DE68921934T2

DE68921934T2 - Immunsuppressives Agens.

Info

Publication number: DE68921934T2
Application number: DE68921934T
Authority: DE
Inventors: Byron H Arison; Shieh-Shung T Chen; Edward S Inamine; Linda S Wicker
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1989-06-22
Publication date: 1995-10-19
Anticipated expiration: 2009-06-23
Also published as: CA1334392C; JPH02188585A; EP0349061A2; DE68921934D1; EP0349061B1; JPH082907B2; EP0349061A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein neues immunsuppressives Mittel "Demethimmunomycin" (L-683 742: auch beschrieben als 31-Desmethoxy-31-hydroxy-L-683 590), ein neues Fermentiationsverfahren zu seiner Herstellung, welches den Mikroorganismus Actinoplanacete sp. (MA 6559), ATCC Nr. 53771, verwendet. Das Verfahren umfaßt die Kultivierung des Mikroorganismus in Gegenwart von L-683 590 unter Bedingungen, die die C&sub3;&sub1;-Methoxygruppe von L-683 590 demethylieren. Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zu ihrer Verwendung in einem menschlichen Wirt zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Infektionen und/oder zur Prävention von Organtransplantat-Abstoßungen.

2. Kurze Beschreibung der Offenbarungen in der Technik

1983 ließ die US FDA Cyclosporin zu, ein extrem wirksames Anti-Abstoßungsarzneimittel, das das Gebiet der Organtransplantationsoperation revolutionierte. Das Arzneimittel wirkt durch Hemmung des körpereigenen Immunsystems durch Mobilisierung seines immensen Arsenals von natürlichen Schutzstoffen, um das Fremdprotein des Transplantats abzustoßen.
So wirksam das Arzneimittel bei der Bekämpfung der Transplantat-Abstoßung ist, so besitzt es doch die Nachteile, daß es Nierenversagen, Leberschädigung und Ulcera verursacht, die in vielen Fällen schwer sein können.
Die EPO-Veröffentlichung Nr. 0184162 von Fujisawa beschreibt ein neues Makrolid-Immunsuppressivum FK-506, das 100mal wirksamer sein soll als Cyclosporin. Das Makrolid wird hergestellt durch Fermentation eines bestimmten Stammes von Streptomyces tsukubaensis. Ebenfalls beschrieben ist das eng verwandte Makrolid-Immunsuppressivum FX-520, produziert von S. hygroscopicus subsp. yakushimaensis.
Die USP 3 244 592 von T. Arai beschreibt die Kultivierung von Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus, um das Fungizid "Ascomycin" zu produzieren.
Es existiert jedoch keine Beschreibung in der Literatur der Produktion von immunsuppressiven Mitteln, denen im wesentlichen die Nebenwirkungen von Cyclosporin fehlen.
Nach neuen sichereren Arzneimitteln, die weniger Nebenwirkungen zeigen, wird auf diesem Gebiet permanent geforscht.

3. Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein ¹H-kernmagnetisches-(NMR)-Spektrum, aufgenommen bei 400 MHZ, von "Demethimmunomycin" in CDCl&sub3;.
Fig. 2 ist ein ¹H-NMR-Spektrum, aufgenommen bei 400 NHz von L-683 590 in CDCl&sub3;.
Fig. 3 stellt die zugeordnete Molekülstruktur von "Demethimmunomycin" dar.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde gefunden, daß ein neues Immunsuppressivum, "Demethimmunomycin", durch Fermention des Mikroorganismus Actinoplanacetae sp. (MA 6559) ATCC Nr. 53771, mit dem Makrolid-Immunsuppressivum L-683 590 unter submersen anaeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kohlenhydratmedium erhalten werden kann, das einen Stickstoffnährstoff enthält, wobei die genannten Bedingungen bei einem ph-Wert von etwa 7 durchgeführt werden, die ausreichen, um L-683 590 in Position C&sub3;&sub1; zu demethylieren.
Das resultierende "Demethimmunomycin" zeigt die immunsuppressive Aktivität, d.h. eine positive Hemmung der T-Zellen-Aktivierung, wie gezeigt durch den durch Calciumionophor (Ionomycin) plus Phorbolmyristatacetat (PMA) induzierten T-Zellen-Stimulationstest, hier auch als "T-Zellen- Prolieferationstest" bezeichnet.
Das Prinzip dieses Tests besteht darin, die Proliferation von Maus-T-Lymphozyten zu messen, die mit der Kombination aus lonomycin plus PMA stimuliert worden sind. Eine positive Probe in diesem Test hemmt die T-Zellen-Proliferation, was durch eine verringerte Aufnahme von tritiiertem Thymidin angezeigt wird.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Produktion eines Immunsuppressivum bereitgestellt, das als "Demethimmunomycin" bezeichnet wurde, umfassend die Stufe Kultivieren eines Stammes von Actinoplanacetae sp. zusammen mit L-683 590 unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Kohlenhydratmedium, das einen Stickstoffnährstoff enthält, ausreichend lange, um das Produkt "Demethimmunomycin" zu produzieren.
Außerdem bereitgestellt wird ein neues Immunsuppressivum, "Demethimmunomycin", hergestellt durch das obige Verfahren, das eine positive Hemmung der T-Zellen-Aktivierung durch den T-Zellen-Proliferationstests zeigt und ein protonenkernmagnetisches Resonanzspektrum, wie in Fig. 1 angegeben, zeigt.
Ebenfalls bereitgestellt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von "Demethimmunomycin" in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen im wesentlichen nichttoxischen Trägerstoff oder einen Hilfsstoff enthält.
Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung von "Demethimmunomycin", wie hier definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines menschlichen Wirts zur Verhinderung einer Transplantat-Abstoßung oder zur Behandlung von Autoimmunerkrankung oder Infektion bereit.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfindung umfaßt die Fermentation von Actinoplanacetae sp. MA 6559 zusammen mit L-683 590, um " Demethimmunomycin" zu produzieren. Der Mikroorganismus wurde am 22. Mai 1988 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive in Rockville, Maryland, unter der ATCC Nr. 53771 hinterlegt und bei der Merck Kultursammlung in Rahway, New Jersey als MA 6559 hinterlegt. Die physikalischen Eigenschaften und die Taxonomie einschließlich der morphologischen, züchterischen, biologischen und physiologischen Eigenschaften werden im folgenden kurz beschrieben.
Auf der Grundlage der bisher durchgeführten Taxonomie-Analyse wurde die Kultur vorläufig der Ordnung Actinomycetales und der Familie Actinoplanacea zugeordnet. Weitere Taxonomie- Eigenschaften werden neu geprüft, um diesen Organismus flüssig innerhalb eines Genus und einer Spezies einzuordnen.
Die Kultur wächst gut auf den üblichen Medien, einschließlich Trypticase-Sojaagar (28 º und 27 ºC), Hefe-Malzextrakt-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar, anorganisches Salz-Stärke-Agar, Hafermehl-Agar, Czapek Dox, Czapek-Lösung-Agar und Pepton- Agar und Bennets-Agar, alles bei 28 ºC.
Morphologie - Die Kultur wächst als verzweigtes fadenförmiges Myzel mit einem Durchmesser von 0,2 - 0,4 µm. Die Kolonien sind trübe, erhaben und ausgefranst. Die Kolonietextur ist gummiartig auf Hefe-Malzextrakt-Agar, neigt jedoch dazu, auf anderen Medien butterartig zu sein, wobei eine deutliche Fragmentierung des Myzels beobachtet wird. Die Kolonieoberfläche neigt dazu, im Aussehen pulverartig zu sein. Es wurden keine diffundierbaren Pigmente beobachtet.
Sporangien - vorherrschend kugelig und in einem Größenbereich von 4 - 25 µm im Durchmesser. Sporangien sind im allgemeinen nach 21 Tagen sichtbar und neigen auf Glycerin-Asparagin-Agar zur Koaleszenz. Sporen sind stäbchenförmig mit stumpfen Enden (0,76 x 1,9 µm), nicht beweglich und treten in langen unverzweigten Ketten von bis zu 150 µm Länge auf.

Kultur-Eiaenschaften von MA 6559

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-Medium 2)

Das vegetative Myzel ist hyalin bis gelb, es entwickelt sich ein Luftmyzel in 24 bis 72 Stunden und ist im Aussehen gelbbraun bis rosafarben-pink und pulverig. Die Gegenseite ist braun bis rotbraun.

Hafermehl-Agar (SIP-Medium 3)

Das vegetative Myzel ist hyalin bis gelb, die Unterseite hyalin bis braun. Das Luftwachstum ist weiß bis leicht rosafarben-beige und pulverig im Aussehen.

anoraanische Salze-Stärke-Agar (ISP-Medium 4)

Leichtes Wachstum, spärliches Luftmyzel. Vegetatives Wachstum ist hyalin und stark fragmentiert. Ein Klären der Stärke tritt an der Peripherie der Kolonien ein und wird am Tag 7 bemerkt.

