JPH02503268A - 保護された化学発光標識物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 保護された化学発光標識物 発明の分野 本発明は、標識の不活化を阻止するように保護されている化学発光（化学ルミネ ッセンス）標識物で標識されている特異的結合性パートナ−５たとえば生物学的 プローブであって、該パートナ−から、脱保護された化学発光標識物を回復させ ることができる特異的結合性パートナ−に関する。

技術の概略 臨床上の研究および診断の分野では、定量的にまたは定性的にせよ生物学的な部 分の存在を確認するための既知の方法は、目的物と特異的に結合するプローブ（ その特異的結合性パートナ−）を使用するものである。たとえば、抗原、または 個々のヌクレオチド配列の形態にあるターゲット（標的）について検定する場合 、そのプロ−ブはそれぞれ抗体、またはオリゴヌクレオチドが可能であろう。

いずれにせよ、プローブを標識するのが通常であり、すなわちその存在を容易に 検出できる原子またはそれと連結した基によって達成される。被検試料中のター ゲットの存在を確認するため、標識したプローブと被検試料内の特異的結合性パ ートナ−との結合を許容する（たとえば、抗体プローブの場合は抗原と結合でき る；オリゴヌクレオチドプローブの場合はヌクレオチド重合体とハイブリダイズ できる）条件下で、該標識プローブをその試料に暴露する。次いで、通常、存在 する標識プローブ／ターゲット複合体を、複合体化していないプローブから分離 し、複合体化した、または複合体化していないプローブの標識物の存在を測定す る。

歴史的には、放射活性の標識物が使用されてきた。しかし、その操作の困難性、 健康上の危険性、および不安定性から、近年、同位体でないＦＡＲ物が開発され た。このような標識物は、その存在を直接的に、または間接的に検出できるよう なものである。直接標識物の例としては、化学発光（化学ルミネッセンス）、リ ン光、蛍光、または分光学的に検出可能な標識物などが挙げられる。間接標識物 の例としては、ビオチンおよび種々の抗原などの、適当な検出可能な標識物とコ ンジコゲートした特異的結合性パートナ−によって検出することができる化合物 などが挙げられる。これら標識物のタイプの中で、化学発光標識物が特に有用で あることが見いだされている。

多くの化学発光化合物が知られている。これらの幾つかは、マツクカブラ（Ｍａ ｃＣａｐｒａ）らのＰｒｏｇｒｅｓｓ　Ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｓｉｓｔ ｒｙ、３．７８（２３）。

２３１−２７７頁（１９７３）に記載されている。この文献は他のすべての引用 文献と同様に本明細書に引用して包含されるものとする。これらの化合物の多く は、過酸化水素または酸素、および水酸化物と処理すると化学発光する。このよ うな化合物には、以下の構造式ｌおよび■で示されるアクリジニウム類およびア クリダン類、ならびに構造式ＩＩ、　ＩＶ、および■で示される化合物がある： （Ｉ［ｌ）　　　　　　　　（ＩＶ）　　　　　　　　　　（Ｖ）英国特許第２ 　１１２　７７９Ｂ号［キャンプベル（Ｃａｍｐｂｅｌ　ｌ）ら、出願番号第８ ２３５０１９号、１９８２年１２月８日出願コには、以下の構造式■で示される アクリジニウムエステルの化学発光生物学的プローブ標識物としての使用が開示 されている：（ＶＩ） この式中、Ｘ−はアニオン、Ｒ′はＨ％Ｃ，−Ｃ，。アルキル、アルケニル、ア ルキニル、またはアリール置換置を意味し、Ｒ１およびＲ３は水素、アミン置換 アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、またはハロゲン置換置 を意味し、Ｒ４は置換されていることもあるフェノキシ部分を意味する。ウィー ク（Ｗｅｅｋ）らのＣｌ１ｎ。

Ｃｈｅｎ、　２９／８．１４フ４−１４７９頁（１９８３）ニも、化学発光抗体 標識物トシテノ上記の式で示されるアクリジニウムエステルの使用が開示されて いる。

アクリジニウムおよびアクリダンに関する化学発光反応機構は詳細に解明されて いる。アクリジニウムの場合は、この化学発光反応は過酸化水素を添加した後、 塩基を添加することによって開始する。

マツクカプラのへテロ環化合物の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｏｆ　Ｅｅｔｅｒ ｏｃｙｃｌｉｃＣｏｍｐｏｕｎｄｓ）、　９巻、　１６−３０頁（１９７３）、 　ｒアクリジン類の化学発光反応」に記載されているように、この機構は明らか に、過酸化物が環の９位炭素を攻撃し、その後に過酸化物の基が脱プロトン化し 、隣接するカルボニルを求核的に攻撃し、ジオキセタン様の中間体が生成するこ とに関連している。これは、脱離基、たとえば酸化物アニオンチルの場合、フェ ノキシトの開裂）と同時に起こることができる。

アクリジニウムは、対応する「疑塩基（ｐｓｕｅｄｏ　ｂａｓｅ）Ｊと平衡して 存在している（このことは、水酸化物イオンの環の９位への付加によって示され る）ので、塩基を添加する前に、またはそれと同時に過酸化水素を添加すべきで あると考えられている。この疑塩基は明らかに化学発光物質でな（、アクリジニ ウムから速い光放出を得るには、アクリジニウムとその疑塩基との平衡が遊離ア クリジニウムのほうにシフトするように、過酸化水素を添加する前にｐＨを低く すべきである。これらの説明は上掲のウィークらに提示されている。

？ツクカプラのＰｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、８巻、　２３１−２７７頁（１９７３）、　ｒ有機化合物の化学発光（Ｃｈｅ ｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ＯｆＯｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｌ１ｐｏｕｎｄｓ） Ｊに指摘されているように、アクリダンの化学発光は、強塩基の存在下にまずア クリダン環の９位水素が脱プロトン化し、対応するアクリダンアニオンが生成す ることに関連していると思われるらしく、これは９位で酸素と反応し、次いでア クリジニウムの場合と同様の機構によってジオ牛セタンが形成され、酸化物を排 除する。

アクリジニウムまたはアクリダンに関する化学発光機構は、いずれの場合でも良 好な脱離基（たとえばフェノキシト）が必要であるようだと示唆されている。こ の要件は、マツクヵプラのＡｃｃｏｕｎｔｓ　Ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、９巻、　？ｉｏ、　６．２０１−２０８（１９７６年、６月）によ って証明されており、これには、収量（励起化合物の化学的収量に基づく）がＲ ＯＨ（ここに、ＲＯ−が脱離酸化物アニオンである）のｐＫａの減少に伴って増 加すると記載されている。すなわち、ＲＯ−が良好な脱離基である場合に収量が 増加するのである。

標識プローブは、生物学的ターゲットの検定試験キットの１成分として調製され ることが多い。通常、このようなキットには、水溶液の形態の標識プローブが含 まれている。この場合の難点は、上述したタイプの化学発光化合物が、化学発光 に必要なその環の９位部分（その活性部である）に加水分解を受けることである 。たとえば、アクリジニウム・フェニルエステルの場合、若干の酸性条件下（た とえば、ｐＨ６）でさえも、そのエステル「活性部」のカルボニル炭素が加水分 解を受け、化学発光物質でない対応するアクリジニウム酸、および脱離基（この 場合はフェノ牛シトアニオンである）になってしまう。このような加水分解は、 標識物を担うプローブをターゲット検定に使用した場合にも起こるであろう。具 体的には、プローブが、上昇温度（たとえば、６０’Ｃ）かつ長時間（たとえば 、２時間）で標的配列とハイブリダイズする検定プロトコールに必要であるオリ ゴヌクレオチドの場合である。

