JPH07507563A - ヘテロ原子によるオリゴヌクレオシド連結 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヘテロ原子によるオリゴヌクレオシド連結関連特許出願 本特許出願は、”主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体”と題され、１９９ ２年５月２１日提出のＰＣＴ出願の一部継続出願であり、そのＰＣＴ出願は１９ ９１年５月２１日提出の米国特許出願第７０３，　６１９号の一部継続出願であ り、米国特許出願第７０３，６１９号は、１９９０年８月１３日提出の米国特許 出願第５６６，　８３６号および１９９０年７月２７日提出の米国特許出願第５ ５８．　６６３号の一部継続出願であり、これらのすべての出願は本出願の譲受 人に譲渡されており、これらの特許文献のすべてを参照文献としてここに引用す る。

発明の分野 本発明は、オリゴヌクレオチド模倣体として機能し、治療や診断用に適した、ま た学術研究用の試薬として適した耐ヌクレアーゼ性の高分子の設計、合成、およ び応用に関する。本発明の高分子は、野生型の核酸にみられるポスボロジエステ ル糖間結合の代わりに修飾された結合を有する。本発明の高分子は、ヌクレアー ゼ分解に対して抵抗性があり、ＤＮＡおよびＲＮＡの活性を調節することができ る。これらの高分子の合成法、および本発明の高分子を使用して蛋白質の生成を 調節する方法もまた提供される。さらに、本高分子の合成に有用な中間体組成物 もまた提供される。

発明の背景 よく知られているように、哺乳動物における肉体状態（疾病状態も含めて）の殆 どは蛋白質によって作用を受ける。こうした蛋白質は、直接作用する場合でも、 あるいは酵素機能を介して作用する場合でも、動物や人間に種々の疾病を引き起 こす一因となることが多い。

従来からの治療学は一般に、疾病を引き起こす作用または疾病を重くする作用を 和らげるよう検討を進めていく上で、蛋白質との相互作用を調べることに重点を 置いている。しかしながら最近では、蛋白質の合成を方向づける分子（すなわち 細胞内ＲＮＡ）との相互作用によって、こうした蛋白質の実際の生成を和らげよ うとする検討がなされている。これらの相互作用には、ＲＮＡに対する相補的“ アンチセンス”オリゴヌクレオチドまたはそれらの特定の類似体のハイブリッド 形成が含まれている。ハイブリッド形成は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチド類似体の、ＲＮＡまたは一重鎖ＤＮＡに対する配列特異的水素結合で ある。蛋白質の生成を妨げることによって、できるだけ高い効能とできるだけ少 ない副作用を示す治療学的結果が得られるものと期待される。同じ様にしてオリ ゴヌクレオチド様高分子も生体による蛋白質の生成を調節することができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体 の薬理学的活性は、他の治療の場合と同様、特定の細胞内標的におけるこれらの 薬剤の有効濃度に影響を及ぼす種々の因子に依存する。オリゴヌクレオチドに関 する１つの重要な因子は、ヌクレアーゼの存在下における安定性である。未修飾 のオリゴヌクレオチドが有用な治療用薬剤になるとは考えられない。なぜなら、 未修飾のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによって速やかに分解されるからで ある。したがって、オリゴヌクレオチドを耐ヌクレアーゼ性にするようこれに修 飾を施すことが必要となる。

耐ヌクレアーゼ性を高めるためのオリゴヌクレオチドの修飾は、一般には糖−リ ン酸主鎖のリン原子上で行われる。ホスホロチオエート、メチルホスホネート、 ホスホロアミデート、およびホスホロトリエステルが、種々のレベルの耐ヌクレ アーゼ性を付与することが報告されている。しかしながら、リン酸修飾オリゴヌ クレオチドは一般的にハイブリッド形成特性がよ（ない［Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｓ 、、　ｅｄ、　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉ ｎｈｉＭｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　（ＣＲＣＰｒｅ ｓ刀AＩｎ ｃ、、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ　ＦＬ、　１９８９）　］。

他の重要な因子は、疾病プロセスに関与している特定の細胞の形質膜をアンチセ ンス化合物が横切る能力である。細胞膜は、脂質−蛋白質二重層からなり、小さ な非イオン性の親油性化合物は自由に透過できるが、殆どの天然代謝産物や治療 用薬剤に対しては本質的に不透過性である（Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｄ、Ｂ、＾ｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ。

４７：９３３−９６５（１９７８））。培養した哺乳類細胞における天然オリゴ ヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの生物学的効果および抗ウイルス効 果が、文献により立証されている。したがって、これらの薬剤は膜を透過して細 胞内の標的に達することができると考えられる。天然オリゴヌクレオチドおよび ある特定の耐ヌクレアーゼ性類似体を使用して、種々の哺乳類細胞（ＨＬ−６０ 、ゴールチン１１ムスターの繊維芽細胞、Ｕ９３７、Ｌ９２９、ＣＶ−１、およ び＾ＴＨ８等の細胞）によるアンチセンス化合物の取り込みが研究されている。

アルキルトリエステル類似体についてはＭｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、、　Ｂｒａｉ ｔｅｒｍａｎ、　Ｌ、Ｔ、およびＴｓ’Ｏ，Ｐ、Ｏ，Ｐ、　［Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　１６：P ９８８−１９９６（１９７７）により結果が報告されている。メチルホスホネー ト類似体についてはＭａｒｃｕｓ−５ｅｋｕｒａ、　Ｃ，Ｒ，、ｆｏｅｒｎｅｒ 、＾」、、５ｈｉｎｏｚｕｋａ、　Ｋ、、　Ｚｏｎ、　Ｇ、、およびＱｕｉｎｍ ａｎ、　Ｇ、Ｖ、、［Ｎｕｃ、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、　１５：５７４９−５７６３ （１９８７）］　、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、、　Ｍｃeａｒｌａｎｄ。

Ｋ、Ｂ、、　Ｈａｙｅｒｉａｎ、　Ｋ、およびＴｓ’Ｏ，Ｐ、０．Ｐ、、　［Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６：　１９１１！８−１９９６i１９７７） ］ならびにＬｏｋｅ、　Ｓ、に、、５ｔｅｉｎ、　Ｃ，、Ｚｈａｎｇ、　Ｘ、Ｂ 、＾ｖｉｇａｎ、　Ｍ、、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、およびＮｅｃｋｅｒｓ、　Ｌ、 １１．　［丁ｏｐ、１ｉｉｃｒｏｂｊｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４１＋　２８ ２二２８９（１９８ｇ）］　らに謔■ 結果が報告されている。

しばしば、修飾オリゴヌクレオチドは対応する天然オリゴヌクレオチドに比べて 簡単には取り込まれに（い。このため、従来より使用されている多くの修飾アン チセンスオリゴヌクレオチドの活性は、実際の治療目的、学術研究目的、または 診断目的に対して充分であるとは言い難い。従来の修飾オリゴヌクレオチドが有 する他の２つの大きな欠点は、細胞内ＲＮＡに対する）１イブリツド形成がよく ないこと、およびＲＮＡの基本的な機能を停止させるための、明確な化学的また は酵素仲介による事象が欠如していることである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を高め、かつ上記の問題点を解消する ための修飾は、これまで多くの形態をとってきている。これらの修飾としては、 ペテロ環塩基の修飾、糖の修飾、および糖−リン酸主鎖の修飾などがある。従来 の糖−リン酸主鎖修飾（特にリン原子上での）によれば、種々のレベルの耐ヌク レアーゼ性が達成されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドが特定のＤＮＡ またはＲＮＡと正確に結合する能力がアンチセンス方法論の基本である。しかし ながら、修飾リンオリゴヌクレオチドは一般に／）イブリッド形成特性が劣って いる。リン原子の置換は、修飾リンオリゴヌクレオチドに伴う問題点を避けよう とする１つのアプローチである。リン原子の置換が有効である特定の修飾が報告 されている。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ　３１：２３８５−２３３８（１９９０）］はリン原子のメチレン基に よる置換を報告している。しかしながら、そのような置換は主鎖全体にわたって ホルムアセクール結合の均一な挿入を与えることが困難なため制約を受けている 。Ｃｏｒｍｉｅｒらは［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６ ：４５８３−４５９４（１９８８）］　］ジイソブロピルンリル部によるリン部 分の置換を報告している。５ｔｉｒｃｈａｋらは［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒ ｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５２：４２０２−４２０６（１９８７）］　 カルノくメート結合またはモルホリノ結合を含む短いホモポリマーによるリン結 合の置換を報告している。これらの置換はいずれも適した合成の方法論の欠如、 生成する分子の溶解性の低さ、およびハイブリッド形成特性が悪いことにより制 約を受けている。ＭａｚｕｒらはしＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４０：３９４９− ３９５６（１９８４月ホスホニック結合によるリン結合の置換を報告している。

この置換はホモトリマー分子の合成以上のものを実現していない。Ｇｏｏｄｃｈ ｉｌｄ、　Ｊ、は［Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ＣｈｅＩｌｌｉｓｔｒｙ　ｌ： １６５−１８７　（１９９０）］エX テル結合による置換を報告している。しかしながら、エステル結合はエステラー ゼによって酵素作用的に分解され、したがってアンチセンスの適用においてリン 酸結合を置き換えるには不適切である。

Ｔｒｏｎｃｈｅｔ、　Ｊ、らによる最近の報文は［Ｊ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ ｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１０ニア２３（１９９１）］二つのモノサッカラ イド間のオキシイミノ糖量結合により形成されたジサ・ツカライドの使用を報告 している。この結合の形成により、第一のカルボニル糖（ヘキソースまたはペン トース）が第二のＯ−アミノヘキソース糖と反応する。

オリゴヌクレオチドのリン主鎖に修飾を施すための有効な方法が限定されている ことから、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる診断、治療、および学術研究 のための、耐ヌクレアーゼ性および満足できるノ＼イブリント形成特性を付与す るであろう他の修飾法の開発が長年にわたって強く要望されている。

発明の目的 本発明の目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる診断、学術研究用試薬 、および治療に使用するためのオリゴヌクレオチド模倣体として機能する高分子 を提供することにある。

本発明の他の目的は、細胞内取り込みを高めたオリゴヌクレオチド模倣高分子を 提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、未修飾のアンチセンスオリゴヌクレオチドより高い 有効性を有するオリゴヌクレオチド模倣高分子を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、このようなオリゴヌクレオチド模倣高分子の合成法 および使用法を提供することにある。

本発明の属する技術分野の当業者にとっては、上記の目的および他の目的は、本 明細書および特許請求の範囲から明らかとなろう。

発明の要約 本発明はＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の活性を調節するために有用であり、一般 的にはオリゴヌクレオチド模倣高分子を含む組成物を提供する。高分子は多数の 結合されたヌクレオシドから構築されている。これらの高分子の構築においては 、野生型核酸にみられる糖リン酸主鎖のホスホロジエステル結合は、三および四 原子結合基に置き換えられている。そのような結合基は、あるヌクレオシドの３ ゛−炭素とその隣接したヌクレオシドの４′−炭素との間に、所望の原子空間配 置を保持している。本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子は、−重鎖または二 重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡのあらかじめ選定されたヌクレオチド配列と特異的 にハイブリッド形成することが可能な選定されたヌクレオシド結合配列を含む。

本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子は、都合よく固相または液相法により合 成され、ＲＮＡまたはＤＮＡのあらかじめ選定されたヌクレオチド配列に対して 相補的であるか、あるいは少なくともその配列と特異的にハイブリッド形成が可 能である。固相合或は市販品として入手可能な核酸合成機を利用して達成される 。そのような合成機を使用することは、妥当な長さをもった殆どすべての所望の オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド模倣体を生成させる上で有効であ ることが、当業者によって一般的に認識されている。

本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子はまた、野生型オリゴヌクレオチドの特 性を改良することが本分野で知られている殆どすべての修飾を含むことができる 。特に、本高分子は耐ヌクレアーゼ性またはハイブリッド形成を増加させること が知られている修飾を含むことができる。

本発明によれば、細胞内への取り込み、耐ヌクレアーゼ性、およびハイブリッド 形成特性を高めるように、かつＲＮＡの基本的な機能を停止させるための明確な 化学的または酵素仲介による事象を与えるようなアンチセンスオリゴヌクレオチ ド模倣体として機能する新規高分子が提供される。

ある種類のオリゴヌクレオチド模倣高分子が、治療にとって有用であり、かつ本 発明の他の目的に対して有用であることが見いだされた。本発明の高分子の少な くとも一部は構造１を有する： 構造１ 上記の構造式において、 Ｌ、またはＬｌの一つは０またはＳであり、かっＬｌまＩこはＬｌの他の−っは Ｎ−Ｒであり：Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であるか、またはＬ３はＣＨ ，であり、かつり、はＣＲ’Ｒ“°であり：またはＬ３またはり、の一つはＯま たはＳであり、かっＬ３またはり、の他の−っはＮ−Ｒであり；ＬｌおよびＬｌ は合わさってＣＨ，であるか、またはＬｌはＣＨ２であり、かつり、はＣＲ″Ｒ ”であり：またはＬｌまたはＬ４の一つはＯ，ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬｌ およびＬ４の他の一つはＣＲ’Ｒ”であり：ＬｌおよびＬ３はＣＨ２である：ま たはＬｌ、Ｌｌ、Ｌ３およびＬ４は一緒になってＯＮ＝ＣＨＣＨｚまたはＣＨ， −ＣＨ＝Ｎ−０であり；または ＬｌはＯであり、ＬｌはＮであり、Ｌ３はＣＨ，であり、かつり、はＣまたはＣ Ｈであり：およびＬｌ、Ｌ、およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはへ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成し；またはり、はＣまたはＣＨで あり：Ｌ２はＣＨ２であり、Ｌ３はＮであり；かっＬ４は。

であり；およびり、、Ｌ、およびＬ３は少な（とも二つの追加の炭素またはへテ ロ原子と一緒になって５または６員環を形成し：およびＲはＨ，Ｃ，からＣ１゜ の直鎖または分岐鎖の低級アルキルまたは置換低級アルキル：Ｃ２からＣＩｌ＋ の直鎖または分岐鎖の低級アルケニルまたは置換低級アルケニル：　Ｃ２からＣ １の直鎖または分岐鎖の低級アルキニルまたは置換低級アルキニル二重Ｃ含有低 級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣＨの置換または 非置換アルカリールまたはアラルキル、１４Ｃ含有の０７からＣＩ４のアルカリ ールまたはアラルキル；脂環式；複素環式；レポーター分子；ＲＮＡ切断基：オ リゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレ オチドの薬力学的特性を改良するための基であり：Ｒ′およびＲ１はＨであり： またはＲ″はＨでありかっＲ”は０−Ｒであり；またはＲ′およびＲ”は合わさ って＝０であり；ＸＩ；ＬＨ；ＯＲ；　Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；　Ｆ：ＣＩ　；Ｂｒ 　；ＣＮ；ＣＦ３；０ＣＦ３；ＯＣＮ；　５ＯＣＨ３；　５０２ＣＨ３；０ＮＯ Ｉ；ＮＯ２；　Ｎｓ：　ＮＨｌ：　ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカ リール：アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；レポーター 分子、ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための 基：またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり： ｎは０より大きな整数であり：および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である。

分子の残りの部分は、ＲＮＡまたは一重鎖または二重鎖ＤＮＡとのハイブリッド 形成を阻害しない（好ましくは促進する）化学官能基から形成されている。

ある好適な実施態様において、構造１の高分子は、ＬｌまたはＬｌの−っは０ま たはＳであり、かっＬｌまたはＬｌの他の−っはＮ−Ｒであり：Ｌ３およびＬ４ は合わさってＣＨ２であり、またはＬ３またはＬ４の一つは０またはＳであり、 がっＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり：およびＬｌおよびＬｌは合わさ ってＣＨ２である高分子を含んでいる。