Glycerin-Asparagin-Agar (ISP-Medium 5)

Das vegetative Wachstum ist hyalin bis gelb, die Unterseite ist hyalin bis zimtbraun. Das Luftmyzel ist pulverig und weiß bis rosafarben-pink.

Peptid-Eisen-Hefeextrakt-Agar (ISP-Medium 6)

Das vegetative Wachstum ist bräunlich. Kein Luftwachstum wird beobachtet und es werden keine melanoiden Pigmente produziert.
Tyrosin-Agar (ISP-Medium 7)
Das vegetative Wachstum ist braun und wird tiefviolett, wenn die Kultur altert. Das Luftmyzel ist sandartig bis graurosabeige.

Czapek-Dox-Agar

Das vegetative Wachstum ist braun mit einem pinkfarbenen Ton, wenn die Kultur altert. Die Luftmyzelien sind kurz und matt mit einem feuchten Aussehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit irgendeinem "Demethimmunomycin-produzierenden" Stamm von Actionplanacetae sp. durchgeführt werden. Besonders bevorzugt wird der Stamm mit der ATCC Nr. 53771.
Im allgemeinen kann "Demethimmunomycin" produziert werden durch Kultivieren (Fermentation) des Stammes, der die Substanz Demethimmunomycin in einem wäßrigen Nährmedium produziert, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen (z.B. Schüttelkultur, submerse Kultur etc.). Das wäßrige Medium wird vorzugsweise bei einem ph-Wert von etwa 7 zu Beginn und Ende (Ernte) des Fermentationsverfahrens gehalten. Ein höherer ph-Wert führt zu einem wesentlichen und/oder gesamten Verlust des Produkts. Der beschriebene ph-Wert kann durch Verwendung eines Puffers, wie Morpholinoethansulfonsäure (MES), Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) und dergleichen, oder durch Wahl der Nährstoffe, das von Natur aus Puffereigenschaften besitzt, wie die Produktmedien, die im folgenden beschrieben werden, eingehalten werden.
Die bevorzugten Kohlenstoffquellen in dem Nährmedium sind Kohlehydrate, wie Glucose, Xylose, Galctose, Glycerin, Stärke, Dextrin und dergleichen. Weitere Quellen, die eingeschlossen sein können, sind Maltose, Rhamnose, Raffinose, Arabinose, Mannose, Salicin, Natriumsuccinat und dergleichen.
Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojamehl und weitere Gemüsemehle (teilweise oder vollständig entfettet), Caseinhydrolysate, Sojabohnenhydrolysate und Hefehydrolysate, Maisquellwasser, Trockenhefe, Weizenkeime, Federmehl, Erdnußpulver, lösliche Destillationssubstanzen etc. sowie anorganische und organische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat etc.), Harnstoff, Aminosäuren und dergleichen.
Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, obwohl zweckmäßigerweise in Kombination eingesetzt, brauchen nicht in ihrer reinen Form verwendet zu werden, da weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen von mineralischen Nährstoffen enthalten, ebenfalls zur Verwendung geeignet sind. Falls gewünscht können zu dem Medium Mineralsalze, wie Natrium- oder Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Natrium- oder Kaliumiodid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Kobaltsalze und dergleichen, zugegeben werden. Falls notwendig, insbesondere wenn das Kulturmedium stark schäumt, kann ein Entschäumungsmittel, wie flüssiges Paraff in, Fettöl, Pflanzenöl, Mineralöl oder Silicon, zugegeben werden.
Das Ausgangsmaterial L-683 590 kann durch Fermentation von S. hyaroscopicus var. ascomvceticus, ATCC Nr. 14891, wie beschrieben in der U.S.-Patentschrift 3 244 592, und durch Fermentation von S. hygroscopicus subsp. yakushimaensis Nr. 7278 (um FR-900520 oder "FK-520" zu produzieren, das mit L-683 590 identisch ist), wie beschrieben in der EPO-Veröffentlichung Nr. 0184162 von Fujisawa, erhalten werden.
Was die Bedingungen zur Produktion von Demethimmunomycin in sehr großen Mengen betrifft, so werden submerse aerobe Kulturbedingungen dafür bevorzugt. Zur Produktion in kleinen Mengen wird eine Schüttel- oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder einer Flasche eingesetzt. Wenn das Wachstum in großen Tanks durchgeführt wird, wird es bevorzugt, die vegetative Form des Organismus zum Animpfen der Produktionstanks zu verwenden, um eine Wachstumsverzögerung während des Produktionsprozesses für Demethimmunomycin zu vermeiden. Demgemäß ist es wünschenswert, zuerst ein vegetatives Inoculum des Organismus zu produzieren, indem eine relativ kleine Menge von Kulturmedium mit Sporen oder Myzelien des Organismus angeimpft wird, der in einem "Schrägröhrchen" produziert worden ist, und indem das genannte angeimpfte Medium, auch "Anzuchtmedium" genannt, kultiviert und anschließend das kultivierte vegetative Inoculum aseptisch in die großen Tanks übergeführt wird. Das Fermentationsmedium, in dem das Inoculum produziert wird, ist im wesentlichen dasselbe oder unterscheidet sich von dem Medium, das zur Produktion von Demethimmunomycin verwendet wird, und wird im allgemeinen zur Sterilisation des Mediums vor dem Animpfen autoklaviert. Der ph-Wert des Mediums wird im allgemeinen auf 7,0 vor der Autoklavierungsstufe durch eine geeignete Zugabe einer Säure oder Base, vorzugsweise in Form einer Pufferlösung, eingestellt.
