、
細胞内で形成されかつ適当な融合相手、例えば、ＭＳ２
レプリカーゼのＮ末端部分に接続されている融合タンパ
ク質として、あるいはまた阻害活性を有しそしてペリプ
ラスミック（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ）空間中に適当な
シグナルペプチド、例えば、ＯｍｐＡシグナル配列のシ
グナルペプチドの使用により分泌される産生物として。

真核生物の系のうちで、例えば、酵母菌の分泌系であり
、ここで発現産生物は適当なリーダー配列、例えば、ア
ルファ因子のｐｒｅ−ｐｒｏ−配列により、分泌ルート
を経て、運ばれ、そして阻害活性を有する物質として培
地中に解放される。

さらに、細胞内合成を生ずる酵母菌の発現系を使用する
ことができる。

しかしながら、多くの他の原核生物および真核生物の発
現系、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブド
ウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ。

ｃｃｕｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ア
スペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　Ｉｕｓ）または
他の宿主菌株を使用することがさらに可能である。

目的が哺乳動物中に存在するものに類似するグリコジル
化を達成する場合、正しくグリコジル化する系を選択し
なくてはならない。非グリコジル化ビクニン変異型は原
核生物の発現系において得られる。酵母菌の発現系は、
通常、哺乳動物のグリコジル化パターンと異なるグリコ
ジル化を生ずる。酵母菌の発現系を使用して得られる非
グリコジル化ビクニン変異型は、脱グリコシク化酵素の
使用によるか、あるいはグリコジル化することができな
い変異型の発現により調製することができる。

本発明は、無毒の不活性製剤学的に適当な賦形剤に加え
て、１種または２種以上の本発明の化合物を含有するか
、あるいは１種または２種以上の本発明の活性化合物か
ら成る製剤学的配合物、およびこれらの調製物の調製方
法を包含する。

本発明は、また、投与単位の製剤学的配合物を包含する
。これは、配合物が個々の部分、例えば、錠剤、被覆し
た錠剤、カプセル剤１、大割、座薬およびアンプルの形
態で存在し、その活性化合物は個々の投与量の分画また
は多数に相当する。投与単位は、例えば、個々の投与量
の１，２．３または４倍または１／２．１／３またはｌ
／４を含１− ２− 有することができる。個々の投与量は、好ましくは、１
回の投与で与えられかつ通常１日の投与量の全体、ｌ／
２．１／３または１／４に相当する量の活性化合物を含
有する。

無毒の不活性の製剤学的に適当な賦形剤とは、すべての
タイプの固体、半固体または液体の希釈剤、充填剤およ
び配合助剤である理解すべきである。

述べることのできる好ましい製剤学的配合物は、錠剤、
被覆した錠剤、カプセル剤、大割、顆粒剤、座薬、溶液
、懸濁液および乳濁液、パスタ、軟膏、ゲル、クリーム
、ローシコン、粉剤およびスプレーである。

錠剤、糖剤、カプセル剤、大割および顆粒剤は、慣用の
賦形剤に加えて活性化合物を含有することができ、賦形
剤の例は次のとおりである：　（ａ）充填剤および増量
剤、例えば、澱粉、ラクト−ス、スクロース、グルコー
ス、マンニトールおよヒサリチル酸、（ｂ）結合剤、例
えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼ
ラチンおよびポリビニルピロリドン、（Ｃ）保温剤、例
えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭
酸カルシウムおよび炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤
、例えば、パラフィンおよび（ｆ）吸収促進剤、例えば
、第四アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セ
チルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、
（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトお
よび（ｊ）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシ
ウム、ステアリン酸マグネシウムおよび固体のポリエチ
レングリコール、またはすぐ上に列挙した（ａ）〜（ｉ
）の物質の混合物。

錠剤、糖剤、カプセル剤、大割および顆粒剤は、必要に
応じて不透明化剤を含有する、慣用の被膜および外殻を
有することができ、そして、また、活性化合物のみを放
出するか、あるいは必要に応じて遅延した方法で、腸管
のある部分において優先的に活性化合物を放出するよう
な組成をを有することができる。使用できる埋め込み組
成物の例は、ポリマーの物質およびろうである。

活性化合物は、また、マイクロカプセル化された形態で
存在することができ、適当ならば１種または２種以上の
前述の賦形剤を含有することかできる。

座薬は、活性化合物に加えて、慣用の水溶性または水不
溶性の賦形剤、例えば、ポリエチレングリコール、油脂
、例えば、カカオ脂および高級エステル（例えば、Ｃ８
−アルコールおよびＣ１６脂肪酸のエステル）、または
これらの物質の混合物を含有することができる。

軟膏、パスタ、クリームおよびゲルは、活性化合物に加
えて、慣用の賦形剤、例えば、動物および植物の油脂、
ろう、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘
導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナ
イト・、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれら
の物質の混合物を含有することができる。

粉剤およびスプレーは、活性化合物に加えて、慣用の賦
形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化ア
ルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、
またはこれらの物質の混合物を含有することができる。

スプレーは、さらに、慣用の噴射剤、例えば、クロロフ
ルオロ炭化水素を含有することができる。

溶液および乳濁液は、活性化合物に加えて、慣用の溶媒
、例えば、可溶化剤および乳化剤、例えば、水、エチル
アルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢
酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート
、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール
、ジメチルホルムアミド、油類、とくに綿実油、グラウ
ンドナラｈ　（ｇｒｏｕｎｄｎｕ　ｔ）油、トウモロコ
シ胚油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油、グリセロ
ール、グリセロールホルマール、テトラヒドロフルフリ
ルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタ
ンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物を含
有することができる。

非経口的投与のために、溶液および乳濁液は、また、血
液と等張である無菌の形態であることができる。

５− １６ 懸濁液は、活性化合物に加えて、慣用の賦形剤、例えば
、液状希釈剤、例えば、水、エチルアルコールまたはプ
ロピレングリコールおよび懸濁剤、例えば、エトキシル
化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソル
ビト−ルおよびソルビタンエフ、チル、微結晶ＪＲセル
ロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト
、寒天およびトラガカント、またはこれらの物質の混合
物を含有することができる。

述べた配合物の形態は、また、着色剤、防腐剤、匂いお
よび味の改良剤、例えば、ペパーミント油およびユーカ
リ油および甘味剤、例えば、サッカリンを含有すること
ができる。

本発明の活性化合物は、好ましくは、前述の製剤学的配
合物中に、合計の混合物の約０．１〜９９．５重量％、
好ましくは約０．５〜９５重量％の濃度で存在すべきで
ある。

前述の製剤学的配合物は、また、他の製剤学的に活性な
化合物を本発明の化合物に加えて含有することができる
。

前述の製剤学的配合物は、慣用の方法で、既知の方法、
例えば、活性化合物を賦形剤と混合することによって調
製される。

活性化合物または配合物は、局所的に、経口的に、非経
口的に、腹腔内におよび／または経直腸的に投与するこ
とができ、好ましくはこれは経口的または非経口的に、
例えば、静脈内または筋肉内に実施する。

一般に、ヒトおよび動物の両者の医学において、本発明
の活性化合物を、約０．５〜５００、好ましくは４〜１
００ｍｇ／ｋｇ体重の合計量で、２４時間毎に、適当な
らばいくつかの個々の投与の形態で投与して、所望の結
果を達成することは有利である。個々の投与量は、本発
明による活性化合物を好ましくは約１〜約２５０１とく
に３〜６０ｍｇ／ｋｇ体重の量で含有する。しかしなが
ら、前述の投与量から逸脱することが必要であることが
あり、とくに処置すべき患者の性質および体重、病気の
性質およびひどさ、配合の性質および薬物の投与の性質
および投与を行う期間または間隔に依存してそのように
することが必要なことがある。

こうして、ある場合において、前述の量より少ない活性
化合物と管理することが十分であることがある。活性化
合物の必要な最適な投与量および投与時間は、専門家に
より彼の経験に基づいて容易に決定することかできる。

