JPH03242553A - エピシアロ複合糖質を含む製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、エピシアロ複合糖質を用いた血ａ診断薬、特
に癌の血清診断薬、癌ワクチン、及び血清診断方法、特
に癌の予防治療診断方法に関する。

〔従来の技術〕

糖鎖が細胞表層における抗原性の重要な担い手であり、
癌においては、細胞表層の糖鎖抗原に異常を来し癌抗原
となる。そして、現在、癌抗原に対するモノクローナル
抗体を用いた癌の治療及び血清診断の可能性が強く示唆
されている。

また、癌抗原に対する抗体が生体内に存在するか否かを
検査することにより、癌の存在を診断することも可能で
ある。そこで、癌抗原に対する抗体に反応する抗原を提
供することが必要となる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、癌抗原に対する抗体に反応する抗原を
提供することにある。

さらに本発明の目的は、そのような抗原を用いた予防治
療診断薬及び方ｌ去を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、動物血清中に、エピシアロ複合糖質を認
識する抗体があることを見出し、本発明を完成するに到
った。

本発明は、エピシアロ複合糖質を含む血清診断薬、特に
癌の血清診断薬及びエピシアロ複合糖質と血清とを反応
させることを含む血清診断方法、特に癌の血清診断方法
に関する。

さらに本発明の別の態様は、エピシアロ複合糖質を含む
癌ワクチンに関する。

以下本発明について詳述する。

ガングリオシドは、糖鎖化合物の１種である。

天然に存在するガングリオシド中のアセチルノイラミン
酸の結合配置はα型である。ところが、近年、ガングリ
オシドの合成の過程でアセチルノイラミン酸の結合配置
がβ型である、所謂エピシアロ複合糖質も得られるよう
になった。

従来知られている糖鎖マーカーは、全てアセチルノイラ
ミン酸の結合配置がα型のものであり、エピシアロ複合
糖質か糖鎖癌マーカーとなることは知られていなかった
。

また、従来の糖鎖不全現象は、癌細胞中で合成される糖
鎖中の糖の組合せパターンの異常であった。さらに、最
近の報告では、癌になると、Ｎグリコリルノイラミン酸
（ＮｅｕＧｃ）が発現スる。ヒトでのシアル酸は胎児期
を例外としてＮ−アセチル型である。Ｎ−グリコリルノ
イラミン酸は、アセチルノイラミン酸の５位のＮ−アセ
チル基が水酸化されたものに過ぎない。即ち、これまで
のところ知られている糖鎖異常現象は、糖鎖中の置換基
が異なるか、糖の組合せパターンが異なる、という内容
のものであった。

したがって、癌によって、本発明で用いるエピシアロ複
合糖質ように、結合様式が異なるような糖鎖異常を有す
る物質が発現することは、知られていなかった。

本発明は、エピシアロ複合糖質を認識する抗体が担癌血
清中で上昇するという知見に基づくものであり、このこ
とは、従来正常組織では知られていなかったエピシアロ
複合糖質が担癌動物生体内に存在することを示唆するも
のでもある。

本発明のエピシアロ複合糖質とは、アセチルノイラミン
酸の結合配置がβ型であるガングリオシドをいう。エピ
シアロ複合糖質の例としては、例えばエビＧＭ、、エビ
Ｇ　Ｍ　２、エビＧＭ３、エビＧＭいエピＧＭ、等を挙
げることかできる。

エビＧ　、’ｖｌ　３は、例えば特公平１−４９３５４
号公報に化合物（２８）として記載され、同公報に記載
の方法により合成することができる。また、エビＧ　Ｍ
　、は、例えば特開昭６１−２８２３９１号公報に化き
物（２７）として記載され、同公報に記載の方法により
合成することができる。さらに、エビＧＭ、は、例えば
特開昭６３−４５２９３号公報に化合物ｍｌ）として記
載され、同公報に記載の方法により合成することができ
る。

本発明によれば、エピシアロ複合糖質を用いることによ
り、血清診断、特に癌の血清診断をすることかできる。

エピシアロ複合糖質を用いる血清診断は、通常の血清診
断と同様の方法で行うことができる。即ち、エピシアロ
複合糖質と動物血清とをインキュベートし、次いでエピ
シアロ複合糖質と反応した抗体の有無、及び必要により
量を、公知の検定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法
等により検定する。

血清診断には、エピシアロ複合糖質を例えばエタノール
、メタノール等の溶媒に溶解した診断薬を用いることが
好ましい。溶媒中のエピシアロ複合糖質の濃度は、例え
ばｌ〜１１０００ｎ／ｍｌの範囲とすることが適当であ
る。

本発明の血清診断法によれば、癌、感染症、遺伝病、免
疫疾患等を診断することができる。

さらに、本発明は、エピシアロ複合糖質を含む癌ワクチ
ンを提供する。

この癌ワクチンは、エピシアロ複合糖質を、それ自体か
、あるいはＢＣＧのリポソーム等のアジュバント等に含
めた物である。

本発明の癌ワクチンは、例えば−回に１〜１０００μｇ
のエピシアロ複合糖質を１〜４週間の間隔で４〜８回接
種することが好ましい。

〔発明の効果〕

本発明のエピシアロ複合糖質を用いる血清診断法によれ
ば、癌、感染症、遺伝病、免疫疾患等を診断することが
できる。

さらに、本発明の癌ワクチンを用いれば、癌に対する免
疫を付与することができる。

〔実施例〕

以下本発明を実施例により、詳細に説明する。

ガングリオシド エピシアロ複合糖質ＧＭ、及びガングリオシドＧＭ３は
、特公平ｌ−４９３５４号公報にに記載の方法により合
成した。ガングリオシドＧＭ、及びエピシアロ複合糖質
ＧＭ、は、特開昭６１−２８２３９１号公報に記載の方
法により合成した。