ピリジン同族体およびアクリジン同族体に関し、それぞれｃ４および０９位にお ける求核付加に関連する一般的な方法について研究が行われている。たとえば、 このような研究は、コロウィック（ｃｏｌｏｗｉｃｋ）らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｔ　、　１９１巻、４４７頁（１９５１）、ルドウイーク（Ｌｕｄｏｖｉ ｅｇ）らのＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　ｅｏｍｍｕｎ、　 、　１４巻、４３１頁（１９６４）、およびジ１ン・ビレイ・アンド・サンズ社 （Ｊｏｈｎ　ｌ１ｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　Ｉｎｃ、、　。

ンドン、英国）から発行されたアケソン（Ａｃｈｅｓｏｎ）の「アクリジン類」 のテキスト（１９７３）に記載されている。

定　　義 ｒｌｕ−比光単位。フォトン（光子）がルミノメータ−の光電子増倍管に当たり 、電子カスケードが開始され、それが機器に示される数値となる。この工程の効 率は機器依存性であるので、その単位が比光単位と呼ばれる。

付加物−２つの構造的に異なる反応体の反応から得られる単一の分子生成物を意 味する。

特異的結合性パードナー−高い程度の特異性をもって他の生物学的分子と結合す る生物学的分子。たとえば、抗体、およびそれと特異的に結合する分析物の各々 が他方に対して特異的結合性パートナ−である（「相補体」と呼ぶこともある） 。

活性部−以後に励起して発光体となるのに必要であるような状態にある化学発光 標識物の部分。

ライト−オフ（ｌｉｇｈｔ−ｏｆｆ）−所望であれば、化学発光標識物から化学 発光を得るための特定の反応。

ライト−オフ試薬−化学発光標識物のライト−オフを得るのに使用される試薬。

不活化−化学発光標識物をライトオフ時に化学発光できなくする反応。

付加物形成体−他の化合物とによって付加物を形成する反応性を十分に有する化 学的化合物。

保護付加物形成体−化学発光標識物を不活化から保護する付加物形成体。

発萌の要旨 本発明は、上述のタイプの化学発光標識物から最大収量を得るには、活性部を良 好な脱離基にすべきである、という認識を基礎としている。しかし、このことは 、脱離基に隣接した炭素が加水分解、または早発性の化学発光のような望ましく ない反応に対して比較的感受性を示すことから、活性部が不活化に対して比較的 感受性になることを内包している。したがって、最大収量が得られるが故に、高 い感受性を有する標識プローブを得るのに使用することができるであろう上述の タイプの標識物はさらに、不活化に対して最も感受性を示すものである。標識物 の不活化は、特に標識化プローブを含むキットの保存時に、または標識物不活化 を促進しかねない検定操作時（たとえば、ターゲットがヌクレオチド配列の場合 に、標識化ヌクレオチドプローブをその特異的結合性パートナ−とハイブリダイ ズさせる時）に、検定感度と精度を失わせる。本発明は、標識物の不活化に対す る感受性を減少させることができる手段を提供することにより、標識物の保存寿 命を改善し、さらに検定感度および精度を高めるものである。このことは、適当 な保護付加物形成体と標識物とから付加物を製造することによって広く行われる が、その形成体は、不活化から活性部を保護すると同時に、通常は生物学的ター ゲットとの複合体が形成された後に、付加物から標識物の化学発光体を容易に回 復させられるものである。

ペプチドまたはヌクレオチド部分、または他の特異的結合性パートナ−１および 化学発光標識物を使用する、標識化特異的結合性パートナ−を調製する方法を提 供するものである。標識物は、化学発光に必要な活性部であるが、不活化を受け て化学発光体でない標識物にしてしまう部分を有している。本発明の方法は、特 異的結合性パートナ−に標識物を結合させ、活性部についての保護部分を形成さ せるように、保護付加物形成体と標識物とから付加物を調製することを拘徴とし ており、これにより、活性部を不活化から保護するものである。この付加物を調 製するのは、標識物をプローブに結合させる前でも、後でもよい。しかし、標識 物をプローブに結合させた後に調製する場合が、プローブに「悪影響を与えない 」条件を選択するにはより望ましいものになることは理解されるであろう（目的 とした特異的結合性パートナ−を検出するには非能率的であるプローブの割合が 相当量にならない）。過酸化水素または酸素および塩基で処理した後に化学発光 する化学発光化合物の場合には、保護部分はＯＨまたは過酸化物（○ＯＨ）以外 のものである。水酸化物由来の付加物の調製および保存には活性基の迅速な加水 分解を促進するに十分なアルカリ性の溶液が必要であるので、水酸化物が保護部 分になるとは考えられない。Ｈは保護部分として使用できるが、アクリダン類の ような化合物の形成にはハイドライドによる還元が必要であり、この反応は容易 な可逆性でないので、好ましいものでない。他方、過酸化物は、その存在によっ て早発の化学発光が促進されるので、はとんどの化学発光標識物にとっては保護 部分として不適である。さらに、付加物を脱保護しても標識物の化学発光体が得 られるような保護部分を選択する。

保護付加物形成体は容易な可逆反応に基づく保護部分を提供するものが好ましい 。（最も好ましくは、容易な可逆平衡反応であり）、このようなものは、脱保護 する時に保護部分が単に開裂し、化学発光標識物が回復されるものである。

このような方法に使用することのできるであろう標識物は、以下の式で示される ： 上記式中、ピリジニウム環はさらに置換されていてもよく、Ｙ！ｔｏ、Ｓ、また １ｔＮＨＴｔ））、Ｒ１は置換されていることある炭化水素、またはＨであり、 Ｒ４は脱離基であり、 −Ｃ−Ｒ’はピリジニウムのオルトまたはパラ位に結合している活性部であって 、加水分解を受けて標識物の非−化学発光体と脱離基とを生成させる部分である 。

この場合、保護基は、活性部に対してα炭素に位置する求核体の付加物であり、 それは上記の構造式■のピリジニウム環の炭素である。好ましくは、標識物は、 式： ［式中　Ｒ１は好ましくは置換されていることあるアルキル、アケニル、アルキ ニルであり、 Ｒ’およびＲ３は任意の置換分であり、好ましくはＨ１アミノ、ヒドロキシ、チ オール、ハロゲン、アミド、アセチル、アルキル、アルケニル、アリール置換ア セチル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、またはア リールオキシから選ばれるものであり、 Ｒ４はハロゲン、置換リン、置換窒素、置換ホウ素、置換ヒ素であってよく、さ らにＲ４は式ニーＺ（Ｒつ（Ｒつ（式中、ＺはＯ１Ｓ％Ｎであり％Ｒ’は置換さ れていることある炭化水素であり、Ｒ・はＲ５またはＺ＝Ｎの場合およびその場 合にのみ、置換されていることある炭化水素である）であってもよい〕 で示されるアクリジニウム化合物である。

最も好ましくは、標識物は、式： で示されるアクリジニウムエステルである。

当然ながら、種々の可能な保護付加物形成体を選択することかできるが、保護付 加物形成体は、第１級チオールから選択される求核体が好ましく、最も好ましく は第１級アルキルまたはアリールチオールである。

