JPH02500723A - コラーゲンとキトサンとグリコサミノグリカンとの混合物を基材とする新規な生体材料、その製造法及び人間の医薬にそれらの応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コラーゲンとキトサンとグリコサミノグリカンとの混合物を基材とする新規な生 体材料、その製造法及び人間の医薬にそれらの応用 本発明はコラーゲンとキトサンとグリコサミノグリカンとの混合物を基材とする 新規な生体材料（バイオ材料）、その製造法及びそれらの応用特に皮膚病学及び ヤケドの被覆及び整形外科への応用に関する。

本発明によると、これらの新規な生体材料はコラーゲンとキトサンとグリコサミ ノグリカンとを組合せてなる化合物を少なくとも１つ含有してなることを特徴と する。

キトサンはキチンの単純な脱アセチル化によって好ましくは得られ、約１０％〜 約４０％のアセチル化度にアセチル化されたま＼である。

本発明の生体材料はあらゆる物質の減損に使用でき且つあらゆる組織の再生に使 用できる。

実際上、種々の成分の部分に作用させることにより生体材料の全ての物理特性（ 耐性、弾性、細孔の月決、分解時間・・・・・・）を計画した用途に改質且つ適 合させ得る。

移植した時には、この生体材料によって構成された細胞外母材は、適当な細胞に 特有な組織を生体中で再生する適当な細胞によって転移増殖される（ｃｏｌｏｎ ｉｚｅ）ものである。

即ち、骨芽細胞は骨材を与えるのに石灰化する結合組織を合成する。繊維芽細胞 は結合組織（真皮、動脈・・・・・・）及び神経の神経細胞を与える。

本発明はその最も重要な用途の１つについて先ず記載し、この用途は肥大した広 原の形成を回避しなから真皮と表皮との同時再生を可能とする人工皮膚である。

この全体的に生分解可能な人工皮膚は人間及び動物の皮膚傷の早い切除後にヤケ ドの早い被覆に主として使用される。

深（広いヤケドの場合には、一方では感染及び発熱（ｃａｌｏｒｉｃｏ）窒素の 減損からヤケドを保護するために他方では真皮が肥大した広痕及び繊維芽細胞の 無秩序な増殖による退縮を回避する土台として作用するように、不透過性の皮膚 遮断壁を出来るだけ早く且つ出来るだけ持続するように再生するのが必須である ことは知られている。

他家移植（ａｌｌｏｇｒａｐｈ）は高価で、有効な被覆を成さない。

何故ならば他家移植は患者に追加のショックを生起して拒絶されるのがきわめて 多いからである。

自己移植（ａｕｔｏｇｒａｐｈ）の標準技術は中程度に広いヤケドの場合にのみ 実施可能である。

外科医療の集中治療の進歩によって皮膚表面の８０％がヤケドを受けたヤケド愚 者を生存させることができる。

この進歩によって皮膚又は皮膚均等物の必要性が増大している。

多数の研究がこの目的のために行なわれている。

即ちグリーン（Ｇｒｅｅｎ）及びオコーナー（０’　ｃｏｎｎｅｒ）はン細胞 患者の細胞から得られるケラチ声≠≠牛から真皮を再生することに着目した。

ベル（Ｂｅｌ　１）及び彼のチームは自知の繊維芽細胞と牛のコラーゲンとの真 皮層と自知のケラチン細胞の表皮層とからなる皮膚均等物を開発した。

これらの２つの技術を用いると、患者にとって適当な人工皮膚を入手し得る前に ２１日の待ち時間（細胞の培養期間に相当する）を必要とすることに注目すべき である。

第３の技術はヤナス（Ｙａｎｎａｓ）及びプルヶ（Ｂｕｒｋｅ）によって開発さ れた（Ｊａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　ＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒ ｃｈ＋　１４巻、　６５〜８１．１０７〜１３１．５１１〜５２８（１９８０） 及びフランス特許公開（ＰＲ−Ａ−）２，３３２．８６３号）。

これらの研究報告者によって提案された人工皮膚は次の２層よりなる： （ｉ）子牛のコラーゲンとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コンドロイチン６ −硫酸とからなりしかもゲルタールアルデヒドで架橋した真皮均等物； （ｉｉ）初期段階の滲出減損を制限し且つ真皮層を被覆するのに由来する惑染剤 に対する遮断壁として作用する非生分解性シリコーン樹脂の一時的な擬似表皮。

この人工皮膚は第３度のヤケドをした組織の初期切除後（ヤケドをしてから４８ 時間及び７２時間後）に適所に配置する。コラーゲン−ＧＡＧは細孔を含存し、 これらの細孔を通って内生の新真皮が多少流通する。即ち通常の真皮；　にきわ めて近い自家製の痔痕組織が再生され、そのレベルでは繊維芽細胞によるコラー ゲンの合成は通常の肉芽組織とは異なって無秩序な要領では生起しない。真皮層 が再脈管化したに（３〜４週）に且つ表皮細胞が沈着した時に、シリコーン膜を 除去する。次いでフィレット（ｆｉｌｌｅｔ）　４又は９としてきわめて薄い表 皮の植皮片（残りの供与領域から取出した）を適所に配置する。

５つの中央病院で２００Å以上のヤケドした患者について米国で既に試験した初 期切除後のこの皮膚被覆法は、初期段階の水分及び発熱窒素滲出減損を防止し且 つ感染を防止し肥大した且つ退縮性の余病の大きさを低下させるのに特に有効で あることが判明している。