Rühren und Belüften des Kulturgemisches kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Das Rühren kann durch eine Propeller oder eine gleichartige mechanische Rührapparatur durch Umrühren oder Schütteln des Fermenters, durch verschiedenes Pumpgerät oder durch Hindurchleiten von steriler Luft durch das Medium bereitgestellt werden. Die Belüftung kann erfolgen, indem sterile Luft durch das Fermentationsgemisch geleitet wird.
Die Fermentation wird im allgemeinen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 ºC und 40 ºC, vorzugsweise bei 25-35 ºC, für einen Zeitrum für etwa 10 Stunden bis 20 Stunden, der je nach Fermentationsbedingungen und Maßstäben variiert werden kann, durchgeführt. Vorzugsweise werden die Produktionskulturen etwa 17 Stunden lang bei 27 ºC auf einem Rotationsschüttler inkubiert, der bei 220 upm betrieben wird, wobei der ph-Wert des Fermentationsmediums bei 7,0 bis zur Ernte gehalten wird.
Bevorzugte Kultur/Produktionsmedien zur Durchführung der Fermentation umfassen die folgenden Medien:
Anzuchtmedium A g/l
Dextrose 1,0
Dextrin 10,0
Rinderextrakt 3,0
Ardamin pH 5,0
NZ-Amin Typ E 5,0
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,05
K&sub2;HPO&sub4; 0,37
Einstellen auf pH 7,1
Zugabe von CaCO&sub3; 0,5 g/l
Transformationsmedium B
Glucose 10
Hycase SF 2
Rinderextrakt 1
Maisquellwasser 3
Einstellen auf pH 7,0
Transformationsmedium C g/l
Mannit 5
Glycerin 5
Hycase SF 2
Rinderextrakt 1
Maisquellwasser 3
Einstellen auf pH 7,0
Das produzierte Demethimmunomycin kann aus dem Kulturmedium durch herkömmliche Mittel, die im allgemeinen zur Gewinnung von anderen bekannten biologisch aktiven Substanzen verwendet werden, gewonnen werden. Die produzierte Demethimmunomycin- Substanz wird in dem kultivierten Myzel und im Filtrat gefunden und kann demgemäß aus dem Myzel und dem Filtrat isoliert und gereinigt werden, die durch Filtrieren oder Zentrifugieren der kultivierten Brühe durch ein herkömmliches Verfahren, wie Konzentrieren unter reduziertem Druck, Lyophilisieren, Extraktion mit einem herkömmlichen Lösungsmittel, wie Ethanol und dergleichen, PH-Wert-Einstellung, Behandeln mit einem herkömmlichen Harz (z.B. einem Anionenoder Kationenaustauscherharz, einem nichtionischen Adsorptionsharz etc.), Behandeln mit einem herkömmlichen Adsorbens (z.B. Aktivkohle, Kieselsäure, Kieselgel, Cellulose, Aluminiumoxid etc.), Kristallisation, Umkristallisation und dergleichen, erhalten werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Lösungsmittelextraktion, insbesondere unter Verwendung von Methanol.
Das Produkt Demethimmunomycin aus der Fermentation zeigt eine positive immunsuppressive Aktivität in dem "T-Zellen-Proliferationstest" und besitzt auf dieser Grundlage Brauchbarkeit und zeigt die folgenden physikalischen Eigenschaften:
1. weißes amorphes Pulver
2. Löslichkeit in Methanol
3. Molekulargewicht 777, wie bestimmt durch FAB- Massenspektroskopie (beobachtet; M + Li 784), konsistent mit der in Fig. 3 zugeordneten Struktur, entsprechend einem Verlust von 14 Masseneinheiten, der CH&sub2;-Gruppe aus
Die NMR-Schlüsseleigenschaft der zugeordneten Demethimmunomycin-Struktur (Fig. 3) besteht in dem Verlust eines Methoxy- Signals in Fig. 1 aus Fig. 2, gekoppelt mit der Abwesenheit der H-31-Resonanz bei ihrer charakteristischen chemischen Verschiebung nahe 3,1 ppm. Da ein CH mit einem angeknüpften OH im allgemeinen relativ zu einem CH-OCH&sub3; um 0,1-0,3 ppm tieffeldverschoben ist, ist die Schlußfolgerung plausibel, daß das 31-Methyl verloren gegangen ist und daß H-31 sich in das 3,3-3,5 ppm-Multiplett verschoben hat, das H-13, H-21, H- 33 und die restlichen Methoxygruppen enthält. Weiterhin gestützt wird die Zuordnung des fehlenden Methoxys zu C-31 statt zu C-13 oder C-15 durch die Tatsache, daß die chemischen Verschiebungen von H-14 und H-15 in Fig. 1 identisch sind mit denjenigen in dem Stammolekül in Fig. 2. Ferner macht die Schlußfolgerung Sinn, daß die C-31-Demethylierung die einzige strukturelle Änderung darstellt, da keine neuen Resonanzen gesehen werden und sämtliche erkennbaren Protonensignale von H-2 bis H-28 praktisch sich mit denjenigen in L-683 590 überlagern.