本発明の別の好適な実施態様においては、Ｌ、またはＬ４の一つがｏ、ｓまたは Ｎ−Ｒであり、力りり、およびＬ４の他の一つはＣＲ’Ｒ”であり：およびＬｌ およびり、がＣＨ，である構造１の高分子が含まれる。

本発明のさらに別の好適な実施態様には、Ｌ、またはＬｌの一つがＯまたはＳで あり、かつり、またはＬｌの他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ、はＣＨｌでありかつ Ｌ４はＣＲ’Ｒ”であり；または、Ｌ３またはＬ４の一つが０またはＳであり、 かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；および、ＬｌはＣＨ２でありか っり、はＣＲ’Ｒ”である構造１の高分子が含まれる。

本発明のさらに別の好適な実施態様には、Ｌ、、Ｌｌ、Ｌ３およびり、が−緒に なってＯＮ＝ＣＨＣＨ２またはＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−０である構造１の高分子が含 まれる。

本発明のさらに別の好適な実施様態においては、Ｌ、はＯであり；ＬｌはＮであ り：Ｌ３はＣＨ，であり、かっＬ４はＣまたはＣＨであり；およびＬｌ、Ｌ３お よびＬ４は少な（とも二つの追加の炭素またはへテロ原子と一緒になって５また は６員環を形成する。または、Ｌ、はＣまたはＣＨ□であり；ＬｌはＣＨ，であ り：Ｌ。

はＮであり：かっＬ４はＯであり；およびり、、Ｌ、およびＬ３は少なくとも２ つの追加の炭素またはへテロ原子と一緒になって５または６員環を形成する、構 造１の高分子が含まれる。

本発明の特に好適な実施態様においては、構造１のＱはＯである。本発明の別の 特に好適な実施態様に従うと、構造１のＸはＯまたはＯＨである。本発明の別の 好適な実施態様に従うと、構造１に取り込まれている個々のヌクレオシドのＢｘ 基は、天然に存在するまたは合成のプリンおよびピリミジン複素環式塩基から独 立的に選択される。そのような複素環式塩基にはアデニン、グアニン、シトシン 、チミン、ウラシル、５−メチルノドシン、ヒポキサンチン、または２−アミノ アデニンなどが含まれるが、それらに制限されるわけではない。その他のそのよ うな複素環式塩基としては、２−メチルプリン、２．６−ジアミツプリン、６− メルカプトプリン、２．６−ジメルカプトプリン、２−アミノ−６−メルカプト プリン、５−メチルシトノン、４−アミノ−２−メルカプトピリミジン、２．４ −ジメルカプトピリミジン、および５−フルオロシトノンが含まれる。

本発明の特に好適な実施態様においては、Ｌ、が０またはＳであり、ＬｌがＮで あり、Ｌ３ｂ’Ｃｆｈテア’）、かっＬ４がＣ１１２またはＣＨｏＲであり、特 １：　Ｒ−ｂ＜　ｌ−Ｉ　Ｔある構造１の高分子が含まれる。本発明の別の特に 好適な実施態様に従うと、Ｌ４はＯまたはＳであり、Ｌ３はＮであり、ＬｌはＣ Ｈ２であり、かつり、はＣＨ２またはＣＨＯＲであり、特にＲはＨである。本発 明のさらに別の特に好適な実施態様に従うと、ＬｌおよびＬ３は両方ともＣＨ， であり、ＬｌまたはＬ４の一つがＮ−Ｒであり他方はＣＨ，である。

本発明の好適な実施態様においては、オリゴヌクレオチド模倣高分子は約２から 約５０のヌクレオシドサブユニット（即ち、ｎ＝約１−約４９）を含む。本発明 のオリゴヌクレオチド模倣高分子は、好ましくは治療投与のために医薬として受 容可能な担体中に含まれる。

上に引用したアルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、およびアラル キルＲ基の置換基には、ハロゲン、ヒドロキシル、ケト、カルボキシル、ニトレ ート、ニトライト、ニトロ、ニトロソ、ニトリル、トリフルオロメチル、Ｏ−ア ルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ−アルキル、アミノ、アジド、スルホキシド、スル ホン、スルファイド、シリル、インターカレーター、コンジュゲ−１−、ポリア ミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴヌクレオチ ドの薬物動態学的特性を改良するための基、およびオリゴヌクレオチドの薬力学 的特性を改良するための基が含まれるが、それらに制限される必要はない。一つ の特に好適なＲ基はＣＦ３である。典型的なインターカレーターおよびコンジュ ゲートには、コレステロール、リン脂質、ビオチン、フェナントロリン、フェナ ジン、フェナントロリン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ロー ダミン、クマリンおよび染料が含まれる。ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素お よびヨウ素が含まれる。本発明の文脈において薬物動態学的特性を改良する基に は、オリゴヌクレオチドの取り込みを促進し、分解に対するオリゴヌクレオチド の耐性を改良し、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリッド形成を強く するような基が含まれる。本発明の文脈において薬力学的特性を改良する基には 、オリゴヌクレオチドの取り込み、分布、代謝、または分泌を改良する基が含ま れる。

本発明はさらに、細胞系または生物と構造１を有するオリゴヌクレオチド模倣高 分子とを接触させることからなる細胞系または生物におけるタンパク質の生成ま たは活性を調節する方法を含む。

本発明はさらに、生物と構造１を有するオリゴヌクレオチド模倣高分子とを接触 させることからなる、タンパク質の望ましくない生成により特徴付けられる疾患 を持つ生物の処置法を含む。

本発明はさらに、核酸を含む試験溶液と構造１を有するオリゴヌクレオチド模倣 高分子とを接触させることからなる、配列特異的核酸のインビトロアッセイ法も 含む。

本発明はさらに、構造１の高分子のヌクレオシド前駆体、すなわち構造２を有す る前駆体： 構造２ （式中、 ＹｌはＯであり、Ｙ２はＨまたはＲ１′であり：およびＺはアミノオキシまたは フタルイミドオキシであり、または Ｙ、はＣＨ，でありＹ２はアミノオキシ、アルキルアミノ、アミノオキシアルキ ル、アルケニルまたはオキソアルキルであり：およびＺはＨ，ＯＨ，Ｏ−Ｒ”’ 、アミノ、メチレンアミノまたはフタルイミドであり： Ｒ″′はヒドロキシル保護基であり： ＸはＨまたはＯＨであり： ＱはＣＨ２または０であり、および Ｂｘは複素環式塩基部分である） を含む。

ある好ましい実施態様においては、ＹｌはＣＨ，であり：Ｙ２はアミノオキシ、 アルキルアミノ、ヒドロキシアルキル、アミノオキシアルキル、アルケニルまた はアルドアルキルであり、およびＺは１１、ＯＨまたはＯ−Ｒ”’である。別の 好ましい実施態様においては、Ｙ、はＯであり、Ｙ２はＨであり、および、Ｚは アミノオキシまたはフタルイミドである。

発明の詳細な説明 術語”ヌクレオシド”とは、複素環塩基および糖（一般的にはペントース糖）で 構成された単位を表している。天然に存在するヌクレオシドにおいては、複素環 塩基は典型的にはグアニン、アデニン、シトシン、チミンまたはウラシルである 。天然に存在するヌクレオシドにおいては、糖は通常チオキシリボース（即ち、 エリスローベントフラノノル）または、リポース（即ち、リポペントフラノシル ）である。アラビノ、キシロまたはりキソベントフラノシル糖またはヘキソース 糖を含む合成糖もまた知られている。本明細書を通して、ヌクレオシドまたは池 の核酸種の糖部分を引用する場合は、真の糖または野生型核酸の通常の糖部分を 置換した化学種を引用しているものと理解されたい。さらに、ヌクレオシドまた は他の核酸種の複素環部分を引用する場合、野生型核酸の一つまたはそれ以上の 通常の塩基部分が置換された天然、修飾または合成塩基を引用しているものと理 解されたい。さらに、糖量結合を引用する場合は、野生型核酸の様式で、糖また は糖置換部分をいっしょに連結させるために働く部分も含まれるであろう。

術語”ヌクレオチド”とは、その２′、３°　または５°糖ヒドロキシル基の一 つとエステル化されたリン酸基を持つヌクレオシドを表している。通常リン酸基 はモノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである。

術語”オリゴヌクレオチド”とは典型的には天然のホスホジエステル結合により 連結された天然に存在する塩基およびペントフラノシル糖から形成される特定の 配列の複数のモノホスフェートヌクレオチド単位を表している。ホモ−オリゴヌ クレオチドは同じ複素環塩基を持つヌクレオチド単位から形成されている、即ち ポリ（Ａ）。術語オリゴヌクレオチドは一般的に天然に存在するサブユニットか ら形成される天然に存在するおよび合成の化学種の両方を意味している。

術語”オリゴヌクレオチド類似体”とは種々の公開された特許出願明細書および その他の文献に使用されており、天然に存在しない部分を持つオリゴヌクレオチ ドと同様の分子種を意味している。この術語は変化させた糖部分、変化させた塩 基部分または変化させた糖量結合を持つオリゴヌクレオチド様分子を同定するた めに使用されてきた。従って、術語オリゴヌクレオチド類似体は、ホスホジエス テルスクレオンド間結合の代わりに使用されたホスホロチオエート、メチルホス ホネート、ホスホトリエステルまたはホスホロアミデートヌクレオシド間結合を 含む変化した糖量結合７グアニン、アデニン、シトシン、チミンまたはウラノル 以外のプリンおよびピリミジン複素環式塩基、および、βペントフラノシル立体 配置以外の配置を持つ糖、または、その２′位に置換基をまたは水素原子の一つ またはそれ以上に置換基を持つ糖を持つ構造を示すために使用されてきた。術語 ”修飾されたオリゴヌクレオチド”もまた、そのような構造を示すために文献で 使用されてきた。

本発明に関連して使用される術語”オリゴヌクレオチド模倣体”とは、オリゴヌ クレオチドと同様にまたはオリゴヌクレオチドの機能を”模倣して”機能するが 、天然に存在しない糖量結合を持つ高分子を表している。従って、オリゴヌクレ オチド模倣体は天然に存在しない糖量結合とともに、天然のまたは変化をうけた 、または天然に存在しない糖部分、および天然のまたは変化をうけた、または天 然に存在しない塩基部分を持っている。

本発明の目的のためには、非ホスホジエステル結合を持つオリゴヌクレオチド模 倣体は”オリゴヌクレオシド”または”オリゴヌクレオチド模倣高分子”とも考 えることができる。従って、術語オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド 模倣高分子は非リン酸含有結合基で結ばれれた複数の連結ヌクレオシドを表して いる。

さらに、術語”オリゴマー”はオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体 、オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド模倣高分子を包含するつもりで ある。従って、“オリゴマー”について説明する際には、天然ホスホジエステル 結合を介して、または本発明の結合を含む池の結合を介して一緒に連結されてい る一連のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に対しても言及がなされている ものとする。一般には、結合はある一つのヌクレオシドの３゛炭素から第二のヌ クレオシドの５゛炭素までである。しかしながら、術語”オリゴマー”はまた２ ′−５′結合または３’−４’結合のような池の結合も含むことができる。

アンチセンス療法とはＲＮＡまたはＤＮＡの相補的鎖への結合の目的でオリゴヌ クレオチドまたは池のオリゴマーを使用することである。結合後、オリゴヌクレ オチドおよびＲＮＡまたはＤＮＡ鎖は天然の二重鎖ＤＮＡと類似の様式で一緒に ”デユーブレックス”を形成していると考えられる。オリゴヌクレオチド鎖およ びＲＮＡまたはＤＮＡ鎖は天然の二重鎖ＤＮＡと同じ意味で相補鎖であると考え られる。そのような相補鎖において、個々の鎖は一つの鎖の複素環塩基の反対の 鎖の複素環塩基へのワトソン／クリックハイブリッド形成を可能にするようにお 互いが位置している。

アンチセンス治療は単核の原核生物および真核生物から多細胞の真核生物までの 範囲の多くの生物で実施できる。その遺伝的、代謝的または細胞制御の基本的部 分でＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−蛋白質翻訳を利用する生物はいずれも、 アンチセンス治療および／または予防に対して感受性がある。表面上、細菌、酵 母、原生動物、藻類、すべての植物および温血動物を含むすべての高等動物のよ うな多様な生物がアンチセンス治療により処置できる。さらに、多細胞真核生物 の細胞はそれらの細胞活性の肝要な部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写およびＲＮＡ −蛋白質翻訳の両方を含んでいるので、アンチセンス治療および／または診断が そのような細胞集団に対して実施できる。さらに、真核生物細胞の多（の細胞小 器官（例えば、ミトコンドリアおよびクロロプラスト）は転写および翻訳機構を 含んでいる。従って、単一細胞、細胞集団または細胞小器官もまたアンチセンス 治療および／または診断で処置できる生物の定義の中に含むことができる。本明 細書で使用される場合、治療とは疾患状態の根治、生物の殺傷（例えば、細菌、 原生動物その他の感染）、または異常なまたは有害な細胞増殖または発現の制御 を含むつもりである。

”オリゴヌクレオチド類似体”を利用する従来のアンチセンス療法は以下の米国 およびＰＣＴ特許出願の開示の中に例示されている：ＲＮＡ活性の検出および調 節するための組成物および方法と題され１９９０年１月１１日に出願された特許 出願筒４６３．３５８号、新規ヌクレオシド類似体と題され１９９０年８月１３ 日に出願された特許出願筒５６６、８３６号、遺伝子発現を検出および調節する 糖修飾オリゴヌクレオチドと題され１９９０年８月１３日に出願された特許出願 筒５６６、９７７号、新規ポリアミン複合オリゴヌクレオチドと題され１９９０ 年７月２７日に出願された特許出願第５５８．６６３号、遺伝子発現を検出およ び調節するヌクレアーゼ耐性ピリミジン修飾オリゴヌクレオチドと題され１９９ １年７月２７日に出願された特許出願第５５８．８０６号、主鎖修飾されたオリ ゴヌクレオチド類似体と題され１９９１年５月２１日に出願された特許出願第７ ０３゜６１９号、ＲＮＡ活性を検出および調節するための組成物および方法と題 され１９９１年１月１１日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１１０ ０２４３号：およびＲＮＡ模倣による遺伝子発現調節の試薬および方法と題され １９９１年３月１９日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１１０１８ ２２号（すべて本発明の譲受人に譲渡されている）。

上に引用した特許出願の開示内容はここに引例として包含されている。

上に引用した米国およびＰＣＴ特許出願に詳しく示されているように、オリゴヌ クレオチドおよびその他のオリゴマーは診断に、治療に、および研究試薬および キットとして応用される。治療に使用するために、オリゴヌクレオチドまたは他 のオリゴマーは処置が望まれている疾患状態を持つ動物（ヒトを含む）に投与さ れるであろう。

本発明はオリゴヌクレオチドと同様に機能し、しかもその他の有用な特性を示す ある種の高分子に関する。本明細書の実施例およびスキームに例示したように、 本高分子は基本的なヌクレオシドユニットから構築される。これらのヌクレオシ ドユニットは本発明の結合により連結されて二量体ユニットを生成する。二量体 ユニットはさらにヌクレオシドを加えることにより三量体、四量体およびその他 のより高い重合度の高分子へ拡大することができる。二量体ユニット（および／ またはより高い重合度のユニット）は本発明の結合以外の結合、例えば、通常の ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロアミデート結合、ホ スホトリエステル結合、メチルまたはその他のアルカリホスホネート結合、ホス ホロジチオエート結合などにより連結できる。