この緻密で架橋した母材は負傷した人の繊維芽細胞によって移植され、繊維芽細 胞はそれら自体でコラーゲンと結合組織の再生に必要な全ての人間蛋白質とを合 成する。

人工真皮の分解時間は２４日間であり、これは傷の治癒時間に相当する。

即ち流通した後にヤケドした患者の繊維芽細胞は良好な配向を取ることができ、 肥大したＲＫを回避する。

勿論第２期には表皮となったま＼である。

この材料は非常事態の必要性に合致する。この材料は殺菌し且つ多量に貯蔵でき る。

この技術は有利であるがなお真皮と擬似表皮との両方について幾つかの欠点があ る。

・真皮ζ２公二ニ ヤナス（ＹＡＮＮＡＳ）及びプルヶ（Ｂ１４ＲＫＥ）によって記載されたコラー ゲンとグリコサミノグリカンとの組合せは複合材料を与え、該材料では該成分は イオン化し得る基本機能におけるコラーゲン不足の故に特に容易に分離できる。

これらの複合材料は生物の体液に可溶性であり、水性媒質中でのそれらの使用が 可能であるようにコラーゲンのレベルで架橋すべきである。しかしながら、水溶 液中での浸漬が必要である毎に（水和、洗浄、中和等）架橋したコラーゲンと酸 性グリコサミノグリカンとの間のわずかな合着はＧＡＧの徐々の塩析の原因とな る。塩析は制御するのが困難であり、真皮の最終組成をがなり改質する。

その分解を減少させ、その耐性を増大させるためには、生物にとって有毒な化合 物であるゲルタールアルデヒドを用いて化学的な架橋によりコラーゲン−ＧＡＧ 共沈物を架し他方では最終生成物のその除去の制御を必要とじ、あるいは熱及び 真空の同時作用による物理的な架橋により架橋させることが必要である。

ヌ１Ｊｕし≧２公ニー シリコーン樹脂の擬似表皮は生分解可能でない、それ故表皮化前にそれを外科的 に除去することが必要である。

更には、試験管内及び生体内培養の担体として使用できない。

最新の技術は罰ＤＲＡ　（欧州特許公開ＥＰ−Ａ−００８９１５２号及び欧州特 許公開ＥＰ−Ａ−０１３８３８５号）によって提案された技術であり、これはケ ラチンから誘導したアニオン系化合物とキトサン及びコラーゲンの如きカチオン 系生重合体との組合せから形成した人工皮膚を提案している。

これらの化合物は２段階で施用してその場でヒドロゲル膜を形成でき、この膜は 保護背中を形成し、病原形成の終了時には硬化し脱落する。

本発明においては、本発明者は前記した技術の欠点を示さない新規な人工皮膚を 製造することに着目した。この目的のために、本発明者は真皮及び表皮が合致す べき成る条件を確定した。

真皮は勿論繊維芽細胞及び内皮細胞の移動を促進し、抗原性を殆んど又は全く示 さず、 制御し得る速度で分解し、 退縮を低下及び防止させることができ、廠痕形成を賦活化し感染を予防し、 炎症反応を生起せず、 苦痛を減少し、 肥大した廠痕を防止すべきである。

更には、諸成分の架橋に顛る必要なしに、真皮は十分に寛容であり、耐性であり 、しかも取扱い得るべきである。

真皮は完全に生分解可能であるべきであり細胞培養の担体として役立つことがで き、更には細菌に対して不透過性であり、液体流を調節し、制御した寸法の細孔 を示すべきである。

本発明の人工皮膚は、コラーゲンとキトサンとコンドロイチン６−硫酸及び４− 硫酸と場合によってはヒアルロン酸との組合せを含有するビロード型の真皮層よ り本質的になることを特徴とする。この真皮層を、膜状構造を有する生分解可能 な擬似表皮と組合せる。

本発明の真皮層の組成は全体的に独創的である。コラーゲンにポリアニオン分子 又はポリカチオン分子を添加するとこの蛋白質のアミン基又はカルボキシル基が 介在するイオン系網状組織を形成することは知られている。

得られた複合材料中のこれらの結合部の密度はこれらの基の接近度、それらの分 布及びそれらの個数に応じて決まる。

コラーゲンとキトサンとを組合せた複合材は既に存在する。即ちコスギ（ＫＯＳ ＵＧＩ）及びコント−（ＫＯＴＴＯ）　（米国特許第４３７８０１７号）は食品 工業で使用できる繊維質の牛のコラーゲン−カニのマクロフィブリル状キトサン を製造する。アセチル化度が好ましくは０〜３０％であるアセチルキトサンであ る。この材料はその諸成分間に介在するイオン結合部を生起するが、その安定性 及びその剛性に影響するには全体的に不十分であると思われる。複合材を安定化 させるには化学的な架橋に頼ることが必須である。研究者によって得られた膜は 透明で、摩擦に対してきわめて耐性であり、弾性で、熱安定性である。更には、 別個に入手した原料のコラーゲン及びキトサンとは対照的に水及び酸性媒質中で 不溶性である。しかしながら、膜は諸成分の塩析が生起することなく水性媒質に 水和性であり、物理化学的特性及び生物学的特性が細胞培養担体としてそれらの 任意用途に相溶性である柔軟で均質な構造を与える。

この場合には、コラーゲンのカルボキシル基のみが網状組織の形成中に介在する 。

欧州特許公開第２００５７４号はアテロコラーゲンとＮ−アシルキトサンと場合 によってはコンド、ロイチン硫酸とから形成した生体材料を記載している。

この文献に記載されたＮ−アシルキトサンは２段階法で得られる。これらの段階 の第１はキチンの少なくとも５５％まで、好ましくは７０〜１００％までの脱ア セチル化よりなる。第２段階は少なくとも５５％に等しいアシル化、好ましくは ７０〜１００％のアシル化まで特に酢酸又はコハク酸を用いて、得られたキトサ ンの再アシル化よりなる。

