JPH025856A - ツルニチニチソウの細胞培養によるビンカミンおよびエピビンカミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビンカミンおよびエピビンカミンの製造方法
に関する。

この数年来、人工培地中での発酵法によってとンカアル
カ１１イドを製造することについて研究が進められてい
る。仏国特許出願早期公開ＦＲ−Ａ２３００１３１号に
は、未同定のビンカアルカロイドの混合物の製造方法が
開示されている。これによると、好ましくは連続的に光
照射しながら、細胞懸濁培養にて２０日間以上発酵する
ことによってアルカロイドの複雑な混合物が約２０〜４
５■／１の収量で製造されることが示されている。

本発明に於いては、驚くべきことに、ツルニチニチソウ
（Ｌ■ｃａ　　ｍ１ｎｏｒ　Ｌ、　）由来の新規細胞培
養株が、他のアルカロイドを生成することなく、収率良
くビンカミンおよびその異性体であるエビビカミンを産
生じ得ることが知見された。そこで、本発明は、資化し
つる炭素源、資化しうる窒素源および無機塩類を含む液
体培地中で、好気性条件下に培養株Ｆ　Ｉ　ＣＥ−Ｖ３
　　（ＤＳＭ　４３６５）［１１１培養することよりな
るビンカミンおよびエビビンカミンの製造方法を提供す
るものである。

本発明によって、培養物を光照射するしないにかかわら
ず、液体培地中において約１　ｇ／ｊ！あるいはそれ以
上の収量でビンカミンおよびエビビンカミンを１！！Ｊ
造することができる。本発明の最大の特徴は、収率が高
いこと、通常の工業規模の発Ｍ槽においても実施しうる
ような簡単なプロセス−Ｃあることおよびビンカミンと
エビビンカミンの二つの異性体のみが生成することであ
り、ツルニブーニチソウ植物体よりアルカロイドを抽出
する方法および前記仏国特許出願早期公開Ｆ　ｒ＜−八
−２３００１３１の半合成的製造方法に比べて有利であ
る。

このようにして得られたビンカミンおよびエビビンカミ
ンは細胞および／または培養ブロスから回収される。こ
れらは各々分難することができる。なお、ビンカミンと
エビごンカミンは、１６位の立体配置が異なる立体異性
体である。

文献上、酸性溶液中でビンカミンからエビビンカミンに
轟収率で変換しうろことが知られている（Ｇ、　５ｚｏ
ｎｔａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　
１ｅｔｔ。

１９１頁、　１９７３年）。したがって本発明によって
製造したビンカミンをこの方法に従ってエビビンカミン
−に変換することができる。

本発明のビンカミンおよびエビビンカミンを生産する新
規培養株をＦＩＣＥ−Ｖ３株と称する。このものは、微
生物の寄託に関する国際的なブダペスト条約下、　１９
８１年１２Ｊ：Ｊ２３日にドイツ微生物寄託機関＜　ｏ
　ｅｕｔｃｈｅ　　ｓ　ａｍｍｌｕｎｇ　ＶＯｎＭ　ｉ
ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ、　Ｄ　Ｓ　Ｍ　）に寄託
番号ＤＳＭ４３６５が付されて寄託されている。

ＦＩＣＥ−Ｖ３細胞の形態学的特徴は次の通りである。

固形培地上で生育した培養物（カルス培養物）は無色で
容易に解集合しうる細胞集団である。細胞は直径５０〜
１００−の円形ないし楕円形の形状を有している。試験
した培養条件下で、カルス培養物は器官形成あるいはい
かなる分化過程をも示さない。２０００ルクスの光に露
光すると、カルス培養物はクロ［ｌフィルの生合成によ
り緑色となる。しかしながら、光露光はアルカロイドの
生合成には影費を及ぼさない。

液体培地にて生育した場合、未分化培養物は５から５０
細胞よりなる小さな集塊として成長する。

このｍ胞は固体培地上で生育したものと同じ形状と大き
さを有している。

他の特性は、ビンカミンとエビビンカミンの二つのアル
カ［ｌイド（以後簡単にｌ゛粗ビンカミンＪと称する）
を産生ずることである。

この新規１ｍ物は、レッコ（ｌ　ｅｃｃｏ）　　［イタ
リア国コモ（Ｃｏｍｏ）　］　＋Ｉ近で採取されたツル
ニチニヂンウ（Ｖ　１ｎｃａ　ｍ１ｎｏｒ）の植物体由
来のものである。この植物体の一部（菓、新芽および根
）を７０％エタノールで５分間、２％次次亜塩素酸上ト
リウム２分間、さらに０．５％塩化第二水銀で４５秒間
洗浄することにより滅菌した。各々の洗浄のあと、ｉ滅
菌蒸留水ですすいだ。