ある実施管様においては、本発明の高分子の形成のためのヌクレオシドの結合に 単一の結合が使用される。例えば（下記スキームＸ■において）、ｍおよびｒは ０であり、ｑは１であり、およびｎおよびｐは１より大きい。別の実施態様にお いては二つまたはそれ以上の異なった結合が使用される。例えば（スキームＸ） １において）、ｍおよび「はＯであり、ｑは１てあり、およびｎおよびｐは１よ り大きい。

する２、３またはそれ以上のヌクレオシドの群と一緒に連結される。活性化され たホスフィチル部分がこのユニットの３°末端に位置しており、除去可能なヒド ロキシル保護基を持つヒドロキシル部分が５°末端に位置している。ヒドロキシ ル保護基の除去およびヒドロキシル基と活性化されたホスフィチル基の反応に続 いて、ユニットは通常のホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはその他の リン結合により連結される。それ故、第１のユニット（本発明の第１の結合によ り連結された二つ、三つまたはそれ以上のヌクレオシドの群）および第２のユニ ット（本発明の第１の結合または第２の結合により連結された二つ、三つまたは それ以上のヌクレオシドの群）はリン酸結合により結合される。本高分子はヌク レオシドのさらなるユニット（本発明の第１、第２またはさらに別の結合により 連結されている）の添加により伸長される（存在する連結されたユニットにこれ らの追加のユニットをさらにリン酸結合により連結することにより）。以下に示 は８５のユニットと結合でき、または、これらの化合物の種々の組み合わせも種 々の高分子構造中に一緒に結合できる。下記スキームＸ■に例示したごと（、そ のような高分子においてはｒはＯまたは１であり、ｍは正の数であり、ｑは１よ り大きく、ｎおよびｐは正の数である。

スキーム■は他のスキームで保護基として使用された略号を示している。スキー ム１はさらに、糖ヒドロキシル上に一〇−ＮＨ２を発生させるためのＮ−ヒドロ キシルーフタルイミドおよびメチルヒドラジンを利用するミツノブ反応による３ ’　−０−アミノおよび３°　−０−メチレンアミノヌクレオシドの合成も示し ている。−〇−ＮＨ２基は次に一〇−メチレンアミノに誘導できる。これらの反 応は実施例１．２．３．５および１５に例示されている。

実施例１．２．３および５の反応は、３’　−０−ＮＨ２ヌクレオシドの改良合 成法を表している。糖上で一〇　−Ｎ　Ｈ２を形成する場合、理論的にはヒドロ キシルアミンで脱離基（例えばトンル基）を置換することにより可能である。し かしながら、Ｆｉｌｅｓ、　Ｌ、　Ｅ、　、　Ｗｉｎｎ、　Ｄ、　Ｔ。、　Ｓｖ ｅｇｃｒ、　Ｒ，Ｗ、　、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｍ、　Ｐ、　、■謔■bｚａｒ ｎｉｋ　［Ｊ、Ａ ａａ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　、　１４　：　１４９３（１９９２）］は、そ のような置換によっては所望の一〇−ＮＨ。

ではなく、−Ｎ　ＨＯＩ（が優勢的に生じることを示している。さらに、実施例 １．２．３および５の反応系列は欧州特許出願０３８１３３５号に例示されてい るものと比較して改良された合成法を表している。その特許出願の合成経路は出 発物質としてキノ口　ヌクレオシドを使用する必要がある。キン口　ヌクレオシ ドは実施例１．２．３および５て利用されるリホヌクレオシドのように容易に入 手できない。

スキーム■は４′−アルド　ヌクレオシドの５°−アルド　ヌクレオシドへの変 換を示している。この反応は実施例１６に例示されている。スキーム■は５゜− アルド　メヂル糖の生成を示している。これは実施例１４に例示されている。

スキーム■は５′　−ヨード　ヌクレオシドの形成を示し、これは実施例６に例 示されている。スキームＸおよび実施例１０で、二量体ユニットの末端ヒドロキ シル上での活性ヨード基の発生に同様の方法論が使用されている。スキーム■に おいて、ヨード　ヌクレオシドは、アロ置換ヌクレオシドを経て６′−アルド　 ヌクレオシドにさらに誘導化さ４する。これは実施例３１および３２に例示され ている。

スキームＶはスキーム］の一〇−メチレンアミノ　ヌクレオシドの５°　−アミ ノ　５゛　−ホモ　ヌクレオシドへのフリーラジカル反応を示している。これは 実施例３０に例示されている。スキーム■はオキシアミン　ホモ　ヌクレオシド （すなわち、６’　ＯＮＨ２５’　−ホモ　ヌクレオシド）合成のための５゛− ホモ　ヌク１ノオンドへのミツノブ反応の使用を示している。これは実施例３６ ．３７および３８に例示されている。スキーム■は６′−〇−アミノー５゛−デ オキシー５−ホモーヌクレオシドのアミノ部分のＮ−アルキル化を示している。

これは実施例□４３．４，４および４５に例示されている。アミノ部分が続いて チオールと反応させられるような場合にはそのようなＮ−アルキル化が望ましい 。そのような反応のＮ−アルキル化生成物は非アルキル化Ｓ−Ｎ結合よりも酸に 対してより大きな安定性を示す。この事はトリチル基の酸除去が普通実施される 固相法において特に有用である。しかしながら、液相合成のような池の合成方法 においてはこの事は問題にならないであろう。

スキーム■からＸ■は二量体、三量体およびその他のより高い重合度のオリゴヌ クレオシドの組立における、スキームＩから■までのヌクレオシドの使用を示し ている。スキーム■において、ヌクレオシド３および３１が酸触媒カップリング 反応により結合され各々二つのヌクレオシド間に一〇−ニトリロメチリジン結合 が形成される。この事は実施例１７に例示されている。三量化オリゴヌクレオシ ド３２はイミノメチレン結合に還元でき、それは次に実施例１８に例示されてい るごとく（メチルイミノ）メチレン結合にアルキル化できる。

スキーム■は、ヌクレオシド５へのヌクレオシド３の結合を示している。このス キームは、スキーム■に類似しているが、スキーム■においては四原子結合が作 られるのに対しスキーム■においては三原子結合が作られる。ヌクレオシド３お よび５は工程１において一〇−ニトリロ結合により結合され、その結合は工程２ において一〇−イミノ結合へ還元される。工程３でのアルキル化で−Ｏ−メチル イミノ結合とし、最終的に工程４で脱保護する。これらの工程は実施例４に例示 されている。工程３のアルキル化反応は二量体の５゛末端でｔ−ブチルジメチル シリル保護基を脱保護することにより達成される。この脱保護反応の利点は他の スキームにおいても利用されている。二量体の３′末端の保護に使用されたｔ− ブチルジフェニルシリル基の脱保護はテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオラ イドを使用することにより達成される。

アルキル化工程は高分子へその他の有用な官能分子の導入に使用できるであろう 。そのような有用な官能分子にはレポーター分子、ＲＮＡ切断基、オリゴヌクレ オチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬 力学的特性を改良するための基が挙げられるが、それらに制限されるわけではな い。そのような分子は主鎖結合窒素原子への結合を通して高分子へ結合または複 合できる。もしくはそのような分子は高分子の一つまたはそれ以上のヌクレオシ ドの糖部分の２″位から伸びる懸垂基に結合できる。そのようなその他の有用な 官能基の例は、改良された取り込みおよびその他の特性を持つ誘導化オリゴヌク レオチドと題して１９９１年１０月２４日に出願された米国特許出願第７８２． ３７４号（本出願のごとく同一の譲受人に譲渡されており、前に参照したその他 の特許出願とともにここに参照文献として含まれている）により提供されている 。

スキームＸはヌクレオシド間に均一な結合を持つ二量体、三量体およびその他の より高度なオリゴヌクレオシドの製造に使用される合成スキームを示している。

このスキームにおいては、実施例７に例示したように、ヌクレオシド１０および １２が連結されてイミノメチレン結合が形成される。スキーム■のアルキル化− ５′末端脱保護工程は、二量体１４の５′末端での保護基の除去にも有効に利用 される（実施例８）。スキーム■のヨード化反応を利用して、本二量体は次に５ ゛末端ヨ一ド中間体へ変換される（実施例１０）。次に、別の３’　−〇−メチ レンアミノヌクレオシドユニット１０が二量体に結合されて三量体が形成され（ 実施例１１）、続いて脱保護およびアルキル化される（実施例１２）。この反応 系列は任意の回数繰り返すことができ、より高度に重合したオリゴヌクレオシド が形成される。実施例９で二量体に、または実施例１３で四量体に対して例示さ れるように、オリゴヌクレオシドは３°末端が脱保護される。

スキームＸＩはヌクレオシドへ最初に連結される１−０−アルキル糖の使用を示 している。アルキル化および脱保護に続く還元により１−０−アルキル糖および ヌクレオシドを連結する一〇−（メチルイミノ）メチレン結合を得る（実施例１ ９に例示）。この構造体は次に実施例２０で例示されているように５゛末端が保 護される。完全に保護された連結糖−ヌクレオシド構造体は次にグリコジル化し て糖部分へ複素環式塩基を加え二量体ヌクレオシド構造を形成させる（実施例２ １）。グリコジル化後、５゛末端保護基を除去し、実施例２２に例示したように αおよびβアノマーをクロマトグラフィーにより分離して二量体を得る。この二 量体はスキームＸの方法に従ってさらに伸ばすことができる。スキームＸのＴ− Ｔ二量体に加えて、実施例２３．３４および２５はチミジン−メチル糖二量体へ のアデニン、ノドシンおよびグアニン塩基の添加によるＴ−Ａ、Ｔ−ＡおよびＴ −Ｇ二量体の生成を例示している。実施例２６．２７および２８はＡ−Ｔ、Ａ− Ａ、Ａ−Ｃ，Ａ−ＧｌＣ−Ｔ、Ｃ−ＡＳＣ−Ｃ，Ｃ−ＧＳＧ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ｇ− ＣおよびＧ−Ｇ二量体の生成を例示している。各々はスキームＸの方法に従って さらに伸長されるであろう。

スキームＸ■はぶら下がったヒドロキシル部分を持つ結合を生成するラジカル反 応を示している。これは実施例３３に例示されている。ぶら下がったＯＨ基はモ ファット酸化条件を用いて＝０へ酸化できる。もしくは、ぶら下がったＯＨ基は 連結部の窒素原子と環化でき５または６員の複素環を形成する。６原子環を含む 結合の形成は実施例３４に例示されている。５原子環はＮｅｕｍｅｙｅｒ、　Ｊ 、　Ｌ、　＆　Ｂｏｙｃｅ、　Ｃ，Ｂ、　、　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　、 　３８：２２９１（１９７３）が使用した条件と類似の条件（トルエン中トリエ チルアミンまたはジエチルフェニルアミンのような塩基の存在下、約６０から約 ８０℃の温度でホスゲンを加える）を利用して形成されるであろう。

スキームＸ■はイミノオキシメチレン結合の形成を示している。実施例３５は５ °　−０−トリチル保護キシロ出発ヌクレオシドの製造を記載しており、実施例 ３９は化合物５０と化合物５４の反応による二量体ユニットの生成を記載してい る。スキームＸ■では続いて、固体支持体建造ブロック（実施例４０）として使 用できる二量体ユニットを製造するために、主鎖窒素原子がアルキル化され、続 いてトリフルオロ酢酸により５’　−０−トリチルおよび３’　−０−（ｔ−プ チルジフェニルシリル）保護基の両方が同時に除去される。５゛　−末端ヒドロ キシル基はジメトキシトリチルで保護され（実施例４１）、続いて活性ホスホロ チオエートニ量体が生成される（実施例４２）。

スキームＸｒＶはチオール中間体の製造および、アミノヌクレオシドとともにＳ −イミノメチレン結合を形成させるためのその中間体の使用を示している（実施 例４５）。スキームＸ■の反応とともに、活性ホスホロアミデート部分を持つ二 量体ユニットが形成できる。この事は実施例４６および４７に例示されている。

スキームＸ■はヌクレオシド中間体の製造およびその中間体の別のヌクレオシド への結合（実施例４８に例示されているように）によるニトリロ−１，２−エタ ンジイル結合の形成を示している。この結合は実施例４９に例示したごとくイミ ノ−１，２−エタンジイル結合へ還元できる。さらに、スキームＸｖは実施例５ ０．５１および５２に例示しているごとく活性ホスホロアミデート化学種の製造 を示している（スキームＸ■およびＸＩＶと類似の方法による）。

スキームＸＶＩは２°置換ヌクレオシドの製造（実施例５３）、およびその２′ 置換ヌクレオシドの活性結合形成部を持つ別のヌクレオシドへの変換（実施例５ ４）を示している。この２゛置換ヌクレオシドの別のヌクレオシドへの結合（実 施例５５）は、続いて活性ホスホロアミデートへ変換される（実施例５６）。上 に示したごとく、本発明の高分子中の２°位の置換は他の分子の導入（レポータ ー分子、ＲＮＡ切断基、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するため の基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基、ならびに ０、ＳおよびＮＨアルキル、アラルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニ ル、アルキニルおよびこれらの基の１４Ｃ含有誘導体、ＦＳＣｌ、Ｂｒ、ＣＮ。

ＣＦ３．０ＣＦ３、ＯＣＮ　１ＳＯＣＨｓ、Ｓ　Ｏ２ＣＨｓ、０ＮＯ２、Ｎｏｔ 、Ｎ３、ＮＯ３、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノア ルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリルなどの導入が挙げられるがこれ らに制限されるわけではない）に有用である。

スキームＸＶＩでさらに示されているものは、炭素環式ヌクレオシドの製造（実 施例５７）、本発明の結合を経るその炭素環式ヌクレオシドと別のヌクレオシド の結合（実施例５８）、および活性ホスホロアミデートの生成（実施例６３）で ある。スキームＸ■にはさらに別の反応系列も示されており、炭素環式ヌクレオ シドはその２°位が誘導体化され（実施例６０）、別のヌクレオシドへ変換され る（実施例６１）。このスキームの別の反応のように、二量体が最初に形成され （実施例６２）、次に活性ホスホロアミデートで誘導化される（実施例６３）。

３′ホスホロアミダイト部分を持つこのスキームの二量体は、ホスホジエステル 、ホスホロチオエートまたはその池の類似のリン酸に基づく結合による本発明の オリゴヌクレオシドの別のヌクレオシドへの連結に使用される。

スキームＸ■は別の炭素環式含有二量体ヌクレオシドを示している。ヌクレオシ ド間変換が実施例６４および６５に例示されており、二量体構造の形成が実施例 ６６に例示されている。スキームＸ■の二量体構造は、二量体の５°　ヌクレオ ノドとしての炭素環式ヌクレオシドを示しており、一方スキームＸＶＩは二量体 の３′　ヌクレオシドとしての炭素環式ヌクレオシドを示している。別の反応ス キームで記載したような様式で両方のヌクレオシド中間体として炭素環式ヌクレ オシドを使用すると、３°および５°位の両方に炭素環式ヌクレオシドを持つ二 量体を得る。

スキームＸ〜１は前のスキームのヌクレオノドおよびオリゴヌクレオシドから製 造される一般構造を示している。典型的な本発明の高分子は、固体支持体合成お よび液相合成の両方について実施例６８に記載されている。