このアシルキトサンは少なくとも５５％に等しいアシル化度、好ましくは７０〜 １００％のアシル化度にアシル化される。

さて、少なくとも７７％までのアシル化、好ましくは７０〜１００％のアシル化 ではアシルキトサンがせいぜい４５％の遊離ＮＨ３”アミン官能基を示すことを 意味する。この事実は次の図式によりこれらのアミン官能基がコラーゲンのＣ０ 〇−基又はコンドロイチン硫酸の５Ｏ４−及びＣＯＯ−基と結合する可能性を制 限する。

酢酸でアシル化したアシルキトサン ＮＨｓ”　、　Ｎｉ１−ＣＯ−Ｃｌｈ　ＮＨ−Ｃｏ−Ｃｌｌｓ　ＮＨ３−Ｎｉ１ −ＣＯＣｌ！そ蛛故諸成分間のイオン結合部の個数は比較的わずかであり、イオ ン網状組織はずっと少ない。

即ち、欧州特許公開第２００５７４号が明記する如く、化学的な架橋法（ヘキサ メチレンジイソシアネート又はゲルタールアルデヒドの使用）に斬って耐性及び 水中の吸収能力を十分に増大させ且つグリコサミノグリカンの塩析を防止する０ が好ましい。

アシル化をコハク酸の如き二塩基酸で行なう場合には、これによって分子内でサ クシニルキトサンそれ自体のＮｌｈ”アミン官能基と及び分子内でサクシニルキ トサンの別の連鎖又はコラーゲンのＮｌｈ’アミン官能基と結合されるＣ００− カルボキシル官能基の個数が増大される。

それ故コラーゲン及び／又はグリコサミノグリカンの酸基と結合し得る遊離Ｎｌ ＋ユ゛アミン官能基はより少なくなる０次の図式を有する。

更には、この文献の教示により得られた生体材料は正確な特性を存するように化 学的に架橋すべきである。

本発明者はカルボキシル基とコラーゲンのアミン基との両方が介在しているイオ ン系網状組織を形成することにより全（格別な結果が得られることを見出した。

これら２つのイオン化し得る基の同時関与はコラーゲンをコンドロイチン硫酸と キトサンとの両方と組合せることにより得られる。得られた構造体はコンドロイ チン硫酸の酸官能基とキトサンのアミン官能基との間のイオン結合部の形成によ って安定化される。

この組合せによってカルボキシル基とコラーゲンのアミン基とが介在するイオン 系網状組織を形成でき、これらの基はそれぞれわずかな残留アセチル化率を示す キトサンのアミン官能基に且つコンドロイチン４−硫酸及び６−硫酸のサルフェ ート基及びカルボキシル基に結合される。

更には、コンドロイチン４−硫酸及び６−硫酸の酸基及びサルフェート基はキト サンのアミン官能基にイオン結合し得る。

これらイオン系網状組織の合着は、真皮が水性媒質に不溶性であるに十分な程且 つコンドロイチン硫酸の塩析が存在しないのに十分な程強力である。コンドロイ チン硫酸の不在によって特に反映されるこの安定性は共有結合による通常の架橋 法（ゲルタールアルデヒド、酸アジド、ジイソシアネート・・・・・・）の使用 を回避できる。

本発明の真皮層の主成分はコラーゲンであり、好ましくは型式１＋ＩＩ［のコラ ーゲン、天然型コラーゲン又は保存した螺旋形構造をもつテロペプチドのないコ ラーゲン、人間起源のコラーゲン、胎盤エキス又は牛のコラーゲンが包含される 。生物の体液に可溶性なこのコラーゲンは細胞酵素によって完全に分解でき、人 間には完全に許容される。

キトサン（ポリグルコサミン）は本発明の真皮層の第２成分である。このキトサ ンは種々の起源を有し得る。

前述した如く、キトサンはエビ背中のミクロフィブリル状キチン（ポリ−Ｎ−ア セチルグルコサミン）のＮ−肌アセチル化により単一段階で得られる。このアミ ノポリオシトはアミノ酸（グルタミン酸及びアスパルチン酸）に冨む蛋白質の高 吸収力を示す。

キトサンの酵素分解速度はその分子量とそのアセチル化度との両方の関数である ０本発明の目的である真皮層の組成に入るキトサンは１５０，０００と１　、０ ００　、０００との間の平均分子量と４０〜１０％のアセチル化度とを示す。こ のアセチル化率は前記した従来技術の材料との本質的な差異をなし；実際上、本 発明のアシルキトサンはそれがコラーゲンとグリコサミノグリカンとの両方に結 合されるに十分な遊離アミン基を示す０分子量及びアセチル化度の変化によって 真皮の諸成分の合着性を改質できかくして所望目的の関数としてそれらの生物学 的特性及び物理化学的特性を調和させ得る。

更には、キトサンは臨床的に使用できる興味ある生物学的特性を示す。キトサン は血液凝固促進性で病原形成性であり細胞培養の支持体として使用できる。細凹 怒染について動物を保護するその役割もまた証明された。キトサンは免疫系の刺 激によって作用し且つ特にマクロファージの賦活化を誘起する。この特性はガン 性腫瘍の処置に動物に使用されている。

それ故キトサン及びコラーゲン−キトサン複合体は人工真皮の成分としてそれら の使用と相溶性の物理化学的特性及び生物学的特性を示す。

第３成分及び第４成分であるコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸はグリコサミ ノグリカンである。

グリコサミノグリカンは結合組織の一体部分である。

グリコサミノグリカンはウロン酸（グルクロン酸又はイズロン酸）とへキソサミ ン（グルコサミン又はグラフトサミン）とより一般になる、きわめて多くＮ−ア シル化された且つｆＬ酸でエステル化された線状の三糖類単位を特徴とする。

