JPH02295A - 親規ポリヌクレオチド類似体、核酸ポリメラーゼを阻害する方法およびインターフェロンの合成を誘発させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般に、重合体鎖中のシトシンおよびウラシル
塩基の若干の５−位における反応性メルカプト基および
フッ素原子の導入により化学的に修飾された新規合成ポ
リヌクレオチドに関する。

部分置換ポリヌクレオチドは新生物哺乳動物細胞の複製
に必須である核酸ポリメラーゼの機能の遮断に有用であ
る。核酸ポリメラーゼの強力な阻害剤であることに加え
て、部分置換ポリヌクレオチドを含む複合体はまたイン
ターフェロンの合成を能動的に誘発する。

核酸ポリメラーゼは若干の抗癌薬の標的酵素であること
が示された。例えば、バートス（Ｂａｒｄｏｓ）ほか、
Ｖｏｌ、１３、ｐ、３５９、プロシーディングズ・オブ
　アメリカン・アソシエーション・オブ・カンサー・リ
サーチ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）は初めに核酸ポリメラーゼの阻害剤と
してポリマー分子のピリミジン塩基の若干の５−位にメ
ルカプト基を含む修飾ポリヌクレオチドの使用を提案し
た。一般に初期研究は、部分チオール化ＤＮＡおよびＲ
ＮＡ分離体、５−メルカプトポリシチジル酸（ＭＰＣ）
および５−メルカプトポリウリジル酸（ＭＰＵ）がＤＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ特異性ＤＮＡポリ
メラーゼ（逆転写酵素）および再生（正常）ラット肝臓
のＤＮＡポリメラーゼアルファの阻害剤として有用であ
ることを示した。

ＤＮＡポリメラーゼ系中の部分チオール化ポリヌクレオ
チドの阻害性抗鋳型（ａｎｔｉｔｅｍｐｌａｔｅ）活性
、すなわち遺伝子複製または転写および細胞増殖に必要
な天然鋳型またはプライマーの結合を妨げるような特異
標的酵素に対する選択的で強い結合、に加えて二本鎖ポ
リヌクレオチド複合体、ポリ　（イノシン酸）−５−メ
ルカプトポリシチジル酸（ポリ［−ＭＰＣ）はヒトα、
βおよびＴインターフェロンを誘発できることを示した
。そのようなポリヌクレオチドの阻害（抗鋳型）および
インターフェロン誘発性はともにその全体的な好ましい
抗腫瘍活性に寄与することができる。

部分チオール化ポリヌクレオチドの作用の抗鋳型様式と
は対照的にハロゲン化ポリヌクレオチド例えばフッ素化
ポリシチジル酸（Ｆ　Ｐ　Ｃ）　　はＤＮＡポリメラー
ゼ阻害活性がないと認められた。その代り、それらは若
干の他の機構によりそれらの細胞毒性効果を及ぼすと思
われる。従ってＦＰＣは抗鋳型阻害性ポリヌクレオチド
に関連する所望の選択性がないが、それでもやはりそれ
は、おそら＜　ＦＰＣの加水分解の結果として遊離され
たモノマー５−フルオロシチジンの細胞毒性効果のため
に、若干の試験管内細胞培養系において実際にＭＰＣよ
り細胞毒性であることが示された。

修飾へテロポリヌクレオチドの基礎組織が抗腫瘍化合物
の作用の様式に対して顕著な効果を有すると思われる観
察を考慮すると、広スペクトルの抗腫瘍活性を与え、例
えば強力な細胞毒性物質として作用し、同時にまた免疫
系に作用するものを含めて抗鋳型様式の作用により腫瘍
細胞の複製を阻害する化合物をもつことが非常に望まし
いであろう。従って、本発明は新規な部分置換ポリヌク
レオチド、インターフェロンの合成を誘発する方法を含
めて生体内生物系における新生物細胞の複製を能動的に
阻害する方法を提供する。

発明の概要 本発明の主目的はシトシンおよび（または）ウラシル塩
基の若干の５−位におけるメルカプト基およびフッ素原
子の交互的導入により修飾された１群の新規な合成へテ
ロポリヌクレオチドを提供することである。より詳しく
は、本発明の１観点は、ヌクレオチドが５’−；・３′
ホスホジ工ステル結合により互いに連結してポリマー鎖
を形成するシチジン−５′−リン酸（ＣＭＰ）またはウ
リジン−５′−リン酸（ＵＭＰ）から誘導された合成部
分置換ポリリボヌクレオチドおよびその塩、例えばナト
リウム、カリウム、アンモニウム、セチルトリメチルア
ンモニウム塩、に関する。本発明の部分置換ポリヌクレ
オチドは、殊に５−メルカプト−５−フルオロ−ポリ　
（シチジル酸）　、ＭＰＰＣ。