ＳＣＨＥＭＥ　１ ２９ｅｘ＝グアニン　２６日。よグアニンＳＣＨＥＭＥ　ＩＩ ＳＣＨＥＭＥ　ｌ　ｌ　Ｉ ＳＣＨＥＭＥ　ＩＶ ４フ ＳＣＨＥＭＥ　Ｖ ＳＣＨＥＭＥ　ｖ＋ ＳＣＨＥ）、ＩＥ　１１ ＳＣ）−ＩＥＭＥ　Ｖｌ　ｌ　１ ＳＣＨＥＭＥ　ＩＸ ＳＣＨＥＭＥ　× ｎ＝　１．１６　ｎ＝３　、２０ ＳＣＨＥＭＥ　Ｘ　ｌ　ｌ　！ ５ＣＨＥｌｖｌＥ　ＸＩＶ ＳＣＨＥＭＥ　ＸＶ ＳＣＨＥＭＥ　Ｘ１ フ３Ｑ＝Ｏ，Ｘ　：ＯＨフ４　０：Ｏ，ｘ＝ｏ−ｃ）（。

）６　０＝Ｏ，ｘ＝ｏ−ｃ）（、フッ　○＝　ｏ、ｘ　：　０−ＣＨコＳＣＨＥ ＭＥ　ＸＶＩ　ｌ ■ Ｔ日Ｏρ５１−０ ＳＣＨＥＭＥ　ＸＶＩ　Ｉ　Ｉ ９０、　９１ 実施例１ ９９０）の方法により製造される、乾燥ＴＨＦ溶液（７５０ｍｌ）］にトリフェ ニルホスフィン（１７，２８ｇ、６６ミリモル）およびＮ−ヒドロキシフタルイ ミド（１０，７４ｇ、６６ミリモル）を加えた。溶液を０℃に冷却し、窒素下撹 拌しなから３時間以上かけてジイソプロピルアゾジカルボキシレート（１５，１ ニア５ミリモル）を加えた。反応混合物は次に室温で１２時間撹拌した。反応４ を蒸発させ残渣をＣＨ２Ｃ１ｇ　（７５０ｍｌ）に溶解し飽和Ｎ　ａ　ＨＣＯ３ （２００ｍ１）および水（２００ｍｌ）で抽出し、乾燥ｉ＆（ＭｇＳＯ３）濾過 し濃縮すると黄色油状残渣を得た。残渣のシリカゲルカラムクロマトグラフィー を行うと（１００％ヘキサン、次にヘキサン・Ｅｔ２０．９０％Ｅｔ２０までの 濃度勾ｒ−２）。

コｒ 元素分析　Ｃ２４Ｈ３１Ｎ３０７Ｓｉとして：計算値：Ｃ，５７，４６；Ｈ，６ ，２３ＩＮ、８．３７；実測値：Ｃ，５７，２０；Ｈ，６，２６；Ｎ、ｓ、２７ ゜５°−０−（ｔ−ブチルジメチルノリル）−３°　−０−フタルイミドチミジ ン（７，４，６ｇ、９．１８ミリモル）の乾燥ＣＨ２Ｃ１２（６０ｍ　ｌ　）溶 液に５−１０℃にて撹拌しながら冷メチルヒドラジン（１，６ｍｌ、３０ミリモ ル）を加えた。１０分１１．２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２−メチル−１− オキソフタリジンの白色沈澱が生じた。懸濁液は室温で１時間撹拌した。懸濁液 を濾過し、沈澱をＣＨ２Ｃｌ２　（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。合併した濾液を 濃縮し、残渣はンリカゲルカラムクロマトグラフイーにより精製した。ＣＨｚＣ Ｉｚ：ＭｅＯＨ（１００：０→９７：３、ｖ　／　ｖ　）で溶出させると白色固 形物として表記化合物を得た（３．３０ｇ、１００％）。ＣＨ２Ｃｌ２から再結 晶して白色針状晶を得た、ｍｐ１７１℃；Ｉ）ｌ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）δ領　 ０５　［Ｓ、６．　（ＣＨ３）２］、０．９０　［ｓ、　９．　（ＣＨ３）　３ ］　、２．２２　２．５８　（２ｍ、　２．２°Ｃ旦２）　、３．９　４．　０ ８　（ｍ、３．　５’　ＣＨ２，および　３′旦）　、４．　３０　（ｍ。

元素分析　Ｃｌ６Ｈ２９Ｎ３０５Ｓｉとして、計算値：Ｃ，５１，７２；Ｈ，７ ，８７；Ｎ、１１．３２；実測値：Ｃ，５１，８７：Ｈ，７，８１：Ｎ、１１． 　３２゜３°　−Ｏ−アミノ−（ｔ−ブチルジメチルノリル）チミジンは（Ｂｕ ）４ＮＦ／ＴＨＦによる標準法により脱保護されて化合物」を得る（７２％）。

エーテル／ヘキサン／エタノールから結晶化させると細かい針状晶として得られ る、ｍｐ８１℃。’ＨＮＭＲ（Ｍｅ２ＳＯｄｏ）δ　１．　７８　（ｓ、３．　 ＣＨｓ）　、２゜１７　および　２．４５　（２ｍ、２．２’　Ｃ旦ｚ）　、３ ．７０　（ｍ、　２．５°Ｃ旦２）　、３．８８　（ｍ、１．４’旦）　、４． 　１６　（ｍ、１．３’旦）、４．８（ｂｒｓ、１．　５°　ＯＨ）、６．　０ ５　（ｄｄ、１．　１’旦）、６．２（ｂｒ　ｓ。

元素分析　Ｃ１ｇ　ＨＩ　Ｓ　Ｎ　３０．として：計算値：Ｃ，４６，６９；Ｈ ，５，８７；Ｎ。

１６．３３＋実測値：Ｃ，４６，５５；比　５．　９１　；Ｎ、１６．　２１゜ 実施例４ ３′−〇−デホスフィニコー３’　−０−（メチルイミノ）チミジリルー（３° →５’　）　−５’−デオキシチミジン、９５ミリモル）、３’　−０−（ｔ− ブチルジメチルシリル）チミジン−５゛　−アルく調製された］およびＡｃＯＨ （０，２５ｍ１）のＣＨ，ＣＩ、（５０ｍｌ）溶液を室温で２時間撹拌した。減 圧下濃縮すると中間体オキシム連結二量体、化合物工程１で得られた残渣をＡｃ ＯＨ（２５ｍｌ）に溶解した。撹拌ＡｃＯＨ溶液に室温でＮａＣＮＢＨ３（１， ５５ｇ−２５ミリモル、３回にわけて）を加えた。

工程２の撹拌反応混合物に室温でＨＣＨＯ水溶液（２０％、２ｍｌ、６６ミリモ ル）および追加のＮａＣＮＢＨ３（１，５５ｇ１２５ミリモル、３回にわけて） を加えた。２時間後溶液をＥｔＯＨ（１００ｍｌ）で希釈し、生じる懸濁液を減 圧上蒸発させた。残渣をｃＨ，ｃ１２（１５０ｍｌ）に溶解させ、つぎに領　Ｉ ＭＨＣＩ　（１００ｍｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍｌ）および水（ ２ｘ５０ｍｌ）で連続的に洗浄した。乾燥（ＭｇＳＯ＜）ＣＨｚＣＩ２溶液を蒸 発させ工程３の残渣をＴＨＦ　（３０ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌しながら（Ｂ ｕ）４ＮＦ（ＬＭ　ＴＨＦ溶液、１０ｍ１）を加えた。１時間後反応混合物を減 圧上蒸発させ、残渣は短いカラムクロマトグラフィーにより精製した。ＣＨ２Ｃ ｌ２：ＭｅＯＨ（８：　２、ｖ／ｖ）で溶出された適当な分画を集め、蒸発させ ると化合物ｍ、　６．５°Ｃ旦２．４’　ＣＨ，３’　Ｃ旦）、４．７５　およ び　５．３　（２１（ｔ、１．　１’旦）、７．４　および　７．　４５　（２ ｓ、２．２Ｃ＊旦）。

５°　−０−（ｔ−ブチルジメチルノリル）−３°　−デオキシ−３°−［（メ チレフ、４２ｇ、２０ミリモル）の乾燥ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）溶液を撹拌しな がら室温でＨＣＨＯ（２０％水溶液、１　ｍ　ｌ　）溶液を滴加した。６時間後 さらにＨＣＨＯ（２０％水溶液、１．５ｍ１）を追加し撹拌を１６時間続けた。

得られた溶液は減圧上蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより精 製すると化合物上りを透明な泡状物として得た（７．２５ｇ、９５％）。ＩＨＮ ＭＲ（ＣＤＣ１ｘ）６０．１　［ｓ、　３．　（ＣＨｚ）　２］　、　０．９　 ［ｓ、　９．　（ＣＨｚ）　ｓ］　。

１、　９（ｓ、３．　ＣＨ３）、２．　２５　２．　７２（ｍ、２．　２’　Ｃ Ｈｚ）、３．　８５−４．　１５　（２ｍ、　３．５’　ＣＨ２，４゛旦）　、 　４．８５　（ｍ、１．３’旦）。

旦２）　、　７．４３　（ｓ、１．６旦）、　９．２　（ｂｒ　ｓ、ＩＨ旦）。

実施例６ ３°　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５゛　−デオキシ−５°　−ヨ ートチ９８２）の方法に従って製造された］の乾燥ＤＭＦ　（３７５ｍｌ）溶液 を撹拌しながらアルゴン下室温でメチルトリフエノキシホスホニウムアイオダイ ド（１２，１２ｇ、３２ミリモル）を加えた。溶液は１６時間撹拌した。減圧下 ＤＭＦを除去し、残渣はＣＨ，ＣＩｔ　（５００ｍｌ）に溶解した。有機層を２ ０％Ｎ　ａ　２　Ｓ　１０３水溶液（２００ｍｌ）　、水（２ｘ２００ｍｌ）で 洗浄し乾燥した（Ｍ　ｇ　Ｓ　０４）。

溶媒を蒸発させシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。ＥｔｉＯ・ヘキ サン（１：１、Ｖ　／　Ｖ　）で溶出し、適当な分画を集めて濃縮すると化合物 旦を白色粉末として得た（７．８７ｇ、６４％、ｍｐ１４２℃）。

元素分析　Ｃ２６Ｈ３１Ｎ２０４Ｓｉ　Ｉとして；計算値：Ｃ，５２，８８；Ｈ ，５，２９：Ｎ、４．　７４　：　Ｉ、２１．　３３　；実測値：Ｃ，５２，８ ６；Ｈ，５，２１；Ｎ、４．６６；　ｒ、２１．５４゜ 実施例７ ５’−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル”）　−３’−０−デホスフイニコ−３ ゛−〇−（イミノメチレン）チミジリル−（３゛→５°）−３’−０−（ｔ−ブ チルジフェニルシリル）−５′−デオキシチミジン、１３５’　−０−（ｔ−ブ チルジメチルシリル）−３°　−デオキシ−３°−［（メチレンアミノ）オキシ ］チミジン（１旦、１．６２ｇ、４．２３ミリモル）、３゛−０−（１−ブチル ジフェニルシリル）−５゛　−デオキシ−５゛　−ヨードチミジン（ヨλ、２． ５ｇ、４．２３ミリモル）、ビス（トリメチルスタニル）ベンゾビナコレート［ ４，８４ｇ、８．４６ミリモル、Ｈｉｌｌｇａｒｔｎｅｒ、　Ｈ；Ｎｅｕｍａｎ ｎ、　Ｗ、　Ｐ、　；５ｃｈｒｏｅｄｅｒ、　Ｂ、　、　Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎ ｎ、　Ｃｈｅｗ、　、　５８６−５９９（１９７５）の方法に従って製造された ］の乾燥ベンゼン（９ｍｌ）溶液を注意深く３回脱気しくアルゴンでフラッシュ して）、８０℃で８時間加熱した。反応混合物を冷却し、減圧下濃縮し、残渣を シリカゲルクロマトグラフィーニより精製した。ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｃＯＨ（９７ ：３、Ｖ／Ｖ）で溶出された適当な分画を集めて濃縮すると二量体オリゴヌクレ オシド、化合物１３を白色泡状物として得た（１．２５ｇ、３５％）。ＩＨＮＭ Ｒ（ＣＤＣｌ２）６０．０９　および　０．　１３　［２ｓ、　６．　（ＣＨ３ ）２］、０．８実施例８ ３′−〇−デホスフィニコー３’　−０−［（メチルイミノ）メチレンアミジリ ル−（３゛　→５”）　−３“　−〇−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５° 　−デオキシチミジン、１４ 方法Ａ イミノ窒素のＮ−アルキル化および二量体の５′　ヌクレオシドの５゛　シリル 保、　２．５６　（ｓ、　３．　Ｎ−ＣＨ３）、　４．７７　（ｂｒ　ｓ、１． ５”　ＯＨ）、６゜ｏ、ｐｈ　旦）、９．　０５　（ｂｒ　ｓ、２．　２　ＮＨ ）およびその他のプロトン。

実施例９ ３′−〇−デホスフィニコー３’　−０−［（メチルイミノ）メチレンアミジリ 程４の方法により除去され完全に脱保護された二量体オリゴヌクレオシド、化合 ヨード−５゛　−デオキシチミジンル−（３゛　→５°）−３’　−０−（ｔ− ブチル能基および残りの３゛位に保護基を持つ表記二量体オリゴヌクレオシド、 化合物実施例１１ ５’−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３°　〜０−デホスフィニコー３゛ −〇−（イミノメチレン）チミジリルー（３°→５’　）　−３°　−０−デホ スフィニコ−３’−０−［（メチルイミノ）メチレン］−５′　−デオキシシチ ジリルーを化合物１旦と反応させると三量体オリゴヌクレオシド、化合物１ユを 得る。

実施例１２ ３′−〇−デホスフィニコー３°　−０−［（メチルイミノ）メチレンアミジリ ル−（３゛　→５’　）　−３’　−０−デホスフィニコ−３’　−０−［（メ チルイミノ）メチレン］−５′−デオキシチミジリル−（３゛→５°）−３’　 −０−（ｔ−ブるであろう。

実施例１３ ３゛−Ｏ−デホスフィニコ−３’−０−［（メチルイミノ）メチレン］チミジリ ルー（３’−５”）−３’　−０−デホスフィニコ−３’　−０−［（メチルイ ミノ）メチレン］−５゛　−デオキシチジリルー（３’　−＋５”）　−３’　 −０−デホスフィニコ−３’　−０−［（メチルイミノ）メチレン］−５°　− デオキシシチジリル伸長させるため実施例１０．１１および１２を連続的に繰り 返す。四量体オリゴた。

