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KR910004950B1 - ACG-1 세포주 및 이를 이용한 진세노사이드 Rg1의 제조방법 - Google Patents

ACG-1 세포주 및 이를 이용한 진세노사이드 Rg1의 제조방법 Download PDF

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KR910004950B1
KR910004950B1 KR1019890016000A KR890016000A KR910004950B1 KR 910004950 B1 KR910004950 B1 KR 910004950B1 KR 1019890016000 A KR1019890016000 A KR 1019890016000A KR 890016000 A KR890016000 A KR 890016000A KR 910004950 B1 KR910004950 B1 KR 910004950B1
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South Korea
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cell line
ginsenoside
acg
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ginseng
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최광태
안인옥
Original Assignee
한국인삼연초 연구소
유광근
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

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Abstract

내용 없음.

Description

ACG-1 세포주 및 이를 이용한 진세노사이드 Rg1의 제조방법
본 발명은 인삼조직배양을 통하여 선발한 ACG-1 세포주 및 이를 이용한 진세노사이드 Rg1의 제조방법에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng)은 의약품으로 오랫동안 애용되어 온 고가의 약용식물로서 약효를 나타내는 물질인 사포닌(saponin), 폴리아세틸렌(polyacetylene), 알카로이드(alkaloid), 페놀(phenol) 등이 포함되어 있어 이에 관한 연구가 집중적으로 수행되고 있다. 특히 오래전부터 인삼 약효성분으로 알려진 사포닌에 관한 최근의 연구 보고에 의하면 인삼 사포닌 성분중 진세노사이드 Rg1(Gin-senoside Rg1)이 심장병 등에 특이한 약효가 있음이 밝혀진 바 있고, 인삼 사포닌 약효 성분중에는 상기 진세노사이드 Rg1(이하 "Rg1"이라 함)외에도 Rg2,Rf,Re,Rb2,Rb1 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 이들의 성분 분포 즉, 진세노사이드 패턴(Ginsenoside Pattern)은 인삼의 약효를 예시하는 인자로서, 통상 상기 성분들을 트리올계(Rg1,Re,Rg2,Rf)와 디올계(Rd,Rc,Rb2,Rb1)로 대분하여 PT/PD비율로서 나타내고 있으며 일반 재배인삼의 경우는 PT/PD비율이 약 1로서 트리올계 진세노사이드와 디올계 진세노사이드가 비슷하게 들어있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 이들 성분들이 모든 질병에 같은 약효로 작용하는 것은 아니고 상기한 바와 같이 질병에 따라 선택적으로 효과를 나타내는 성분이 있으며 특수성분의 선택사용은 약효를 높일 수 있는 바람직한 방법이 될 수도 있다.
인삼의 세포배양 기술분야에 있어서, 조직배양을 통한 인삼세포의 증식으로 사포닌의 대량생산이 가능하게 되었음은 본 발명과 함께 특허출원된 "ACG-2 세포주 및 이를 이용한 사포닌 생산방법"에서 공개된 바 있다. 이러한 조직배양방법을 이용하면 특정 성분만의 대량생산 즉, 상기한 바와 같이 심장병 등에 약효가 인정된 Rg1 등의 단일성분을 대량으로 생산하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 목적은 Rg1을 다량 함유하는 신규의 인삼 세포주를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 신규의 인삼세포주를 이용하여 단일성분의 Rg1을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 본 발명의 목적 및 기타의 부수적인 목적은 이하의 설명에서 좀더 명백해질 것이다.
본 명세서에서 ACG-1으로 명명되는 선발 세포주는 고려인삼의 뿌리로부터 유기된 세포주를 고체 배양기에 접종하여 계대 배양시킨 것이다. 즉, Rg1이 많이 포함된 인삼 뿌리의 동체에서 유기된 세포주를 M-S(Murashige-Skoog) 기본배지에 수크로스 3중량%(M-S 기본배지 기준-이하 동일하다)와 2,4-D 0.1mg/1를 첨가한 고체배양기에 접종하여 배양시키되, 4-5주 이상 배양시켜 살아 남는 세포주를 계속 계대 배양시키면 본 발명 세포주 ACG-1을 얻게 된다. 이 세포주의 생물학적으로 순수한 배양물은 1989. 10. 17자로 한국과학기술원에 기탁되어 KCTC 8473 P의 기탁번호를 부여받았다. 이렇게 선발된 세포주를 사용하여 각종 영양 배지가 세포주의 생육 및 진세노사이드 Rg1의 생성에 미치는 효과를 더욱 측정하고, 이 세포주에 대한 가장 적합하고 효과적인 배지조성과 발효조건을 결정하였다.
[세포주의 특성]
