DE3902980A1 - Verfahren zur herstellung von vincamin und epivincamin durch zuechtung von vinca-minor-zellkulturen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vincamin und Epivincamin.

Die Herstellung von Vinca-Alkaloiden durch ein Fermentations­ verfahren in einem künstlichen Medium wird seit mehreren Jahren untersucht. In der FR-A-23 00 131 wird ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches undefinierter Vinca-Alka­ loide beschrieben. Dort wird die Herstellung eines kom­ plexen Alkaloidgemisches nach mehr als 20 Tagen Fermen­ tation von Zellsuspensionskulturen und bevorzugt bei kon­ tinuierlicher Beleuchtung mit Ausbeuten von etwa 20-45 mg/l beschrieben.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß erfindungsgemäß eine neue Zellkultur, die sich von Vinca minor L. ableitet, Vincamin und sein Isomeres Epivincamin ohne weitere Alka­ loide in guten Ausbeuten bilden kann. Die vorliegende Er­ findung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Vincamin und Epivincamin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Zellen der Kultur FICE-V3 (DSM 4365) bei aeroben Be­ dingungen in einem flüssigen Medium, welches eine assimi­ lierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoff­ quelle und Mineralsalze enthält, gezüchtet werden.

Es ist somit möglich, Ausbeuten an Vincamin und Epivincamin von etwa 1g/l oder darüber in einer flüssigen Kultur zu er­ halten unabhängig davon, ob die Kultur beleuchtet bzw. be­ strahlt wird oder nicht. Die hohe Ausbeute bei der Her­ stellung, die Einfachheit des Verfahrens, welches in üb­ lichen Industriefermentationsvorrichtungen durchgeführt werden kann, und die Tatsache, daß nur zwei Isomere, Vin­ camin und Epivincamin, gebildet werden, sind die wesent­ lichsten Vorteile gemäß der vorliegenden Erfindung und stellen eine Verbesserung gegenüber dem Extraktionsver­ fahren von Alkaloiden aus Vinca minor-Pflanzen und dem semisynthetischen Herstellungsverfahren der FR-A-23 00 131 dar.

Das so gebildete Vincamin und Epivincamin können aus den Zellen und/oder der Kulturbrühe isoliert werden. Sie kön­ nen voneineinander getrennt werden. Vincamin und Epivin­ camin unterscheiden sich voneinander in ihrer Stereochemie in der 16-Stellung. Aus der Literatur ist bekannt, daß die Umwandlung von Vincamin in Epivincamin leicht mit hohen Ausbeuten in saurer Lösung erfolgen kann (G. Szantay et al., Tetrahedron Lett. (1973) S. 191). Das erfindungsgemäß her­ gestellte Vincamin kann daher in Epivincamin umgewandelt werden.

Die neue Kultur, welche Vincamin und Epivincamin bildet, wird als Stamm FICE-V3 bezeichnet. Sie wurde am 23. Dezem­ ber 1987 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) unter der Hinterlegungsnummer DSM 4365 hinterlegt. Die morphologischen Eigenschaften von FICE-V3-Zellen sind folgende:

Auf einem festen Medium gezüchtete Kulturen (Callus-Kultu­ ren) sind farblose, leicht zerlegbare Zellmassen. Die Zel­ len haben eine runde bis elliptische Form mit einem Durch­ messer von 50-100 µm. Bei den geprüften Kulturbedingungen zeigen die Callus-Kulturen keine Organogenese oder irgend­ eine Differenzierung. Bei der Einwirkung von Licht mit 2000 Lux verfärben sich die Callus-Kulturen, bedingt durch die Chlorophyllbiosynthese grün. Jedoch beeinflußt die Lichteinwirkung die Alkaloidbiosynthese nicht.

Bei der Züchtung in flüssigen Medien wachsen nicht­ differenzierte Kulturen als kleine Aggregate von 5 bis 50 Zellen. Die Zellen besitzen die gleiche Form und gleiche Dimensionen wie jene, die auf festen Medien gezüchtet wer­ den.

Eine andere Eigenschaft ist die Bildung der beiden Alka­ loide Vincamin und Epivincamin in im wesentlichen reiner Form, die im folgenden einfach als "rohes Vincamin" be­ zeichnet werden.

Die neue Kultur wurde aus einer Vinca minor-Pflanze, die nahe Lecco (Como, Italien) gefunden wurde, gewonnen. Pflan­ zenteile (Blätter, Triebe und Wurzeln) wurden durch Waschen mit 70%-igem Ethanol während 5 Minuten, 2%-igem Natrium­ hyperchlorit während 2 Minuten und 5%-igem Quecksilber- (II)-chlorid während 45 Sekunden sterilisiert. Nach jedem Waschvorgang wurden sie mit sterilem destilliertem Wasser gespült.