実施例１４ 一〇−シリル化すると、７０％の総収量でメチル　３−０−　（ｔ−ブチルジメ チルシリル）−２−デオキシ−５−０−トシル−α／β−Ｄ−エリスローベント フラノシドを得た。この化合物をヨード化し、続いてシアノ化すると対応する５ −の製造と類似の様式で製造された３′−〇−アミノー２°−デオキシアデノシ ン５°位がｔ−ブチルジメチルシリル基で保護され、対応する３゛−〇−アミノ ー５’−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−２°−デオキシアデノシン、３’　− ０−アミノ−５°　−（１−ブチルジメチルシリル）−２゛　−デオキシシチジ ンおよび３′−〇−アミノー５’−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−２°　−デ オキシグアノシン　ヌクレオシド中間体が得られた。保護された中間体を実施例 ５の方法または欧州特許出願０　３８１　３３５号の製造例４の方法により処理 すると対応する５°　−０−（１−ブチルジメチルシリル）　−２’　、３°　 −ジデオキシ−３゜−［（メチレンアミノ）オキシ］アデノシン（化合物２７） ；５°−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−２°、３′−ジデオキシ−３’− ［（メチレンアミノ）オキシ］ンチジン（化合物λ旦）；および５’　−０−（ ｔ−ブチルジメチルシリル）−２’　、３°−ジデオキシ−３’−［（メチレン アミノ）オキシ］グアノシ３’−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジン −６°−アルデヒド、３１表記化合物はＢａｒｔｏｎ、Ｄ、Ｈ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ 、、Ｔｅｔ、　１．ｅｔｔｓ、、３０：４９６９（１９８９）の方法を利用して 、前記の３°−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）チミジン−５′−アルディッ ヒ反応により処理される。得られたエノールエーテル（化合物１旦）はＮｉｃ。

Ｃ）２．ＫＩ、Ｈ２ＣおよびＴＨＦにより加水分解して化合物呈上を得る。

実施例１７ ５°−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）　−３’　−０−デホスフィニコ−３ ′　−〇−にトリロメチリディン）チミンリル−（３゛　→５°）−３’　−０ −（ｔ−により製造され、オキシム結合を持つ二量体オリゴヌクレオノドが得ら れる。

実施例１８ が得られるであろう。

糖およびヌクレオシドをオキシム結合によりカップルさせるため実施例４、工程 １の方法を利用して化合物λ旦および化合物旦が連結された。得られたオキシム 結合は実施例４、工程２の方法を使用してイミノメチレン結合に還元され、こら れるであろう。

塩化ベンゾイルで処理されて遊離５°　−ヒドロキシルがベンゾイル化され、そ れ実施例２１ ５′　−ベンゾイル−３″−〇−デホスフィニコー３’−０−［（メチルイミノ ）化合初刊」をアセトニトリル−トルエン中、ジベンゾ−１８−クラウン−６お よびヨウ化カリウムを利用するＢａｕｄ　ｅｔ、　ａｔ、　、　Ｔｅｔ、　Ｌｅ ｔｔｓ、　、　３１　：４４３７（１９９０）の方法の従ってシリル化チミンと 反応させ、５°　−〇−ベンゾイルー３’　−０−デホスフィニコ−３’　−０ −［（メチルイミノ）メチレン］チミジリル−（３°→５゛）−３−０−（ｔ− ブチルジフェニルシリル）−５″　−デオキシチミジン（化合物３゛−０−デホ スフィニコ−３′　−Ｏ−Ｃ＜メチルイミノ）メチレン］チミジリルー（３°→ ５’　）　−３’　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５゛　−チオ化合 物３５をメタノール性アンモニアで処理しても化合物上Ａが得られるであろう。

実施例９の方法によりさらに処理すると完全に脱保護された二量体が得られ、そ れからクロマトグラフィーによりアノマー的に純粋な化合物が得られるであろう 。

実施例２３ ３°　−０−デホスフィニコ−３’　−０−［（メチルイミノ）メチレン］チミ ジリルー（３゛→５”）　−３’　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５ ゛　−デオキシアデノシン、３６ 化合物３４をアセトニトリル−トルエン中、ジベンゾ−１８−クラウン−６およ びヨウ化カリウムを利用するＢａｕｄ　ｅｔ、　ａｔ、　、　Ｔｅｔルｅｔｔｓ 、　、　３１　：４４３７（１９９０）の方法の従ってシリル化アデニンと反応 させる。メタノール性アンモニアでベンゾイル基を除去し、クロマトグラフィー による分離により３゛−０−デホスフィニコ−３’−〇−［（メチルイミノ）メ チレン］チミジリルー（３゛　→５’　）　−３’　−れるであろう。

実施例２４ ３’　−〇−デホスフィニコー３°−０−［（メチルイミノ）メチレン］チミジ リル−（３′→５°）−３’−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５°−デ オキシチミン、３７ 化合物１戟をアセトニトリル−トルエン中、ジベンゾ−１８−クラウン−６およ びヨウ化カリウムを利用するＢａｕｄ　ｅｔ、　ａｌ、　、　Ｔｅｔ、　Ｌｅｔ ｔｓ、　、　３１　：４４３７（１９９０）の方法の従ってシリル化シチジンと 反応させる。メタノール性アンモニアでベンゾイル基を除去し、クロマトグラフ ィーによる分離により３’　−０−デホスフィニコ−３’　−０−［（メチルイ ミノ）メチレン］チミジリルー（３′→５°）−３°　−るであろう。

実施例２５ ３°　−０−デホスフィニコ−３°−０−［（メチルイミノ）メチレン］チミジ リル−（３゛→５°）−３°−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５°−デ オキシグアノシン、３８ 化合物１迭をアセトニトリル−トルエン中、ジベンゾ−１８−クラウン−６およ びヨウ化カリウムを利用するＢａｕｄ　ｅｔ、　ａｔ、　、　Ｔｅｔ、　Ｌｅｔ ｔｓ、　、　３１　：４４３７（１９９０）の方法の従ってシリル化グアニンと 反応させる。メタノール性アンモニアでベンゾイル基を除去し、クロマトグラフ ィーによる分離により３゛−ｏ−デホスフィニコー３’−０−［（メチルイミノ ）メチレン］チミジリルー（３°→５°）　−３’　−０−（ｔ−ブチルジフェ ニルシリル）−５゛−デオキシグアノシン、３８が得られるであろう。

実施例２６ 実施例１９および２０の方法と類似の様式で実施例１５の５°−（ｊ−ブチルジ メチルノリル）　−３’　−０−アミノアデノシン中間体と化合物３を反応させ ると化合物３３と等価な連結されたヌクレオシド−糖化合物（式中、Ｂｘｉはア デニンである）が得られるであろう。連結されたヌクレオシド−糖中間体は次に 実施例２１．２３．２４および２５の方法により反応させ、おのおの化合物上」 の構造と等価な構造のＡ−Ｔ、Ａ−Ａ、Ａ−ＣおよびＡ−Ｇ二量体（式中Ｂｘｉ はおのおのチミン、アデニン、シトシンおよびグアニンである）が得られるであ ろ実施例１９および２０の方法と類似の様式で実施例１５の５°−（１−ブチル ンである）が得られるであろう。連結されたヌクレオシド−糖中間体は次に実施 例２１．２３．２４および２５の方法により反応させ、おのおの化合物上」の構 造と等価な構造のＣ−Ｔ、Ｃ−ＡＳＣ−ＣおよびＣ−Ｇ二量体（式中Ｂｘｉはお のおのチミン、アデニン、シトノンおよびグアニンである）が得られるであろう 。

実施例１９および２０の方法と類似の様式で実施例１５の５°−（１−ブチルニ ンである）が得られるであろう。連結されたヌクレオシド−糖中間体は次に実施 例２１．２３．２４および２５の方法により反応させ、おのおの化合物１４の構 造と等価な構造のＧ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ｇ−ＣおよびＧ−Ｇ二量体（式中Ｂｘｉはお のおのチミン、アデニン、シトシンおよびグアニンである）が得られるであろ実 施例２１．２３．２４．２５．２６．２７および２８の二量体は実施例１０．１ １および１２のループを形成する一連の反応を使用して実施例５および１５の５ ’−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３゛　−デオキシ−３°−［（メチレンア ミノ）オキシ］ヌクレオシド（化合物１０．２７．２８および２９）と反応させ ることにより伸長されて三量体が形成される。この反応系列ループの反復は、反 応系列ループの各々の反復当たり成長するオリゴヌクレオシドへさらなるヌクレ オシドをつけ加える。オリゴヌクレオシドを所望の”ｎ＋１”の長さに伸ばすた め、実施例１０．１１および１２の反応系列ループが”ｎ”回繰り返される最終 的な３′−保護オリゴヌクレオシドが実施例９の方法により処理されると末端３ ′　−〇−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）保護基が除去され選定されたヌクレ オシド配列および長さの完全に脱保護されたオリゴヌクレオシドが得られるであ ろう。

゛−ジデオキシー５°−ホモグアノシン、４５（分子内フリーラジカル反応を経 （１９７０）の方法によりメチルトリフエノキシホスホニウムアイオダイドで処 理することによりヨード化され５′　−デオキシ−５°−ヨード−３′−〇−メ チレンアミノチミジン（化合物並）が得られる。化合物ＵはＣｕｒｒａｎ、　Ｄ 、　Ｐ、　、ラジカル付加反応、Ｉｎ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｏｒｇａ ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｔｒｏｓｔ、　Ｂ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｆｒｅｍｉ ｎｇA　１．　、　Ｅｄｓ。

、ｖｏｌ、４．　ｐ７１５−８３２．Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏ ｒｄ（１９９１）の方法に従った分子内ラジカル反応を行うと対応する３’　− 〇−イソオキサゾリジンチミジン（化合物４１）を与え、それはＤＩＢＡＬ−Ｈ 還元により６゛−アミノ−５゛−ホモチミジン、体得られるであろう。

れるであろう。

３°　−０−（ｔ−ブチジフェニルシリル）−５′　−デオキシ−５°−ヨード チミジン（↓７．１．７７ｇ、３ミリモル）、アリルトリブチルスズ（２，９７ ｇ。

９ミリモル）およびＡＩＢＮ　（０，５４ｇ、３．３ミリモル）の乾燥トルエン （３０ｍｌ）溶液を撹拌し、完全に脱気して６５℃に６時間加熱した。溶液を冷 却し、真空上濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製 し、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ（１：１、Ｖ／Ｖ）で溶出すると表記化合物が均質な 物質として得られた。適当な分画を集めて蒸発させると４６　（０，７５ｇの泡 状物質、５０％の収率）が得られた。構造は’ＨＮＭＲにより確認された。

旦（１ミリモル）　、０８０４　（０，１ミリモル）およびｎ−メチルモルホリ ンオキシド（２ミリモル）のジエチルエーテル（４ｍｌ）および水（２ｍｌ）溶 液を室温で１８時間撹拌した。Ｎａ１Ｏ４溶液（３ｍｌ）を加え、反応液はさら に１２時間撹拌した。水層をジエチルエーテルで抽出する。有機層を蒸発させる ５’　−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３°　−〇−デホスフィニコー３ ′−〇−（イミノメチレン）チミジリル−（３′→５°）−３’−０−（ｔ−ブ チルジフェニルシリル）−５′　−デオキシ−５“−ヒドロキシチミジン、４８ ）ｌａｎａａ＋ｏｔｏ、　Ｔ、および　Ｉｎａｎａｇａ、　Ｊ、　、　Ｔｅｔ、 　Ｌｅｔｔｓ、　、　３２：３５５５（１９９１）の方法を■pし、 ＳｍＩ！（領　１ミリモル）のＴＨＦ　（３ｍｌ）溶液をを化合物足および化合 物１旦のＨＭＰＡ溶液に撹拌しながら加えた。付加体を形成させるため（脱色に より検出される）、混合物は室温で約１５分間されるであろう。溶媒を除去し、 残が得られるであろう。

実施例３４ ３′−〇−デホスフィニコー３’　−０−［Ｎ−（モルホリン−２−イル）］チ ミジリルー（３゛→４’　）　−３’　−０−（ｔ−ブチルジフェニルシリル） −５’−よびＰａｎ、　Ｙ、　−Ｇ、　、　Ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ、　２０３　ＡＣ３ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ｓａｎ@Ｆｒａｎ ｃｉｓｃｏ。

Ｃ＾、、１９９２年４月５−１０日、による改良法を用いて、実施例３３の二量 体オリゴヌクレオシド（化合物４８．１当量）はアセトン中、塩化クロロアセチ ルで処理されて連結基のアミノ基と付加体を生成する。温度を上げてＤＭＳＯ中 、Ｋ　２ＣＯ。

（１，２当量）でさらに処理されると、付加体は連結基のヒドロキシル基ととも に環化されて、連結基と５−オキソモルホリノ付加体を形成するであろう。オキ ソモルホリノ付加体は次にＢＨ，−ＴＨＦと加熱還流する事により還元され一〇 を得る。

造に利用されるであろう。ただし、ｌｌｏｒｗｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、のメチルス ルホン酸無水物条スルホン酸無水物／ピリジン（−５０℃から０℃）反応条件に 置き換えられる。

５′−ホモチミジン［Ｅｔｚｏｌｔ、　Ｇ、　、　Ｋｏｗｏｌｌｉｋ、　Ｇ、　 、およびＬａｎｇｅｎ、　Ｒ，、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｗｉｕｎｉｃａｔｉｏ ｎｓ、　ｐｇ４２２（１９６８）］　（５↓、１．２８ｇ、５ミリモル）、Ｎ− ヒドロキノフタルイミド（１，０９ｇ、６．　６ミリモル）およびトリフェニル ホスフィン（１，７５ｇ、６．６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ　（２５ｍｌ）に加え た混合物を撹拌し、ンイソプロピルアゾジカルボキシレート（１，５ｍｌ、７． ５ミリモル）を０℃にて３０分以上かけて添加する。室温で１２時間撹拌を続け る。真空下溶媒を蒸発させ、残渣はジエチルエーテル（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄す る。残渣は次実施例３７ ン（３ミリモル）を加える。反応溶液は１２時間撹拌後、冷却しく０℃）、濾過 する。沈澱をＣＨ２Ｃｌ　２で洗い、合併した濾液は濃縮する。残渣はフラッシ ュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２０ｇ）により精製する。ＣＨｘＣ Ｉ　２　：３′−デ（オキソホスフィニコ）−３“−（イミノオキシメチレン） −５°　−トリチルチミジリルー（３′→５°）−３’　−０−（ｔ−ブチルジ フェニルシリル）−５′−デオキシチミジン、５５ ６゛−〇−アミノー３’　−〇−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５°　−ホ モチミジン、５４はＹａｎｇ、　Ｄ、　、　Ｋ１ｌ１．　Ｓ、−）１．およびＫ ａｈｎｅ、Ｄ、、　Ｊ、＾ｒｅ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　、@１１３：４７１ ５ （１，９９１）の立体選択的条件を使用すると、エチル　クロロホルメート（Ｃ Ｈ２ＣＩ□−飽和Ｎ　ａ　ＨＣ０３）により対応するウレタンへ変換される。こ の反応の残渣はルノリル）−５゛−チオキシチミジン、５６リル）保護基はトリ フルオロ酢酸処理により除去され、残基は５ｐｒｏａｔ、　Ｂ、　Ｓ、およｓｓ 、　ｐｇ、　５５（１９９１）の方法によりジメトキシトリチル化されて表記化 合物を与える。

解する。ジイソプロピルエチルアミン（０，８２ｍ１．４，０３ミリモル）を加 え反応混合物を氷温まで冷却する。反応混合物にクロロ（ジイソプロピルアミノ ）−β−シアノエトキシホスフィン（０，８８ｍ１．４．０３ミリモル）を加え 反応混合物は放置して２０℃まで暖め３時間撹拌する。酢酸エチル（８０ｍｌ） およびトリエチルアミノ（１ｍｌ）を加え溶液を食塩水で３回（３ｘ２５ｍｌ） 洗浄する。有機相を分離し硫酸マグネシウムで乾燥する。固形物を濾過後溶媒を 真空下２０℃で蒸発させると得られる油状物をンリカおよび溶出液としてヘキサ ン−酢酸エチル−トリエチルアミン（５０：　４０　：　１）のような溶媒を用 いるカラムクロマトグラフィーにより生成する。真空下集めた分画を蒸発させ残 渣はさらに水酸化ナトリウム存在下２６℃で真空下（１ｔ　ｏ　ｒ　ｒ）無水ピ リジン（２０ｍ５′　−アミノ−３°　−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）− ５°　−ホモチミジン、５９はＲａｗｓｏｎ、　Ｔ、　Ｅ、　、およびｆｅｂｂ 、　Ｔ、　Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、　９ F８９（１９９ ０）、の方法により製造される。ｔ−ブチルジメチルシリル基は実施例４の工程 ４の方法により除去され表記化合物を与えるであろう。