１迭 １）　Ｎ　Ａを制限酵素で切断する方法、ＤＮＡポリメ
ラーセＩ（クレノー断片）の存在下に５″　−突起する
末端にｄＮＴＰを充填する方法、ヤエナリヌクレアーセ
を使用する消化の方法、ＤＮＡのゲル電気泳動、Ｄ　Ｎ
　Ａ断片の分離、Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換およびコロニ
ーハイブリダイゼーションの方法は、次の文献に記載さ
れている標準の方法：マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　　Ｃ１ｏｎｉ＋＋ｇ）、コールド・スプリング・ハー
バ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）（
１９８２）；製造業者の情報を考慮する［ベーリンガー
・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅ
　ｉｍ）（Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ）　、バイオラプス（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ）、ファーマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（Ｆｒｅｌｂｕｒｇ）からの
制限酵素：ヤエナリヌクレアーゼ、ファーマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）、および成分Ｅ、ｃｏｌｉ細胞、ＢＲ
Ｌ　（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）］。

オリゴヌクレオチドの化学的合成 オリゴヌクレオチドは、７アーマシア遺伝子アセンブラ
−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｇｅｎｅ　　Ａｓｓ　ｅ　
ｍ　ｂ　Ｉ　ｅ　ｒ■）中で確立されたホスホルアミダ
イト化学（β−シアノエチルＮＮ−シイツブＯピルボス
ホルアミダイ）・）を使用して合威し、そしてポリアク
リルアミドゲルの電気泳動を変性することによって精製
した。

ＤＮＡの配列決定 個々の遺伝子の構成体のＤＮＡ配列を評価するために、
二本鎖ＤＮＡを各場合において両者の鎖においてチェノ
（Ｃｈｅｎ）およびセーバーグ（Ｓｅｅｌｌｕｒｇ）（
ＤＮＡ、４．１６５、＋９８５）９ ２０ の方法により直接配列決定した。

酵母菌の形質転換 ２ＸＩＯ’の細胞濃度を有する酵母菌菌株ＳＣ１０ＳＣ
１０６（アルファ、ｌ〕ｏ　ｍ　３、ｇａ１２、ｈ　ｉ
　ｓ　６、ｕ　ｒ　ａ　３　＋菌株５２２ＯＡ、Ｙｅａ
ｓｔ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　５ｔｏｃｈ　　Ｃｅｎｔ
ｅｒ１カリフォルニア大学、米国カリフォルニア州９４
７２０バーケレイ）の細胞懸濁液の１００ｍＱを回転し
た；細胞の沈澱を１回５ｍＱのＴＥ緩衝液（１０ミリモ
ルのトリスＸＨＣｌ、ｐＨ７゜５．１ミリモルのＥＤＴ
Ａ）で、次いで５ｍ１２のＬ　ｉ　Ａ緩衝液（０，１モ
ルのＴＥ緩衝液中の酢酸リチウム）で洗浄した。次いで
、細胞をＩｍＱのＬ　ｉ　Ａ緩衝液中に懸濁し、モして
３０’Ｃにおいて１時間インキコベーションした。この
ようにして得られた成分の細胞を４°Ｃにおいて１日間
貯蔵した。形質転換を次の方法で実施した。

１０℃ｇのプラスミド溶液（１〜５　ｔｔ　ｇのＤＮＡ
）およびｌ　５　ｐ　Ｑの担体ＤＮＡ　にシン精子から
の変性ＤＮＡ、３ｍｇ／ｍＱ）を、Ｏ，ＩｍＱの細胞懸
濁液に添加した。３０００において３０分間インキュベ
ーションし、次いで０．７ｍＱのポリプロピｌノングリ
コール（ＬｉＡ緩衝液中の４０％のポリプロピレングリ
コール３３５０）を添加し、次いで３０°Ｃにおいてさ
らに６０分間インキュベーションした。次いで、細胞を
熱衝撃（４２°Ｃ１５分）にかけ、引き統いてエラベン
ドル７のマイクロ７−ジ中で４秒間回転した。細胞の沈
澱を各回０−５ｍｆｆのＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次い
で細胞を０．１ｍ（２のＴＥ緩衝液中に懸濁し、そして
選択栄養培地上で平板培養した。形質転換体を３日後得
た。

分泌産生物の形質転換体および分析の増殖形質転換体は
、スレオニン、メチオニンおよびヒスチジン（各々２０
ｍｇ／（２）を補充したＳＤ培地（アミノ酸を含まない
０．６７％の窒素塩基、２％のＤ−グルコース）中で３
０℃において培養した。適切な細胞密度に到達した後、
細胞を各回し、そして培養懸濁液中のトリプシンまたは
エラスターゼを測定した。

ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 タンパク質は、通常、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの
電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎ　ａ　ｔ　ｕ　Ｉ’ｅ　
２７７．６８０，１９７０）およびクーマッンー（Ｃｏ
　ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）ブリリアン［・・ブルーを
使用する着色により検出した。

アミノ酸分析 約１ナノモルのタンパク質は２００ｍ（ｉの６モルのＨ
ＣＩ、０．０５％のβ−メルカプトエタノールの存在下
にＩＩＯ’Ｏにおいて真空下に２２時間インキュベーシ
ョンした。加水分解物を乾燥し、１５０１ｚ４の０．２
モルのクエン酸すｌ・リウム緩衝液ｐＨ２，２中に溶解
し、そして濾過した。アミノ酸分析はバイオトロニック
（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ）ＬＣ５０００アミノ酸分析器で
蛍光検出器およびシマズ（Ｓ　ｈ　ｏｍａ、　ｄ　ｚ　
ｕ）　Ｃ−Ｒ２ＡＸ積分器を使用して実施した。アミノ
酸を文献に従いフタルアルデヒドとの反応接定量した［
ベンツン（Ｂｅｎｓｏｎ）およびヘヤー（ｈａｒｅ）、
プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・−リ“イエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ、ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ％　　７２．６１９（１
９７５）］　　。

アミノ酸の配列決定 ３０　ｐ　Ｑの］・リフル調口酢酸中に溶解した１〜２
ナノモルのタンパク質を、ポリブレン処理したガラス繊
維のフィルターへ適用し、そして気相配列決定装置［ア
プライド・バイオシスデムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉ
ｏｓｙｓＬｅｍｓ）］中で文献の方法に従い配列決定し
た［ヘラインク（Ｈｅｗｉｃｋ）ら、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏ　１
．Ｃｈｅｍ、）、２５６．７９９０　（１９８１）］］
ｏ−ｙエニルヒダントイン誘導を、文献に記載されてい
るように、ウォーターズ（Ｗａ、ｔ　ｅ　ｒ　５）ＨＰ
ＬＣ系を使用してシアノＩ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム［デ
ュッポン（ＤｕＰｏｎＬ）］の助けにより分離および分
析した［ベリレウテル（Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ）ら、タ
ンパク質化学において現代の方法（Ｍｏｄｅｒｎ　　Ｍ
ｅｔｌ＋ｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｈｅ
ｍ３ ４ ｉ　　ｓ　　ｔ　　ｒｙ）、　３０３　　３２５、Ｗａ
ｉｔｅｒｄｅ　　Ｇｒｕｙｔｅｒ、ベルリン（１，９８
３）］。

！・リブシン阻害因子のアッセイ ］・リブシンの活性は、次の文献の方法に従い、基質と
してベンゾイル−Ｌ−アルギニンｐ−二トロアニリドを
使用して決定した：ゲイが−（Ｇｅｉｇｅｒ）およびフ
リッノ（Ｆｒｉｔｓ）、酵素分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　　Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）、Ｖｏｌ、Ｖ、第３版、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ編、Ｖ
ｅｒｌａｇ　　Ｃｈ　ｅ　ｍ　ｉ　ｅ　、ワインハイム
（１９８４）。遊離したｐ−二］・ロアニリンを分光光
度計で４．０５　ｎ　ｍにおいて測定した。酵素および
阻害因子を１５分間予備インキュベーションした後、基
質を添加しｌこ　。

エラスターゼ阻害アッセイ ヒト白血球エラスターゼは、エラスチン・プロダクツ・
カンパニー・インコーホレーテッド（ＥＩａｓｔｉｎ　
　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　Ｃｏｍｐａｎｙ　　Ｉｎｃ、、
米国ミシシッピイ州６３０６９バシフィック）から入手
した。使用した基質はＭｅＯ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ｖａｌ−ｐＮＡ　［ベイケム（Ｂａｃｈｅｍ）、スイ
ス国ブーベンドルフ］であった。アッセイの条件を表１
に示す。