主要なグリコサミノグリカンは次の通りである；ヒアルロン酸、 コンドロイチン４−硫酸即ちコンドロイチン硫酸Ａ　（ＣＳＡ）、コンドロイチ ン６−硫酸即ちコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ５Ｃ）、デルマタン硫酸即ちコンドロ イチン硫酸Ｂ　（ＣＳＢ）、ヘパラン硫酸（Ｈ３）、 ケラタン硫酸（ＭＳ）、これはウロン酸の代りにガラクトース、の存在によって 他のグリコサミノグリカンとは異なる。

コンドロイチン４−硫酸及び６−硫酸が最も普通である。これらはその基本単位 が次の（β１，３）グルクロニル（β１゜４）　Ｎ−アセチルガラクトサミン硫 酸である重合体である。

コンドロイチン４−硫酸及び６−硫酸はサルフェート基のそれらの位置によって のみ異なる。ガラクトサミン分子は４位（コンドロイチン４−硫酸即ちコンドロ イチン硫酸Ａ）で又は６位（コンドロイチン６−硫酸即ちコンドロイチン硫酸Ｃ ）でエステル化される。

ケラタン硫酸を除いては硫酸塩化したグリコサミノグリカンは試験管内で形成で きしかも生理的ｐＨでコラーゲンとのイオン性結合体を形成できることが示され た。これらの結合体はグリコサミノグリカンのイズロン酸含量が高ければ高い程 強力である。

酸性ｐＨでコラーゲンとコンドロイチン６−硫酸とを共沈させるとコラゲナーゼ の活動場所を遮蔽することによりコラーゲンの分解を遅延させ且つ抗原場所を遮 蔽することによりその免疫原性を低下させる。コンドロイチン硫酸は血小板の凝 集及びセロトニンの放出を低下させることによりコラーゲンを血液相溶性とさせ る。

前記した如くキトサンと同時に本発明で使用したコンドロイチン６−硫酸及び４ −硫酸は細胞の生長及び細胞の移動を調節する役割を演する前記したヒアルロン 酸と有利に組合される。ヒアルロン酸は硫酸塩化していない唯一のグリコサミノ グリカンである。

ヒアルロン酸は（β１，３）グルクロニル（β１．４）　Ｎ−アセチルガラクト サミン硫酸よりなる単位重合体である。ヒアルロン酸は考慮した組織に応じて１ ００．０００と数百万との間で変化する分子量を有する。

コラーゲンとコンドロイチン硫酸とを基剤とする組成物中にキトサンを導入する と、生物学的水準で真皮に付与される改良に加えて塩析及び架橋の問題に対する 解決に寄与することを強調すべきである。実際上、この多糖類は真皮の諸成分の 各々にイオン結合により結合し得るきわめて多数のイオン化しうるアミン官能基 を示す。何故ならばこれらは全てかなりの割合でカルボン酸及びスルホン酸官能 基を示すからである。

この場合にはしかも既知のコラーゲン−ＧＡＧ混合物でコラーゲンを単独で化学 的架橋させた後に生起するのとは反対に、全ての成分は塩析が無視し得る程に十 分な多数のイオン結合により互いに結合される。得られた真皮の化学組成は水溶 液中への浸漬を必要とする操作中に未変化のま−である。それ故本発明の真皮均 等物にキトサンが存在するときわめて明確な組成の材料を得ることができ、該材 料は共有の化学架橋に頼る必要なしに生物の体液に不溶性であるという特徴を示 す。

更には、人工真皮を被覆する擬似表皮層は天然の表皮に近い物理化学的特性を有 するべきである。この擬似表皮層は水分流調部器として且つ伝染剤に対する遮断 壁として作用すべきである。更には、その機械的特性により、植皮の時期に生起 する取扱い条件（水和、洗浄、切断、縫合・・・・・・）に相溶性の剛性及び弾 性を真皮−表皮単位に付与すべきである。

本発明によると、この表皮層はキトサンのフィルムあるいはコンドロイチン硫酸 及び／又はコラーゲンと組合せたキトサンのフィルムよりなる。表皮層はまた、 これらの成分単独よりなるか又は置換されたカルボキシメチル又はアミノエチル ケラチンの如き改質構造の蛋白質と組合せたこれらの成分よりなり得る。

真皮層は１０〜２０％のキトサンと４〜１０％のコンドロイチン４−硫酸及び６ −硫酸とを含んでなり、この％はコラーゲンの重量に関して計算しである。

１つ又はそれ以上のイオン化し得る巨大分子と組合せて他の高分子電解質の使用 も可能である。特に植物質のポリオシト（ポリガラクツロン酸・・・）又はポリ アミノ酸は所望の物理化学的特性を示すイオン性網状組織の構成に使用できる。

これらの複合フィルムは脂肪酸又は他の疎水性物質の如き無毒置換体の化学的植 皮により又は遊離又はエステル化脂肪酸を含有する皮脂代用品又は皮脂中に含有 される他の物質の表面施用により多少とも親油性とされる。

不透過性の真皮を形成するのに一般に使用した化学物質に関して利点を与える本 発明の擬似表皮は、用いた脂肪物質の種類又は導入した親油性置換体の種類の関 数として調和させ得る親油性を示す。

本発明をより良く理解するため次の実施例により説明するが、本発明は何らこれ に限定されることなく本発明の利点は明らかとなるであろう。

全ての実施例において、キトサンはエビ背中から入手されるミクロフィブリル状 キチン（ポリ−Ｎ−アセチルグリコサミン）のＮ−説アセチル化によって得られ る。アセチル化の程度は約１０〜約４０％であるキトサンである。