および５−メルカプト−５−フルオロ−ポリ　（ウリジ
ル酸）　、ＭＦＰＵ、を含む。

本発明のなお他の目的は、ピリミジン塩基含有モノヌク
レオチド、２′−デオキシシチジン−５′−リン酸（ｄ
ＣＭＰ）または２′−デオキシウリジン−５′−リン酸
（ｄＵＭＰ）から誘導され、またポリマー鎖のシトシン
およびウラシル塩基中の５−位の水素の若干がメルカプ
ト基で、および他の若干のフッ素原子で置換された一群
の新規な合成部分置換ポリ　（２′−デオキシリボヌク
レオチド）およびその塩例えばナトリウム、カリウム、
アンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム塩を提供
することである。殊にそれらは５−メルカプト−５−フ
ルオロ−ポリ　（２′−デオキシシチジル酸）および５
−メルカプト−５−フルオロ−ポリ　（２′−デオキシ
ウリジル酸）が含まれる。

本発明のなお他の主目的は、ポリ　（イノシン酸）〔ポ
リ　（Ｉ）と称する〕、またはポリ　（アデニル酸）〔
ポリ　（Ａ）と称する〕と複合体化した前記部分置換ポ
リヌクレオチドを含む二本鎖ポリマーを提供することで
ある。

本発明の他の観点は、感受性細胞を部分置換ボリヌクレ
オチドまたはポリヌクレオチド複合体の有効濃度にさら
すことにより新生物細胞の複製を阻害し、生体内生物系
、殊に哺乳動物細胞、中のインターフェロンの合成を誘
発させる方法に関する。

発明の詳細な説明 主題発明のポリヌクレオチドは、それらのピリミジン塩
基、シトシンまたはウラシル、の若干の５−位における
水素がメルカプト基で置換され、また若干がフッ素で置
換されたヘテロポリマーである。従って、ポリシチジル
酸（Ｐ　Ｃ）およびポリウリジル酸（Ｐ　Ｕ）のモノヌ
クレオチド残基のシトシンおよびウラシル部分が各ヌク
レオチド単位の５−位に水素、メルカプトまたはフッ素
を有する。すなわち、ポリヌクレオチド鎖中の（Ｃ）ま
たは（Ｕ）単位の５−忙中の約５〜約９０％の水素がフ
ッ素で置換され、さらに（Ｃ）または（Ｕ　、）鎖の５
−忙中の約１〜約３０％の水素が、酸化されたジスルフ
ィド形態であることができるメルカプト基で置換される
。従って、ヘテロポリマーはそれらのピリミジン塩基の
５−位に水素、メルカプト基およびフッ素を含む。好ま
しいポリリボヌクレオチドはＭＦＰＣおよびＭＦＰＵと
称される。

合成部分置換へテロポリヌクレオチドのさらに好ましい
態様はピリミジン塩基含有モノヌクレオチド、２′−デ
オキシシチジン−５′−リン酸（ｄＣＭＰ）および２′
−デオキシウリジン−５′リン酸（ｄＵＭＰ）から誘導
される。そのような２′−デオキシリボヌクレオチドの
リン酸基は糖部分の５′−ヒドロキシルを、水の分子を
排除してホスホジエステル結合を形成することによりポ
リマー鎖中の隣接ヌクレオチド単位の３′−ヒドロキシ
ルに連結する。従って、本発明はまたピリミジン塩基含
有モノヌクレオチド（ｄＣＭＰ）または（ｄＵＭＰ）か
ら誘導され、（Ｐ　ｄ　Ｃ）または（Ｐ　ｄ　Ｕ）鎖中
のピリミジンの５−忙中の水素の約５〜約９０％がフッ
素で置換され、さらに（Ｐ　ｄ　Ｃ）または（Ｐ　ｄ　
Ｕ）鎖中のピリミジンの５−忙中の水素の約１〜約３０
％がまた、酸化されたジスルフィド形態で存在すること
ができるメルカプト基で置換された部分置換３′−・ｉ
・５′ポリ（２′−デオキシリボヌクレオチド）、ポリ
　（２′−デオキシシチジル酸（Ｐ　ｄ　Ｃ）およびポ
リ　（２′−デオキシウリジル酸（Ｐ　ｄ　Ｕ）を意図
する。好ましい態様は５−メルカプト−５−フルオロポ
リデオキシシチジル酸および５−メルカプト−５−フル
オロ−ポリ、デオキシウラシル酸、すなわちそれぞれＭ
ＦＰ　（ｄＣ）およびＭＦＰ　（ｄＵ）　、と称するこ
とができる。