Das gemäß den Fermentationsprozessen, wie vorstehend erklärt, erhaltene Demethimmunomycin kann auf herkömmliche Weise isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Extraktion, Fällung, fraktionierte Kristallisation, Umkristallisation, Chromatographie und dergleichen.
Geeignete Salze des Materials können pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen, wie basische Salze, beispielsweise Alkalimetallsalz (z.B. Natriumsalz, Kaliumsalz etc.), Erdalkalimetallsalz (z.B. Calciumsalz, Magnesiumsalz etc.), Ammoniumsalz, Aminsalz (z.B. Triethylaminsalz, N-Benzyl-N- methylaminsalz etc.) und weitere herkömmliche organische Salze.
Es sei angemerkt, daß bei den vorgenannten Fermentationsreaktionen und bei der Nachbehandlung des Fermentationsgemisches darin, daß sich das Conformer und/oder (die) Stereosisomer(e) von Demethimmunomycin aufgrund des asymmetrischen Kohlenstoffatoms (asymmetrischer Kohlenstoffatome) oder aufgrund einer Doppelbindung (Doppelbindungen) von Demethimmunomycin gelegentlich sich in das andere Conformer und/oder Stereoisomer(e) umwandeln kann. Solche Fälle sind ebenfalls in den Umfang der Erfindung eingeschlossen.
Das erfindungsgemäße Demethimmunomycin besitzt eine pharmakologische Aktivität, wie eine immunsuppressive Aktivität, antimikrobielle Aktivität und dergleichen, und ist darum zur Behandlung und Prävention der Transplantat-Abstoßung von Organen oder Geweben, wie Herz, Niere, Leber, Medulla Ossium, Haut etc., Pfropf-auf-Wirt-Krankheiten durch Medulla-Ossium- Transplantation, Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Hashimoto- Thyreoiditis, Multiple Sklerose, Myasthenia Gravis, Diabetis vom Typ I, Uveitis und dergleichen, geeignet.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form einer pharmazeutischen Präparation, beispielsweise in fester, halbfester oder flüssiger Form verwendet werden, die das erfindungsgemäße Demethimmunomycin als aktiven Bestandteil in einem Gemisch mit einem organischen oder anorganischen Trägerstoff oder Hilfsstoff für externe, enterale oder parenterale Anwendungen geeignet, enthält. Der aktive Bestandteil kann kompoundiert sein, beispielsweise mit den üblichen nichttoxischen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen für Tabletten, Pellets, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und für jede weitere zur Anwendung geeigneten Form. Die Trägerstoffe, die verwendet werden können, sind Wasser, Glucose, Lactose, Akaziengummi, Gelatine, Mannit, Stärkepaste, Magnesiumtrisilicat, Talk, Maisstärke, Keratin, kolloidale Kieselsäure, Kartoffelstärke, Harnstoff, und weitere Trägerstoffe, die zur Verwendung bei der Herstellung der Präparationen in fester, halbfester oder flüssiger Form geeignet sind. Außerdem können Hilfsmittel, Stabilisatoren, Verdicker und Farbstoffe und Duftstoffe verwendet werden. Die aktive erfindungsgemäße Verbindung ist in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge eingeschlossen, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung auf den Prozeß oder den Zustand der Erkrankungen auszuüben.
Zur Verabreichung dieser Zusammensetzung an einen Menschen ist es vorzuziehen, sie durch parenterale oder enterale Verabreichung anzuwenden. Während die Dosis der therapeutisch wirksamen Menge von Demethimmunomycin in Abhängigkeit von Alter und Zustand eines jeden einzelnen zu behandelnden Patienten variiert und davon abhängt, wird im allgemeinen eine tägliche Dosis (berechnet auf der Grundlage eines 70-kgschweren Mannes) von etwa 0,01-1000 mg, vorzugsweise von 0,1-500 mg und mehr bevorzugt von 0,5-100 mg des aktiven Bestandteiles zur Behandlung der Krankheiten verabreicht, und im allgemeinen wird eine durchschnittliche Einzeldosis von etwa 0,5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg und 500 mg verabreicht.
Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Erläuterung der Erfindung angegeben und sollten nicht als Einschränkungen des Umfangs oder Geistes der Erfindung betrachtet werden.