１：　の八／　ン　る　の側゛告 コラーゲン溶液の製造： 好ましいコラーゲンは型式Ｉ［［＋　Ｌ型式■、型式■、型式■及び型式Ｖのコ ラーゲンに属し、天然型のコラーゲン又はテロペプチドのないコラーゲン、溶液 に保存した螺旋状構造をもつコラーゲン又は繊維形のコラーゲンである。

コラーゲン啼標準の仕方で牛の真皮から製造する（Ｓ、Ａ。

ｄｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔ及びｄ’Ｕｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ　ｄｕ　Ｃ ｕｌｒ社によりフランスで市販されたコラーゲン）。コラーゲンはまた人間の胎 盤からも得られる（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｍｅｒｉｅｕｘ社によりフランスで市販 されたコラーゲン）。

コラーゲン溶液は撹拌機を用いて室温でｐ）１３．５で０．０５Ｍ酢酸中で１％ のコラーゲン（重量／容量）を混合することにより形成される。

剛性の少ない真皮が望ましいならば、該溶液の濃度は０゜３％（重量／容りに低 下させ得る。

土上並ｌ皇里■ キトサンはエビ背中から入手されるミクロフィブリル状キチン（ポリ−Ｎ−アセ チルグルコサミン）のＮ−説アセチル化によって製造される。

かくして得られた高度に精製したキトサンをコラーゲンに関して１５％（重量／ 重量）の割合で前記のコラーゲン溶液に添加する。

キトサンの生来の特性に加えて、キトサンはイオン性の架橋剤として作用する。

その分子量は１５０．０００〜１，０００，０００で変化し得る。

４０〜１０％で変化させ得るアセチル化度は架橋度を決定し、それ故人工皮膚の 分解速度に作用させ得る。

コンドロイ　ンＰ　の５１、 羊の鼻中隔から９９％に精製したコンドロイチン４−硫酸とコンドロイチン６− 硫酸との混合物を原料コラーゲンの量に関して６％（重量／重量）の割合でコラ ーゲン−キトサン溶液に添加する。最初の２成分の存在はＧＡＧの可溶化を促進 し、ＧＡＧは室温で攪拌しながら急速に溶解した。

この段階で、コラーゲンに関して１％（重量／重量）の割合でヒアルロン酸を前 記溶液に添加できる。この化合物は細胞接着を改良することができしかもグリコ サミノグリカンによって既に促進された細胞生長をより一層改良することができ る。

生−租 種々成分の十分均質な混合物が得られた時、真皮の中和を行なう。

ＮａＯＨのＩＮ溶液により又はトリス−Ｈ（／！４％街剤（ｐ）１１０．５）に よりｐＨを次いで６．５〜７にする。

別の方法は溶液を凍結乾燥後に中和を行なうことに在る。

次いで真皮を殺菌水、生理血清又はトリス−ＨＣｌ！１Ｍ街剤の２個の連続した 浴中でゆすぐ。

遠拮乾原 得られた均質な溶液を工業用凍結乾燥剤中で凍結乾燥させる。

真皮の厚さは成形型にそ−いた溶液の量に応じて決まり、使用者の要求に連合さ せ得る。平均してこの厚さは使用に応じて１〜８＋＋ｏで変化する。

前もって製造した均質な溶液からフィルムを形成することもできる。

この溶液を成形型にそ＼ぎ３５°Ｃで４８時間炉中に保持し、これによって厚さ ０．１〜０．８腫の平滑で透明な人工皮膚を得ることができる。

双−皿 ２つの主要な殺菌法が考慮される； １）７０°アルコールによる殺菌 ｉｉ）γ線による殺菌 ７０°アルコール 細菌による汚染を最大限に回避しながら標準技術により７０°アルコールを充填 したプラスチック袋に人工真皮を装填する：アルコール中に装填してから１週間 と６ケ月との間で行なった全ての細菌学的試験は陰性であることが判った。

ＬＩ四ど良肚 人工真皮はイオン化照射により殺菌できる。γ線はコバルト６０発生源から生ず る。

放射線量は真皮の特性を変性させることなく１〜３メガラドの範囲であり得る。

かくして得られた人工真皮を以下に記載する種々の検査にかける。これらの検査 の若干を添附図面に表わす；第１図はコラゲナーゼによる本発明の真皮の酵素分 解率を表わす曲線図であり； 第２図はコラーゲン単独のＸ−線回折スペクトル図を表わし； 第３図は本発明の人工真皮と変性したコラーゲンとのＸ−線回折スペクトル図を 表わし； 第４図はＸ−線及び７０＠アルコールで一旦殺菌した後の本発明の人工真皮のＸ −線回折スペクトル図を表わし；第５図は牛のコラーゲンから形成した真皮の電 気泳動の結果を表わす。

里王…徽鍍 走査電子顕微鏡によって凍結乾燥した真皮の多孔質構造及びフィルム形成性真皮 の層状構造を観察することができ、しかも真皮の乾燥物質の割合（％）によって 測定した細孔の寸法を点検することができる。

伝送電子顕微鏡によって本発明の真皮のミクロフィブリル状構造を示すことがで きる。

の　・ 真皮材料の引張強さの試験はＡＤＡＭＥＬ　ＬＨＯＭＥＲＧＹ　ＤＹ　２１ｂ測 定装置で行なった。試料は幅０．０５ｃｍ、長さ３ｃｍ、厚さ０．３３膿の唖鈴 の形に調製した。試験片の各端部を装置のジョー間に竪く締め付は保涛した。