一本鎖部分置換ポリリボヌクレオチド、ＭＰＰＣおよび
ＭＦＰＵに加えて、本発明は新規な二本鎖ポリヌクレオ
チドを意図する。ＭＦＰＣはポリ　（イノシン酸）と１
：１の塩基比で複合体にすることができる。さらに、Ｍ
ＦＰＵはポリ　（アデニル酸）と１：１または２：１の
塩基比で複合体にすることができる。二本鎖複合体はイ
ンターフェロンの活性誘発物質であり、また哺乳動物の
細胞中で抗鋳型阻害活性を有する。

一般に、本発明のポリヌクレオチドは、初めに中間体の
部分フツ素化ポリヌクレオチド、を合成し、次いでそれ
を部分チオール化することにより製造される。予定塩基
組成を有する部分フツ素化ポリヌクレオチドは、それぞ
れポリリボヌクレオチドおよびポリ　（２′−デオキシ
リボヌクレオチド）の合成を触媒するポリヌクレオチド
ホスホリラーゼまたは末端デオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ（Ｔ　ｄ　Ｔ）を用いて酵素的に調製す
ることができ、反応混合物中に用いる物質の比により決
定される塩基組成を有する。

部分フツ素化ポリヌクレオチド中間体の製造において、
基質は５−フルオロ置換および非置換ウリジンニリン酸
または５−フルオロ置換および非置換２′−デオキシウ
リジン三リン酸である。あるいは、基質は５−フルオロ
置換および非置換シチジンニリン酸または５−フルオロ
置換および非置換２′−デオキシシチジン三リン酸であ
る。上記対のそれぞれ中の５−フルオロ置換と非置換基
質との特定比は生ずる部分フツ素化ポリヌクレオチドの
組成を決定する。

次の反応図式に従って、部分フツ素化ポリヌクレオチド
の非置換塩基の若干が次にそれらの５−位でチオール化
され、または換言すれば、部分フツ素化ポリヌクレオチ
ドが次にまた部分置換され、その間ポリマー鎖中の５−
フルオロ置換塩基は変化しないで保存される。

前記反応図式の最終部分置換へテロポリヌクレオチドは
単にモノヌクレオチドの１つの可能な配列の例示とみる
べきである。すなわち、鎖中の非置換、５−フルオロ置
換および５−メルカプト置換塩基を含むポリマーは可能
な配列の任意渦中に配列されることができる。

前記のように、本発明の部分置換ポリヌクレオチドは活
性細胞毒性物質であり、とりわけ、抗鋳型阻害活性を有
し、若干はまたは若干の他の機構によりそれらの抗腫瘍
効果を及ぼすと思われる。

例えばＭＦＰＣはＭＯＬＴ−４ヒトリンパ腫細胞のＤＮ
Ａポリメラーゼアルファの活性阻害物質であり、並びに
実質的腫瘍、Ａ−５４９ヒト肺癌およびＨＴ−２９ヒト
結腸癌腫細胞系に対し細胞毒性であると認められた。さ
らにＭＦＰＣはヒト膀胱ｃ−Ｈａ　　ｒａｓオンコシン
、ＥＪにより形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞（３ＪＩ
と称される）に対して活性であることが示された。本発
明の二本鎖ポリヌクレオチドはインターフェロン誘発物
質として有用であるが、しかしさらにポリ　（１）ＭＦ
ＰＣはマウス乳癌の阻害に活性であることが示された。

新生物哺乳動物細胞などの阻害物質として、感受性物質
が部分置換ポリヌクレオチドの有効濃度にさらされる。

一般に、有効濃度は約１〜６０ｎ＋ｇ／ｋｇ体重の範囲
内にある。試験管内インターフェロン誘発は２〜５０μ
ｇ　／　ｍ　ｊ２　ｔｍ度で生ずる。本発明のポリヌク
レオチドはまた真菌阻害量で感受性細胞に投与するとき
に抗真菌剤として有用である。