般に、阻害因子の試料をアッセイの緩衝液で希釈し、酵
素を添加し、次いでこの混合物を予備インキュベーショ
ンした。反応は基質（ＤＳＭＯ中に０．１モルの濃度に
溶解し、そして原溶液を緩衝液でその濃度に調節した）
の添加により開始し、そして基質からのｐ−ニトロアニ
リンの遊離を４０５ｎｍにおいて連続的に追跡した。１
００％の値は阻害因子を使用しない対応するアッセイに
おいて決定した。阻害（％）は、次の等式から計算し　
ｌこ　。

阻害％−１００Ｘ［］、−（阻阻害子の存在下のΔＯＤ
）／　（阻害因子の不存在下の八〇Ｄ）］表１・　エラ
スターゼ阻害アッセイのだめの条件「ナカジマ（Ｎａｋ
ａ　ｊ　ｉｍａ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミスト　リ　−（Ｊ、　　　Ｂ　　ｉ　　ｏ　　
１．　　　Ｃｈｅｍ、　　　）　　、装」Ｊ、４０２７
　　（１９７９）］　　。

緩衝液 ０．２モルのトリス／ＨＣＩ、ｐＨ８゜０＋Ｏ，１％の
ツイーン８０ 基質の添加後の合計の体積 ０．６５ｍＱ 酵素の量／アッセイ ０ｎｇ 室温における予備インキュベーション ３０分 基質 Ｍｅ　　Ｏ−Ａ　　ｌ　　ａ　　　Ａ　　］　　ａｒｏ
−Ｖ １−ｐＮＡ 原溶液 ０．０６５モル 量／アッセイ ３０°Ｃ 実施例１ ビクニン遺伝子変異型の構成およびＥ、ｃｏｌｉ中の発
現 個々のビクニン遺伝子変異型は、一方において、自然ｍ
ＲＮＡに基づきそして、他方において、個々のドメイン
、またはその一部分に基づく。ｃＤＮＡは、適当なｃＤ
ＮＡのバンクから、オリゴヌクレオチドのプローブとの
ハイブリダイゼーション［カウメイアー（Ｋａｕｍｅｙ
ｅｒ）ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１４．７８３１−７８４９．
１９８６１によるか、あるいはヒトのインター−α−ト
リグシン阻害因子に対する抗体を使用するスクリニング
「シュレイトミューラ−（Ｓｃｈｒｅｉｔｍｔｉｌ　ｌ
　ｅ　ｒ）ら、Ｂ　ｉ　ｏ　１．　　Ｃｈ　ｅｍ、　　
Ｈ。

ｐｐｅ−３ｅｙｅｒ　　３６８．９６３−９７０．１．
９８７］により得られた。合成遺伝子（第１ドメイン）
または遺伝子セグメント（第２ドメイン）は、次のよう
にして得た： 第１ドメイン（ｄｅ［１−１７８−目’］−Ｍｅｔ７ ８ １８−ビクニン）およびその変異型（ｄｅ［ｌ−＋７７
８−口’］　−Ｍｅ　ｔ＋８−Ｘａａ”−Ｘａａ３８−
ビクニン遺伝子の構成、例えば、Ｘａａ−Ｔ　１ｅ１Ｌ
ｅ　ｕ　ＳＭ　ｅ　ｔまたはＶａ　ｌ）の遺伝子は、２
つの分子から構威し、それらは完全な合成により発生さ
れ、そして、単一にまたは一緒に、制限ヌクレアーゼ、
Ｎｃｏｌ、Ａ、５ｐ７１８および５ａｌｔの適当な組み
合わせで切断してこれらの遺伝子から除去することがで
きる。構成体は、種々のベクター系における遺伝子の操
作および、内部のＡ、　５ｐ７１８制限切断部位を経る
、変異型の調製のためのモジュールの置換を促進する（
第２図）。

モジュールＩはオリゴヌクレオチド１〜６を包含し、そ
してモジュール２はオリゴヌクレオチド７〜１２を包含
する。Ｘａａ３６−Ｘａａ３８の変異型の構成は、単に
、モジコールｌの置換を必要とする。モジュールｌ変異
型を構成するために、オリゴヌクレオチド２．３．５お
よび６を、必要に応じて、オリゴヌクレオチドの変異型
で置換し、こレラのオリゴヌクレオチドの変異型におい
て、Ｍｅｔのコドン（Ａ、　Ｔ　Ｇ　）がイソロイシン
のコドン（ＡＴＣ）またはロイシンのコドン（ＣＴＧ）
またはバリンのコドン（ＧＴＴ）またＬＪ反対の鎖の相
補的配列により置換されている。Ｎ末端の配列Ｖ−Ｔ−
には自然Ｎ末端ペプチドの一部分である。唯一の外来ア
ミノ酸は開始メチオニンであり、その排除は生体内のＥ
、ｃｏｌｉ中の遺伝子の直接の発現により遠戚すること
ができる。

クローニングの方法は第３図において概説されている。

プラスミドｐＴＺ］、８ＮＣＯは、ｐＴＺ１８Ｒ（ファ
ーマシア）をＥｃｏＲＩで切断し、ヤエナリヌクレアー
ゼで処理し、パリンドロームの配列５’　−ＡＣＣＡＴ
ＧＧＴ−３’　で結合し、そしてＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ
５中に形質転換することによって調製した。！皮体を配
列の分析により評価した。

シラスミドｐＴＺＭＯＤＩおよびｐＴＺＭＯＤＩＸＸ　
（ＸＸ＝ＩＬＳＬＭ、ＭＭ、ＬＬ、ＶＬ）は、プラスミ
ドｐＴＺ　１８ＮＣＯをＮｄｅｌおよびＡｓｐ７１８で
切断し、直線化プラスミドをオリボヌクレオチド１〜６
（モジュールＬ第２図）またはオリゴヌクレオチド変異
型（これはポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化されて
いる）で結合し、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５中に形質転換
し、放射線標識したオリゴヌクレオチド４でコロニーハ
イブリダイゼーションし、そしてプラスミドＤＮＡを分
離することによって特性決定した。

ｐ　Ｔ　Ｚ　Ｋ、　Ｕ　Ｎ　ｌは、プラスミドｐＴＺＭ
ＯＤＩをＡｓｐ７１８および５ａｌＩで切断し、直線化
プラスミドをオリゴヌクレオチド７〜１２（モジュル２
、第２図）（これはポリヌクレオチドキナーゼでリン酸
化されている）で結合し、Ｅ、ｃ。

１ｉＤＨ５中に形質転換し、そして放射線標識したオリ
ゴヌクレオチド１１でコロニーハイブリダイゼーション
することによって分離し、そしてプラスミドＤＮＡを分
離することによって特性決定した。

プラスミｌ’ｐＴＺＭＯＤ　ＩＸＸ　（ＸＸ−１１−。

ＬＭ、ＭＭ、ＬＬＸＶＬ）を構成するために、ｐＴＺＫ
ＵＮＩからＡｓｐ７１８およびＳ　ａ、　Ｉ　Ｉで除去
したモジュール２の断片を、このモジュールの個々のオ
リゴヌク１ノオチド７〜１２の代わりに使用し、そして
構成の手順はそれ以外すでに記載したものに類似した。

ｄ　ｅ　　［ト”］　−Ｍｅ　ｔ　”−Ｘａ　ａ”−Ｘ
ａ　ａ３ａビクニン型のビクニン遺伝子は、第１ドメイ
ンにおいてのみアミノ酸の置換をもつ二重ヘッドの変異
型である。それらは、第１ドメインの合成遺伝子または
その変異型を第２ドメインの自然遺伝子の断片と縮合す
ることによって得た。クローニングの方法は第４図に記
載されている。

プラスミドｐＴＺＢ　Ｉ　Ｋは、ｐＴＺｌ、８Ｒ中で制
限ヌクレアーゼＳ　ａ　ｕ、　３　Ａを使用する切断に
よリクローニングした、α、−ミクログロブリンービク
ニンクローン（ｐＴ２１８ＭＢ　１）のｃＤＮＡから得
た。この発生した断片Ａ（第４図）し、これはゲル電気
泳動により分離した。この断片は、ビクニン遺伝子のほ
とんど完全な配列を有するが、１ ２− α１−ミクログロブリンをエンコードする部分およびビ
クニンのＮ末端ペプチドのための遺伝子セグメントの小
さい部分なもたない。断片の末端を選択的にｄＡＴＰお
よびｄＧＴＰでクレノー酵素の存在下に充填し、ヤエナ
リヌクレアーゼで平滑末端とし、そしてプラスミドＩ）
ＴＺ１９Ｒ，（ファーマシア）（これはＨｉ　ｎ　ｄ　
Ｉ　Ｉ　Ｉで直線化されそして同様にヤエナリヌクレア
ーゼで平滑末端とされている）中にクローニングした。