本発明はさらに、以下に説明する生物学的プローブ標識物として有用である保護 された化学発光標識物をも提供するものである。以下の式中、　−Ｃ−Ｒ’″は 、上記の方法に関連して記載したタイプの活性部であり、他方、ＭはＨｌまたは ＯＨ，またはＯＯＨ（過酸化物）以外の保護部分である。この保護部分は開裂可 能であり、脱保護された化学発光標識物を生成させ、これは、保護された標識物 のＣ＝Ｙ炭素が脱保護された標識物よりも加水分解を受けにく（なるように選択 される。好ましくは、Ｒ’（脱離基）は、生物学的プローブと容易に結合するこ とのできる官能基、または既にプローブと結合していてもよい官能基を含有する 。

好ましくは、保護された標識物は、式：■ｂまたは］Ｘｃのいずれかの式で示さ れるものである。上記ＩＸｂおよびＩＸｃのタイプの保護された化学発光標識物 は、Ｍを含有する保護付加物形成体の付加物とみなすことができ、前記構造式■ で示される標識物で、その活性部に対してのα炭素にＭｏが付加される。保護さ れた標識物のうち最も好ましいものは、式： ［式中、Ｍは好ましくは第１級チオールである］で示されるアクリジニウムエス テルである。

本発明はさらに、上記の式のタイプの保護された標識物に結合した生物学的プロ ーブを提供するものである。

図　　面 本発明の態様を以下の図面を用いて説明する。

第１図は、本発明の保護された標識物における経時的な安定性を示すグラフであ る（実施例１参照）。

第２図は、保護付加物形成体濃度に対する、保護付加物形成体によって標識物に 供与される保護の依存性を説明する部分的な紫外線スペクトルである（実施例２ 参照）。

第３図は、保護付加物形成体濃度に対する本発明の付加物の形成の依存性を説明 するグラフである（実施例３参照）。

第４図は、本発明の具体的な保護された標識物の形成に関する容易な可逆性平衡 反応を説明するものである（実施例４参照）。

第５図は、付加物形成体の酸化による、本発明の保護された標識物からの回収シ グナル、したがって脱保護ｔａ識撒物回収を説明するグラフである（実施例６参 照）。

第６図は、本発明の付加物の温度安定性を説明するものである（実施例８参照） 。

本発明の態様の詳細な説明 本発明の保護された標識物を製造するのに適当な保護付加物形成体を選択する操 作をまず説明する。さらに特異的結合性パートナ−を標識物に結合させるための 操作も説明する。次いで、付加物形成体濃度に対する、本発明の保護された標識 物における過酸化物不活化からの保護の依存性を説明する。次の実施例では、１ ）希釈、２）全体酸化、３）特定酸化によって本発明の保護された標識物を保護 されていない標識物に戻す新規な方法を説明する。次いで、アクリジニウムエス テルを取り扱う保護付加物形成体の利用を示す。

上記式■で示されるアクリジニウムエステルの場合、活性部、詳細にはＣ＝Ｙ　 （たとえばカルボニル）の炭素を加水分解から保護するに当たりては、活性部の α炭素（すなわち、これは詳細にはピリジニウム環の炭素である）に形成される 適当な求核体と標識物との付加物を製造すればよい。この場合、実験により活性 部の加水分解の減少能を測定することによって、適当である可能性のある保護付 加物形成体を捜し出すことができる。このような方法を以下の実施例１で説明す る。

で示されるアクリジニウムフェニルエステルについての可能性ある保護基として 、種々の求核体を選択した。下記の被検水溶液に求核体（以下の第４表に「活性 物質」として示した可能性ある付加物形成体の形態で）を混合することによって 、保護部分として機能することができる求核体各々の能力を実験的に確認した： ０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）−−ｐＨ６，００，１％ドデシル硫酸ナトリウム （ＳＤＳ）５ｍＭ活性物質 置換アクリジニウムフェニルエステルで標識された２６塩基対（ｂｐ）オリゴヌ クレオチドの形態にある１０＠ｒｌｕの生物学的プローブ。

オリゴヌクレオチドの標識は、継続中の米国特許出願第１０５．０８０号［１９ ８７年１０月５日出願、題目「アクリジニウムエステルの標識およびヌクレオチ ドプローブの精製（Ａｅｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｅｓｔｅｒ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａ ｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ ）Ｊ］に記載されている方法によって行うことができる。

上記の混合物を室温で３０分間インキニベートした後、６０℃でインキ１ベート し、以下の第１表に記載した時間に一部標本を抜き取った。次いで、その一部標 本を０．５Ｎ　ＨＮｏ、１００マイクロリツトル（μｍ２）に加え、存在する疑 塩基形態のアクリジニウムエステルを遊離エステルに変換した。次いで、硝酸溶 液、０．２％Ｈ，０、に、次いでアルカリ性リン酸緩衝液（ｐＨ１２，７５）２ ００μＱに加えてライトオフを行った。試験する付加物形成化合物（すなわち、 「活性物質」）を加えていない上記混合物からなる多くの対照についても光放出 の測定を行った。光放出の測定はそれぞれ約１０秒間行い、各時点において得ら れた値（ｒｌｕの１０００倍）を第」表に示す。光放出が０分後の各時点で対照 よりも有意に高いときに、その活性物質の求核性化合物は適当である可能性のあ る保護付加物形成体と考えられた。上述の基準に基づき、本発明の保護された標 識物を産すると考えられ、本発明の方法に適当である可能性のある付加物形成体 を指摘するために、以下の第１表の標題「適当である可能性」の欄に「Ｙ」を用 いて示した。

第１表 亜硫酸水素ナトリウム　　　　７６７６　　　６８　　７３　　　５１　　　　 Ｙチオ尿素　　　　　　　　　　？：ａ７０　　　３０　　４２　　　２　　　 　Ｎメルカブトエタ／−ル４０４０　　　３１　　２７　　　　ｉｇ　　　　Ｙ Ｎ−フｏ％スク’ｙン４ミＦ　　　　３９１７　　　　０．２　　０．２　　０ ．２　　　ＮＮ−ヨードスクシンイミド　　　６９４０　　　　３　　　０．９ 　　　０．４　　　ＮＮ−ヒドロキシスクシンイミド　７１６８　　　３１　　 １５　　　−　　　　に過ヨウ素酸塩　　　　　　　　　６５６６　　　　２７ １０　　　　２Ｎ過酸化水素　　　　　　　　　６７６９　　　３１　　１３− Ｎイミダゾール　　　　　　　　７１７５　　　２８　　１３−Ｎ次亜塩素酸塩 　　　　　　　　２　０．２　　　０．４　　０．２−Ｎヒドラジン　　　　　 　　　　７６６９　　　３１　　１４−Ｎ対照　　　　　　　　　　　　４１４ ２　　　２０　　　８　　　１．７−ｍ−２，５−ジメルカプト−４６４２２３ １４１０Ｙｌ、　３．４−チアジアゾール システアミン　　　　　　　　３７３３　　　１６　　　６．５　　１．６　　 　Ｎ４−ヒドロキシチオフェノール　６５８１１３２Ｙシアン化ナトリウム　　 　　　４１３９　　　１７　　　６　　　１．４　　　Ｎチオール酢酸　　　　 　　　　３８４０　　　１８　　　８　　　２　　　　Ｎチオリン酸ナトリウム 　　　　３８３２　　　１６　　　９．５　　４．４　　５対照　　　　　　　 　　　　　１７５−７０　　５３　　　＊６３　　−−−４−アミノチオフェノ ール　　　３０−６５　　６４　　　＊１０　　　　Ｙ３−メルカプトプロピオ ン酸　　７フー６７　　　６９　　　＊７６　　　　Ｙチｔサリｆｈｒｌ！　　 　　　　　　１２７−６７　　５８　　　＊６２　　　　Ｎメルカプトエタン　 　　　　　１３１−６３　　７１　　　＊７１　　　　Ｙスルホン酸 ヒドロスルファイト　　　　　１５３−７１　　８６　　　＊１１８　　　　Ｙ ナトリウム メルカプトコハク酸　　　　１５３−６６　　６４　　　＊７７　　　　Ｎ対照 　　　　　　　　　　　５０９−３１９　　２４５　　１４３　　−−−システ ィン　　　　　　　　　３３４−２８０　　２８３　　２２７　　　　Ｙ２−ア ミノエタンチオール　　　４２１−３４９　　３３４　　　２６１　　　　Ｙ＊ これらは、６０分ではなく、４５分時点に読み取った（数字はｒｌｕの１，００ ０倍である） Ｒ，Ｔ、　＝室温 上記の第１表に記載の可能性ある付加物形成体の幾つかについての結果を、第１ 図において、以下の値： Ｌｏｇ［１００ｘ（ある時点のｒｌｕ）／（０時点のｒ＋ｕ）］を時間に対して プロットして説明する。第１表および第１図から理解できるように、試験した多 くの活性物質によって標識物の不活化を減少せしめる保護部分が得られた。これ らの付加物形成体は、上記第１表の標題「適当である可能性」の欄において、ｒ ＹＪで示している。