腫瘍の治療に投与する化合物の実際の量は、含まれる温
血動物の大きさ、実質的腫瘍の型、および含まれる動物
の種によって変動する。一般に、多くの適用に対し、有
効腫瘍阻止濃度は上記範囲内にある。一般に、大動物は
小動物より体重光りに小量の薬学的化合物を必要とする
。用いた「実質的腫瘍」という語は上皮新生物例えば皮
膚および胃癌；結合組織新生物例えば骨および平滑筋痛
；神経系の新生物；増殖組織の新生物例えば乳癌および
腎臓癌；並びに雑多の新生物例えば胎盤癌および卵巣癌
腫である。結腸、肺および乳房の実質的癌腫瘍が殊に重
要である。

処置は個々の腫瘍に有効な適当な方法、すなわち適切で
あるように経口、直腸、局所、非経口、または他の経路
の投与であることができる。本発明のポリヌクレオチド
は薬学的に許容される希釈剤、増量剤、担体などととも
に使用できる。適用を容易にするために適当な担体また
は希釈と配合された静脈内、皮下または筋肉内適用によ
る非経口処置が本発明のポリヌクレオチドの溢血動物に
対する好ましい投与法である。

以下の特定実施例は本発明の生成物および方法を示す。

しかし、これらの実施例が単に例示のためであり、条件
および範囲に関して全く限定的であることを意味しない
ことを理解すべきである。

実施例１ 反応媒質５ｍｌはシチジンニリン酸カリウム〔シグマ（
Ｓｉｇｍａ）製）（１０＋＋＋Ｍ、０．０２３０３グラ
ム）５−フルオロシチジンニリン酸ナトリウム（１０１
，０，０２４０３ｇ）　、塩化マグネシウム〔シグマ（
Ｓｉｇｍａ）製）　　（１０ｍＭ）　、ＥＤＴＡ　（シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）製）　　（０，５ｍＭ、ｐＨ６，６
）；ミクロコツカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ　Ｉｕｔｅｕｓ）からのポリヌクレオチドホスホリラ
ーゼタイプ１５〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
製〕　（５単位毎ｎｕ反応混合物）、トリス−塩化水素
緩衝液ｐＨ９，０（０，１５Ｍ）およびｌｌｌ１１の脱
イオン蒸留水のすべてを、トリス１１１１緩衝液中に浸
し、蒸留水で十分洗浄し、ＲＮａｓｅを含まなくした特
定処理１５ｍｊ！管中に含有した。この溶液を穏やかに
振りまぜ、３７℃で１１時間インキュベートした。重合
反応混合物をクロロホルム−イソアミルアルコール（２
４：１、ｖ　／　ｖ　）による反復抽出により除タンパ
クした。

生じたコポリマーをゲル濾過により分離した。

Ｇ−１００セフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム
を精製に用い；それは次の寸法および仕様を有した：高
さ８７ｃｍ、半径０．８ｃ１１１トリス−ＨＣｊ２（２
０ｍＭ１、ｐｉ４７．２　）で、約４Ｆ３ｍｌ／時の流
量で、平衡させ、溶離した。水相をカラム中に置き、両
分をＵＶレコーダーを有するＬＫＢフラクショネータ上
に捕集し；　６０　ＲＮａｓｅを含まない管（洗浄し、
３５０℃で４５分間加熱した）（３，５ｍｌ／管）中に
３．５ｍｊ！画分を捕集した。ポリヌクレオチドピーク
を透析により濃縮した。種々の直径で種々の長さのセロ
ハン透析管〔フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）製）は、０
．５％ラウリル硫酸ナトリウム中に５分間浸漬すること
により調製し、水中で１５分間煮沸し、９５％エタノー
ル中に４℃で貯蔵した。ＦＰＣを透析バックに移し、密
封し、ペトリ皿に入れ、次いで４℃でポリビニルピロリ
ドンでおおった。溶液を約３ｎ／ｌの適当な容積が得ら
れるまでモニターし、次いでそれをパスツールピペット
によりＲＮａｓｅを含まないバイアルに移し、４℃で貯
蔵した。未反応モノマーを回転蒸発により捕集し、４℃
で貯蔵した。ポリヌクレオチドはＵＶ（ベックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）モデル２５、カリ（Ｃａｒｙ）　１１　
Ｂ）およびＮＭＲ（ジエオル（Ｊ　ＥＯＬ）　２７０Ｍ
Ｈｚ）分析により確認した。ＮＭＲ研究は試料（Ｆ　Ｐ
　Ｃ）および標準５−フルオロシチジン〔カルビオケム
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）製〕対照を１９ｍＭおよび１
１ｍＭで用いて５龍ＲＮａｓｅを含まない管中でフッ素
１９−プローブで行なった。試料ＦＰＣは測定可能量の
フッ素を得るために、前記のように透析により６１ｍＭ
で１．５　ｍ　ＩＩに濃、縮した。４００スキヤンを標
準で行ない１２００スキヤンをポリマーでコンパイルし
た。また吸光係数は２６（ＩｎにおけるＵＶ吸光度の測
定により決定し、ポリヌクレオチドの量はリン酸塩分析
により検定した。