ノー３’−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５′　−ホモチミジン（化合物 ６１）を与え、それは続いて実施例４の工程３の方法により処理されて５°アミ ノ５°−メチルアミノ−３’−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５°　−ホ モチミジン、６２（１ミリモル）を次亜塩素酸ナトリウム水溶液に加えるとクロ ロアミド中間体を得る。クロロアミド中間体は冷却しく０℃）、５°−０−モノ メ：６７０２（１９９１）の方法を使用して後処理され、残渣をクロマトグラフ ィーにより精製すると表記化合物１旦を得る。

える。

に従って製造された３゛−アミノ−５’　−０−（ｔ−ブチルジメチルシリル） −える。

実施例４９ ３゛−デ（オキシホスフィニコ）−３’−［（メチルイミノ）−１，２−エタン ｅｓ：５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ　Ａ　Ｐ窒≠モ狽奄モ≠戟O ル化される。

（β−シアノエトキシ）−Ｎ−（ジイソプロピル）ホスフィニコ］−５’　−デ オえる。

５ｅｎｄおよびＲ，Ｓ、Ｔｉｐｓｏｎ、　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ ｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、ｐｇ、２４０　（１９９１）■■@ により製造されたホモアデノシン（７３）はＴＩＰＳ（即ち、テトライソブロピ ルシリル）保護基によりその３゛および５゛　ヒドロキシルに渡って保護され、 続いて１９９０年８月１３日に出願された米国特許出願第５６６．９７７号およ び１９９１年８月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９１１０５７２０に記載され ている方法によりアルキル化される。実施例４の工程４の方法に従いテトラ−ｎ −６′−Ｏ−アミノ−３’−０−（ｔ−プチルジフェニルシリル）−５゛　−ホ モアデノシン、７５ 化合物ヱ」を実施例３６．３７および３８の方法により処理すると表記化合物３ ′−デ（オキソホスフィニコ）−３°−（イミノオキシメチレン）−５′　−ジ 化合物−ヱ」−は実施例３９の方法により化合物５０と反応させ表記化合物ヱ旦 を得る。

実施例５６ ３′−デ（オキソホスフィニコ）−３′−［メチル（イミノオキシメチレン）］ −］５°−ジメトキシトリチルチミジリル（３°→５’　）　−３’　−［（β −シアーホモ−２゛−デオキシアデノシンの炭素環式類似体）はＪｏｎｅｓ、　 Ｍ、　Ｆ、およびＲｏｂｅ２′−デオキシアデノシンの６’　−０−アミノ−３ °−保護炭素環式類似体、体得る。

合物８１を得る。

３°−デ（オキソホスフィニコ）−３’−（イミノオキシメチレン）−５°−ジ メトキシトリチルチミンリルー（３′　→５°）−３’　−０−（ｔ−プチルジ フェニルシリル）　−２’　−０−ブチル−５′−デオキシアリステロマイシン 、８４化合物８３は実施例３９の方法により化合物５０と反応させ表記化合物足 」を得る。

一５°−ジメトキシトリチルチミンリに＝バ３′−５°　）−３゛−［（β−ノ アノエトキ／）−Ｎ−（ジイソプロピル）ホスフィリル］−２’−０−ブチル− ５゛−デオキシアリステロマイシン、８５化合物８４を実施例４０．４１および ４２の一連の反応により反応させ表記化（＋）−１−［（ＩＲ，３Ｓ、４Ｓ）− ３−アジド−５−ジメトキシトリチル−より製造された（＋）−１−［（ＩＲ， ３Ｓ、４Ｓ）−３−アジド−４−（ヒドロキシメチル）−ノタロペンチル］−５ −メチル−２，４−（ＩＨ，３Ｈ）−ビリチルを使用してジメトキシトリチル化 され、表記化合物８７を与える。

キンメチル）−シクロペンチル］−５−メチル−２，４−（ＩＨ，３Ｈ）−ピリ ミジンジオン、８８ 化合物足ヱは１ｌｒｏｎｏｖｓｋｉ、　Ｌ、　Ｊ、　Ｊ、および５ｚａｒｅｋ、 　Ｗ、＾、　、　Ｊ、　Ｃｈｅｌｌ、　Ｓｏｃ、　、　Ｃｈ■煤@Ｃｏｍｍｕｎ 。

、　１５４７（１９９０）の方法により室温でピリジン中、Ｐｈ５Ｐにより還元 され、３′−える。

得る。

固相支持オリゴヌクレオチドおよび”オリゴヌクレオチド様”合成は＾ｐｐｌｉ ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ■５３８０Ｂまたは３９４　ＯＮ八へ成機上、製造元から 供給される試薬を用い、以下の標準的ホスホロアミデートプロトコールおよびサ イクルで実施した。オリゴヌクレオチドは通常１０マイクロモルスケールまたは ３ｘ１マイクロモルスケールにて”　トリチル−オン”モードで合成された。標 準的脱保護条件（３０％Ｎ　Ｉ−（４０Ｈ１５５℃、１６時間）が用イられた。

ＨＰＬＣはモデル９９１検出器を備えたＷａｔｅｒｓ　６００Ｅ装置で実施され た。分析用クロマトグラフィーとしては、以下の逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ条件が用いら れた：　Ｈａａｉｌｔｏｎ　ＰＲＰ−１カラム（１５ｘ２．５ｃｍ）、溶媒Ａ： ５０ミリモルＴＥＡＡ、ｐＨ７，Ｏ；溶媒Ｂ　二８０’％ＣＨ，ＣＮを加えた４ ５ミリモルＴＥＡＡ：流速：１．５ｍｌ／分；濃度勾配：最初の５分は５％Ｂ、 その後１分ごとに直線的に（１％）Ｂを増加。分取の目的には、以下の逆相ＨＰ ＬＣ条件が用いられた：　１ａｙｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ　Ｐａｋ　Ｃ４１５μｍ、 ３００オングストローム、２５ｘ１００　Ｉｎ、同一の物質を充填したガードカ ラムを付けて；流速：５ｍｌ／分；濃度勾配：最初の１０分は５％Ｂ１その後１ 分ごとに直線的に（１％）Ｂを増加。ＨＰＬＣ精製に続いて、オリゴヌクレオチ ドは脱トリチル化され、さらに５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムを用いたサイ ズ排除により精製された。

実施例６８ 高度に重合した混合オリゴヌクレオシド−オリゴヌクレオシドおよび混合オリゴ ヌクレオシド−オリゴヌクレオチド Ａ、３′−デ（オキソホスフィニコ）−３″−［メチル（イミノオキシメチレン 用連結オリゴヌクレオシドニ量体およびその３′末端での３°　−デ（オキシホ スフィニコ）−３’−［（メチルイミノ）−１，２−エタンジイル］連結オリゴ ヌクレオシドニ量体による３′−デ（オキソホスフィニコ）−３°−［メチル（ イミノオキシメチレン）］−］チミジリルー３’　−５°　）−５゛　−チオキ シチミノリル−３°　−ホスホロチオエートーチミジリル−（３°→５’　）　 −３’　−デ（オキソホスフィニコ）−３’−［（メチルイミノ）−１，２−エ タンノイル］チミジリル−（３゛→５’　）　−３’　−〇−（ｔ−ブチルジフ ェニルシリル）−５゛−チオキシチミジン（９ｏ１その５′末端に隣接するヌク レオチド結合を取り込んだ混合オリゴヌクレオシドーオリゴヌクレオチドーオリ ゴヌクレオシド重合体）の液相合成 ホスホロチオエート　ヌクレオチド結合により一緒にカップリングされた３゜− デ（オキソホスフィニコ）−３’−［メチル（イミノオキシメチレン）］連結オ リゴヌクレオシドニ量体および３′〜デ（オキソホスフィニコ）−３°−［（メ チルイミノ）−１，２−エタンジイル］連結オリゴヌクレオシドニ量体を持つ混 合オリゴヌクレオシド−オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオシドはアルゴン下 、無水アセトニトリル中で化合物５８、化合物７０およびテトラゾールを反応さ せることにより製造されるであろう。カップリング反応は放置して完了させ、続 いてＺｏｎ、　Ｇ、および５ｔｅｃ、　ｆ、　Ｊ、　、　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔ ｈｉｏａｔｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、　ｏ撃奄■盾獅浮モ撃■ ｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ ｃｈ、　Ｆ、　Ｅｃｋｔｅｉｎ　Ｅｄ、　、　ＩＲＬ　Ｐｒ■唐刀A　ｐｇ８７ （１９ ９１）に従ってジメトキシトリチル保護基を除去するためにポーケージ試薬およ び水酸化アンモニウムで処理された。３°保護基は次に実施例４の工程３の方法 により除去され、ＨＰＬＣにより精製すると表記化合物９０を得る：スキームＸ ■の構造を利用すると、Ｔ３およびＴ５はＯＨであり、ＤはＳであり、ＥはＯＨ であり、ＸはＨであり、Ｑは０であり、ｒは２であり：および各々のｑに対しく すなわち、ｑｌおよびＱｚ）、ｎおよびｐは各々の例において１であり；および ｑｌに対して、ｍは１であり：およびｑ２に対して、ｍはＯであり：およびＢｘ ｊおよびＢｘｉはチミンである。

キンメチレン）　］　−（３’　−５°）−チミジリル−（３′→５’）−ｐ− ２°　−チオキシンチジン（９１、通常の連結ヌクレオチドが隣接する３′−デ （オキソホスフィニコ）　−３’　−［メチル（イミノオキシメチレン）］連結 オリゴヌクレオシドニ量体を含む混合オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオシド 重合体の固相食感　二量体オリゴヌクレオシド旦が実施例６７の方法による通常 のオリゴヌクレオチド固相合成での構築ブロックユニットとして利用された。例 示の目的で７つのヌクレオシドを含む重合体について記述する。二量体オリゴヌ クレオシド５８の第１のユニットは３′　ヒドロキシル基を通して固体支持体に 繋がれ、遊離の５′　ヒドロキシル基を持つ第１のンチジンヌクレオシドヘ結合 される。支持体へ化合物５８の第１のユニットが結合された後、その第１の化合 物５８ユニツトの５゛−ジメトキシトリチル基は常法により除去されるであろう 。次に、普通のスホジエステル結合が形成され、ヌクレオシド二つ分（または一 つのオリゴヌク量体ユニットにより重合体が伸ばされる。第１および第２の二量 体ユニットを加長さおよび塩基配列が完成する。この重合体は改変された標準ホ スホジエステルより除去され、続いてまた常法により固体支持体から重合体が放 出される。重合体の精製はＨＰ　Ｌ　Ｃにより達成され、スキームＸ〜１の構造 を利用すると、Ｔ３およびＴ、はＯＨであり、ＤはＯであり、ＥはＯＨであり、 ＸはＨであり；ＱはＯてあり、ｒは１でありおよび記載された７ヌクレオシド重 合体に対しｑは３であり、および各々のｑに対しく即ち、Ｑｌ、Ｑ２およびｑｓ ）ｎおよびｐは各々の例において１であり：およびｑｌおよびｑ２に対してｍは １であり：およびｑ３に対してｍは０であり：およびＢｘｋはントンンであり、 および各々のＢｘｊおよびＢｘｉはチミンである化合物９１が得られる。

評価 方法１　ヌクレアーゼ耐性 Ａ　血清および細胞質ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチド模倣高分子の耐 性の評価 血清ヌクレアーゼに対する本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子の耐性は、こ のオリゴヌクレオチド模倣高分子を種々の濃度のウシ胎児血清またはヒト成人血 清を含む培養液中でインキュベートすることにより評価することができる。標識 したオリゴヌクレオチド模倣高分子を種々の時間インキュベートし、プロテアー ゼにで処理し、次に２０％ポリアクリルアミド尿素変性ケルにおける電気泳動、 およびそれに続くオートラジオグラフィーによって分析する。オートラジオグラ ムをレーザー密度計で定量化する。修飾結合の位置および既知のオリゴヌクレオ チド模倣高分子の長さに基づいて、特定の修飾がヌクレアーゼ分解に及ぼす影響 を決定することができる。細胞質ヌクレアーゼについては、ＨＬ６０細胞株を用 いることができる。ポスト・ミトコンドリア上清を密度差遠心分離により調製し 、標識した本高分子をこの上清中で種々の時間インキュベートする。インキュベ ートの後、血清核酸溶解分解について上述したように、分解について本高分子を 評価する。オートラジオグラフィーの結果を本発明の高分子の評価のために定量 化する。本高分子は血清および細胞質ヌクレアーゼに対して完全に耐性であろう ことが期待される。

Ｂ、特定のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレ オチド模倣高分子の耐性の評価 天然のオリゴヌクレオチドおよび本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子の、特 定のヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ、３°、５゛−エキソヌクレアーゼおよ び５’、３’−エキソヌクレアーゼ）に対する耐性の評価を行い、高分子結合の 分解に対する実際の効果を決定することができる。本オリゴヌクレオチド模倣高 分子を、種々の選択されたヌクレアーゼに特異的な限定された反応緩衝液中でイ ンキュベートする。生成物をプロテアーゼにで処理した後、尿素を加え、尿素を 含む２０％ポリアクリルアミドゲルによる分析を実施する。ゲル生成物をスティ ンズオール試薬（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）で染色して可視化 する。レーザー密度計を用いて分解の程度を定量化する。特定のヌクレアーゼに ついて、高分子結合の効果を決定し、血清および細胞質系から得られた結果と比 較する。血清および細胞質ヌクレアーゼ同様に、本発明のオリゴヌクレオチド模 倣高分子はエンド−およびエキソヌクレアーゼに対して完全に耐性であろうこと が期待される。

方法２５−リポキンゲナーゼ分析およびアッセイＡ、治療 治療に用いるためには、５−リポキシゲナーゼの過剰なまたは異常な供給により 特徴づけられる疾患を有すると疑われる動物を、本発明の高分子を投与すること により処置する。当業者は、最適な投与量、投与方法および反復速度を容易に決 定することができる。このような処置は一般に、治癒がなされるかまたは疾患状 態の減縮が達成されるまで続けられる。いくつかの疾患については、同様に長期 処置が行われる。

Ｂ、研究試薬 本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子はまた、粗細胞ライセード中、または部 分的にまたは完全に精製されたＲＮＡ調製物中の、５−リポキシゲナーゼｍＲＮ Ａを切断あるいは調節するために用いられる場合、研究試薬用としても有用であ る。この本発明の応用は、例えば細胞を標準的方法により溶解し、最適にＲＮＡ を抽出し、次にこれを緩衝液（例えば５０ｍＭリン酸塩、ｐＨ約４〜約１０）中 の、例えば約１００〜約５００ｎｇ／１０ｍｇ全ＲＮＡの濃度の組成物を用いて 、約３０８Ｃ〜約５０°Ｃの温度において処理することにより行うことができる 。