상기한 바와 같이 인삼 뿌리에서 유기시킨 세포주를 2,4-D를 함유하는 고체 배양기에서 계대 배양하여 선발한 본 발명의 ACG-1 세포주(기탁번호: KCTC 8473 P)의 특성은 표 Ⅰ과 같다. 비교을 위해, 본 발명에서 선발한 ACG-1 세포주와 인삼의 일반 세포주를 M-S 기본배지에 수크로스 3중량%와, 2,4-D 0.1mg/1를 첨가한 고체 배양기에서 25℃로 50일간 배양한 후 색, 건물중 및 사포닌 함량과 진세노사이드 패턴을 측정 분석하여 재배인삼인 백삼과 비교하였다. 표 Ⅰ의 진세노사이드의 패턴에 있어서, 본 발명은 ACG-1 세포주의 Rg1함량은 6.09mg/g으로서 일반 세포주나 백삼의 그것에 비해 월등히 높음을 알 수 있다.
[표 Ⅰ]
Figure kpo00001
*g/flask ** mg/g
[생육조건]
ACG-1 세포주는 조절된 조건하에서 적절한 수성영양 배지로 배양시킴으로써 생육이 진행된다. 배지는 동화가능한 탄소, 질소 및 무기염의 공급원을 함유하는데 수크로스와 2,4-D가 M-S 기본배지에 첨가되어 본 발명의 가장 적절한 배지조성으로 사용된다. 이러한 생육조건 위한 배지조성은 선발 세포주의 생육면에서 뿐 아니라 본 발명의 목적상, 생성 세포주의 진세노사이드 패턴을 고려함이 필수적이다. 또 한가지 생육 조건에서 고려되어야 할 중요한 인자는 온도와 명암조건이다. 본 발명 세포주인 ACG-1 세포주는 광(光), 암(暗)배양시 그 생장에는 별 영향이 없었으나 Rg1의 함량은 광배양시에 증가하고 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명 ACG-1 세포주의 배지조성은 M-S 기본배지에 수크로스 1-5중량%, 2,4-D 0.05-5mg/1가 바람직하며, 가장 바람직하기로는 수크로스 1-5중량% 2,4-D 0.1-3mg/1이다. 배양온도는 15-25℃, 광처리하에 배양시킨다. 본 명세서에 기술한 영양배지는 사용할 수 있는 광범위한 종류의 배지의 단순한 예에 불과하며 이것으로 제한되지는 않는다. 이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 생성된 세포주로부터 아래의 방법에 의해 사포닌의 진세노사이드 패턴을 측정 분석하고 그 결과를 표 Ⅱ에 표시하였다.
[진세노사이드 패턴 측정방법]
수확된 시료를 60℃에서 건조시켜 정확히 1g을 취한 후 메탄올, 에테르, 클로로포름 및 부탄올 순으로 용매 추출하여 사포닌을 추출한다. 다음 이 추출액을 증류수로 3회 세척하고 농축하여 분석시료로 하였다.
이렇게 농축된 사포닌을 HPLC용 메탄올로 용해시킨 다음 HPLC로 진세노사이드 함량 및 패턴을 분석하였다.
[실시예 1]
M-S기본배지에 수크로스를 3중량%, 2,4-D를 0.1mg/1 첨가한 배지를 35ml씩 분주한 고체배양기에 선발 세포주 ACG-1을 접종하여 25℃에서 1,000룩스 광을 조사하며 배양하여 50일 후에 세포조직을 수확하고 진세노사이드 패턴을 측정 분석하였다.
[실시예 2]
실시예 1의 2,4-D 첨가량 0.1mg/1 대신에 3mg/1을 첨가한 배지를 사용하는 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 세포조직을 수확하고 진세노사이드 패턴을 측정분석하였다.
[실시예 3]
실시예 1의 1,000룩스 광을 조사하는 대신에 암상태에서 ACG-1세포주를 배양하는 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 세포조직을 수확하고 진세노사이드 패턴을 측정분석하였다.
[비교예 1]
실시예 1의 ACG-1세포주를 사용하는 대신에 일반 세포주를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 일반 세포조직을 수확하고 진세노사이드 패턴을 측정분석하였다.
[비교예 2]
비교예 1의 2,4-D 첨가량 0.1mg/1 대신에 3mg/1을 첨가한 배지를 사용하는 외에는 비교예 1과 동일한 방법으로 일반 세포조직을 수확하고 진세노사이드 패턴을 측정분석하였다.
[표 Ⅱ]
Figure kpo00002
표 Ⅱ에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACG-1 세포주는 일반 세포주에 비해 같은 생육조건에서 Rg1의 생성능이 6 내지 8배에 달한다.
2,4-D 농도에 따른 ACG-1 세포주의 Rg1 생산량은 고농도에서(1.33mg/g)보다 저농도에서 (6.09mg/g) 약 4.6배 더 생산됨을 알 수 있고 광 배양시가 암 배양시보다 약 1.7배 더 많이 생성됨을 알 수 있다. 이와 같이, 본 발명 ACG-1 세포주는 심장병 등에 약효가 있는 Rg1을 다량 함유하는 신규의 세포주로서 본 발명 방법에 따라 조직배양할 경우 단일성분 순품으로 Rg1의 대량생산이 가능하다.

Claims (3)

  1. 인삼(Panax ginseng) 조직에서 유기된 세포주를 2,4-D가 포함된 배지에서 계대 배양시켜 선발한 기탁번호 KCTC 8473 P(기탁일: 1989. 10. 17, 기탁기관: 한국과학기술원)의 ACG-1 세포주.
  2. 인삼(Panax ginseng) 조직에서 유기된 세포주를 2,4-D가 포함된 배지에서 계대 배양시켜 선발한 기탁번호 KCTC 8473 P의 ACG-1 세포주를 배지조성: M-S 기본배지에 수크로스 1-5중량%, 2,4-D 0.05-5mg/1을 함유하는 배양기내에서, 배양온도: 15°-25℃로 광 배양시키고, 이로부터 진세노사이드 Rg1을 회수함을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg1의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 배지조성중 2, 4-D의 함량이 0.1-3mg/1인 진세노사이드 Rg1의 제조방법.
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