トリス−ＨＣｌの水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ７，２）中の
部分フツ素化ポリ　（シチジル酸）のナトリウム塩（２
０，７ｗ、６４．１２１Ｊｍｏｌ、４．５８ｍＭ）　　
１４ＩＩ１１に４℃で、七チルトリメチルアンモニウム
プロミド〔イーストマン・コダック（ｔ！ａｓｔｍａｎ
　Ｋｏｄａｋ）製〕の２％水溶液１．５２ｍ／、８３．
２μｍｏＪ、１．３倍過剰、を滴加した。沈澱したセチ
ルトリメチルアンモニウムＦＰＣをナルゲン（Ｎａｌｇ
ｅｎｅ　）５０ｍＩ！、管中の遠心分離（７０００ｒｐ
ｍ、１０分）により捕集した。それを蒸留水で３回（５
ｍｆｆ）洗浄した。ペレットを１００ｍｌ丸底フラスコ
（ＲＮａｓｅを含まない）に移し、メタノール（２０Ｉ
Ｉ１１）中に、４℃で穏やかにかくはんすることにより
溶解した。かくはん１２時間後に沈澱がすべて溶液にな
ったわけではない。溶液を再び遠心分離し、上澄みを捕
集した。溶液のＵＶ測定（カリ１１８）は２７０ｎｍ　
（７２，４＃ｒｔｈｏｌ　）で吸光度の増加を示した。

ペレットはメタノールまたは水性トリス−ＨｔＪｉ衝液
中で完全には溶液にならなかった。上澄みを真空で回転
蒸発により蒸発乾固した。残留物をデシケータ中五酸化
リン上で２５℃で１２時間真空で乾燥した。

バート　旦：メトキシプロミド　　　の初めに次亜臭素
酸メチルを調製した。＝１５℃でかくはんした無水メタ
ノール（２０ｍｇ）と炭酸銀（１，７ｇ）との混合物に
臭素（ＨｚＳ（１４）上で乾燥した）を加えた（０．１
４ｎ＋ｌ）。溶液を一１５℃で１６５時間激しくかくは
んした。次いで溶液を一３０°Ｃに冷却し、セライト（
Ｃｅｌｉｔｅ）を通して冷却（−１５℃）丸底フラスコ
中へ濾過した。帯緑色溶液（０，１２８Ｍ、　ＣＨ＋０
Ｂｒ）は直ちに使用すべきである乾燥ＦＰＣのセチルト
リメチルアンモニウム塩を無水メタノール（２０ｍｊ２
）に溶解した。非修飾シトシン残基の定量的臭素化のた
めに２．２過剰のメトキシプロミド（１４１μｍｏｌ）
を加え（１，１ｎｌ、　０．１２８Ｍ）　、混合物を０
℃で３０分間かくはんした。反応の終了は２７０龍にお
けるＵＶビークの消失および同時の２３４龍ｍにおける
ピークの出現により決定した。

パート　旦：　ＦＰＣ，のチオール ハロゲン化コポリマーを１０ｍＡ’に回転蒸発し、乾燥
Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド（１０ｍｊりを加え、窒
素を溶液に１５分間通した。微粉Ｎａ５Ｈ・２Ｈ２０を
２倍過剰（１４，７ｍｇ、１６０　μｍｏＪ）を０℃で
速やかに加え、溶液を窒素下に１．５時間かくはんした
。１．５時間後に溶液を、溶液が無色に変るまで、また
は０℃で１５分間濾過空気の雰囲気下に置いた。ＮａＣ
１（３Ｍ、４ｍ１）を４℃で滴加することによりチオー
ル化ポリリボヌクレオチド（ＭＦＰＣ）をナトリウム塩
に転化した。ナルゲン遠心管中に７．００　Ｏｒｐｍで
１０分間遠心分離することにより沈澱を捕集した。上澄
みをデカントし、ペレットをエタノールおよびＮａＣｌ
溶液（０，１５Ｍ）　３　：　１　　（Ｖ　：　Ｖ）　
テ３回洗浄した。