BEISPIEL 1

Mikroorganismus und Kulturbedingungen

Die lyophilisierte Kultur (MA 6559) ATCC Nr. 53771 wurde zum Animpfen eines 250-ml-Schleusen-Schüttelkolbens, der 50 ml eines autoklavierten (sterilisierten) Anzuchtmediums enthielt, das bestand aus (in Einheiten von g/l) Dextrin 10,0 %, Dextrose 1,0 %, Rinderextrakt 3,0 %, Ardamin-PH (Yeast Products, Inc.) 5,0 %, N-Z-Amin Typ E 5,0 %, MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,05 %, KH&sub2;PO&sub4; 0,37 % und CaCO&sub3; 0,5 %. Der pH-Wert des Anzuchtmediums wurde vor dem Autoklavieren auf 7,1 eingestellt. Die Anzucht wurde in dem Anzuchtmedium bei 27 ºC 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der bei 220 upm betrieben wurde, inkubiert. Alternativ wird die Kultur, falls gefrorene vegetative Myzelien oder eine Schrägkultur als Quelle verwendet werden, in dem Anzuchtmedium bei 27 ºC 24 Stunden bei 220 upm inkubiert. Ein 2,5-ml-Aliquot des resultierenden Anzuchtmediums wurde zum Animpfen eines 250-ml-Schüttelkolbens ohne Schleuse verwendet, der 50 ml des folgenden zuvor autoklavierten (sterilisierten) Transformationsmediums B enthielt. L-683 590 wurde als Lösung in Dimethylsulfoxid zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml Konzentration zu erreichen. Der Inhalt der Schüttelkolben wurde anschließend 18 Stunden bei 27 ºC auf einem Rotationsschüttler, der bei 220 upm betrieben wurde, inkubiert:
1. Transformationsmedium B bestand aus (in g/l) Glucose 10,0, Hycase SF 2,0, Rinderextrakt 1,0, Maisquellwasser 3,0, worin der ph-Wert vor dem Autoklavieren auf 7,0 eingestellt wurde.