Ｅ、ｃｏｌＤＨ５中への形質転換を実施した。生ずるク
ローンのプラスミドＤＮＡは配列の分析により評価した
。

プラスミドｐＴＺＢ　Ｉ　Ｋ　ｌおよびｐＴＺＢＩＫ］
　ＸＸ　（ＸＸ＝　Ｉ　Ｌ、ＬＭ、ＭＭＳ　ＬＬ、ＶＬ
）は、ビクニン遺伝子のドメイン１についての自然遺伝
子セグメントを適当な自戒遺伝子セグメントまたはその
変異型のセグメントで置換することによって発生させた
。ｐＴＺＢ　Ｉ　ＫのＤＮＡの断片ＣをＳｐｈ　］およ
びＰｓｔｌで切断後分離し、そしてこれはドメインｌの
ほとんどすべてについての遺伝子セグメントを除外して
、ビクニンの完全なｃＤＮＡを含有し、そして対応［７
て切断したプラスミドｐＴＺＫＵＮＩおよびｐＴＺＫＵ
ＮＩＸＸ　（ＸＸ＝　Ｉ　Ｌ、ＬＭ、ＭＭ、ＬＬ、ＶＬ
）（参照第３図）中に結合し、そしてＥ、ｃｏｌｉ　　
ＤＨ５中にクローニングした。生ずるクローンのプラス
ミドＤＮＡは、配列の分析により特性決定しｌこ　。

第２ドメインの遺伝子（ｄ　ｅ　　［”’］　−ビクニ
ン）は、ビクニンの切頭（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）によ
り得た（第５図）。その変異型（ｄ　ｅ［１−７９］Ｘ
ａａ９２−Ｘａａ９４−ビクニン）は、ドメイン２のＡ
ｖａ　Ｉ／Ｘｍｎ　Ｔ　ｎｏ制限断片（モジュール３）
をオリゴヌクレオチドＡ、、−Ｄまたはそれらの変異型
の適当な組み合わせ（第６図）で第７図に示すように置
換することによって調製した。

プラスミド１）ＴＺＫＵＮ２（第５図）は、断片Ａ（こ
れはｐＴＺＢＩＫＩ　　ＤＮＡを制限ヌクレアーゼＨｉ
ｎｄｒｒｌおよびＢ　ｓ　ｐ　Ｍ　Ｉで処理し、そして
断片の末端をヤエナリヌクレアーゼで平滑末端とするこ
とによって発生された）を、ベクターＩ）ＴＺ１９Ｒ（
７フーマンア）（これはＸｃｙＩで切断し、そしてＥ、
ｃｏｌｉ　　ＤＨ５細胞中の形質転換後、同様にヤエナ
リヌクレアーゼで処理されている）と結合することによ
って得た。個々のクローンのプラスミドＤＮＡは、配列
の分析により特性決定した。

プラスミドｐＴＺＫＵＮ２ＸＸ　（ＸＸ−Ｉ　Ｔ−。

ＬＬ、ＶＬおよびＬＦ）は、ｐ　Ｔ　Ｚ　Ｋ　Ｕ　Ｎ　
２　（７）　Ａｖａｌ／Ｘｍｎ１の断片をモジュール３
の適当なオリゴヌクレオチドで置換することによって得
た（参照、第６図）。ベクターの断片は、前記制限ヌク
レアーゼで切断後分離し、そして仔つシ腸アルカリ性ホ
スファターゼで５′末端を脱リン酸化した。ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化したモジュール３のオリゴヌ
クレオチドと結合し、そしてＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５中
に形質転換した後、個々のクローンのプラスミドＤＮＡ
をマツピングおよび、最後に、配列の分析により特性決
定した（第７図）。

両者のドメインにおいて置換をもつビクニン遺伝子の変
異型は、種々のドメイン１をもつビクニン遺伝子変異型
（ｐＴＺＢＩＫＩＸＸ；第４図）から、自然ドメイン２
の遺伝子セグメントを、第８図に示す方法において、ド
メイン２の遺伝子変異型の対応するセグメント（第７図
）で置換することによって発生された。

プラスミドｐＴＺＢＩＸＸの制限ヌクレアーゼＥｃｏＲ
ＩおよびＡｐａｌによる切断、仔つシ腸アルカリ性ホス
ファターゼによるＤＮＡ断片の５′末端の脱リン酸化お
よびベクター断片の分離を実施し、次いでｐＴＺＫＵＮ
２ＸＸから同様に分離したＥｃｏＲＩ／Ａｐａｌ断片と
結合し、モしてＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５中にクローニン
グした。

個々のクローンのプラスミドは、配列の分析によ３５− ６ り特性決定した。

アミノ酸配列Ｔ−Ｖ−Ａ、−Ａ　（ｄ　ｅ　［ト”　　
”〜”’］　−Ｍｅ　ｔ”−Ｘａａ”−Ｘａａ３８−ビ
クニン）による追加のＣ末端伸長をもつ第１ドメインの
遺伝子は、適当なビクニン変異型のプラスミドｐＴＺＢ
ＩＫＪＸＸから、第２ドメインをオリゴヌクレオチドａ
　（５’　−ＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＧ−３’　
）およびｌ）　（５’　−Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＴＣＡＧ
ＧＣＣＧＣＣ−３’　）で置換後、得た（第９図）。こ
の目的で、ｐＴＺＢＩＫＩＸＸをＢｓｐ　Ｍ　Ｉ　８よ
びＥｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡ断片の５′末端を仔つシ
腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し、そしてベ
クターの断片を分離し、そしてオリゴヌクレオチドの存
在下に結合した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＤＨ５の形質転換後、個々のクローン
のプラスミドｐＴＺＢ　ＩＫ　ＩＸＸｃＸＸ的分析によ
り評価した。

ビクニ；・変異型の発現 記載するビクニン遺伝子変異型のあるものは、クローニ
ングベクターそれ自体中でおよび種々の発現ベクター、
例えば、ｐＪＬＡ５０２　（Ｓｃｈａｕｄｅｒ　　ｅｔ
　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　　５２．２７９−２８３．１９
８７）およびｐＥＸ３（Ｓｔａ　ｎ　Ｉ　ｅ　ｙ　　＆
　　Ｌ　ｕ　ｚ　ｉ　ｏ、ＥＭＢＯＪ、３．１４２９−
１４３４．１９８４）８よびｐＥＸ３４０７　　（Ｋｏ
ｃｋｅｎ　　　　ｅ　　ｔ　　　　ａ　　１．　　、　
　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２３６、］、、　３２−　］、　
３４．１９８８）中の再クローニング後の両者において
、発現することができた。例えば、Ｎｃｏｌ／５ａｌｉ
およびＮ　ｃ　ｏ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片は、
それぞれ、グラスミドｐＴＺＫＵＮＩＸＸおよびｐＴＺ
ＢｒＫＩＸＸ２ＸＸ　（第３図および第８図）から分離
し、そして直接ベクターｐＪＬＡ５０２（相応して切断
しそして仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理され
ている）中に結合することができる。あるいは、プラス
ミドｐＴＺＢ　Ｉ　Ｋ　ＩＸＸ　（Ｎｃ　。

Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ１断片、第４図）、ｐＴＺＢＩ
ＫＩＸＸ２ＸＸ　（Ｎｃｏｌ／ＥｃｏＲＩ断片、第８図
）、　ｐＴＺＫＬＩＮＩＸＸ　　（Ｎｃｏｒ／Ｈｉｎｄ
ｌｌ■、第３図）からの断片を分離し、ヤエナリヌクレ
アーゼで平滑末端とし、そしてベクターｐＥＸ３または
ｐ　Ｅｘ　３４０７中に結合することかできる。