生じた部分チオール化およびフッ素化ポリ　（シチジル
酸）ペレットを水性トリス−ＨＣｊ！　（２０ｍｊ！。

２０ｍＭ、　ｐＨ７，２）中に４℃で一夜穏やかにかく
はんすることにより溶解した。４０℃に１時間の加熱後
でも、ＭＦＰＣがすべて溶解したわけではない。コポリ
マーを遠心分離（８，００Ｏｒｐｍ、１０分）し、上澄
みをセファデックスＧ−１０（１０）カラム上で精製し
た。ペレットは些少量のポリマーを含有し、廃棄した。

上澄みのスペクトル分析をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ
）モデル２５およびギルフォード（Ｇｉｌｆｏｒｄ　）
　２４００−　Ｓでゲル濾過前に行なった。カラムの寸
法、溶離剤および捕集操作はＦＰＣの合成に対して記載
したものと同一であった。ＭＦＰＣを含む上澄みは、カ
ラムの超過荷重を避けるためにゲル濾過のために３等部
分に分割した。ＭＦＰＣポリリボヌクレオチドを表わす
両分をプールし、分光測光的に分析した。次いでＭＦＰ
Ｃをセロハン透析バッグによりポリビニルピロリドンを
４℃で用いて約８ｍｊ！に濃縮し、１？Ｎａ５ｅを含ま
ないバイアルに移した。

実施例■ ポリ　（１）　　・ＭＦＰＣＯ制 等モル量のポリ　（Ｉ）およびＭＦＰＣを標準法を用い
てアニールした。従って、ポリ　（１）の４ＩＩＩＭ溶
液１０ｍｇとＭＦＰＣの４ｍＭ溶液１０ＩＩ１１とを、
０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび２ＩＩＩＭ塩化マグネシ
ウムを含むリン酸ナトリウム緩衝液２０ｗＭ、ＰＨ７，
２中で混合した。溶液を２５℃で３時間および４℃で１
６時間インキュベートして完全なアニールを保証した。

得られたポリ（Ｉ）　　・ＭＦＰＣ溶液を紫外吸収スペ
クトルによりさらに分析し、その熱安定性を紫外吸収−
温度プロフィルにより決定した。

実施例■ 実施例Ｉの部分５−チオール化、部分５−フッ素化ポリ
　（シチジル酸）　　（Ｍ　Ｆ　Ｐ　Ｃ）をその培養細
胞の増殖を妨害する能力について試験管内で試験した。

試験した３細胞はヒト肺腫瘍細胞系、Ａ３４９ｉ擬正常
マウス細胞系、ＮＩＨ３Ｔ３、およびヒト膀胱Ｃ−Ｈａ
ｒａｓオンコシン、ＥＪ。

により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞であった。

このクローン系は３ＪＩと称された。Ａ３４９．３Ｔ３
および３ＪＩの８Ｘ１０’細胞を１６鶴直径培養容器中
へ、１０％ウシ血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ）培地
（ＥＭ　１０　Ｃ）　０．５ｎ＋１分割量に接種した。

翌日、培地を表１に示すＭ　Ｆ　Ｐ　Ｃ濃度を含む培地
で置換した。細胞を接種７日後にトリプシン処理し、計
数した。

ＭＦＰＣは多数の実験で０．００３未満〜約０．１μｇ
毎ｍ１の範囲内の５０％増殖阻止Ｎｃｓｏ）に十分な濃
度で前記３細胞系のそれぞれを阻害することが認められ
た。Ａ３４９およびＮｌｌｌ３Ｔ３細胞は類似の感受性
を有したが、しかし３ＪＩ細胞よりもＭＦＰＣに対し耐
性であった。

実施例■ ポＵ（１）　　・ＭＦＰＣ複合体を実施例■の方法に従
って製造し、そのＢａ＃ｂ／Ｃマウス中の３ＪＩ細胞に
よる腫瘍形成を阻害する能力について試験した。試験動
物は、ｌＸ１０’３ＪＩ細胞を肩甲骨間に皮下注射した
。腫瘍移植の翌日から始めて、示した量のポリ　（１）
　　・ＭＦＰＣをマウスに腫瘍部位に皮下注射した。注
射は１日置きに合計８注射与えた。対照動物はパック（
Ｐｕｃｋ）のＧ塩類液で処置した。動物を最後の注射の
３日後に（腫瘍移植の１８日後）層殺し秤量した。腫瘍
を切出して秤量した。生体内試験の結果は表■に示され
る。