Die Blätter, Triebe und Wurzeln wurden dann in Stücke ge­ schnitten und aseptisch in Gamborg-B5-Medium (O. L. Gam­ borg et al., Exp. Cell Res. 50, S. 151 (1968)), supplemen­ mentiert mit 1 mg/ml Naphthalin-Essigsäure (NAA) und 7 g/l Agar, fixiert und in der Dunkelheit bei 28°C gehalten. Nach 10 bis 15 Tagen begann ein undifferenziertes Gewebe (Callus) zu wachsen und nach 20 bis 30 Tagen wurde es auf Agarschräg­ platten mit dem gleichen Medium transferiert. Gewöhnlich dauert es etwa 20 Tage bei 28°C in der Dunkelheit, bis das Kulturwachstum beendet ist. Nach 2 oder 3 Übertragungen wer­ den stabilisierte Kulturen erhalten und als Inokulum in Schüt­ telkolben verwendet.

Etwa 1-2 g Frischgewicht des Callus werden mit einem Glas­ stab homogenisiert und in einen 300-ml-Erlenmeyer-Kolben ge­ geben, welcher 50 ml flüssiges Gamborg-Medium, supplemen­ tiert mit 1 mg/l NAA, enthält. Nach 7tägiger Inkubation bei 28°C in der Dunkelheit an einer Rotationsschüttelvorrich­ tung mit 120 UpM beträgt das Trockengewicht der Kultur et­ wa 10 mg/ml, und 5 ml vegetative Kultur werden zum Inoku­ lieren eines 300-ml-Erlenmeyer-Kolbens verwendet, welcher 45 ml Gamborg-B5-Medium mit 30 g/l Saccharose und 1 mg/l NAA (G30-Medium) enthält. Diese Kulturen werden bei 23°C in der Dunkelheit auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 120 UpM während 10-14 Tagen gezüchtet.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die FICE-V3- Zellen in einem flüssigen Medium gezüchtet. Kolben oder Fermentoren aus Glas oder anderen üblicherweise verwendeten Materialien, wie rostfreiem Stahl, können verwendet werden. Das flüssige Medium kann eine Nährlösung sein, welche eine assimilierbare organische Kohlenstoffquelle, eine assimi­ lierbare organische oder anorganische Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls Pflanzenhormone und/ oder Vitamine enthält. Die assimilierbare organische Kohlen­ stoffquelle kann aus Kohlehydraten, wie Saccharose, Glucose, Fructose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Mannit und Mannose be­ stehen. Die assimilierbare organische oder anorganische Stickstoffquelle kann aus Aminosäuren oder ihren Gemischen, Peptiden und Proteinen oder ihren Hydrolisaten, Caseinhydro­ lysat, wasserlöslichen Fraktionen von Getreiden, wie die Rückstände der Maisdestillation oder von Weizen bei der Alkoholproduktion, oder Hefe und auch aus anorganischen Ni­ traten und anorganischen Ammoniumsalzen bestehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird typischerweise in Sus­ pensionskultur, beispielsweise in einem Kolben unter Rüh­ ren oder in einem belüfteten Fermentor bei einem pH im Be­ reich von 4,4 bis 7,0, vorzugsweise 6,5, und bei einer Tem­ peratur im Bereich von 18 bis 36°C, vorzugsweise 23°C, durchgeführt. Im allgemeinen sind bevorzugte Kulturbe­ dingungen Arbeiten in der Dunkelheit bei einem pH-Wert von 5,1 bis 6,8 bei einer Temperatur von 18 bis 30°C und von 8 bis 16 Tagen. Die Produktion des rohen Vincamin beginnt nach 2 bis 3 Tagen des Wachstums und erreicht ihr Maximum nach 10 bis 14 Tagen.

Die Extraktion des rohen Vincamin kann sowohl aus den Zel­ len als auch aus der Kulturbrühe erfolgen. Aus den gefil­ terten Zellen wird das rohe Vincamin typischerweise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Aceton, extrahiert. Aus der Kultur­ brühe, die von den Zellen abgetrennt wurde und bis zu einem pH-Wert von 8-9 alkalisch gemacht wurde, wird das rohe Vin­ camin im allgemeinen mit einem mit Wasser unmischbaren Lö­ sungsmittel, wie Chloroform, Methylendichlorid oder Ethyl­ ether, extrahiert.

Das so gebildete Vincamin oder Epivincamin kann in einem pharmazeutischen Präparat zu einem pharmazeutisch annehm­ baren Träger oder Verdünnungsmittel verarbeitet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Das Verfahren wird in 30-ml-Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Nährmedium G30 enthalten und deren pH-Wert auf 6,5 mit verdünntem Ammoniak eingestellt wurde, durchgeführt. Die Kolben werden auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (120 UpM; exzentrischer Weg: 8 cm) geschüttelt. Die opti­ male Inkubationstemperatur beträgt 23°C. Die Kolben wer­ den mit Zellen inokuliert, welche aus 14 Tage alten FICE- V3-Kulturen in B5-Agar-Medium erhalten wurden.