プラスミドｐＴＺＫＵＮ２ＸＸ　（第７図）の断片は、
ＥｃｏＲＴで切断し、ヤエナリヌクレアーセで処理し、
次いでＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切断し、そし、てｐＥＸベク
ター中に結合することができる。ｐＥＸベクターのＤ　
Ｎ　Ａは、この目的で、５ａｌＩで切断しそしてヤエナ
リヌクレアーゼで処理するか、あるいは最後に述へた構
成におけるように、ヤエナリヌクレアーゼで処理し、次
いでＢ　ａ　ｍ　Ｉ−（Ｉで処理することができる。Ｅ
、ｃｏｌｉ　　ｐｏｐ２１３６の形質転換体（Ｖｉｄａ
　ｌ−１ｎｇｉｇｌｉ１−１ｎ　　＆　　Ｒａｕｂａｕ
ｄｓ核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）、Ｉ３．１１６３．１９８５）は、遺
伝子の発現の温度依存性制御を可能とする。各場合にお
いて産生される融合タンパク質は、酸不安定なＡＳｐＰ
ｒｏペプチドの１ｋｇを経て発現すべきタンパク質に結
合する。融合タンパク質の部分の除去、ビクニン部分の
精製および復元ｈ　ａ、　ｄ　ｅ　　［”］］Ｐｒｏ１
８−ビクニンｄｅ［しＩ＋　　７８−１＋７）ＰｒＯ１
８−ビクニンおよびｄ　ｅ　　Ｉ’−７８］　　　Ｐ　
ｒ　。

７９−ビクニンの型の阻害因子の変異型を生じた。

ビクニン部分は、また、融合相手から、タンパク質分解
（トリプシンを使用する）に対してとくに不安定な配列
Ｐｒｏ”−Ｌｙｓ２１−Ｌｙｓ”の使用により切断する
ことができる。単一ヘッドの変異型を分泌発現系におい
てとくによく発現することができた。

発現産生物は、ゲル電気泳動（例えば、融合タンパク質
の決定のため）によるか、あるいは標準の酵素阻害アッ
セイ（融合相手の排除、ビクニン部分の精製および復元
後）において検出された。

得られた結果は、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中の発現により
記載する方法で調製された、ｄｅ［＋−１７］Ｍ　ｅ　
ｔ　−１８−Ｌ　ｅ　１１−３６−１−　ｅ　ｕ　−３
８−ビクニン、ｄｅ　　［”’］　−Ｍｅ　ｔ−１８−
Ｌｅｕ９ ４０ ３６−Ｌｅｕ−３８−Ｌｅｕ−９２−Ｌｅｕ　−９４−
ビクニンおよびｄ　ｅ　　［’−１７１−Ｍｅ　ｔ　−
１８−Ｌｅ　ｕ−９２−Ｌｅ　ｕ−９４−ビクニンは、
効力のあるプロテアーゼ阻害作用を有する。

実施例２ ２から誘導された（これはＭＡＴ−アルファー１の構造
遺伝子を含有する）（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏ
ｗｉｔｚ、Ｃｅ１ｌｘ　３０．９３３．１９８２）は、
ヘルスコウィッツ（Ｈｅ　ｒ　ｓ　ｋ　０ｗ１ｔｚ）（
カルフォルニア大学）から入手したｐＭＴｌ、５は酵母
菌−Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベクターである（第１０図）
。それはＡ、ｍｐＲｂｌａおよびＵ　ＲＡ、　３遺伝子
セグメンｌ−（これらはＥ。

ｃｏｌｉおよび酵母菌の選択可能なマーカーとして作用
する）を有する。ｐＭＴｌ、５は、さらに、ｐＢＲ３２
２のＣｏ１ＥＩ由来および２μのプラスミドのＢ形態の
セグメントを有するので、プラスミドはＥ、ｃｏｌｉお
よび酵母菌の両者において安定な複製を行うことができ
る。それは、さらに、ＭＡＴＩ−アルファプロモーター
および、プラスミドｐｃＹ１７から得られたＥ　ｃ　ｏ
　Ｒｒ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片として、アルファ因子の
前駆体のＮ末端のｐｒｅ−ｐｒｏ−配列の解読配列を有
する。この断片に引き続いて３′に、前インベルターゼ
の３４のＮ末端のアミノ酸の遺伝情報を指定する１１５
ｂｐのＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＴ
断片が存在する（Ｄａｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、モレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス（Ｍｏｌ
ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　ｉｃ、）２１８、ｐ、２４
０，１９８９）。最後に、ｐＭＴｌ５は、酵母菌ＵＲＡ
３遺伝子から得られた酵母菌の転写ターミネータ−の１
６０ｂｐの断片をＢ　ａ　ｍ　Ｈ１切断部位の３′末端
に含有した［Ｙａｒｇｅｒｅｔ　　ａｌ、、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅｌ
　１．Ｂｉｏｌ、）、８．１０９５．１９８６］。

アルファー因子ｐｒｅ−ｐｒｏ−リーダー配列の解読領
域を有するｐ　Ｍ　Ｔｌ　５からの２３５ｂｐのＰｓｔ
　ｌ−Ｈｌｎｄｌ　Ｉ　ｒ断片を、ベクターＭ］、　３
　ｍ　ｐ　ｌ　８中にクローニングし、そして突然変異
原のオリゴヌクレオチド５’　−ＧＡＡ　　ＧＡＡＧＧ
Ｇ　　ＧＴＡ　　ＴＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＡ　　ＡＧ
Ａ−３’　を使用して特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然
変異誘発にかけた。この突然変異誘発により、アルファ
ー因子ｐ　ｌ’　ｅ　−ｐ　ｒ　Ｏ−配列中の位置８１
におけるセリンのコドンはＴ　ＣＴからＡ、　Ｇ　Ｃに
変化され、Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｔ　Ｉ制限切断部位を発
生した。これにより調製された２１３ｂｐのＰｓｔｌＨ
ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片（第１１図）を使用して、
ｐＭＴ１５中の２３５ｂｐのＰｓｔｒ−ＨｉｎｄＩＩＩ
断片を置換した。このようにして修飾されたプラスミド
をｐｓａｏ０と呼んだ；それは処理部位としてＬｙｓ−
Ａｒｇ−Ｇ！ｕ−Ａｈａ−Ｇｕ−Ａｌａの代わりにＬｙ
ｓ−Ａｒｇのための解読配列を有する（第１２図）。

Ｌ　ｅ　ｕ　−３６−Ｌ　ｅ　ｕ　−３８−ビクニン遺
伝子の構成：ビクニンの解読配列（第１３図）を有する
プラスミドＰＩＭＩ（ＤａｓおよびＬ　ｅ　ｈ　ｍ　ａ
ｎ、　　Ｊ、Ｃｅ　　ｌ　　１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　　、　２Ｂ％　　２８４．１９８８）からの５４０ｂ
ｐの５ａｕ３ＡＩ断片を、Ｍｌ　３ｍｐ　ｌ　９中にク
ローニングし、そして部位特異的突然変異させてＭｅｔ
−１６をＬ　ｅ　ｕ−１６にそしてＭ　ｅ　ｔ−３８を
Ｌｅｕ−３８に形質転換した。突然変異誘発はセイヤー
ス（Ｓａｙｅｒｓ）ら［核酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１６．７９、（１９
８８）］の方法により実施した。さらに、次の配列の二
本鎖のＤＮＡ断片を調製した：５′・・・ＡＧＣＴＴＧ
　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　
ＣＣＣＣＡＡ３’−ＡＣＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＣＧ
Ａ　ＣＧＡ　ＣＡＣＧＡＴ　ＧＧＧ　ＧＴＴＧＡＡ　Ｇ
ＡＧ　ＧＡＡ　Ｇ・・・・・・・・・・・３′ＣＴＴ　
ＣＴＣＣＴＴ　ＣＣＴ　ＡＧ・・・・・・５′ＤＮＡ断
片を標準の方法によりリン酸化した。