適当である可能性ある付加物形成体である活性物質の保護部分によって達成され る保護は、特に２つの利点をもたらす可能性がある。

第１に、保護された標識物で標識された特異的結合性パートナ−の貯蔵寿命が対 応する保護されていない標識物で標識されたプローブのそれよりも長いことであ る。第２に、このような保護は、標識物の加水分解が促進する可能性のある苛酷 な条件下における標識化特異的結合性パートナ−とその相補体との複合体の形成 時に、特に有益である。たとえば、検定において特異的結合性パートナ−が相補 性ターゲットとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである場合には、高い温 度と長時間が必要である。第１表および第１図で示されるように、６０℃程の高 い温度では、保護されていない標識物の不活化速度は非常に増加し、これは加水 分解されて非化学発光体になることから認められる。第１表および第１図からは さらに、保護された標識物からの始めの光放出は、多くの場合、対応する保護さ れていない標識物よりも非常に低いことが認められる。これは、明らかに、ライ トオフ時に、付加物が過酸化水素と競合して標識物との強い結合を形成する結果 である。以下に示しているように、これらの光放出のｒｒｌｕ喪失」は開示され た方法によって回復可能である。

適当である可能性のある保護付加物形成体が実際のところある特定の場合に適当 であるかどうかは、標識物と共に使用する特異的結合性パートナ−に依存するも のであることに留意する必要がある。

たとえば、特異的結合性パートナ−がオリゴヌクレオチドプローブである場合、 亜硫酸水素塩を使用すればハイブリダイゼーシ９ンは顕著に減少することが見い だされている。これは、シトシンのウリジンへの分解の結果に由来するものらし く、したがってプローブとそのターゲット（すなわち、その相補体）との相同性 が減少する。

このように、個々の事例においては、共に使用する特異的結合性７＜−トナーへ の適当であり得る保護付加物形成体の悪影響の作用をチェックすべきである。

実施例２ 過酸化物からの保護の濃度依存性 本実施例では、付加物形成体濃度に対する本発明の保護された標識物の形成の依 存性を説明する。以下の成分をそれぞれ含有する５つの溶液を調製した： ０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）、０．１％ＳＤＳ。

８０ナノモル（ｎＭ）のアクリジニウムフェニルエステル標識物、付加物形成体 である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）の増加量を加え、濃度を０から１ ０ｍＭ　とした。

次いで、得られた混合物の３００−２４０ナノメーター（ｎｍ）！域の紫外線（ ＵＶ）スキャンを得た（これらのスキャンを第２図に示す）。

２６０ｎｍにおける吸収は付加物のないアクリジニウム環構造に対応している。

したがって、第１図から示されるように、付加物形成体の濃度を増加させると、 アクリジニウム環構造が付加物に変換するので、相応して２６０ｎｍの吸収が減 少する。さらに、付加物の量がＭＰＡの固定濃度においては時間に対応して有意 に変化しないことも観察された。このことは、付加物が遊離アクリジニウム構造 と力学的平衡にあることを示している。

叉籏舅１ 化学発光によって認められる過酸化物からの保護の濃度依存性本実施例も、実施 例２と同様に、保護された標識物の形成程度が付加物形成体濃度に依存している ことを説明するものである。

本実施例では、アクリジニウムエステル標識化プローブを含有する溶液１μｇを ０．５Ｎ　ＨＮｏ、１００μｇに加え、次いで付加物形成体（３−メルカプトプ ロピオン酸）の必要量を加え、第３図に示す付加物形成体濃度とすることによっ て、以下の組成を有する種々の溶液を調製した。次いで、得られた混合物１００ μＱそれぞれに０．２％Ｈ＝Ｏ＊（重量％）、次いでアルカリ性リン酸緩衝液（ ｐＨ１２，７５）を添加してライトオフを行った。付加物形成体の濃度（＋ｅＭ 単位）の対数に対して得られた光放出をプロットし、それを第３図に示す。

第３図も、付加物形成体の濃度に対する幾つかの本発明の保護された標識物の形 成の依存性を説明するものである。すなわち、付加物形成体の濃度が高くなれば 、それだけ保護された標識物形態に変換された標識物の比率は高くなる。この結 果も、少なくとも本実施例の付加物形成体に関しては、付加物形成体の濃度を減 少させることによって化学発光標識物をその保護された非−化学発光形態から回 復させることができることを示すものである。

叉旅」１ 粘状による可逆性の証明 化学発光標識物に回復させるために付加物形成体の濃度を減少させる１つの手段 は、標識物および付加物形成体を含有する溶液を単に希釈することである。すべ ての化学溶液が、希釈により付加物形成体と標識物との平衡反応の移動（シフト ）を起こし、保護標識物が得られるようなものである溶液を選択するならば、こ の方法はまさに有効である。第１級チオール付加物形成体を考えると、予想され る平衡反応は、 ＲＳＨ＋　Ａｃｒ”　　　　　　Ｈ”　＋ＲＳＡｃｒ　　　　（１）＼；−−− −−−− であると思われる。式中、ＲＳＨは第１級チオールの形態にある付加物形成体で あり、Ａｃｒ”は保護されていないアクリジニウムエステル標識物であり、ＲＳ Ａｃｒはアクリジウム付加物（すなわち、保護された標識物）である。この系で は、緩衝液が存在するときＨ゛濃度一定のままであるので、溶液の希釈により平 衡は左にシフトし、それに続いて保護されたアクリジニウムエステル標識物の脱 保護作用によって化学発光アクリジニウムエステル標識物が回復する。