Nach 14 Tagen beträgt die Produktion etwa 750 mg/l Vinca­ min und 340 mg/l Epivircamin, bestimmt durch HPLC. Zehn Liter Zellsuspensionskulturen, erhalten aus 200 Kolben, werden zentrifugiert und die Zellen und der Überstand werden getrennt extrahiert. Der Überstand wird auf pH 9 mit Natriumcarbonat gebracht und zweimal mit 10 Litern Methylenchlorid extrahiert. Die organischen Extrakte wer­ den ihrerseits mit einer 2%-igen wäßrigen Weinsäurelö­ sung extrahiert. Die saure Lösung wird auf pH 9-10 eingestellt und mit Methylenchlorid extrahiert.

Die zentrifugierten Zellen werden mit einer 50%-igen wäß­ rigen Acetonlösung, welche 2% Weinsäure enthält, homoge­ nisiert und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum konzen­ triert und die entstehende wäßrige Lösung wird alkalisch gemacht, pH-Wert 9-10, und mit Methylenchlorid extrahiert.

Die organischen Extrakte der Zellen und des Über­ standes werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. 8,8 g rohes Vincamin, welches aus 6,0 g Vincamin und 2,8 g Epivincamin, bestimmt durch HPLC besteht, werden erhalten. Die zwei Alkaloide werden durch Säulenchromatographie an Silicagel in Methylenchlorid mit steigenden Mengen an Etha­ nol getrennt. Von der Säule werden 5,6 g reines Vincamin und 2,5 g Epivincamin isoliert.

Beispiel 2

Das Verfahren wird in Kolben gemäß einem zweistufigen Fer­ mentationsverfahren durchgeführt. Zuerst wird das Wachs­ tum an Murashige-Medium (T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15, (1962) S. 473) mit 20 g/l Glucose, 1 mg/l NAA und bei den Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach 8 Tagen erreicht das Trockengewicht 10-13 mg/l. Die Kulturen werden aseptisch zentrifugiert und die Zellen in Produktionsmedium G30 resuspendiert. Nach 6-8 Fermenta­ tionstagen beträgt die Produktion an rohem Vincamin 1050 mg/l. Die HPLC-Analyse entspricht 73% Vincamin und 25% Epivincamin, bezogen auf die gesamten Alkaloide. Durch Verfahrensdurchführung in 100-Erlenmeyer-Kolben, wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 3,6 g reines Vincamin und 1,0 g Epivincamin getrennt. Es werden fast die gleichen Ausbeuten erhalten, wenn Glucose oder Maltose im Medium an Stelle von Glucose verwendet werden.

Beispiel 3

Das Verfahren wird in 10-Liter-Fermentoren, welche 6 l Nähr­ medium G30 enthalten, durchgeführt. Eine Kultur von Vinca minor FICE-V3 wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einem 30-ml-Erlenmeyer-Kolben mit 50 ml Medium B5 hergestellt. Nach 7 bis 10 Tagen (Trockengewicht 12 mg/ml) wird die Kultur zur Inokulation von einem 2000-ml-Rundkolben, wel­ cher 450 ml Medium B5 enthält, verwendet. Die Kultur wird auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei 100 UpM in der Dunkelheit bei 28°C inkubiert. Nach 7 bis 10 Tagen wird die vollständig gewachsene Kultur (Trockengewicht 10 mg/ml) als Inokulum für einen 10-Liter-Fermentor, welcher 6 l Medium G30 enthält, verwendet. Die Produktionsphase erfolgte bei 27°C in der Dunkelheit mit einem Anfangsrühren von 100 UpM und einer Belüftungsmenge von 0,5 Vol/Vol/min. Wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff um 20% abnahm, wurde das Rühren um 20 UpM gesteigert.

Nach 10 bis 14 Tagen besitzt die Kultur ein Trockengewicht von 20 mg/ml und einen Alkaloidgehalt von 760 mg/l, ausge­ drückt als rohes Vincamin. Die Alkaloide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert und gereinigt. Die Ausbeute betrug 3,3 g/l Vincamin und 0,9 g/l Epivincamin.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Vincamin und Epivin­ camin, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen der Kultur FICE-V3 (DSM 4365) bei aeroben Bedingungen in einem flüssigen Medium, welches eine assimilierbare Koh­ lenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, gezüchtet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zellen in der Dunkelheit bei einem pH-Wert von 5,1 bis 6,8 bei einer Temperatur von 18 bis 30°C und von 8 bis 16 Tagen gezüchtet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die so gebildeten Vincamin und Epivincamin aus den Zellen und/oder der Kulturbrühe isoliert werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die so gebilde­ ten Vincamin und Epivincamin voneinander getrennt werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das so gebil­ dete Vincamin in Epivincamin umgewandelt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem Fermentor durchgeführt wird.

7. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein Verdünnungsmittel und als aktiven Bestand­ teil Vincamin oder Epivincamin, welches nach einem Verfahren der vorhergehenden Ansprüche hergestellt worden ist, enthält.

8. Zellkultur FICE-V3 (DSM 4365).