延伸測定は試料に応じて５胴／分又はＬＯｍｍ／分の割合で行なった。各測定に つき３回の試験を行った。結果を以下の表１に示す。

表Ｉ 試　料　塘　引シ肋　伸び　ヤング率 ＤａＮ　（ハ）　張シ全の コラーゲン　殺菌ぜず　０．０１　きわめてゎず力１　／ニアー７−’Ｉ’７　 ＋　ＧＡＧ　ｉｃｙず　ｏ、０２　きわめてゎｉ’Ｊ＋１／コラーゲンＩｔ　＋ 　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　殺菌せず　０．９　１４．３３　０．１６コラーデンＨ＋ 　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　γ線　０．１　１？、３　０．１４コラーデン＋１＋Ｏ１ ＋ＧＡＧ　７０＠フルコール０．０９　１５．７　０．１４５コラーケ’ンＨ＋ ｃｈ＋ＧＡＧ　７０”７ル：＋　−／Ｌ／　０．２３　２０．１　０．２９＋住 り肯■Ｍ切以表皮 コラ−５”Ｊ　Ｂ　＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　ｉＱ菌せず　０．０６　１２．２７ 　０．１３コラーデンＢ　＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　γ線　０．０？　１３．００ 　０．１３コラ−デフＢ＋Ｃｈ＋ＧＡＧ　７０”７／Ｉ／：Ｉ　−Ｊｌ／　０． ０６　１３．３　０．１２コラーデンＨ：人間のコラーゲン コラーゲン分子間のコラーゲン Ｃｈ：キトサン ＣＲＡＧ：グリコサミノグリカン コラーゲン単独、コラーゲンとグリコサミノグリカン及びコラーゲンとキトサン とグリコサミノグリカンよりなる試料を比較すると、キトサンの存在によって人 工真皮の機械的強度がかなり増大することを示している。

表から見られる如く、１５重量ｙのキトサンを配合すると試料化合物を破壊する に必要な力を４倍だけ増大させる。

これは３つの分子それら自体の間での合着力を明らかに示している。

コラゲナーゼによる人工真皮の酵素分解率の研究伝導率測定は次の技術により行 なった；トリスＣａＣＲ２回ｍ？援衝剤ｐＨ中の試料懸濁物４−を３０”Ｃの恒 温槽に入れた。

コンダクタンスは熱安定性に達する（約１０分の終了時）や否やＷＡＹＮＥ−Ｋ ＥＲＲＢ　６４１変圧器測定ブリツジにより記録した。酵素（クロストリジウム 　ヒストリチカムＥＣ３４２４３のコラゲナーゼ−シグマＮａ　Ｃ−０７７３） を次いで槽に導入しく酵素の最終濃度：　３．２４Ｕ／ｄ）コンダクタンスの変 化を記録する。

酵素反応は少量（５０μりのＩＯＭ）ｌｃｊ２の添加により標定する。次いで加 水分解によるコンダクタンスの変化は酵素反応により媒質中の当量の自由プロト ンに転化させる。加水分解率は１！当り且つ１時間当りの当量の遊離プロトン（ Ｈ＃／時）で表わす。

表　■ 試　料　殺菌　酵素活性　分解率 α）　μｍ（Ｈ”　／１／ｈ） 人間のコラーゲン　殺菌せず　１００　１０５０コラーゲンＨ＋　Ｃｈ　＋　Ｇ ＡＧ（２）　殺菌せず　４４．８　４６２コラーゲンＨ＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ（ ３）　γ線　羽、２　４０２コラーゲンＨ＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ（４）　７０＠ アルコールＧＡＧ　（５）　殺菌せず　００ キトサン（６）　殺菌せず　０　０ キトサン及びＧＡＧの添加はコラゲナーゼによるコラーゲンの分解を半分だけ減 少させる。殺菌していない人工真皮とγ線又は７０６アルコールで殺菌した人工 真皮との間の有意な差異は認められない。

−と二井１ム因圧完 この研究によって人工真皮の製造後及び殺菌後のコラーゲン分子の抱合性を検査 することができる。

試料を中空パンチを用いて製造し、平坦にして直径１　ｃｒａ厚さ１ｍ＋ｎのベ レットを得る。これらのベレットをデータ処理系に接続したＸ−線回折装置に配 置した。

結果を第２図〜第４図に示す。

コラーゲンに特有のピークＰ１及びβ２は第２図に示した曲線Ａで観察できる。

ピークＰ，はコラーゲン分子間の間隔を測定できる．ピークＰ２は２つの酸分子 間の間隔を反映する．その存在はコラーゲン分子の抱合度を決定できる。

ピーク３はコラーゲン分子の螺旋のピッチを知ることができる。これは示すのが 特に困難なピークである。

ピーク４は人工真皮中に含有される全ての非晶質成分によって与えられる故に使 用できない。

第３図においては、曲線Ｂは本発明の真皮のＸ−線回折図であり、曲線Ｃは変性 コラーゲンのＸ−線回折図である。

製造法によってコラーゲン分子を変化させないことが見られる。何故ならばピー クＰ２が常に存在するからである。

ピーク３はもはや見られない。キトサン及びグリコサミノグリカンの残留物によ って遮蔽されていると思われる。

ピークＰ，は人工真皮及びコラーゲン単独において同一の大きさを保持する。

第４図で観察されたＸ−線回折スペクトルは殺菌処理ではコラーゲン分子を変化 させないことを示している。第４図では曲線りはＸ−線で殺菌した真皮のＸ−線 回折スペクトル図であり曲線Ｅは７０″アルコールで殺菌した真皮のＸ−線回折 スペクトル図である。