これを説明するため、リン酸緩衝溶液（ｐ　Ｈ６，０）中、アクリジニウムフェ ニルエステルに付加物形成体である３−メルカプトプロピオン酸の溶液を加え、 付加物形成体の最終濃度を１０＋ａＭにすることによって、試験溶液を調製した 。次いで、この溶液を希釈し、第４図に示す種々の濃度の付加物形成体を含有す る試験試料を調製した。次に、希釈した試料１００μＱに０．５Ｎ　ＨＮＯ３を 加え、次いで０．２％Ｈ艷、を、そしてアルカリ性リン酸緩衝液（ｐＨ１２，７ ５）を加え、これらの試験試料のライトオフを行った。試験試料、および保護付 加物形成体を存在させないことを除いては上記と同じ方法によって調製した対照 試料の両者について、濃度に対し、使用した希釈度に関して補正した光放出をプ ロットして第４図に示す。

保護付加物形成体である３−メルカプトプロピオン酸に関しては、上記の等式（ １）の平衡反応が容易である可逆平衡反応であることは、第４図から明らかであ る。詳細には、この付加物形成体では、保護された標識物の脱保護、たとえば実 質的に−・定のｐＨ条件下で希釈して平衡をシフトさせる操作によって、化学発 光標識物は容易に回復させ得る。

実施例５ 固体支持相に結合させた後の洗浄による逆反応特異的結合性パートナ−が本発明 の保護された標識物で標識されているオリゴヌクレオチドプローブであり、得ら れたプローブ／ターゲットのバイブリドを固体支持相に結合させる場合、上記実 施例４で説明した希釈は、ハイブリダイゼーシヨンの後の支持相の洗浄時に容易 に行うことができる。本実施例は、このことを説明するものである。以下の処理 によって、「標識プローブバイブリド」を調製し、処理した： （ｉ）リン酸緩衝液（Ｐ　ＢＸｐ　Ｈ６，０）中、アクリジニウムフェニルエス テルで標識した２６ｂｐオリゴヌクレオチドと標的ヌクレオチド配列とのハイブ リダイゼーシヨンを行った；（ｉｉ）固体支持相上において、ハイブリダイズし た標識プローブをハイブリダイズされていないプローブから分離し、次いで固体 支持相をＰＢ（ｐＨ６，０）で洗浄した；（ｉｉｉ　）工程（ｉｉ）で得られた スラリー５０μｇを硝酸で処理し、実施例４に関連して説明した方法と同じくラ イトオフを行った。この光放出を第２表の「付加−前」に示す［第２表の光放出 はすべてｒＩＵであるコ　； （ｉｖ）工程（ｉｉ）で得られた残りのスラリー供給物に、十分量の３−メルカ プトプロピオン酸（保護付加物形成体）を加え、その濃度を１０ｍＭにした； （ｖ）次いで、工程（ｉｖ）で得られたスラリーの別の５０μｇ部分量を工程（ ｉｉｉ）と同じくライトオフした。得られた放出を以下の第２表の「形成後」に 記載する： （ｖｉ）工程（ｉｖ）で得られたスラリーの残りをＦＢで１回洗浄し、上記工程 （ｉｉｉ　）の操作法によって５０μｇ部分量をライトオフした。

得られた放出を以下の第２表の「１回洗浄後」に記載する；（ｖｉ）工程（ｖｉ ）で得られたスラリーの残りを再度ＰＢで洗浄し、次いで別の部分■を上記工程 （ｉｉ）の操作法によってライトオフした。

以下の第２表の「２回洗浄後」に記載する。

対照の場合には保護付加物形成体を加えずに（すなわち、３−メルカブトブロピ オン酸を加えずに）、そしてブランクの場合にはオリゴヌクレオチドを存在させ ずに、上記の操作法を対照とブランクについても繰り返した。対照およびブラン クのそれぞれから得られた光放出を、それぞれ［対照］および「ブランク」とし て以下の第２表に示す。

第２表 付加前　　形成後　　１回洗浄後　２回洗浄後標識プローブ　　１５１８９　　 　７４０　　　１３７３９　　　　１３７３ｇバイブリド 対照　　　　　　１４８９６　　１２０９３　　　１５０２０　　　　１１７７ ９ブランク　　　　　　　５８８　　　　６１６　　　　６４７　　　　　　５ ７３第２表から明らかなように、ＭＰＡにより殆どすべての標識物が保護された 非−化学発光標識物に有効に変換されており、これは「形成後」の欄の光放出で 説明される。さらに、ＰＢで洗浄して脱保護を簡単に行い、２回洗浄と同様に有 効である１回の洗浄によって保護されていない化学発光標識物が得られた。当然 ではあるが、臨床検査では、本発明の保護された標識物で標識されたハイブリダ イズしていないプローブを含有する試験キットは、標識プローブの保存時、およ び検定操作のインキニベーシ１ン時に、標識物の不活化が最小限度になるように 、通常は、検定前に製造する必要がある。しかし、第２表に示した定量的な結果 は、この場合にも期待できるでＦ　ｅ（ＣＮ）、”での酸化による逆反応前述の 実施例で説明してきたように、これらの保護付加物形成体とアクリジニウムエス テル標識物などの標識物との平衡反応は、容易な可逆反応であり、化学発光性の 保護されていない標識物を回復させることができる。希釈は保護されていない標 識物のための平衡をシフトさせる１つの方法であることを証明したが、他の平衡 をシフトさせる方法も明らかであろう。本実施例は、このような他の方法、すな わち保護付加物形成体の酸化を説明するものである。この例として、以下の操作 法に従った： （ｉ）アクリジニウムフェニルエステルで標識された２６−ｍｅｒオリゴヌクレ オチドプローブをＰＢ（ＰＨ４，９）に混合し、（ｉｉ）　保護付加物形成体で ある４−ヒドロキシチオフェノールの十分量を加え、その濃度を７　、５　ｍＭ にし、（ｉｉｉ　）工程（ｉ５）の溶液の部分量５μｇを第５図に記載した濃度 のフェリシアン化カリウム＜　Ｋ＊　Ｆ　ｅ（ＣＮ　）＊＞溶液のそれぞれ５μ Ｑ部分量に加え、多くの試験試料を製し、（ｉｖ）次いで、工程（ｉｉｉ　）の 試験試料それぞれを実施例１に関連して記載した操作法に従って、すなわち硝酸 を加え、次いで過酸化水素、次ぎにアルカリ性リン酸緩衝液（ｐＨ１２，７５） で処理することによってライトオフを行った。

付加物形成体（４−ヒドロキシチオフェノール）を加えていない加えた溶液中に おけるフェリシアン化物の濃度（得られた試料のフェリシアン化物濃度は第５図 に示した値の半分である）に対し、対応する対照試料と比較した試料の放出を％ で表した光放出を第５図にプロットし、試験試料から得られた光放出の結果を示 す。

第５図に示されているように、付加物形成体４−ヒドロキシチオフェノールの酸 化もまた、平衡をシフトさせて保護された標識物を脱保護し、保護されていない 化学発光標識物に回復させるのに非常に有効な手段である。臨床検査では、この ような脱保護工程は通常、ライトオフ前の、機織化プローブとターゲットとの間 の複合体形成の後になるであろう。