このようにして得られたＤＮＡ断片を、突然変異したビ
クニン配列と一緒に、ＨｉｎｄｌｒＩおよびＢａｍＨｒ
で消化した８、２ｂｐのｐｓａｏ。

中に挿入した。オリゴマーは、ｐｒｅ−ｐｒ。

アルファー因子の３′末端およびビクニン配列の４３ ４ ５′末端の両者を再構成した。したがって、このように
して得られた新しいプラスミドｐ　Ｌ　Ｉ−８３６３８
は、Ｌ　ｅ　ｕ　−３６−Ｌ　ｅ　ｕ　−３８−ビクニ
ン配列に融合した処理部位としてＬ　ｙ　ｓ　−Ａ、　
ｒ　ｇをもつｐ　ｌ’　ｅ−ｐ　ｒ　Ｏ−アルファー因
子のための解読配列を含有する。ｐＬＬＢ３６３８中の
ＤＮＡおよびｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子−Ｌｅｕ
−３６−Ｌｅｕ−３８−ビクニンの融合部位における対
応するアミノ酸配列を第１４図に示す。

Ｃ１０６（ＭＡＴｄ、　　ｈｏｍ３、　ｇａ＋２、　ｈ
ｉｓ６、ｕｒａ３）を、前述の方法に従い、ｐＬＴ、。

Ｂ５６３８を使用して形質転換した；ＵＲＡ３”細胞を
分離し、そして培養した；培養上澄み液をエラスターゼ
阻害活性について試験した。対照試験において、ｐｓａ
ｏ０で形質転換した５ＣＩＯ６細胞は培地中でエラスタ
ーゼ阻害活性を産生しないことが示された。

その結果、ザッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発
現されたＬｅｕ−３６−Ｌｅｕ−３８＝ビクニン遺伝子
は、次の性質をもつ培地中で２つのタンパク質種の形成
に導いたことが示された：　（ａ）活性トリプシン阻害
因子、（ｂ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳
動に従い２０におよび１．７　ｋの分子量、（Ｃ）各タ
ンパク質種のうちで、約６０％はビクニンのＮ末端の配
列を示し、そして約４０％はｄｅ（Ａｌａ−１）ビクニ
ンの配列を示した。

実施例３ １３図）をもつｐＴＭＩ　　ＤＮＡの５４０ｂｐの５ａ
ｕ３ＡＩ断片（ＤａｓおよびＩ−ｅ　ｈ　ｍ　ａ、　ｎ
　。

Ｊ、Ｃｃ　　Ｉ　　１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　、　
１２Ｂ、　　２８４．１９８８）をプラスミドＭｌ　３
ｍｐ　ｌ　９中にクローニングし、そして特異的突然変
異誘発にかけて、Ａｒｇ−９２をＬ　ｅ　ｖ　−９２に
変え、そしてＰｈｅ−９４をＬｅｕ９４に変えた。この
ようにして突然変異した断片を、実施例１に類似する方
法でプラスミドｐｓ６００中にクローニングした。発現
ベクターｐＬＬＢ９２９４中のＤＮＡ配列およびｐ　ｌ
’　ｅ−ｐ　ｒ　Ｏ−アルファー因子−Ｌｅｕ　−９２
−Ｌ　ｅ　ｕ　−９４−ビクニンの融合部位における対
応するアミノ酸配列を第１５図に示す。

Ｓポリアクリルアミドゲル中の電気泳動に従い２０にお
よび１７にの分子量、（ｃ）各タンパク質種のうちで、
約６０％はビクニンのＮ末端の配列を示し、そして約４
０％はｄｅ（Ａ、ｌａ−］）ビクニンの配列を示した。

実施例４ 前述の方法に従い、ｐＬＬＢ９２９４を使用して形質転
換した。　Ｕ　ＲＡ、、　３４細胞を分離し、そして培
養した；培養上澄み液をエラスターゼ阻害活性について
試験した。対照試験において、ｐｓ６００で形質転換し
た５ｃ１０６細胞は培地中でエラスターゼ阻害活性を産
生じないことが示された。

その結果、ザッカロミセス・セレヒシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａ、ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖ＋ｓ＋ａｅ）中の発
現されたＬｅｕ−９２−Ｌｅｕ−９４ビクニン遺伝子は
、次の性質をもつ培地中で２つのタンパク質種の形成に
導いたことが示された＝　（ａ）活性エラスターゼ阻害
因子、（ｂ）ＳＤ遺伝子のクローニング：ビクニンの解
読配列（第１３図）をもつｐＩＭＩ　　ＤＮＡの５４０
ｂｐの５ａｕ３ＡＩ断片（ＤａｓおよびＬｅｈｍａｎ。

Ｊ、Ｃｅ　Ｉ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、１２Ｂｓ　２
８４．１９８８）をプラスミドＭ１３ｍｐｌＱ中にクロ
ーニングし、そして特異的突然変異誘発にかけて、Ｍｅ
ｔ３６をＬ　ｅ　ｕ−３６に変え、Ｍｅｔ−３８をＬｅ
ｕ−３８に変え、Ａｒｇ−９２をＬｅｕ−９２に変え、
そしてＰｈｅ−９４をＬｅｕ９４に変えた。このように
して突然変異した断片を、実施例１に類似する方法でプ
ラスミドルＳ６００中にクローニングした。発現ベクタ
ーｐ４４７ ８ Ｌ　Ｂ中のＤＮＡ配列およびｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファ
ー因子＝Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３６Ｌｅｕ−３８−９２−Ｌ
ｅｕ−９４−ビクニンノ融合部位における対応するアミ
ノ酸配列を第１６図に示す。

分泌および検出：５Ｃ１０６を、前述の方法に従い、ｐ
４ＬＢを使用して形質転換した。ＵＲＡ３“細胞を分離
し、そして培養した；培養上澄み液をエラスターゼ阻害
活性について試験した。対照試験において、ｐｓ６００
で形質転換した５Ｃ１０６細胞は培地中でエラスターゼ
阻害活性を産生じないことが示された。

その結果、ザッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現
されたＬｅｕ−３６−Ｌｅｕ−３８−Ｌｅｕ−９２−Ｌ
ｅｕ−９４−ビクニン遺伝子は、次の性質をもつ培地中
で２つのタンパク質種の形成に導いたことが示された：
　（ａ）活性エラスターゼ阻害因子、（ｂ）ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル中の電気泳動に従い２０におよび１
７にの分子量、（Ｃ）各タンパク質種のうちで、約６０
％はビクニンのＮ末端の配列を示し、そして約４０％は
ｄｅ（Ａｌａ　　ｌ）ビクニンの配列を示した。

実施例５ 遺伝子のクローニング：ｄｅ　（１−２１）−ビクニン
の解読配列（第１３図）をもつｐｌＭＩ　　ＤＮＡの４
８０１）　ｐのＰｖｕ　Ｔ　Ｉ断片（ＤａｓおよびＬｅ
ｈｍａｎ、Ｊ、Ｃｅ　ｌ　１．Ｂｌｏｃｈｅｍ。

１２Ｂ、２８４．１９８８）をプラスミドＭ１３ｍｐｌ
Ｑ中にクローニングし、そして特異的突然変異誘発にか
けて、Ｍ　ｅ　ｔ　−３６をＬｅｕ−３６に変え、そし
てＭｅｔ−３８をＬｅｕ−３８に変えた。突然変異誘発
はセイヤース（ＳａｙｅｒＳ）ら［核酸の研究（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａ、ｒｃｈ）、１
６．７９、（１９８８）１の方法により実施した。さら
に、次の配列の二本鎖のＤＮＡ断片を調製した： ５’−ＡＧＣＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ
　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴＧＣＣＡＧ−３’ＡＣＣＴ
Ａ　　Ｔ丁Ｔ　　ＴＣＴ　　Ｔ丁Ｔ　　ＣＴＴ　　ＣＴ
Ａ　　ＡＧＧ　　ＡＣＦ　　ＧＴＣ−５’ＤＮＡ断片を
標準の方法に」；リリン酸化した。

このようにして得られたＤＮＡ断片を、突然変異したビ
クニン配列と一緒に、Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　ｒおよび
ＢａｍＨＩで消化した８、２ｂｐのｐｓ６００中に挿入
した。オリゴマーは、ｐｒｅ−ｐｒ０アルファー因子の
３′末端およびビクニン配列の５′末端の両者を再構成
した。したかつて、このようにして得られた新しいプラ
スミドｐＤＬＬＢ１２１は、ｄｅ　（１−２１）−Ｌｅ
ｕ−３６Ｌ　ｅ　ｕ−３８−ビクニン配列に融合した処
理部位としてＬ　ｙ　ｓ　−Ａ　ｒ　ｇをもつｐ　ｒ　
ｅ−ｐ　ｒ　Ｏ−アルファー因子のための解読配列を含
有する。ｒ＋ＤＬ　ｉ−Ｂ　−１，２１中のＤＮＡおよ
びｐｒｅ−ｐｒ。