Isolierungs- und Reinigungsverfahren der Brühe

Die gesamte Brühe (100 ml) von Transformationsmedium B wurde 3mal mit Methylenchlorid (3 x 100 ml) extrahiert. Die Methylchlorid-Extrakte wurden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der Rückstand wurde in Acetonitril aufgelöst und eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Reinigung unterworfen.
Die HPLC wurde mit einer Whatman-Partisil-10-ODS-3-Säule von 9,4 mm x 25 cm durchgeführt und bei 205 nm und 225 nm bei 60 ºC überwacht. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten aus 0,1 % wäßrigem H&sub3;PO&sub4;-CH&sub3;CN, 45:55, bis 0,1 % wäßriges H&sub3;PO&sub4;-CH&sub3;CN, 20:80, in 30 Minuten entwickelt. Die Verbindung wurde während wiederholter Injektionen des oben beschriebenen Extraktes gesammelt. Die Fraktionen bei einer Retentionszeit von 24 Minuten wurden vereinigt, auf pH 6,5 eingestellt und zur Entfernung von Acetonitril eingedampft. Die Verbindung wurde noch unter Verwendung von C&sub1;&sub8;-Sep-Pak (Waters Associates) und eines Elutionslösungsmittels von Acetonitril- Wasser gereinigt, so daß sich 1,4 mg Produkt ergaben, das als L-683 422, "Demethimmunomycin" bezeichnet wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Transformationsmedium C erhalten.

Charakterisierung

Demethimmunomycin wurde mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert, wobei sich das NMR-Spektrum aus Fig. 1 ergab. Die zugeordnete Molekülstruktur ist in Fig. 3 gezeigt.

BEISPIEL 2

T-Zellen-Proliferationstest

1. Probenpräparation

Gereinigtes Demethimmunomycin, wie hergestellt durch HPLC vorstehend, wurde in absolutem Ethanol zu 1 mg/ml aufgelöst.

2. Test

Milz von C57B1/6-Mäusen wurde unter sterilen Bedingungen entnommen und vorsichtig in eiskaltem RPMI-1640-Kulturmedium (GIBCO, Grand Island, N.Y.) dissoziiert, das mit 10 % wärmeinaktiviertem fetalem Kälberserum (GIBCO) angereichert war. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 1500 upm 8 Minuten lang pelletisiert. Verunreinigende Erythrozyten wurden durch Behandeln des Pellets mit Ammoniumchlorid- Lysepuffer (GIBCO) für 2 Minuten bei 4 ºC entfernt. Das kalte Medium wurde zugegeben, und die Zellen nochmals bei 1500 upm 8 Minuten lang zentrifugiert. T-Lymphozyten wurden sodann durch Abtrennen der Zellsuspension über Nylonwolle-Säulen wie folgt isoliert: Nylonwolle-Säulen wurden hergestellt, indem ungefähr 4 g gewaschene und getrocknete Nylonwolle in 20-ml-Kunststoffspritzen gepackt wurden. Die Säulen wurden durch Autoklavieren bei 250 ºF [120 ºC] 30 Minuten lang sterilisiert. Die Nylonwolle-Säulen wurden mit warmem (37 ºC) Kulturmedium benetzt und mit demselben Medium gespült. Die gewaschenen in warmen Medium resuspendierten Milzzellen wurden langsam auf die Nylonwolle aufgegeben. Die Säulen wurden sodann in aufrechter Position bei 37 ºC 1 Stunde lang inkubiert. Nichtzusammenhaftende T-Lymphozyten wurden aus den Säulen mit warmem Kulturmedium eluiert, und die Zellsuspensionen wurden wie vorstehend zentrifugiert.
Gereinigte T-Lymphozyten wurden zu 2,5-x-10&sup5;-Zellen/ml in Komplett-Kulturmedium, bestehend aus RPMI-1640-Medium, mit 10 % wärmeinaktiviertem fetalem Kälberserum, 100 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 2 x 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und 50 µg/ml Gentamycin resuspendiert. Ionomycin wurde zu 250 ng/ml und PMA zu 10 ng/ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde sofort auf Mikrokulturplatten mit 96 flachbödigen Vertiefungen (Costar) (eingetragenes Warenzeichen) zu 200 µl/Vertiefung verteilt. Die Kontrolle, die aus Medium ohne Testarzneimittel bestand, und verschiedene nachstehend angegebenen Verdünnungen der Probe (vorstehend beschriebenes gereinigtes Demethimmunomycin), die zu testen waren, wurden sodann in dreifacher Ausführung in die Vertiefungen zu 20 µl/Vertiefung gegeben. L-679 934 wurde als Standard verwendet. Die Kulturplatten wurden sodann bei 37 ºC in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO&sub2;-95 % Luft 44 Stunden lang inkubiert. Die Proliferation der T-Lymphozyten wurde durch Messung des Einbaus von tritiiertem Thymidin bewertet. Nach 44 Stunden in Kultur wurden die Zellen mit 2 µCi/Vertiefung tritiiertem Thymidin (NEN, Cambridge, MA) Puls-markiert. Nach weiteren 4 Stunden Inkubation wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern unter Anwendung einer Mehrproben-Erntevorrichtung geerntet. Die Radioaktivität der Filterscheiben, entsprechend den einzelnen Vertiefungen wurde durch Standardflüssigkeitsscintillations-Zählverfahren (Betacounter) gemessen. Die durchschnittlichen Zählraten pro Minuten der Vertiefungen in mehrfacher Ausführung wurden berechnet und die Ergebnisse in Prozent Hemmung der tritiierten Thymidin- Aufnahme (Proliferation) wie folgt ausgedrückt:
cpm Durchschnitt, getestete Probe/% Hemmung 100 - cpm Durchschnitt, Kontrollmedium x 100
Die Ergebnisse in % Hemmung bei verschiedenen Konzentrationen von Demethimmunomycin sind in der folgenden Tabelle angegeben: TABELLE Hemmung der T-Zellen-Proliferation durch Demethimmunomycin Demethimmunomycin (ng/ml) % Hemmung
Anmerkungen: 1. Maus-T-Zellen-Kulturen wurden mit ³H-Thymidin 4 Stunden lang vor der Ernte bei 48 Stunden gepulst.
2. Standard-L-679 934 (10 ng/ml) ergab eine Hemmung von 99 %.
3. IC&sub5;&sub0; 1,81 nM für Demethimmunomycin, (L-638 742) und im allgemeinen im Bereich von 1,6 bis 1,9 x 10&supmin;&sup9; molar.
4. Hemmung der T-Zellen-Proliferation durch Demethimmunomycin wurde durch Zugabe von 50 µg/ml IL-2 (rekombinantes IL-2) zu Beginn der Kultur umgekehrt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Immunsuppressivums, das als "Demethimmunomycin" bezeichnet wird, umfassend die Stufe Kultivieren eines Stammes von Actinoplanacete sp. ATCC Nr. 53771 zusammen mit dem Makrolid-Immunsuppressivum L-683 590 unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen in einem wäßrigen Kohlehydratmedium, das einen Stickstoff-Nährstoff enthält, bei einem ph-Wert von etwa 7 und einer Temperatur zwischen etwa 20 ºC und 40 ºC ausreichend lange, so daß "Demethimmunomycin" produziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Medium das Fermentationsmedium "Medium B" ist, das Glucose, Hycase SF, Rinderextrakt und Maisquellwasser umfaßt, und bei dem in dem Medium der pH-Wert auf 7,0 eingestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Medium das Fermentationsmedium "Medium C" ist, das Mannit, Glycerin, Hycase SF, Rinderextrakt und Maisquellwasser umfaßt, und bei dem in dem Medium der ph-Wert auf 7,0 eingestellt wird.