切断された５−リポキシゲナーゼＲＮＡは、アガロースゲル電気泳動および放射 性標識されたＤＮＡプローブを用いるハイブリッド形成、あるいはその他の標準 的な方法により分析することができる。

Ｃ９診断 本発明のオリゴヌクレオチド模倣高分子はまた、診断への応用において、特に種 々の組織における特定のｍＲＮＡ種の発現、あるいは異常または変異ＲＮＡ種の 発現の決定にも有用である。この例においては、本高分子は、異常な配列に相補 的なように設計することによって、仮想の異常ｍＲＮＡを標的とするが、正常ｍ ＲＮＡにはハイブリッド形成せずこれを切断しない。

組織標本をホモジナイズし、標準的な方法に従ってＲＮＡを抽出することができ る。粗ホモンネートまたは抽出物を処理して、例えば標的ＲＮＡを切断すること ができる。次に、この生成物を、切断部位の５゛側の領域に相補的なオリゴヌク レオチドが結合されている固体支持体にハイブリッド形成させることができる。

正常および異常のｍＲＮＡの５′領域はいずれも固体支持体に結合する。異常Ｒ ＮＡの３′領域は、本発明の化合物により切断されて、支持体に結合しないため 、正常ＲＮＡから分離される。

調節のための標的ｍＲＮＡ種は、５−リポキシゲナーゼに関係するものである。

しかし、当業者は、本発明がそのように制限されるものではな（、一般的に適用 しうろことを理解するであろう。５−リポキシゲナーゼ酵素の生成の阻害または 調節は、疾患の治療において顕著な治療の利益を有すると予想される。この組成 物の有効性を評価するために、１つまたは一連のアッセイが必要である。

Ｄ　インビトロアッセイ ５−リポキンゲナーゼの細胞性アッセイは、好ましくはヒト前骨髄性白血病細胞 株ＨＬ−６０を用いて行う。これらの細胞は、種々の既知の試薬により誘導して 単球様細胞または好中球様細胞に分化させることができる。細胞を１．３％ジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理することは、細胞の好中球への分化を促進 することが知られている。現在、基底Ｈ−６０細胞が検出可能なレベルの５−リ ポキンゲナーゼ蛋白質を合成しないか、またはロイコトリエン（５−リポキシゲ ナーゼの下流生成物）を分泌しないことが知られている。ＤＭＳＯによる細胞の 分化は、ＤＭＳＯの添加から４８時間後に５−リポキノゲナーゼ蛋白質の出現と ロイコトリエン生合成を引き起こす。したがって、５−リポキシゲナーゼ蛋白質 合成の誘導は、これらの細胞において５−リポキシゲナーゼ合成を阻害するオリ ゴヌクレオチド模倣高分子の分析のための試験システムとして利用することがで きる。

オリゴヌクレオチド模倣高分子の第２の試験システムは、５−リポキンゲナーゼ が“自殺”酵素である、すなわち、酵素が基質と反応することによってそれ自身 を不活性化するという事実を利用するものである。分化したＨＬ−６０または５ −リポキシゲナーゼを発現するその他の細胞を、１０μＭのＡ２３１８７　（カ ルシウム・イオノフオア）によって処理することは、５−リポキノゲナーゼのサ イドシルから膜への移動およびそれに続く酵素の活性化を促進する。活性化およ び何回かの触媒作用の後、酵素は触媒的に不活性化する。したがって、カルシウ ム・イオノフオアによる細胞の処理は、内因性５−リポキシゲナーゼを不活性化 する。ロイコトリエンＢ４の合成能力により測定したところ、細胞がＡ２３１８ ７処理から回復するためには約２４時間を要する。５−リポキシゲナーゼに対す るオリゴヌクレオチド類似体は、以下の定量的なアッセイを用いて、２つのＨＬ −６０モデル系において活性を測定することができる。これらのアッセイは、生 きた細胞における５−リポキシゲナーゼ活性の測定等の、より下流の事象と比べ て、生きた細胞における５−リポキンゲナーゼ蛋白質合成の阻害の最も直接的な 測定である。

生きた細胞においてオリゴヌクレオチド模倣高分子が及ぼすことができ、容易に 定量化しうる直接的な効果は、５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の特異的な阻害 である。この方法を実施するためには、細胞を３５８−メチオニン（５０μＣｉ ／　ｍ　Ｌ　）で３７℃において２時間標識し、新たに合成された蛋白質を標識 する。

細胞を抽出して全細胞蛋白質を可溶化し、５−リポキシゲナーゼ抗体で５−リポ キンゲナーゼを免疫沈降させ、次にプロティンＡセファロースビーズから溶出す る。免疫沈降した蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離 し７、オートラジオグラフィーのために感光を行う。免疫沈降した５−リポキシ ゲナーゼの量を走査密度計て定量化する。

これらの実験の予想される結果は次のとおりである。対照細胞から免疫沈降され た５−リポキシゲナーゼ蛋白質の量を１００％として標準とする。細胞を１μＭ 、１０ＩＩＭおよび３０ｆ１Ｍの本発明の高分子によって４８時間処理すると、 免疫沈降された５−リポキンゲナーゼはそれぞれ対照から５％、２５％および７ ５％減少する。

細胞ホモジネートにおける５−リポキノゲナーゼ酵素活性の測定もまた、ロイコ トリエンを合成しうる酵素の存在量を定量化するために用いることができる。

現在、逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃを用いて細胞ホモジネート中の５−リポキシゲナーゼ酵 素を定量化するための放射測定法が開発されている。細胞をプロテアーゼ阻害剤 およびＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む緩衝液中で超音波処理により破壊する。細胞ホモジ ネート・を１０、ＯＯＯｘｇで３０分間遠心分離し、上清を５−リポキンゲナー ゼ活性についてアッセイする。サイドシル蛋白質を１０μＭの１４０−アラキド ン酸、２ｍＭＡＴＰ、５０μＭ遊離カルシウム、１００μｇ／ｍｌホスファチジ ルコリン、および５０ｍＭｂ　ｉ　５−Ｔｒ　ｉ　ｓ緩衝液（ｐＨ７，０）とと もに３７℃において５分間インキュベートする。等量のアセトンを加えることに より反応を停止させ、酢酸エチルで脂肪酸を抽出する。基質と反応生成物をＮｏ ｖａｐａｋＣ１８カラムｆｌａｔｃｒ５１１ｃ、、　Ｍｉｌｌｆｏｒｄ、　ＭＡ ）を用いて逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃにより分離する。ラジオクロマトグラフィー検出機 （Ｂｅｃｋｍａｎ　ｍｏｄｅｌ　１７１）により、放射活性を有するピークを検 出する。ジーＨＥ　Ｔ　Ｅおよびモノ−ＨＥＴＥに転換されたアラキドン酸の量 を５−リポキシゲナーゼ活性の測定値として用いる。

ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞を、有効な高分子で１μＭ１１０μＭおよび３０／ ＩＭの濃度において処理した予想される結果は以下のとおりである。対照細胞は ２００ｐｍｏ　１１５分／細胞１０６個のアラキドン酸を酸化する。１７１Ｍ、 １０μＭおよび３０μＭの有効なオリゴヌクレオチド模倣高分子で処理した細胞 は、それぞれ１９５ｐｍｏＬ　１４０ｐｍｏｌおよび５Ｑｐｍｏ１１５分／細胞 １０６個のアラキドン酸を酸化する。

細胞中の全５−リポキンゲナーゼ蛋白質の測定のための定量的競合酵素免疫アッ セイ（ＥＬＩＳＡ）が開発されている。大腸菌で発現させ、抽出、Ｑ−セファロ ース、ヒドロキシアパタイトおよび逆相ＨＰＬＣにより精製したヒト５−リボキ ンゲナーゼを標準として、およびマイクロタイタープレートの被覆のための第１ 抗体として用いる。２５％ｇの精製５−リボキンゲナーゼを４℃で一晩マイクロ タイタープレートに結合させる。ウェルを２０　ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣ１緩衝液 （ｐＨ７，４）および１５０ｍＭＮａＣｌ　（ＴＢＳ）で希釈した５％ヤギ血清 で９０分間被覆する。細胞抽出物（０，２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１２， ０００Ｘｇ、３０分間）または精製５−リポキシゲナーゼを、全量１００μＬの １　：　４０００希釈抗５−リポキシゲナーゼポリクローナル抗体とともに、マ イクロタイターのウェル中で９０分間インキュベートする。抗体は、精製ヒト組 み換え５−リポキシゲナーゼでウサギを免疫して調製する。ウェルを０．０５％ ｔｖｅｅｎ　２０を含むＴＢＳ　（ＴＢＳＴ）で洗浄し、次に１００μＬの１・ １０００希釈ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｍａｌｖｅｒｎ、　Ｐ＾）とともに２５℃において ６０分間インキュベートする。ウェルをＴＢＳＴで洗浄し、テトラメデルベンツ ジンで発色させてベルオギノダーゼ標識第２抗体の量を決定する。

１μＭ、１０１ｔ　Ｍおよび３０１１Ｍの３０塩基のオリゴヌクレオチド模倣高 分子を用いたそのようなアッセイの予想される結果は、それぞれ細胞１０６個に つき５−リポキノゲナーゼが３０ｎｇ、１８ｎｇおよび５ｎｇであり、処理して いない細胞は約３４ｎｇの５−リポキノゲナーゼを含む。

５−リポキシゲナーゼ生合成の阻害の正味の効果は、刺激された細胞から放出さ れたロイコトリエンの員の減少である。ＤＭＳＯ分化ＨＬ−６０細胞は、カルシ ウム・イオノフオアＡ２３１８７による刺激によりロイコトリエンＢ４を放出す る。細胞培養液に放出されたロイコトリエンは、商業的に入手可能な診断キット （Ｎｃｖ　Ｅｎｇｌ、ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を用 いて、ラジオイムノアッセイにより定量することができる。ＨＬ−６０細胞にお けるロイコトリエンＢ４の産生は、ＤＭＳＯを添加して細胞を好中球様細胞に分 化させてから４８時間後に検出することができる。細胞（２×１０５個／　ｍ　 Ｌ　）を１．３％のＤＭＳＯ（７）存在下で、増加する濃度のオリゴヌクレオチ ド類似体で４８−７２時間処理する。細胞を洗浄し、１％脱脱脂シン血清アルブ ミン含むダルベコリン酸緩衝液生理食塩水中に、２Ｘ１０’個／ｍＬの濃度で再 懸濁する。細胞を１０μＭカルシウム・イオノフオアＡ２３１８７で１５分間刺 激し、５×１０５個の細胞から産生されたＬＴＢ。

の量を、製造者の記述にしたがってラジオイムノアッセイにより決定する。

このアッセイを用いて、５−ＬＯｍＲＮＡに対する、オリゴヌクレオチド模倣高 分子について得られるであろう結果は以下のとおりである。細胞を１μＭ、　１ ０μＭまたは３０μＭのオリゴヌクレオチド模倣高分子とともに、１．３％ＤＭ ＳＯの存在下で７２時間処理する。５×１０５個の細胞から産生されるＬＴＢ、 の量は、それぞれ約７５ｐｇ、５０ｐｇおよび３５ｐｇであり、未処理の分化細 胞は７５ｐｇのＬＴＢ４を産生すると予期される。

Ｅ、インビボアッセイ マウスにおける５−リポキノゲナーゼ産生の阻害は、以下の方法にしたがって示 すことがてきる。アラキドン酸を局所投与することにより、ロイコトリエンＢ４ 、ロイコトリエンＣ４およびプロスタクランジンＥ２が皮膚において速やかに生 成し、続いて浮腫および細胞性浸潤が生じる。５−リポキノゲナーゼのある種の 阻害剤がこのアッセイにおいて活性を示すことが知られている。このアッセイの ために、２ｍｇのアラキドン酸をマウスの耳に適用し、反対側の耳を対照とする 。アラキドン酸投与から１時間後の生検試料から得たホモジネート中のミエロベ ルオキシダーゼ活性により多形核細胞浸潤をアッセイする。浮腫性の反応は、耳 の厚さおよびパンチした生検試料の重量を測定することにより定量化する。組織 中の５−リポキシゲナーゼ活性の直接的測定として、生検試料において産生され たロイコトリエンＢ４の測定を実施する。化合物の最適な活性を得るために、オ リゴヌクレオチド模倣高分子をアラキドン酸の投与の１２〜２４時間前に両方の 耳に局所的に適用する。アラキドン酸の投与の前に両方の耳を、０．１μｍ０１ １領　３μｍｏｌまたは１．０μｍｏｌの本高分子で２４時間前処理する。値は 、１つの濃度につき３匹の動物の平均で表わす。０１μｍｏｌ、０．３μｍＯ１ および１．Ｑ７１ｍｏｌについての多形核細胞浸潤の阻害は、それぞれ対照の活 性の約１０％、７５％および９２％であると予期される。浮腫の阻害は、それぞ れ約３％、５８％および９０％であり、これに対しロイコトリエンＢ４の生成の 阻害はそれぞれ約１５％、７９％および９９％であると予期される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　６年１２月２６日