ア／ｌ／７７−因子−Ｌ　ｅ　ｕ−３６−Ｔ−ｅ　ｕ　
−３８ビクニンの融合部位における対応するアミノ酸配
列を第１７図に示す。

阻害活性ヲ有ず６ｄｅ　（１−２１）　−Ｌｅｕ−３，
６−Ｌｅｕ−３８−ビクニンの発現、分泌おＪ：び敗旦
ニ酵母菌菌株５Ｃ１０６を、前述の方法に従い、ｐ　Ｄ
　Ｌ　Ｌ　Ｂ　−１，２１を使用して形質転換した、　
Ｕ　Ｒ，Ａ、　３　”細胞を分離し、そして培養した；
培養上澄み液をエラスターゼ阻害活性について試験した
。対照試験において、ｐｓ６００で形質転換した５ＣＩ
０６細胞は培地中でエラスターゼ阻害活性を産生じない
ことが示された。

その結果、ザッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の発現
されたｄ　ｅ　（１−２１）　−Ｌｅ　ｕ３６−　Ｌ　
ｅ　ｕ　−３８−ビクニン遺伝子は、次の性質をもつ培
地中でタンパク質種の形成に導いたことが示された＝　
（ａ）活性ｉ・リプシン阻害因子、（ｂ）ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル中の電気泳動に従い１．７　］＜およ
び１．５　ｋの分子量、（Ｃ）タンパク質はｄｅ（１−
２１）−ビクニンのＮ末端の配列Ｌｙ　ｓ−Ｇ　Ｉ　ｕ
−Ａｓ　ｐ−３ｅ　ｒ−Ｃｙ　ｓを示した。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りであＩ ２ る。

１、ヒトのビクニンのアミノ酸２１〜１４７の配列を有
し、前記配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が
他の天然に産出するアミノ酸により置換されていること
を特徴とする、プロテイナーゼ阻害因子。

２、位置３６．３８．４５．９２．９４．９８．１、１
６の１または２以上のアミノ酸残基が他の天然に産出す
るアミノ酸により置換されている、上記第１項記載のプ
ロテイナーゼ阻害因子。

３、置換はＡ、　］　ａ　％　Ｇ　Ｉ　Ｖ　ＸＩ　ｌ　
ｅ　％　Ｉ−ｅ　ｕ　ＮＰｈｅ、Ｖａ、Ｉ、Ａ、ｒｇｚ
　Ｔｙ　ｒｌＴｒｐ、ＬｙＳからなる群からのアミノ酸
残基による、上記第１項記載のプロテイナーゼ阻害因子
。

４、次の置換： 位置３６　：　Ｌｅｕ、Ｉ　Ｉ　ｅ、Ｖａ　Ｉ、Ａｒｇ
、Ｐｈ　ｅｌＴｙ　ｒ、　Ｔ　ｒ　９％　Ｌ　ｙ　ｓに
よりＭｅｔ。

位置３８：Ｌｅｕｓ　Ａｒｇｓ　　Ｉ　Ｉｅ、Ｖａｌ、
ＬＳｓ 位置４５：他の自然アミノ酸によりＡｓｎ。

位置９２　：Ｌｅｕ、Ｉ　Ｉｅ、Ｖａ　ｌ、Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓによりＡ、ｒｇ。

位置９４　：ＬｅｕＳＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｉ　Ｉｅ、Ｖａ
ｌによりＰ　ｌ〕ｅ　ｓ 位置９８　：Ｔｙｒ、Ｌｙｓｓ　　Ｉ　Ｉｅｘ　Ｖａ　
Ｉ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒによりＴ
ｙ　ｐ　１ 位置１１６　：ＡｒｇＳＬｙｓによりＧ１１１％の所望
の組み合わせを有する、上記第１〜３項のいずれかに記
載のプロテイナーゼ阻害因子。