その後、葉と新芽と根を小さな片に切り、１ｍｇ／ｄの
ナフタレン酸ＩＩ（ＮＡＡ）と７ｇ／！の寒天を補足し
たギャンボルグＢ５培地（０゜し、Ｇａｍｂｏｒｇｅｔ
　ａｌ、　　ＥＸＤ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、５０゜ｐ
　１５１（１９６８））に無菌的に固定し、暗所で２８
℃に保った。１０〜１５日後、未分化組織（カルス）は
成長しはじめ、２０〜３０日後にそれを同じ培地の寒天
斜面上に移した。通常、十分に成長した培養物を得るに
は、暗所２８℃で約２０日間を要する。２ないし３回移
したのち、安定な培養物が得られ、振とうフラスコにお
ける接種材料として用いた。

新鮮重計約１〜２ｇのカルスをガラス棒で均質化したの
ら、１ｍ９／ＩｔのＮＡＡを追加した５０＃１ｅ（７）
液状ギャンボルグ培地を含む３００ｍ容の三角フラスコ
に移した。回転振とう器（１２０ｒｐｍ）上で暗所２８
℃にて７日間培養したのち、培養物は乾燥重量的１０ｍ
ｙ／ｌｎ１．となり、ついで５ｒｄの増殖型培養物を、
３０９／Ｉｔのショ糖と１■／１のＮＡＡを入れた４５
ｄのギャンボルグＢ５培地（Ｇ３０培地）を含む３００
Ｉｎ１容の三角フラスコに接種づ°る。これらの培養物
を１２Ｏｒｐｍの回転振とう器上で、暗所２３℃にて１
０〜１４日間培養する。

本発明の方法においては、ＦＩＣＥ−Ｖ３１１１１１１
を液体培地中で培養する。ガラスあるいは例えばステン
レススチールのようなその他の一般に使用される材料の
フラスコまたは発酵槽を使用することができる。液体培
地としては、資化しうる有機炭素源、資化しうる有機ま
たは無機の窒素源、無機塩類、および必要に応じて植物
ホルモン類および／またはビタミン類を含有する栄養溶
液をあげることができる。資化しうる有機炭素源として
は、シヨ糖、ブト・り糖、フラクトース、でんぷん、デ
キストリン、グリセリン、マンニトールおよびマンノー
スのような炭水化物をあげることができる。

資化しうる有機または無機の窒素源としては、アミノ酸
類やその混合物、ペプチド類とタンパク質もしくはこれ
らの加水分解物、カゼインの加水分解物、アルコール合
成におけるトウモ【ココシや小麦の蒸留残渣のような穀
類の水溶性画分や酵素および無機硝酸塩や無機のアンモ
ニウム塩をあげることができる。

本発明の方法は、典型的には懸濁培養により、例えば撹
拌しながらフラスコ中で、あるいは通気発酵槽中で、ｐ
Ｈが４．４〜７．０の範囲好ましくはｐＨ６，５にて、
温度が１８−３６℃の範囲好ましくは２３℃で行なわれ
る。−膜内で好ましい培養条件は、暗所、５．１〜６．
８　（７）　Ｉ）Ｈ範囲、１８〜３０’Ｃ（７）　ｍ度
範囲かつ８〜１６日間の期間である。粗ビンカミンの産
生は２〜３日の生育侵に始まり、１０〜１４日後に最高
に達する。

粗ピンカミンは細胞および培養ブロスの双方より抽出す
ることができる。濾過した細胞から、典型的にはメタノ
ール、エタノールあるいはアセトンのような水と混和し
うる有機溶媒を用いて粗ビンカミンを抽出することがで
きる。細胞を除去してｐＨ８〜９のアルカリ性とした培
養ブロスからは、通常クロロホルム、二塩化メヂレン、
エテルニーデルのような水と混和しない溶媒により粗ビ
ンカミンを抽出することができる。

このようにして製造したビンカミンもしくはエピビンカ
ミンは、医薬上許容しつる担体または希粗剤と共に医薬
組成物とすることができる。

以Ｆ１実施例により本発明をさらに詳細に説明する。た
だし、以下の説明はなんら本発明を限定するものではな
い。

実施例１ 希アンモニアでＩ）Ｈを６．５に調整した５０ｄの０３
０栄養培地を含む３００ｄ容の三角フラスコ中で行ない
、これを回転振どう器（回転数１２０ｒｐｍ、偏心距！
！１８ｃｍ）によって振とうした。最良の培養温度は２
３℃であった。このフラスコに８５寒天培地中で１４日
経たＦＩＣピー■３培養物により得られた細胞を接種し
た。

高速液体クロマトグラフィー（Ｈｐｌｃ）での測定から
、１４日後に約７５０ｒｎｇ／ｊのビンカミンと３４０
■／ｊ！のエビビンカミンが生成していることが判つた
。２００個のフラスコより得られた１０１の細胞懸濁培
養物を遠心分離し、細胞と上澄みとを別個に抽出した。