ガングリオシドＧＭ、及びエピシアロ複合糖質ＧＭ５は
、特開昭６３−４５２９３号公報に記載の方ｌ去により
合成した。

マウス 種々の近文系マウスは、チャールズリバー・ジャパン株
式会社及び日本ＳＬＣ株式会社より購入し、ＳＰＦ環境
下で飼育したものを用いた。

延遺 マウスから眼底採血法により採血した血液を凝固させた
後、遠心分離することにより血清を得た。

ＥＬＩＳＡアッセイ ＥＬＩＳＡアッセイは、常法により行った。

エタノールに溶解した各ガングリオシド１１００ｎを９
６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた後、
３７°Ｃに放置してエタノールを完全に除去した。各ウ
ェルにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を含むリン酸緩
衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）からなるブロッキング液を加え、３
７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、ブロッキ
ング液を除いた後、採取したマウス血清を各ウェルに加
え、３７０Ｃで１時間インキュベートした。各ウェルを
１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダー
ゼ標識した抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体を加
え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを１
％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した後、Ｏフェニレンジア
ミン４００μｇ　／　ｄ及び０．００１％過酸（ヒ水素
を含む基質液を加え、室温で１５分間反応を行った。８
Ｎ硫酸を加えて反応を停止した後、各ウェル中の反応液
の４９０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレート用分光
光度計により測定した。

抜工 （１）マウス血清のエビＧＭ、との反応性９週齢のＣ５
７ＢＬ／６系雌性マウス由来の正常血清は、ヒトの正常
直情と異なり、エビＧ　Ｍ　＝　（実線）と反応した。

しかし、ＧＭ、（破線）とは反応しなかった（第１図参
照）。

Ｂ１６メラノーマ細胞を移植した９週齢のＣ５７ＢＬ／
６系雌性マウス由来の血清（移植後２週間目）は、同様
にエビＧＭ、（実線）と反応した。しかも、その反応レ
ヘルの急上昇か認められた。又同様に、Ｃ，Ｖ１３（破
線）とは反応しなかった（第２図参照）。

尚、第２図に示した・、△、ム及び口は、それぞれ腫瘍
径が５　ｍｍ以下、６ｆｆ１ｍｓ８ｍｍ及び１６ｍｍの
マウス由来の血清についての値を示す。

第１図及び第２図の結果を比較すると、エビＧＭ３との
反応性は、正常マウス由来の血清に比べて腫瘍細胞を移
植したマウス由来の血清の方が強いことがわかる。

尚、第１図及び第２図に示した各値は、バックグランド
値域算出後の３個のウェルの平均を示す。

（２）マウス血清とエビＧＭ３以外のガングリオシドと
の反応性 （１）で用いたＢ１６メラノーマ細胞を移植した９週齢
のＣ５７ＢＬ／６系雌性マウス由来の血清の内で最も強
い反応性を示した血清（腫瘍径が６　ｍｍのマウス由来
の血清）を２００倍希釈して、ＧＭ、、エビＧＭ３、Ｇ
Ｍ、、エビＧ　Ｍ　４、Ｇ　Ｍ　ｓ及びエビＧＭ。

との反応性を試験した。その結果、エビＧ　Ｍ　３との
反応性が最も強く、次いでエビＧＭ、との反応性が強い
ことを示した。（第３図参照）。

尚、第３図に示した各値は、バックグランド値域算出後
の３個のウェルの平均を示す。

種々の濃度のアセチルノイラミン酸ナトリウムを（２）
で用いたと同様のマウス血清に加えて、エビＧＭ、（実
線）及びＧＭ３（破線）との反応性を試験した（第４図
参照）。尚、第４図に示した容儀は、バックグランド値
域算出後の３個のウェルの平均を示す。また、アセチル
ノイラミン酸として、反応液のｐＨ低下の影響を避ける
ためにアセチルノイラミン酸のナトリウム塩を用いた。

第４図に示す結果から、水酸基の配置がβ型であるアセ
チルノイラミン酸により、マウス血隋とエビＧ　Ｍ　３
との反応性は阻害されており、エビＧＭ、とマウス血清
との強い反応性が、エビＧＭ、中のアセチルノイラミン
酸基がβ配置であることに起因していることを示唆する
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、正常マウス血清とＧ　Ｍ　３及びエビＧＭ。 との反応性を示す図である。 第２図は、癌移植マウス血清とＧＭ、及びエビＧＭ、と
の反応性を示す図である。 第３図は、癌移植マウス血清とＧ　Ｍ　３及びエビＧＭ
、、Ｇ　ＭいエビＧＭいＧＭ５及びエビＧＭ。 との反応性を示す図である。 第４図は、癌移植マウス血清とエビＧＭ、との反応性に
対するアセチルノイラミン酸の阻害効果を示す図である
。 第１図 第２図 血清の希釈度 血清の希釈度 第３図 抗原 第４図 ｅｕＡｃ Ｎａ　（ｍＭ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）エピシアロ複合糖質を含むことを特徴とする血清
   診断薬。
2. （２）エピシアロ複合糖質を含むことを特徴とする癌の
   血清診断薬。
3. （３）エピシアロ複合糖質を含むことを特徴とする癌ワ
   クチン。
4. （４）エピシアロ複合糖質と血清とを反応させることを
   特徴とする血清診断方法。
5. （５）エピシアロ複合糖質と血清とを反応させることを
   特徴とする癌の血清診断方法。