５．１または２以上のＭｅｔ残基は非酸化可能のアミノ
酸残基により置換されている、上記第１〜４項のいずれ
かに記載のプロテイナーゼ阻害因子。

６、Ｎ末端に追加のポリペプチドを有し、そのアミノ酸
配列はビクニンの自然配列１〜２１から誘導される、上
記第１〜５項のいずれかに記載のプロテイナーゼ阻害因
子。

７、グリコジル化を有するまたは有さない、上記第１〜
６項のいずれかに記載のプロテイナーゼ阻害因子。

８、上記第１〜７項のいずれかに記載のプロテイナーゼ
阻害因子から得られた、プロテイナーゼ阻害囚を有する
断片。

９、ビクニンのアミノ酸２２〜７７．１〜７７または７
８〜１４７の配列を本質的に含有する、上記第８項記載
の断片。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトのビクニンの一次構造を示す。 Ｎ末端ペプチド（位置１２１）およびドメインｌ（位置
２：２−７７）およびドメイン２（位置７８−１．４７
）は、トリプシンを使用する切断により得ることかでき
る。矢印は、異なるエクソンによりエンコードされる領
域の配列を示し、そして星印は反応性中心の特異的に変
更された残基Ｐ。 およびＰ２′　を示す。ビクニンの２つの阻害因子のド
メインにおける同一のアミノ酸残基は、垂直線で強調さ
れている。 第２図は、ｄ　ｅ　　［＋−１７７８−１４７３Ｍ　ｅ
　ｔｌ　８Ｘａａ３６−Ｘａａ”−ビクニン変異型の構
成および基本遺伝子のオリゴヌクレオチド配列を示す。 変異型において置換された残基は二重の下線を弓かれて
いる。Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉ認識配列ＣＣＡＴＧＧの境部分の
５″末端における第１コドン、および遺伝子の３′末端
における３つの連続する停止コドンの第３の最後のヌク
レオチド（ｌｅｉ）は、５ａｌＩ認識配列ＧＴＣＧＡＣ
の一部分である。個々のモジュールを限定する制限ヌク
レアーゼのＮｅ。 １、Ａｓｐ７１８およびＳａｌ＋は、−重の下線が引か
れている。遺伝子の構成に使用するオリゴヌクレオチド
は、矢印で表されており、そして番号を付されている。 第３図は、ｄｅ［１−Ｉ？　　７Ｍ−目７］−Ｍｅｔ１
８−ビクニン遺伝子（ｐＴＺＫＵＮｌ、）およびｄｅｌ
’＋７７８−口’］　−Ｍｅ　ｔ　＋８−Ｘａ　ａ”−
Ｘａ　ａ”ビクニン遺伝子の変異型（ｐＴＺＫＵＮ　Ｉ
　ＸＸ）のクローニングを示す。 第４図は、ｄ　ｅ　［ト１７　］　−ビクニン遺伝子（
ｐＴＺＢ　Ｉ　Ｋ）　、　ｄ　ｅ　　［’−＋７］　−
Ｍｅ　ｔ　”−ビクニン遺伝子（ｐＴＺＢｉＫｌ）およ
びｄ　ｅ　［ト１７　］５ Ｇ Ｍｅ　ｔ　’　−Ｘａ　ａ”−Ｘａ　ａ”−ビクニン遺
伝子（ｐＴＺＢＩＫＩＸＸ）のクローニングを示す。 Ｍ：α１−ミクログロブリン・ＤｌおよびＤ２：ビクニ
ンのドメイン１および２；Ｎ：ビクニンのＮ末端のペプ
チド；Ｃ：ビクニンのＣ末端の配列、ＫＵＮｌ、：モジ
ュールＭｏｄｌおよびＭ　ｏ　ｄ　２から戊る台底ドメ
イン１０クローニング手順のために失われる切断部位は
、生ずるプラスミド中に記録されるが、もはや同定され
ない。断片ＢおよびＤは−それらがそれ自体発生されな
い場合−向きを改良するためにを示されている。 第６図は、ビクニンの第２ドメインの遺伝子変異型：　
ｄ　ｅ　　［”’］　−Ｘａ　ａ”−Ｘａ　ａ９′−ビ
クニンの変異型およびｄ　ｅ　　［”’］　−Ｍｅ　ｔ
　”−Ｌｅｕ”−Ｌｅｕ”−Ｌｅｕ”−Ｌｅｕ”−ビク
ニン、ここでＸａａ９２−Ｘａ、ａ！＋４＝Ｉ　ｌｅ、
Ｌｅｕ。 Ｍｅｔ、ＶａｔまたはＰｈｅ、の構成を示す。ドメイン
２からの自然ビクニン（位置７８）および合成オリゴヌ
クレオチドＡ−Ｄ　（矢印）が示されており、ここでオ
リゴヌクレオチドＡおよびＢにおいてビクニンの位置９
２および９４におけるコドン（二重の下線）は個々の変
異型の要件に従い置換されている（Ｉｌｅ：ＡＴＣ；Ｌ
ｅｕ：ＣＴＧ；Ｖａｌ：ＧＴＴ；または反対の鎖中のそ
れらの相補的配列）。制限ヌクレアーゼＡ　ｐ　ａ、　
Ｉの認識配列（ＧＧＧＣＣＣ）およびＸｍｎ　Ｔ認識配
列（ＧＡＡＮＮＮＮＴＴＣ）には、−重の下線が引かれ
ている。 第７図は、ｄ　ｅ　　［”’］　−Ｘ　ａ、　ａ　９２
−Ｘ　ａ　ａ　”ビクニン遺伝子の変異型、ここでＸａ
ａ＝Ｉ　ｌｅ　％　Ｌ　ｅ　ｕ　ｓ　Ｍ　ｅ　ｔおよび
Ｖａｌ、のクローニングを示す。Ｄ２：ビクニンのドメ
イン２；ＫＵＮ２：合皮モジュール３による自然Ｘ　ｍ
　ｎ　Ｔ　／　Ａ　ｐａ１断片の置換後のビクニンのド
メイン２；Ｃ：ビクニンのＣ末端の配列。 第８図は、ｄｅ　［”’］　−Ｍｅ　ｔｌｓ−Ｘａａ”
Ｘａａ３８−Ｘａａ９２−Ｘａａ”−ビクニン遺伝子の
変異型、ここでＸａａ＝Ｉ　ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅ（、Ｖ
ａｌおよびＰｈｅ、のクローニングを示ず。ＫＵＮＩ：
モジュールｌおよび２から戊る合威ドメインＩ；ＫＵＮ
２・合皮モジュール３による自然Ｘｍｎ１／Ａｐａｌ断
片の置換後のビクニンのドメイン２；Ｃ：ビクニンのＣ
末端の配列。 第９図は、ｄｅＥ　＋−１８２−１７７］　−Ｍｅ（１
８Ｘａ、ａ３６−Ｘａａ３８−ビクニン遺伝子（アミノ
酸配列”Ｉ＞Ｖ−Ａ−Ａによる第１ドメインのＣ末端の
伸長）ＫＵＮＩ：モジュール１および２から威る合皮ド
メイン１．；Ｄ２：ビクニンのドメイン；Ｃ：ビクニン
のＣ末端の配列：ａおよびｂ＝ニオリボヌクレオチドリ
ンカ−（参照、発明の詳細な説明）。 第１０図は、ｐＭＴｌ、５、Ｅ、ｃｏｌｉ−酵母菌のシ
ャトルベクターを示す。 第１１図は、アルファー因子のリーダー配列の部位特異
的突然変異の線図である。ＴＣＴのＡＧＣへの突然変異
は、（１）と呼ぶ２１３ｂｐのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄｌＩ
Ｉ断片の分離を促進する。 第１２図は、アルファー因子のプロモーターおよび修飾
したアルファー因子のリーダー配列を使用する、ビクニ
ンの発現／分泌のための修飾された酵母菌−Ｅ、ｃｏｌ
ｉの構成を示ず。修飾されたアルファー因子のリーダー
配列（第１１図においてＩと呼ぶ）はＰｓｔｌ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片としてベクターｐＭＴ１５中へ組み込まれ
、そして本来のアルファー因子のリーダー配列は置換さ
れ　ｌこ　。 第１３図は、アルファー因子のｐ　ｒ　ｅ−ｐ　Ｉ’　
０配列を含有するｐＭＴｌ５　　Ｅ、ｃｏｌｉ　−酵母
菌のシャ］・ルベラター中にクローニングされた、天然
に産出するビクニン遺伝子を示す。 第１４図は、発現ベクターｐＬＬＢ３６３８、ベクター
ｐＳ６００中にクローニングしたｐｒｅｐｒｏ−アルフ
ァー因子−Ｌｅｕ　　３６　　Ｌｅｕ−３８−ビクニン
遺伝子の融合、およびｐＬＬＢ３６３８中のＤＮＡおよ
びｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子−Ｌ　ｅ　ｕ−３６
−Ｌ　ｅ　ｕ−３８−ビクニンの融合部位における対応
するアミノ酸配列を示す。Ｌ　ｙ　ｓ　−Ａ、　ｒ　ｇ
は、ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子の配列のＫＥＸ２
処理部位である（Ｊｕｌｉｕｓ酢酸エチル、Ｃｅ１ｌ、
３ヱ、１０７９ ６〇− ５、＋９８４）。アミノ酸の番号１〜３８は、ビクニン
ムテイン配列中のそれに相当する。 第１５図は、発現ベクターｐＬＬＢ９２９４、ベクター
ｐｓ６００中にクローニングしたｐｒｅ−ｐｒｏ−アル
ファー因子−Ｌｅｕ−９２−ＬｅＵ−９４−ビクニン遺
伝子の融合、およびｐ　Ｌ　ＬＢ３６３８中のＤＮＡお
よびｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子−Ｌｅｕ−９２−
Ｌｅｕ−９４−ビクニンの融合部位における対応するア
ミノ酸配列を示す。Ｌｙｓ−Ａｒｇは、ｐｒｅ−ｐｒｏ
−アルファー因子の配列のＫＥＸ２処理部位である（Ｊ
ｕｌｉｎｓ酢酸エチル、Ｃｅ１ｌ、３７．１０７５．１
９８４）。アミノ酸の番号１〜９４は、ビクニンムテイ
ン配列中のそれに相当する。 第１６図は、発現ベクターｐ４ＬＢ、ベクターｐｓ６０
０中にクローニングしたｐ　ｌ’　ｅ！−ｐ　ｒ　Ｏア
／１，７７−因子−Ｌｅｕ−９２−Ｌｅｕ、　　９４ビ
クニン遺伝子の融合、およびｐ４ＬＢ中のＤＮＡおよび
ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子−Ｌｅ　ｕ−３６−Ｌ
　ｅ　ｕ　−３８−Ｌ　ｅ　ｕ　−９２−Ｌ　ｅｕ−９
４−ビクニンの融合部位における対応するアミノ酸配列
を示す。Ｌｙｓ−Ａ、ｒｇは、ｐ　ｒ　ｅｐｌ“０−ア
ルファー因子の配列のＫＥＸ２処理部位である（Ｊｕｌ
ｉｕｓ酢酸エチル、Ｃｅ１ｌ、３７．１０７５．１９８
４）。アミノ酸の番号１〜９４は、ビクニンムテイン配
列中のそれに相当する。 第１７図は、発現ベクターｐＤＬＬＢ−１２１、ベクタ
ーｐｓ６００中にクローニングしたｐｒｅ−ｐｒｏ−ア
ルファー因子−ｄｅ（１，−２１）Ｌｅｕ−３６−Ｌｅ
ｕ　　３８−ビクニン遺伝子の融合、およびｐＤＬＬＢ
−１２１中のＤＮＡおよびｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー
因子−Ｌｅｕ−３６−Ｌ　ｅ　ｕ　−３８−ビクニンの
融合部位における対応するアミノ酸配列を示す。Ｌｙｓ
−Ａｒｇは、ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファー因子の配列の
ＫＥＸ２処理部位である（Ｊｕｌｉｕｓ酢酸エチル、Ｃ
ｅ１ｌ、３７．１０７５．１９８４）、アミノ酸の番号
１〜３８は、ビクニンムテイン配列中のそれに相当する
。 手続補正書（方式） 手続補正書 平成２午１０月１２日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ヒトのビクニンのアミノ酸２１〜１４７の配列を有
   し、前記配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が
   他の天然に産出するアミノ酸により置換されていること
   を特徴とする、プロテイナーゼ阻害因子。