上澄みを炭酸ナトリウムを加えてｐＨ９とし、１０１の
塩化メチレンで２回抽出した。

有機性抽出物を次いで２％の酒石酸水溶液で抽出した。

得られた酸性溶液をｐＨ９へ・１０としたのち、塩化メ
チレンで抽出した。

遠心分離した細胞は２％の酒石酸を含む５０％アヒトン
水溶液で均質化し、濾過した。Ｐ液を減圧下溌縮し、得
られた水溶液を１））−１９〜１０のアルカリ性とした
のら塩化メチレンで抽出した。

細胞および上澄みの有機抽出物を合ねゼ蒸発乾固さける
ことにより、８．８ｇの粗ビンカミンＮ−１ｐｌｃ測定
によれば、６．０ｇのビンカミンと２．８３のエビビン
カミンよりなる）を得た。二つのアルカロイドはシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより分離した。この際
、溶離液として、含有するエタノールの量を徐々に増や
した塩化メチレンを用いた。カラムより５．６９の純粋
なビンカミンと２．５ｇのエビビンカミンを回収した。

実施例２ 本発明の方法を二段発酵法によりフラスコ中で行なった
。最初に、２０９／ｌのブドウ糖と１■／ｌのＮＡＡを
含むムラシゲ培地（Ｔ　、　Ｍ　ｕｒａｓｈｉａｅｅｔ
　ａｌ、、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　Ｐｌａｎｔ、　　誌　
１５巻、４１３頁。

１９６２年）上で実施例１と同様条件にて生育を行なっ
た。８日後に乾燥Φ母は１０〜１３勺／ｌに達しており
、培養物を無菌的に遠心分離し、細胞は生産培地Ｇ３０
中に再懸濁した。６〜８日間の発酵によって粗ビンカミ
ンは１０５０ｍｇ／　ｌ生成した。Ｈｐｌｃ分析により
、ビンカミンは全アルカロイドの７３％、エビビンカミ
ンは２５％であることが判った。実施例１に記載したと
同様に１００個の三角フラスコを用いて操作したところ
、３．６ｇの純粋なビンカミンと１．０９のエビビンカ
ミンが単離された。ブドウ糖の代りにフラクトースある
いはマルトースを培地中に用いた場合にも殆んど同じ収
量であった。

実施例３ ６１のＧ３０栄養培地を含むＩＪの培養槽中で行なった
。ツルニチニヂソウ培養株ＦＩＣＥ−ｖ３の培養は実施
例１に従って、５０ｒｄの８５培地を入れた３００ｄ容
の三角フラス」中で行なった。１〜１０日後（乾燥ｉｆ
邑１２ｒｆｔｇ／ｄ）　、培養物を４５０ｍｅの８５培
地を含む２０００７容の丸底フラスコに接種し、暗所２
８℃にて回転数１１００ｒｐの回転振どう器上で培養し
た。７〜１０日後充分に成長した培養物（乾燥ｌｆｆ１
１０ａｙ／ｄ）を、６ｊ！（７）Ｇ３０培地を含ム１０
Ｒ１の培養槽への接種材料として用いた。１１００ｒｐ
の初期撹拌速度かつ０．５容量／容出／分の通気速度で
、暗所２７℃にて増殖を行なった。溶存酸素濃度が２０
％低下した場合には、撹拌速度を２０ｒｐｍ増加させた
。

１０−〜１４日後培養物は乾燥型部で２０η／ｄとなり
、粗ビンカミンとして表わしたアルカロイド含量は７Ｇ
ＯＩｎｇ／βてあった。このアルカロイドを実施例１に
記したと同様に抽出し、精製して、３．３９／ｌのビン
カミンおよびｏＪｇ／　ｊ２のエピビンカミンを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）資化しうる炭素源と資化しうる窒素源および無機
   塩類とを含む液体培地にて、好気性条件下で培養株ＦＩ
   ＣＥ−Ｖ３（ＤＳＭ４３６５）の細胞を培養することを
   特徴とするビンカミンおよびエピビンカミンの製造方法
   。 （２）細胞を暗所で５．１〜６．８のｐＨ、１８〜３０
   ℃の温度にて８〜１６日間培養することを特徴とする請
   求項１に記載の方法。 （３）製造されたビンカミンおよびエピビンカミンを細
   胞および／または培養ブロスから回収することを特徴と
   する請求項１または請求項２に記載の方法。 （４）製造されたビンカミンおよびエピビンカミンをお
   互いに分離することを特徴とする請求項１から請求項３
   のいずれかに記載の方法。 （５）製造されたビンカミンをエピビンカミンに変換す
   ることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに
   記載の方法。 （６）発酵槽中で行なうことを特徴とする請求項１から
   請求項５のいずれかに記載の方法。 （７）実質的にいずれかの実施例に記載のビンカミンま
   たはエピビンカミンの製造方法。（８）医薬上許容しう
   る担体あるいは希釈剤、および活性成分として請求項１
   から請求項６のいずれかに記載の方法によって製造され
   るビンカミンあるいはエピビンカミンより成る医薬組成
   物。 （９）細胞培養株ＦＩＣＥ−Ｖ３（ＤＳＭ４３６５）。