実施例７ チオール特異的試薬との反応による付加物の逆反応上記の実施例６では、可逆反 応は、非特異的な酸化剤の使用を説明している。ここでは、特異的試薬の使用に ついて説明する。この場合、保護付加物形成体は反応性の第１級チオールである ので、付加物の形成反応を逆にする活性物質としてはアルトリチオール（Ａｄｄ ｒｉｔｈｉｏｌ）（２，２’−ジチオジピリジン）が有用である。この反応試薬 は、すべての可能性および他のチオール特異的試薬を包括するものでなく、すな わち他の保護付加物形成性求核体に特異的な試薬を使用することができる。以下 の操作法を行った：（ｉ）プローブを５０％ホルムアミド（容量単位）、０．２ Ｍ　ＰＢ（ｐＨ６，０）の溶液に加えることによって、アクリジニウムエステル で標識したオリゴヌクレオチドプローブ溶液を調製し、（ｉｉ）上記の緩衝液、 および１００％ホルムアミド中でＯＳＯ，１、ｌ　オヨＣｊ　１０＋ｅＭの、そ れぞれ付加物形成体である２−メルカプトエタンスルホン酸（２ＭＥＳＡ）の溶 液、およびアルトリチオールの溶液を各々調製し、 （ｉｉｉ　）以下に示す第３表のように、プローブ溶液１００μｇに、付加物溶 液１００μｇおよびアルトリチオール溶液１００μｇを加え、 （ｉｖ　）このようにして調製した試料を室諷で５分間インキニベートし、次い で０．１％Ｈ，Ｏ，と共ニ０　、４　Ｎ　ＨＮ　Ｏｓ　２００　ａ　Ｑ　’ｅ加 え、次いで１ＮＮａＯＨを加えてライトオフを行った。

以下の第３表に示す結果は、溶液中の付加物形成体濃度を効率的に減少させるこ とによって化学量論的逆反応が起こることを示すものである。

！１嚢 ２ＭＥＳＡの濃度（ｎＭ） ０　　　　０．１　　　　１　　　１０アルトリチオール０　１５４２０４　　 １４８３１１　　１４９７３２　　１５５３３７濃度（ｎＭ）　　　０．１　１ １３１１８　　１２０６８４　　１５４５９６　　１６０１１１３８実施例８　 　　　　“ 付加物の使用による減少した温度感受性本発明の保護された標識物の温度安定性 を説明するため、以下の溶液の２つの水性試料を調製した： ｒＤＩＢｓｓミックス」（すなわち、４５重量％のジイソブチルスルホスクシネ ート＜ＤＩＢＢＳ＞）、およびリン酸緩衝液、エチレンジアミン四酢酸＜ＥＤＴ Ａ＞、およびＥＧＴＡ＜エチレングリコール−ビス−（Ｂ−アミノエチルエーテ ル”）　−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’四酢酸〉ミックスｐ　Ｈ６，８， １０＠ｒｌｕのアクリジニウムフェニルエステルで標識された２６塩基対（ｂｐ ）オリゴヌクレオチド。

０または５ｍＭ４−ヒドロキシチオフェノールがら２つのＤＩＢＳＳ溶液を調製 した。３％ＬＤＳ　（ドデシル硫酸リチウム）中、プローブ２μｇをいずれかの ＤＩＢＳＳミックス２０μｇに加えた。

上記のようにして調製した個々の試料を、各温度点で処理した。試料を水浴中に 入れ、５分間インキ二ベート中、温度を徐々に上昇させた。次いで、過酸化水素 を使用し、次ぎに硝酸処理し、塩基処理することによって各標本のライトオフを 行った。第６図において、これら２つの試料の標本について温度に対して光放出 をプロットした。

第６図に示されるように、４−ヒドロキシチオフェノールがら明らかにアクリジ ニウムエステルの付加物が得られ、これは高温においてアクリジニウムエステル 自身よりも相当に安定であった。このように本発明の保護された標識物は、それ が結合するプローブがオリゴヌクレオチドであり、上昇させたハイブリダイゼー ション温度で使用するのが所望である場合に特に有益である。

長期のハイブリダイゼータ１ン後におけるシグナル回復の改良長期のハイプリダ イイー２１２時における、オリゴヌクレオチドプローブに結合した標識物を保護 する効果を説明する。本実施例では、実施例８と同じ混合物を使用し、すなわち １つの試料には保護付加物形成体を入れず、第２の試料では３−メルカプトプロ ピオン酸を入れ、そして第３の試料では４−ヒドロキシチオフェノールを入れて ３つの試験溶液を調製した。次いで、保護付加物形成体およびアクリジニウムエ ステルの各々は、対応する保護された標識物を形成するであろう。次いで、上述 の溶液それぞれから得られた標本を６０℃で２．５時間、同一の標的ヌクレオチ ド配列ｒＲＮＡとハイブリダイズした。各試料をヒドロキシ燐石灰（ｈｙｄｒｏ ｘｙａｐａｔ　１ｔｅ）と結合させ、上清を「非結合」として回収し、その支持 体をリン酸緩衝液で１回洗浄し、洗浄液を「洗液」として採取した。支持体、非 結合、および洗液からの光放出を実施例５のライトオフ操作を使用して測定した 。光放出を第４表に示す。

！土嚢 ハイブリダイイー２３フ２．５時間後のシグナル回復なし　　　　　　　　　６ ４５０　　　５０２７　　　６７１４−ヒドロキシチオフェノール　２１６７７ 　　４３６９２　　３１１１３−メルカプトプロピオン酸　　２３４フロ　　　 １１１６０　　１０４１付加物で保護された試料では、シグナルが対照試料より も３倍近く大きいことに留意すべきである。すべての試験では、同一のｒｌｕが 得られる標識物の量を有していた。

次ぎに、第４表の結果は、長時間にわたるオリゴヌクレオチド／ターゲットハイ ブリダイゼーションに対するオリゴヌクレオチド結合化アクリジニウムエステル 標識物のための保護基が得られる効果を説明するものである。第４表から分かる ように、保護された本発明の標識物は、保護されていない標識物で得られるより も大きなシグナルを回復させることができ（すなわち、より遅ｔ１標識物不活化 を示し）、シたがって増大した感度を有するターゲット検定を可能とする。この ことは、長時間（たとえば、約２時間以上）のインキユベーシヨンに特に当ては まる。

上記の実施例で説明したように改良された安定性は多くの利点を有している。特 に興味深いものは、アクリジニウムエステル標識プローブの改良された保存性で ある。この改良された保存安定性を説明するため、以下の条件を使用した。溶液 を次のようにして調製した： ０．１Ｍコハク酸リチウム（ｐＨ５，２）、０．１％ラウリル硫酸リチウム アクリジニウムエステル標識化ＤＮＡプローブ、１０＋ｏＭ３−メルカプトプロ ピオン酸（対照試料では存在しない）。

この溶液を標識物の化学発光活性について検定するに当たり、この溶ＫＮの１０ ０倍希釈５μｇを５０％ホルムアミド、０．２Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ６，０に加 え、上記の実施例７に記載のようにライトオフを行った。次いで、この溶液の部 分量１ｘＱを凍結乾燥し、得られたペレットを４５℃で１または３日間インキコ ベートした。次いで、これらを元の容量まで再構成し、化学発光活性の保持に関 して検定した。その％を以下に示す。

付加物なし　　　　　　　　６１％　　　２３％付加物あり　　　　　　　１０ １％　　１０５％付加物として保存した場合、価値ある程度で改良された安定性 が得られることは明白である。使用した上昇温度の条件は、良好な安定性が低温 ではより長期にわたるか否かを評価するのに使用される一般的な方法による。