！１床軌 ＳＯＳの存在下にポリアクリルアミドゲルの第１の一連の電気泳動を実施した。

それらの分子量の関数として連鎖を分離できる。

牛のコラーゲンから得られた人工真皮の電気泳動の結果を第５図に示す。酸可溶 性の牛のコラーゲンに特有のピークα．、α２、β，，、β１□が存在し、牛の コラーゲン単独と全体的に匹敵し得る．低分子量分子に相当するピークが存在し ないことは従って製造法でコラーゲン分子を変化させないことを確認するもので あり、これをＸ−線回折の研究が既に推量し得たものである。

皿鳳爽住立匪突 繊維芽細胞及びケラチン細胞の培養物上で本発明の人工真皮の直接及び間接細胞 毒性の研究を実施した。結果を表■に与える。

各々の場合に細胞毒性の徴候はｔａ察されない。

細胞の形態は対照物の形態と同一のま＼である。生長速度はわずかに増大した。

表■ 試　料　細胞毒性　細　胞 直接　間接　生長速度 人工真皮なしの対照　／　／　標準 コラーゲンＨ＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　陰性　陰性　標準（アルコールで殺菌した ） コラーゲンＨ＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　陰性　陰性　標準（γ線で殺菌した） コラーゲンＢ　＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　陰性　陰性　標準（アルコールで殺菌し た） コラーゲンＢ　＋　Ｃｈ　＋　ＧＡＧ　陰性　陰性　標準（γ線で殺菌した） 工　の　ａ、ＬＱ」１究。

殺菌した人工真皮を生理血清の２個の浴中でゆすぎ、無菌の外科装置で所望の寸 法に切断した。

酸素とハロタン（ｈａｌｏｔｈａｎｅ）との混合物に暴露することにより選択し た動物（白色の実験室用ラット）を麻酔した。

ラットの背面を開毛し′＃５腐溶液で洗浄した。出血を最小としながらラットの 背筋に２ｃ＋ｆｉの切除部分２個を作った。

１つの切除部分には人工真皮を配置し、他方は対照として使用した。

各々の負傷部に捻子を縫合し、全体を包帯で被覆した。

若干の一連の３匹のラットをこのモデルに使用した。

ラットを２日、７日、１５日、２１日及び３１日目に屠殺した。

次いで人工真皮の外観を注視し、走査及び伝送電子顕微鏡での研究のため並びに それらの組織研究のため２個所の負傷部の筋肉から生検を採取する。

抗体調査のため心臓内穿刺によりラットの血液を採取する。

２日目に得られた結果は標準の炎症反応を示し、続いて７日目には人工真皮の細 胞転移増殖を示した。１５日目には重感染は観察されない。

２１日目に得られた最初の結果は人工真皮が未だ存在し細胞によって十分に転移 増殖されていることを示す。

かくして得られた人工真皮は生分解性の擬似表皮を用いて第２段階で表皮化でき ；本発明によると好ましくはキトサン単独を基材とする擬似表皮あるいはコンド ロイチン硫酸及び／又はコラーゲンとしかも場合によっては改質構造の蛋白質又 は他の高分子電解質と組合せたキトサンとを基材とする擬似表皮を使用する。

化学的な植皮により又は皮脂代用品の表面施用により成る親油性を擬似表皮に有 利に付与する。

かくして得られた真皮＋擬似表皮の複合材料は前述した全ての利点を示す。更に は全体的に生分解性で患者のケラチン細胞の支持体として使用でき、ヤケドに続 いて数日で移植できる。

第３度のヤケドした組織の初期切除の技術において有用な換え材料によって即座 の被覆を与えることができ、滲出減損及び発熱窒素の減損を回避し、感染に対す る遮断壁を示し、肥大した感震を制限し、退縮性の余病を弱めるものである。更 には複合材料は患者自体での表皮細胞の培養を考慮し得る優れた支持体である。

即ち、表皮層の再生は真皮層の再生と同時に行われるものであり、溶液は全てヤ ケドの中心に長く留まる。

皇施脳ｌ： 神経細胞の生長に好都合な細胞外母材の具体例となった時、０．１５％のキトサ ン次いで０１０６％のグリコサミノグリカンを溶解した。

得られた溶液は人工真皮と同じ濃度を有し、直径２〜６肛の生体相溶性シリコー ン管にそ＼いた。これらの管体を凍結乾燥させ次いで７０°アルコール又はγ線 で殺菌した。

これらの管体は最初の時期に、座骨神経の再生可能性を試験するのにラビットに 移植するように提供される。

実五五主＝骨組織の再生用細胞外母材の具体例０．０５Ｎ酢酸中のキトサンの１ ％（重量／容量）溶液を実施例１に記載した方法により調製した。この溶液にキ トサンの原重量に関して１６％のコラーゲン次いでキトサンの原重量に関して８ ４％のグリコサミノグリカンを添加した。

沈澱物を製造しこれを中性に近い値にｐＨを近ずけることにより濃厚にした。こ の繊維質沈澱物を回収し、加圧し、直径０．９〜１．５　ｃｒｎの生体相溶性の シリコーン管に配置した。

これはそのま＼放置できあるいはコラーゲン（１％）とキトサン（０，１５％） とグリコサミノグリカン（０，０６％）との溶液即ち人工真皮の濃度の溶液を充 填できる。

次いでシリコーン管を炉中で乾燥させ又は凍結乾燥させた。それらの外観はその 時硬質で繊維質である。これらをγ線又は７０°アルコールで殺菌した。これら の管体は第１の段階で、骨材又は負傷した骨の細片の再生及び修復の可能性を試 験するためラビット又は犬に移植するように提供される。

カルシウムを原料混合物に添加して普通の骨構造により近くすることができる。

！ｌＬｔ：既に存在する補綴の生体相溶性包装体を達成するため前記した混合物 の使用 シリコーン補綴（乳房の補綴、下あごの補綴・・・・・・）又はダクロン（Ｄａ ｃｒｏｎ）補綴（靭帯）は細胞によって再転移増殖されず又はきわめて緩慢に再 転移増殖される。これによってシリコーン補綴、特に乳房の補綴が多少とも太き （滑動する危険を生ずる。