表−」− ５４，７９±　２．７６ ５　　　　　　３．５９　　±　２．３５４”　　　　
　０．５７　　±　０．３６２７．９　±　１．５ ２７．２　±　１．５ １４．１　±　０．９ 表■中のデータはポリ　（１）　　・ＭＦＰＣが２０■
毎ｋｇ体重で１Ｉｆｆｉ瘍の増殖を非常に阻害したこと
を示す、低用量でポリヌクレオチド複合体の阻害活性を
比較できるが、しかし毒性に対する潜在性が低いと思わ
れる。

実施例■ ポリ　（１）　　・ＭＦＰＣおよびポリ　（１）　　・
ＮＰＣのマウス中の抗腫瘍活性を比較ベースで示すため
に一連の生体内試験を行なった。この研究に用いたＭＦ
ＰＣは８％５−メルカプトシチジレート、３３％５−フ
ルオロシチジレートおよび４９％シチジレートを含むこ
とが示された。ポリ　（１）との安定な二重らせんが形
成された。この研究に用いたＭＰＣは１２％５−メルカ
プトジチジレート残基を含有した。

用いた腫瘍モデルはサプラインし、めすＤＢＡ／２ジャ
クソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスに皮下移植したＳＭＴ
−Ｆ腫瘍、急速増殖自然マウス乳癌であった。供与体マ
ウスの腫瘍の小片（１，５ｎ”）を１８ゲージトロカー
ルで、８週令の各約２０ｇの受容体マウスに移植した。

ポリ　（Ｉ）　　・ＭＦＰＣ二本鎖化合物を腫瘍の移植
後第１日、第７日および第１３日に１０ｍｇ／ｋｇ体重
の用量で腫瘍移植と同位置に皮下注射により投与した。

対照マウスは同容積の塩溶液を与えた。腫瘍は第５日に
検出することができ、第７日に測定可能であった。腫瘍
の大きさは最大径（長さ）およびその直角径（幅）をノ
ギスで１日置きに測定してＩ　Ｘ　ｗ　（ｗｍ”　）と
して示した。実験の終りにマウスを剖検し、腫瘍を切出
して秤量した。平均腫瘍大きさおよび重量毎群、標準偏
差および標準誤差を計算し、スチューデントのｔ試験を
用いて分析し、比較した。

まｌ　ポ１ ■ ・ＭＦＰＣの 塩類液　　　　　０．６１　±０．１１　　　　　１０
０ポリ（１）・ＭＰＰＣ０，０１３±０．００６１　　
　　　２．０６ポリ（１）・ＮＰＣ０，１４±０．０３
３　　　　　２６．６ボリ　（Ｉ＞　　・ＭＦＰＣで処
置した５マウス中の３匹は腫瘍がなく、それらは外観的
に健康で正常であった。第２５日にこの３マウス中の１
匹が非常に大きく増殖した検出可能な腫瘍を示したので
、１週後にそのマウスを剖検しなければならなかった。

他の２マウスは第３２日にやはり腫瘍がなかった。ポリ
　（１）　　・ＭＰＣ処置群中の５マウス中の１匹は第
３２日に腫瘍がなかった。

ポリ　（１）　　・ＭＦＰＣおよびポリ　（Ｉ）　　・
ＭＰＣがともにマウス中の腫瘍の増殖に対し阻害性であ
ったけれども、ポリ　（１）　　・ＭＦＰＣがポリ　（
１）・ＭＰＣ（Ｔ／Ｃ＝７４）よりも−層強力（Ｔ／Ｃ
＝９８）であった。

本発明はその特定実施例に関して記載されたけれども、
これは単に例示である。従って、多くの選択、改変およ
び変更は前記記載にてらして当業者に明らかであり、従
って、そのような選択、改変および変更はすべて特許請
求の範囲の精神および広い範囲内の帰属に関して包含さ
れるものとする。