4. Brühe, die durch das Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wird und "Demethimmunomycin" enthält.

5. Immunsuppressives Produkt, hergestellt durch das vorstehend beschriebene Verfahren nach Anspruch 1.

6. Immunsuppressivum, "Demethimmunomycin", das eine positive Hemmung (IC&sub5;&sub0; etwa 1,6 bis 1,9 x 10&supmin;&sup9; molar) der T-Zellen-Aktivierung gemäß T-Zellen-Proliferationstest und ein protonenkernmagnetisches Spektrum, wie in Figur 1 abgebildet, aufweist.

7. Immunsuppressivum, "Demethiummunomycin", mit einer Molekülstruktur, wie in Figur 3 abgebildet.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von "Demethimmunomycin", das eine positive Hemmung (IC&sub5;&sub0; etwa 1,6 bis 1,9 x 10&supmin;&sup9; molar) der T-Zellen-Aktivierung gemäß T-Zellen-Proliferationstest und ein protonenkernmagnetisches Spektrum, wie in Figur 1 abgebildet, aufweist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen, im wesentlichen nichttoxischen Träger- Hilfsstoff enthält.

9. Verwendung von "Demethimmunomycin", das eine positive Hemmung (IC&sub5;&sub0; etwa 1,6 bis 1,9 x 10&supmin;&sup9; molar) der T-Zellen-Aktivierung gemäß T-Zellen-Proliferationstest und ein protonenkernmagnetisches Spektrum, wie in Figur 1 abgebildet, aufweist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines menschlichen Wirtes zur Verhinderung einer Transplantationsabstoßung oder zur Behandlung einer Autoimmun- oder Infektionskrankheit.

10. Biologisch reine Kultur von Actinoplanacete sp. (MA 6559) ATCC Nr. 53771.