実施例の要約 上述のことから、種々の付加物形成体を使用して化学発光標識物を保護し、保護 された標識物を得ることができ、これは、付加物形成体由来の保護部分が存在す ることにより加水分解などの不活化に対し、保護されていない標識物よりも影響 を受けにくいことを明らかにした。さらに、上記説明により、多くの場合、保護 付加物形成体と標識物との反応が、付加物形成体の希釈または酸化などの手段に よって容易に逆反応することのできることが多い平衡反応であることをも示した 。しかし、上記のタイプの容易な可逆性平衡反応においては、保護されていない 標識物によって平衡をシフトさせる他の多くの手段を予見することができると理 解されるであろう。たとえば、保護されたフェニルアクリジニウム標識物を付加 物形成体３−メルカプトプロピオン酸を使用して形成させた場合、平衡は、Ｎ− エチルマレイミドまたは２，２°−ジチオジピリジンを加えることによって脱保 護された標識物のほうヘシフトした。しかし、保護基を標識物に付加するに当た って、他の種々の付加物形成体を選択することができ、さらに個々の付加物形成 体に応じて、保護されていない標識物を回復させる手段を組み立てることができ るのは明らかである。さらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブ以外の特 異的結合性パートナ−と結合する標識物を保護するのにも使用できることは理解 されるであろう。本発明の基礎概念は、既に特異的結合性パートナ−と結合した 、またはそれらと結合することができる標識物を提供することにあり、その標識 物は、化学発光に必須の不活化を受ける活性部を有しているが、その活性部は不 活化がらの感受性を脱保護標識物よりも低めるような保護部分によって保護され ており、通常は、検定後に、脱保護された化学発光標識物を回収することができ る。

このような本発明はさらに、検定システムにおいて上記実施例のような本質的に 遊離形態にある保護付加物形成体でなく、特異的結合性パートナ−と結合した保 護付加物形成体を供する検定にも適用することができる。標識された特異的結合 性パートナ−が、それ自身で保護付加物形成体を担うことができるが、または保 護付加物形成体を担う他の相補体とさらに複合体化することができるいずれかの 相補体と複合体化する場合に、上記の手法は標識物を保護することができるとい う利点を有する。実際のところ、これは、標識物の近くの保護付加物形成体の局 所濃度に基づくものであり、それは高い。しかし、非複合体化標識物は同程度に は保護されないので、選択的に不活化することができる。

この手法は、たとえば３つの特異的結合性パートナ−のすべてに関連した２点検 定（ｔ％ｏ　５ｉｔｅ　ａｓｓａｙ）に適用することができる。１つのパートナ −は、保護付加物形成体を担うものであり、他方２番目のハードナーは保護され ていない標識物を担うものが考えられる。

このような検定には、サンドイッチおよびその後の飽和型検定などが挙げられる であろう。しかし、この手法は１点検定（２つの特異的結合性パートナ−しか関 係しない）にも適用することができる。

さらに、この手法では、検定は均一または不均一のいずれであってもよい。検定 のタイプに拘わらず、その基礎的な原理は、化学発光標識物の付近における付加 物形成性物質の局所濃度が、検出すべきターゲットの存在に関連して変化され得 ることにある。

具体的な例としては、２つのＤＮＡプローブが共通するポリヌクレオチドのター ゲットにおいて隣接する部位群に結合することによる２点ＤＮＡプローブ検定で ある検出タイプを挙げることができる。

このような検定では、化学発光ｆＡＦａ物を第１のプローブの末端に位置させ、 付加物形成性物質を第２のプローブの末端に位置させれば、２つのプローブが両 者共に標的ヌクレオチド配列と結合する場合には保護付加物形成体が第１のプロ ーブの化学発光標識物に近付くであろう。２つのプローブを同じ標的ポリヌクレ オチドに同時に結合させると、付加物形成性物質が集まり、次いで化学発光標識 物付近で顕著に増加するであろう。このような増大した集中は、代わって複合体 の化学発光標識物の安定性を高めると考えられ、これにより、複合体化および非 複合体化の形態のプローブをそれらの相対的な安定性に基づいて識別することが できる。非複合体の化学発光プローブの標識物が、保護されたプローブに実質的 に影響を与えない手段によって適切に不活化され、複合体のプローブに付随する 付加物が逆反応した後では、無傷の化学発光標識物の量は該複合体の量の測定手 段として、したがって存在するターゲット量の測定手段として役立つものである 。このような検定法の基礎的な工程は以下のようになる： １、検定において、関連する特異的結合性パートナ−を相互に複合体化し、複合 体化した結合性パートナ−の標識物付近における保護付加物形成体の局所濃度を 高め、 ２、次いで、減成のような手段（たとえば、アクリジニウムの加水分解）によっ て、保護されていない標識物を不活化し、３、次いで、保護された標識物を脱保 護し、４、次いで、ターゲットの存在の測定手段として無傷の標識物の量を検出 する。

既述のように、本発明は、均一な検定タイプの設計に容易に使用することができ る。しがし、本発明は、複合体化および非複合体化特異的結合性パートナ−を区 別したいとさらに望む場合、不均一および均一な検定フォーマットとしても使用 することができる。