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリマー鎖中のピリミジンの５−位中の水素の約
   ５〜約９０％がフッ素で置換され、さらにポリマー鎖中
   のピリミジンの５−位中の水素の約１〜約３０％が、酸
   化ジスルフィド形態で存在することができるメルカプト
   基で置換されたシチジン−５′−リン酸（ＣＭＰ）、ウ
   リジン−５′−リン酸（ＵＭＰ）、２′−デオキシシチ
   ジン−５′−リン酸（ｄＣＭＰ）および２′−ジオキシ
   ウリジン−５′−リン酸（ｄＵＭＰ）からなる群から選
   ばれるピリミジン塩基含有モノヌクレオチドから誘導さ
   れたポリマー鎖を含む部分置換３′・・・・・５′ポリ
   ヌクレオチドおよびその塩。
2. （２）５−メルカプト−５−フルオロ−ポリ（シチジル
   酸である、請求項（１）記載の部分置換ポリヌクレオチ
   ド。
3. （３）５−メルカプト−５−フルオロ−ポリ（ウリジル
   酸）である、請求項（１）記載の部分置換ポリヌクレオ
   チド。
4. （４）ポリ（イノシン酸）と１：１の塩基比で複合体化
   された、請求項（２）記載の部分置換ポリヌクレオチド
   。
5. （５）ポリ（アデニル酸）と１：１の塩基比で複合体化
   された、請求項（３）記載の部分置換ポリヌクレオチド
   。
6. （６）ポリ（アデニル酸）と２：１の塩基比で複合体化
   された、請求項（３）記載の部分置換ポリヌクレオチド
   。
7. （７）５−メルカプト−５−フルオロ−ポリ（２′−デ
   オキシシチジル酸）である、請求項（１）記載の部分置
   換ポリヌクレオチド。
8. （８）５−メルカプト−５−フルオロ−ポリ（２′−デ
   オキシウリジル酸）である、請求項（１）記載の部分置
   換ポリヌクレオチド。
9. （９）薬学的に許容される担体および請求項（１）記載
   の部分置換ポリヌクレオチドの抗腫瘍量を含む薬学的組
   成物。
10. （１０）新生物哺乳動物細胞の複製を、それらの核酸ポ
    リメラーゼの機能を遮断することにより阻害する方法で
    あって、感受性細胞を請求項（１）記載のポリヌクレオ
    チドの有効濃度にさらすことを含む方法。
11. （１１）新生物哺乳動物細胞の複製を、それらの核酸ポ
    リメラーゼの機能を遮断することにより阻害する方法で
    あって、感受性細胞を請求項（２）記載のポリヌクレオ
    チドの有効濃度にさらすことを含む方法。
12. （１２）新生物哺乳動物細胞の複製を、それらの核酸ポ
    リメラーゼの機能を遮断することにより阻害する方法で
    あって、感受性細胞を請求項（３）記載のポリヌクレオ
    チドの有効濃度にさらすことを含む方法。
13. （１３）新生物哺乳動物細胞の複製を、それらの核酸ポ
    リメラーゼの機能を遮断することにより阻害する方法で
    あって、感受性細胞を請求項（７）記載のポリヌクレオ
    チドの有効濃度にさらすことを含む方法。
14. （１４）感受性細胞を請求項（４）記載のポリヌクレオ
    チド複合体の有効濃度にさらすことを含む、哺乳動物細
    胞によるインターフェロンの合成を誘発させる方法。
15. （１５）感受性細胞を請求項（５）記載のポリヌクレオ
    チド複合体の有効濃度にさらすことを含む、哺乳動物細
    胞によるインターフェロンの合成を誘発させる方法。
16. （１６）感受性細胞を請求項（６）記載のポリヌクレオ
    チド複合体の有効濃度にさらすことを含む、哺乳動物細
    胞によるインターフェロンの合成を誘発させる方法。
17. （１７）薬学的に許容される担体および請求項（２）記
    載の部分置換ポリヌクレオチドの抗腫瘍量を含む薬学的
    組成物。
18. （１８）薬学的に許容される担体および請求項（３）記
    載の部分置換ポリヌクレオチドの抗腫瘍量を含む薬学的
    組成物。
19. （１９）薬学的に許容される担体および請求項（４）記
    載の複合体のインターフェロン誘発量を含む薬学的組成
    物。
20. （２０）薬学的に許容される担体および請求項（５）記
    載の複合体のインターフェロン誘発量を含む薬学的組成
    物。
21. （２１）薬学的に許容される担体および請求項（６）記
    載の複合体のインターフェロン誘発量を含む薬学的組成
    物。