これらの補綴を包囲する生体相溶性の材料は、この滑動を予防し且つ補綴とと囲 組礒との優れた界面を成す組織を再生できるものである。

涜　“　の貝 コラーゲンとキトサンとグリコサミノグリカンとの溶液は実施例３０条件下で形 成される。各成分の割合は被覆すべき補綴の形状及び大きさにより変化する。平 均して最適な割合はコラーゲン０．５％（重量／容量）、キトサン０．０８％及 びグリコサミノグリカン０．０３％である。

溶液を遠心機（３０００ｒｐｍで３７４時間）で脱気し、次いで得られる均質な 液体を補綴の全表面上に散布し、完全な乾燥が得られるまで３０℃で炉中に配置 した。

次いで補綴及びその包装体をアルコール又はＴ線で殺菌した。

皇施脳旦：薬理毒性試験のため細胞培養の支持体として実施例１〜３に記載した 種々の細胞外母材の使用 実施例１〜３に記載した溶液をビン、ベトリ皿又は多聞したフィルムは皿に接着 しており細胞培養用の優れた支持体を成す。

他方、凍結乾燥した母材は細胞（繊維芽細胞、ケラチン細胞、軟骨細胞・・・） の三次元培養物を達成できるように試験管内で使用できる。

これらの培養物モデルは種々の薬剤分子又は医薬分子の薬理毒性研究のため役立 ち得る。

製薬工業においては、これらの培養物は分子群（ｆａｍｉｌｉｅｓ）の篩分を行 ない且つ実験室動物の使用をかなり減少させることかできる故にそれらの使用が 増大している。

ノ１９）４−−−Ｊ−’ 国際調査報告 国際調査報告 ＦＲ８８００３０３

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．コラーゲンと、約１０％と約４０％との間のアセチル化度にまでアセチル化 したキトサンとグリコサミノグリカンとを組合せてなる化合物を少なくとも含有 してなることを特徴とする生体材料。
2. ２．キトサンはエピ背甲のミクロフィブリル状キチン（ポリ−Ｎ−アセチルグリ コサミン）のＮ−脱アセチルかから入手する請求項１記載の生体材料。
3. ３．キトサンは１５０，０００〜１，０００，０００の分子量を示す請求項１又 は２記載の生体材料。
4. ４．コラーゲンは型式ＩＩＩ＋Ｉのコラーゲン、人間起源又は牛起源のコラーゲ ン、天然型コラーゲン又はテロペプチドのないコラーゲン、溶液中に保存した螺 旋形構造をもつコラーゲン又は繊維状のコラーゲンから選ばれる請求項１〜３の 何れかに記載の生体材料。
5. ５．整形術及び整形外科における請求項１〜４の何れかに記載の生体材料の応用 。
6. ６．神経細胞の再生用細胞外母材を形成するため請求項１〜４の何れかに記載の 生体材料の応用。
7. ７．骨材の再生用細胞外母材を形成するため請求項１〜４の何れかに記載の生体 材料の応用。
8. ８．細胞培養の支持体として請求項１〜４の何れかに記載の生体材料の応用。
9. ９．生体相溶性の外包を形成するため請求項１〜４の何れかに記載の生体材料の 応用。
10. １０．コラーゲンとグリコサミノグリカンとキトサンとを基材どする人工皮層に おいて、請求項１〜４の何れかの生体材料を含有しているビロード型の真皮層よ り本質的になる、人工皮層。
11. １１．グリコサミノグリカンはコンドロイチン４−硫酸及びコンドロイチン６− 硫酸及びヒアルロン酸から選ばれる請求項１０記載の人工皮層。
12. １２．真皮層は１０〜２０％のキトサンと４〜１０％のコンドロイチン４−硫酸 及びコンドロイチン６−硫酸とを含有してなり、これらの％はコラーゲンの重量 に関して計算されている請求項１０又は１１の人工皮層。
13. １３．真皮層は更にコラーゲンに関して１重量部のヒアルロン酸を含有してなる 請求項１０〜１２の何れかに記載の人工皮層。
14. １４．真皮層は膜状構造を有する生分解し得る擬似表皮と組合せてなる請求項１ ０〜１３の何れかに記載の人工皮層。
15. １５．擬似表皮はキトサンフィルムである請求項１４記載の人工皮層。
16. １６．キトサンフィルムをコンドロイチン硫酸及び／又はコラーゲンと組合せて なる請求項１４又は１５記載の人工皮層。
17. １７．擬似表皮の成分を蛋白質と組合せる請求項１５又は１６記載の人工皮層。
18. １８．脂肪酸又は他の疎水性物質の如き無毒の置換体の化学的な植皮によってあ るいは遊離脂肪酸又はエステル化した脂肪酸を含有する皮脂代用品又は皮脂中に 含有される他の物質の表面施用によって或る親油性を擬似表皮に付与する請求項 １４〜１７の何れかに記載の人工皮層。
19. １９．次の工程即ン 人間起源又は牛起源の酸可溶性又は繊維質コラーゲンを酢酸に溶解させ； 精製されたエピのキトサンをコラーゲンの溶液に添加し；コンドロイチン４−硫 酸とコンドロイチン６−硫酸との混合物をコラーゲン−キトサンに添加し場合に よっては続いてヒアルロン酸を添加し； ｐＨ６．５〜７に中和させ； 凍結乾燥させ又はフィルムに変形させ；殺菌させる工程 を含有てなる、請求項１０〜１３の何れかに記載の人工真皮層を得る方法。