当業者であれば、既述した本発明の態様についての種々の修正法および変法を考 えることができる。したがって、本発明は上記で詳細に説明した態様および修正 法に限定されるものでない。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）特異的結合性パートナー、および（ｉｉ）不活化を受けて化学発光形 態でない標識物を生成させる不安定な活性部を有する化学発光標識物から、標識 された特異的結合性パートナーを製造する方法であって、 （ａ）特異的結合性パートナーを標識物に結合し、次いで（ｂ）活性部を不活化 から保護するために保護付加物形成体と該標識物から、化学発光形態にある標識 物を回復させることができる付加物を調製する、 ことを特徴とする方法。 ２．（ｉ）特異的結合性パートナー、および（ｉｉ）不活化を受けて化学発光形 態でない標識物を生成させる不安定な活性部を有する化学発光標識物から、標識 された特異的結合性パートナーを製造する方法であって、 （ａ）特異的結合性パートナーを標識物に結合し、（ｂ）活性部を不活化から保 護するために、Ｈ以外の保護部分を標識物に提供する保護付加物形成体と該標識 物から、化学発光形態にある標識物を回復させることができる付加物を調製する 、ことを特徴とする方法。 ３．標識物が、式： 量Ｙ ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ピリジニウム環はさらに置換されていてもよく、ＹはＯ、Ｓ、またはＮ Ｈであり、 Ｒ１は置換されていることある炭化水素、またはＨであり、Ｒ４は脱離基であり 、 ▲数式、化学式、表等があります▼は加水分解を受けて標識物と脱離基とを生成 させる活性部であって、ピリジニウム環のオルトまたはバラ位に結合しているも のであり、そして、ここに保護付加物形成体は、該活性部に対してα位のピリジ ニウム炭素に付加する求核体である］で示されるものである請求項１に記載の方 法。 ４．標識物が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ピリジニウム環のいずれかがさらに置換されていてもよい］で示される アクリジニウム化合物である請求項３に記載の方法。 ５．Ｒ１が置換されていることあるアルキル、アルケニル、またはアルキニルで ある請求項４に記載の方法。 ６．（ｉ）特異的結合性パートナー、 （ｉｉ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、両フェニル環は置換されていてもよく、Ｒ１は置換されていることある 炭化水素、またはＨであり、ＹはＯ、Ｓ、またはＮであり、 ＺはＯ、Ｎ、ハロゲン、置換されていることあるＳ、置換されているＰ、置換さ れているＢ、または置換されているＡｓであり、−Ｚ−Ｒ５は脱離基であり、 ▲数式、化学式、表等があります▼はＣ＝Ｙ炭素が加水分解を受けて化学発光性 のない加水分解された標識物と脱離基とを生成させる活性部であり、Ｒ５は置換 されていることある炭化水素であるか、またはＺがハロゲンの場合は不存在であ る］ で示される化学発光標識物、 から化学発光特異的結合性パートナーを製造する方法であって、（ａ）特異的結 合性パートナーを標識物に結合し、次いで（ｂ）活性部を不活化から保護するた めに保護付加物形成体と該標識物から、化学発光形態にある標識物を回復させる ことができる付加物を調製する、 ことを特徴とする方法。 ７．標識物が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるものである請求項５に記載の方法。 ８．標識物がＲ５を介して特異的結合性パートナーと結合している請求項６また は請求項７に記載の方法。 ９．保護付加物形成体が環の９位に付加する求核性付加物形成体である請求項７ に記載の方法。 １０．保護付加物形成体が第１級チオールから選択される請求項９に記載の方法 。 １１．保護付加物形成体が第１級アルキルまたはアリールチオールから選択され る請求項１０に記載の方法。 １２．保護付加物形成体が第１級アルキルチオールから選択される請求項１０に 記載の方法。 １３．Ｒ５−Ｚ−が置換されていることあるアルコキシ、アルケノキシ、アルキ ノキシ、およびアリールオキシの中から選択される請求項９から請求項１２まで のいずれかに記載の方法。 １４．Ｒ５−Ｚ−が置換されていることあるアリールオキシであり、Ｒ１が置換 されていることあるＣ１−Ｃ５アルキルである請求項９から請求項１２までのい ずれかに記載の方法。 １５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、フェニルおよびピリジン環は置換されていてもよく、ＹはＯ、Ｎ、また はＳであり、 Ｒ１はＨ、または置換されていることある炭化水素であり、Ｒ４は特異的結合性 パートナーと結合していることある脱離基であり、 ▲数式、化学式、表等があります▼は加水分解を受けて化学発光形態でない標識 物と脱離基とを生成させる活性部であり、 ＭはＨ、ＯＨ、またはＯＯＨ以外の開製して脱保護された化学発光標識物を生成 させる保護部分であって、保護された標識物の活性部が脱保護された標識物の場 合よりも加水分解を受けにくいように選択されるものである〕 のいずれかで示される、特異的結合性パートナーの標識物として有用な保護され た化学発光標識物。 １６．Ｒ４が置換されていることあるフェノキシである請求項１５に記載の保護 された標識物。 １７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、両フェニル環は置換されていてもよく、Ｒ１はＨ、または置換されてい ることある炭化水素であり、Ｒ５は特異的結合性パートナーと結合していること ある脱離基であり、 ▲数式、化学式、表等があります▼は加水分解を受けて化学発光形態でない標識 物と脱離基とを生成させる活性部であり、 ＭはＨ、ＯＨ、またはＯＯＨ以外の開裂して脱保護された化学発光標識物を生成 させる保護部分であって、保護された標識物の活性部が脱保護された標識物の場 合よりも加水分解を受けにくいように選択されるものである］ で示される、特異的結合性パートナーの標識物として有用な保護された標識物。 １８．脱保護された標識物が、水溶液中において、過酸化水素または酸素、およ び水酸化物との反応後に発光するものである請求項１７に記載の保護された標識 物。 １９．Ｒ５が置換されていることあるアリール部であり、Ｒ１が置換されている ことあるアルキル、アルケニル、またはアルキニル部である請求項１８に記載の 保護された標識物。 ２０．Ｍが第１級チオールである請求項１８に記載の保護された標識物。 ２１．２つのフェニル基の任意の置換分がアミノ、置換アミノ、カルボニル、ヒ ドロキシ、アルコキシ、ニトロ、またはハライド置換分から選択される請求項１ ８に記載の保護された標識物。 ２２．Ｒ１がＣ１−Ｃ１０アルキルであり、２つのフェニル基が置換されていな い請求項１８、請求項１９または請求項１７に記載の保護された標識物。 ２３．（ａ）特異的結合性パートナー、（ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、フェニルおよびピリジン環はさらに置換されていてもよく、ＹはＯ、Ｎ 、またはＳであり、 Ｒ１はＨ、または置換されていることある炭化水素であり、Ｒ４は特異的結合性 パートナーと結合していることある脱離基であり、 ▲数式、化学式、表等があります▼はＣ＝Ｙ炭素が加水分解を受けて化学発光形 態でない標識物と脱離基とを生成させる活性部であり、ＭはＨ、ＯＨ、または過 酸化物以外の開裂して脱保護された化学発光標識物を生成させる保護部分であっ て、保護された標識物のＣ＝Ｙ炭素が脱保護された標識物の場合よりも加水分解 を受けにくいように選択されるものである］ で示される特異的結合性パートナーと結合した保護された標識物、からなる標識 された特異的結合性パートナー。 ２４．（ａ）特異的結合性パートナー、（ｂ）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、フェニル環は置換されていてもよく、Ｒ１はＨ、または置換されている ことある炭化水素であり、−Ｏ−Ｒ５はＲ５が特異的結合性パートナーと結合し ていることある脱離基であり、 ▲数式、化学式、表等があります▼はカルボニル炭素が加水分解を受けて化学発 光形態でない標識物と脱離基とを生成させる活性部であり、ＭはＨ、ＯＨ、また はＯＯＨ以外の開裂して脱保護された化学発光標識物を生成させる保護部分であ って、保護された標識物の活性部が脱保護された標識物の場合よりも加水分解を 受けにくいように選択されるものである］ で示される特異的結合性パートナーと結合した保護された標識物、からなる標識 された特異的結合性パートナー。 ２５．脱保護された標識物が、水溶液中において、過酸化水素または酸素、およ び水酸化物との反応後に発光するものである請求項２２、請求項２３、または請 求項２４に記載の標識された特異的結合性パートナー。 ２６．Ｒ５が置換されていることあるアリール部であり、Ｒ１が置換されている ことあるアルキル、アルケニル、またはアルキニル部である請求項２４に記載の 標識された特異的結合性パートナー。 ２７．Ｍが第１級チオールである請求項２６に記載の標識された特異的結合性パ ートナー。 ２８．２つのフェニル基の任意の置換分がアミノ、置換アミノ、カルボニル、ヒ ドロキシ、アルコキシ、ニトロ、またはハライド置換分から選択される請求項２ ６に記載の標識された特異的結合性パートナー。 ３０．Ｒ１がＣ１−Ｃ１０アルキルであり、２つのフェニル基が置換されていな い請求項２５、請求項２６または請求項２７に記載の標識された特異的結合性パ ートナー。 ３１．（ｉ）不活化を受けて標識物を非一発光形態にする不安定な活性部、およ び （ｉｉ）活性部を不活化から保護する、開裂して保護されていない化学発光標識 物を生成させる保護部分、 を有する化学発光性のない保護された形態にある化学発光標識物で標識された特 異的結合性パートナーを使用し、試験試料中のターゲットについて検定を行う方 法であって、 （ａ）検定を行い、 （ｂ）保護部分を開裂させて保護された標識物を脱保護し、保護されていない化 学発光標識物を回復させる、ことを特徴とする方法。 ３２．保護部分が酸化によって開裂されるものである請求項３１に記載の方法。 ３３．保護部分がフェリシアン化物による酸化によって開裂されるものである請 求項３１に記載の方法。