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくともその一部が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１またはＬ２の一つはＯまたはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一つはＮ −Ｒであり；Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であるか、またはＬ３はＣＨ２ であり、かつＬ４はＣＲ′Ｒ′′であり；またはＬ３またはＬ４の一つはＯまた はＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ１およびＬ２は 合わさってＣＨ２であるか、またはＬ２はＣＨ２であり、かつＬｌはＣＲ′Ｒ′ ′であり；またはＬｌまたはＬ４の一つはＯ、ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬｌ およびＬ４の他の一つはＣＲ′Ｒ′′であり；Ｌ２およびＬ３はＣＨ２であり； またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は一緒になってＯ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ２または ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−０であり：または ＬＩはＯであり；Ｌ２はＮであり；Ｌ３はＣＨ２であり；かつＬ４はＣまたはＣ Ｈであり；およびＬ２、Ｌ３およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはヘ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成し；またはＬ１はＣまたはＣＨで あり；Ｌ２はＣＨ２であり：Ｌ３はＮであり：かつＬ４はＯであり；およびＬ１ ，Ｌ２およびＬ３は少なくとも二つの追加の炭素またはヘテロ原子と一緒になっ て５または６員間を形成し；およびＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキルまたは置換低級アルキル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の 低級アルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキニルまたは置換低級アルキニル；１４Ｃ含有低級アルキル、低級ア ルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキ ル：１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル：脂環式；複 素環式：レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特 性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた めの基であり；Ｒ′およびＲ′′はＨであり；またはＲ′はＨでありかつＲ′′ はＯ−Ｒであり；またはＲ′およびＲ′′は合わさって＝Ｏであり：ＸはＨ；Ｏ −Ｒ；Ｓ−Ｒ：ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ； ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロア ルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミ ノ；置換シリル；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動 態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有する高分子。
2. ２．ＲがＨである請求項第１項記載の高分子。
3. ３．ＲがＣ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルキルまたは置換低級アル キル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルケニルまたは置換低級アル ケニル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルキニルまたは置換低級ア ルキニル；またはＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキルである請求項 第１項記載の高分子。
4. ４．Ｒが１４Ｃ含有低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニル；また は１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキルである請求項第 １項記載の高分子。
5. ５．Ｒがレポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特 性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた めの基である請求項第１項記載の高分子。
6. ６．ＱがＯである請求項第１項記載の高分子。
7. ７．ＸがＨまたはＯＨである請求項第１項記載の高分子。
8. ８．少なくともその一部が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１またはＬ２の一つはＯまたはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一つはＮ −Ｒであり：Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であり；またはＬ３またはＬ４ の一つはＯまたはＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ １およびＬ２は合わさってＣＨ２であり；およびＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖 または分岐鎖の低級アルキルまたは置換低級アルキル；Ｃ２からＣ１０の直鎖ま たは分岐領の低級アルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２からＣ１０の直鎖 または分岐鎖の低級アルキニルまたは置換低級アルキニル：１４Ｃ含有低級アル キル、低級アルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣ１４のアルカリールま たはアラルキル；１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル ：脂環式；複素環式：レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬 物動態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性 を改良するための基であり；ＸはＨ；Ｏ−Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；ＣＩ；Ｂ ｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２； ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；ア ミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；レポーター分子；ＲＮ Ａ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基；または オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有する高分子。
9. ９．Ｌ３およびＬ４が合わさってＣＨ２である請求項第８項記載の高分子。
10. １０．Ｌ１がＯであり、かつＬ２がＮ−Ｒである請求項第９項記載の高分子。
11. １１．少なくともその一部が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 ＬｌまたはＬ４の一つはＯ、ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬ１およびＬ４の他の 一つはＣＲ′Ｒ′′であり；Ｌ２およびＬ３はＣＨ２であり；ＲはＨ；Ｃ１から Ｃ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルキルまたは置換低級アルキル：Ｃ２からＣ １０の直鎖または分岐鎖の低級アルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２から Ｃ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルキニルまたは置換低級アルキエル；１４Ｃ 含有低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣ４のアル カリールまたはアラルキル：１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたは アラルキル；脂環式；複素環式；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレ オチドの薬物動態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬 力学的特性を改良するための基であり；Ｒ′およびＲ′′はＨであり；またはＲ ′はＨであり、かつＲ′′はＯ−ＲでありまたはＲ′およびＲ′′は合わさって ＝Ｏであり；ＸはＨ；Ｏ−Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３； ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロァルカリール；アミノアルキルア ミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリ ゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオ チドの薬力学的特性を改良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有する高分子。
12. １２．Ｒ′およびＲ′′がＨである請求項第１１項記載の高分子。
13. １３．Ｒ′がＨであり；Ｒ′′がＯ−Ｒであり；およびＲがＨである請求項第１ １項記載の高分子。
14. １４．少なくともその一部が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１たはＬ２の一つはＣＨ２、ＯまたはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一 つはＮ−Ｒであり；およびＬ３はＣＨ２であり、かつＬ４はＣＲ′Ｒ′′であり ；または Ｌ３またはＬ４の一つはＣＨ２、ＯまたはＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の 一つはＮ−Ｒであり；およびＬ２はＣＨ２であり、かつＬｌはＣＲ′Ｒ′′であ り；および ＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルキルまたは置換低級アル キル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルケニルまたは置換低級アル ケニル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級アルキニルまたは置換低級ア ルキエル；１４Ｃ含有低級アルキル、低級アルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル；１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４の アルカリールまたはアラルキル；脂環式；複素環式；レポーター分子；ＲＮＡ切 断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基；またはオリ ゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり；Ｒ′およびＲ′′は Ｈであり；またはＲ′はＨでありかつＲ′′はＯ−Ｒであり；またはＲ′および Ｒ′′は合わさって＝Ｏであり；ＸはＨ；Ｏ−Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ ２；ＮＯ２；Ｎ３ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール； アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；レポーター分子；Ｒ ＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基；また はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有する高分子。
15. １５．Ｌ３およびＬ４がＣＨ２である請求項第１４項記載の高分子。
16. １６．Ｌ１がＯまたはＳであり、かつＬ２がＮ−Ｒである請求項第１５項記載の 高分子。
17. １７．Ｌ１がＯである請求項第１６項記載の高分子。
18. １８．Ｌ１がＳである請求項第１６項記載の高分子。
19. １９．Ｌ１がＮ−Ｒである請求項第１４項記載の高分子。
20. ２０．Ｌ２がＣＨ２、ＯまたはＳである請求項第１９項記載の高分子。
21. ２１．Ｌ２がＣＨ２である請求項第１９項記載の高分子。
22. ２２．Ｌ２がＯまたはＳである請求項第１９項記載の高分子。
23. ２３．Ｌ２がＯである請求項第２２項記載の高分子。
24. ２４．Ｌ１またはＬ４がＣＲ′Ｒ′′であり、Ｒ′がＨであり、およびＲ′′が Ｏ−Ｒである請求項第１４項記載の高分子。
25. ２５．ＲがＨである請求項第２４項記載の高分子。
26. ２６．Ｌ４がＣＲ′Ｒ′′であり、Ｒ′がＨであり、およびＲ′′がＯ−Ｒであ る請求項第１４項記載の高分子。
27. ２７．ＲがＨである請求項第２６項記載の高分子。
28. ２８．Ｌ１がＯまたはＳであり、およびＬ２がＮ−Ｒである請求項第２７項記載 の高分子。
29. ２９．少なくともその一部が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は一緒になってＯ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ２またはＣＨ２ −ＣＨ＝Ｎ−Ｏであり； ＸはＨ；Ｏ−Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；Ｃｆ３；ＯＣＦ３ ；ＯＣＮ；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３ＮＨ２；ヘテロ シクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアル キルアミノ；置換シリル；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチド の薬物動態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的 特性を改良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有する高分子。
30. ３０．少なくともその一部が構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１はＯであり；Ｌ２はＮであり；Ｌ３はＣＨ２であり；かつＬ４はＣまたはＣ Ｈであり；およびＬ２、Ｌ３およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはヘ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成し；またはＬ１はＣまたはＣＨで あり；Ｌ２はＣＨ２であり；Ｌ３はＮであり；かつＬ４はＯであり；およびＬ１ ，Ｌ２およびＬ３は少なくとも二つの追加の炭素またはヘテロ原子と一緒になっ て５または６員環を形成し；およびＸはＨ；Ｏ−Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃ ｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮ Ｏ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリー ル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；レポーター分子 ；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基； またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有する高分子。
31. ３１．構造； ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｙ１はＯであり；Ｙ２はＨまたはＲ′′′であり；およびＺはアミノオキシまた はフタルイミドオキシであり；または Ｙ１はＣＨ２であり；および Ｙ２はアミノオキシ、アルキルアミノ、アミノヒドロキシアルキル、アルケニル またはオキソアルキルであり；およびＺはＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｒ′′′、アミノ、メ チレンアミノ、またはフタルイミドであり； Ｒ′′′はヒドロキシル保護基であり；ＸはＨまたはＯＨであり； ＱはＣＨ２またはＯであり；および Ｂｘは複素環式塩差部分である） を有するヌクレオシド。
32. ３２．Ｙ１がＯであり、Ｙ２はＨまたはＲ′′′であり、およびＺがアミノオキ シまたはフタルイミドオキシである請求項第３１項記載のヌクレオシド。
33. ３３．Ｙ２がＨであり、およびＺがアミノオキシである請求項第３２項記載のヌ クレオシド。
34. ３４．Ｙ１がＣＨ２であり； Ｙ２がアミノオキシ、アルキルアミノ、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、 アミノヒドロキシアルキル、アルケニルまたはアルドアルキルであり；および ＺがＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｒ′′′、アミノ、メチレンアミノ、またはフタルイミドで ある請求項第３１項記載のヌクレオシド。
35. ３５．ＺがＯＨである請求項第３４項記載のヌクレオシド。
36. ３６．生物中の蛋白質の生成または活性を調節する方法であって、該生物と高分 子とを接触させることを含み、ここで該高分子の少なくとも一部は以下の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１またはＬ２の一つはＯまたはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一つはＮ −Ｒであり；Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であるか、またはＬ３はＣＨ２ であり、かつＬ４はＣＲ′Ｒ′′であり；またはＬ３ほたはＬ４の一つはＯまた はＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ１およびＬ２は 合わさってＣＨ２であるか、またはＬ２はＣＨ２でありかＰＬ１はＣＲ′Ｒ′′ であり；またはＬ１またはＬ４の一つはＯ、ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬ１お よびＬ４の他の一つはＣＲ′Ｒ′′であり；Ｌ２およびＬ３はＣＨ２であり；ま たはＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、一緒になってＯ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ２または ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−Ｏであり；または Ｌ１は０であり；Ｌ２はＮであり；Ｌ３はＣＨ２であり；かつＬ４はＣまたはＣ Ｈであり；およびＬ２、Ｌ３およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはヘ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成し；またはＬ１はＣまたはＣＨで あり；Ｌ２はＣＨ２であり；Ｌ３はＮであり；かつＬ４は○であり；およびＬ１ ，Ｌ２およびＬ３は少なくとも二つの追加の炭素またはヘテロ原子と一緒になっ て５または６員環を形成し；およびＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキルまたは置換低級アルキル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の 低級アルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキニルまたは置換低級アルキニル；１４Ｃ含有低級アルキル、低級ア ルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキ ル；１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル；脂環式；複 素環式；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特 性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた めの基であり；Ｒ′およびＲ′′はＨであり；またはＲ′はＨでありかっＲ′′ はＯ−Ｒであり；またはＲ′およびＲ′′は合わさって＝０であり；ＸはＨ；Ｏ −Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ； ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロア ルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミ ノ；置換シリル；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動 態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有することを特徴とする方法。
37. ３７．蛋白質の望まれない生成により特徴付けられる疾患を持つ生物を処置する 方法であって、該生物と高分子とを接触させることを含み、ここで該高分子の少 なくとも一部は以下の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１またはＬ２の一つはＯまたはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一つはＮ −Ｒであり；Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であるか、またはＬ３はＣＨ２ であり、かつＬ４はＣＲ′Ｒ′′であり；またはＬ３またはＬ４の一つはＯまた はＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ１およびＬ２は 合わさってＣＨ２であるか、またはＬ２はＣＨ２でありかつＬ１はＣＲ′Ｒ′′ であり；またはＬ１またはＬ４の一つはＯ、ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬ１お よびＬ４の他の一つはＣＲ′Ｒ′′であり；Ｌ２およびＬ３はＣＨ２であり；ま たはＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、一緒になってＯ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ２または ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−Ｏであり；または Ｌ１はＯであり；Ｌ２はＮであり；Ｌ３はＣＨ２であり；かつＬ４はＣまたはＣ Ｈであり；およびＬ２、Ｌ３およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはヘ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成し；またはＬ１はＣまたはＣＨで あり；Ｌ２はＣＨ２であり；Ｌ３はＮであり；かつＬ４はＯであり；およびＬ１ ，Ｌ２およびＬ３は少なくとも二つの追加の炭素またはヘテロ原子と一緒になっ て５または６員環を形成し；ＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級 アルキルまたは置換低級アルキル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の低級ア ルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２から１０の直鎖または分岐鎖の低級ア ルキニルまたは置換低級アルキニル；１４Ｃ含有低級アルキル、低級アルケニル または低級アルキニル；Ｃ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル；１４ Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル；脂環式；複素環式； レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良 するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基で あり；Ｒ′およびＲ′′はＨであり；またはＲ′はＨでありかつＲ′′はＯ−Ｒ であり；またはＲ′およびＲ′′は合わさって＝Ｏであり；ＸはＨ；Ｏ−Ｒ；Ｓ −Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ；ＳＯＣＨ ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル； ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換 シリル；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特 性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた めの基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな整数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である）を有することを特徴とする方法。
38. ３８．配列特異的核酸をアッセイする方法であって、該核酸を含む試験溶液と高 分子とを接触させることを含み、ここで該高分子の少なくとも一部は以下の構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｌ１またはＬ２の一つは０またはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一つはＮ −Ｒであり；Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であるか、またはＬ３はＣＨ２ であり、かつＬ４はＣＲ′Ｒ′′であり；またはＬ３またはＬ４の一つはＯまた はＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ１およびＬ２は 合わさってＣＨ２であるか、またはＬ２はＣＨ２でありかつＬ１はＣＲ′Ｒ′′ であり；またはＬｌまたはＬ４の一つはＯ、ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬ１お よびＬ４の他の一つはＣＲ′Ｒ′′であり；Ｌ２およびＬ３はＣＨ２であり；ま たはＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は一緒になってＯ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ２またはＣ Ｈ２−ＣＨ＝Ｎ−Ｏであり；または Ｌ１はＯであり；Ｌ２はＮであり；Ｌ３はＣＨ２であり；かつＬ４はＣまたはＣ Ｈであり；およびＬ２、Ｌ３およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはヘ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成Ｌ；またはＬ１はＣまたはＣＨで あり；Ｌ２はＣＨ２であり；Ｌ３はＮであり；かつＬ４はＯであり；およびＬ１ ，Ｌ２およびＬ３は少なくとも二つの追加の炭素またはヘテロ原子と一緒になっ て５または６員環を形成Ｌ；およびＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキルまたは置換低級アルキル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の 低級アルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２からＣｌｏの直鎖または分岐鎖 の低級アルキニルまたは置換低級アルキニル；１４Ｃ含有低級アルキル、低級ア ルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキ ル；１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル；脂環式；複 素環式；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特 性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた めの基であり；Ｒ１およびＲ′′はＨであり；またはＲ′はＨでありかつＲ′′ はＯ−Ｒであり；またはＲ′およびＲ′′は合わさって＝Ｏであり；ＸはＨ；Ｏ −Ｒ；Ｓ−Ｒ；ＮＨ−Ｒ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；ＯＣＮ； ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロア ルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミ ノ；置換シリル；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動 態学的特性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改 良するための基であり； ＱはＯまたはＣＨ２であり； ｎは０より大きな並数であり；および Ｂｘは可変の複素環式塩基部分である を有することを特徴とする方法。
39. ３９．第１のヌクレオシドの３′位および第２のヌクレオシドの４′位が結合− Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−（式中 Ｌ１またはＬ２の一つはＯまたはＳであり、かつＬ１またはＬ２の他の一つはＮ −Ｒであり；Ｌ３およびＬ４は合わさってＣＨ２であるか、またはＬ３はＣＨ２ であり、かつＬ４はＣＲ′Ｒ′′であり；またはＬ３またはＬ４の一つはＯまた はＳであり、かつＬ３またはＬ４の他の一つはＮ−Ｒであり；Ｌ１およびＬ２は 合わさってＣＨ２であるか、またはＬ２はＣＨ２でありかつＬ１はＣＲ′Ｒ′′ であり；またはＬ１またはＬ４の一つはＯ、ＳまたはＮ−Ｒであり、かつＬ１お よびＬ４の他の一つはＣＲ′Ｒ′′であり；Ｌ２およびＬ３はＣＨ２であり；ま たはＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、一緒になってＯ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＨ２または ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−Ｏであり；または Ｌ１はＯであり；Ｌ２はＮであり；Ｌ３はＣＨ２であり；かつＬ４はＣまたはＣ Ｈであり；およびＬ２、Ｌ３およびＬ４は少なくとも二つの追加の炭素またはヘ テロ原子と一緒になって５または６員環を形成Ｌ；またはＬ１はＣまたはＣＨで あり；Ｌ２はＣＨ２であり；Ｌ３はＮであり；かつＬ４はＯであり；およびＬ１ ，Ｌ２およびＬ３は少なくとも二つの追加の炭素またはヘテロ原子と一緒になっ て５または６員環を形成し；およびＲはＨ；Ｃ１からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキルまたは置換低級アルキル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖の 低級アルケニルまたは置換低級アルケニル；Ｃ２からＣ１０の直鎖または分岐鎖 の低級アルキニルまたは置換低級アルキニル；１４Ｃ含有低級アルキル、低級ア ルケニルまたは低級アルキニル；Ｃ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキ ル；１４Ｃ含有のＣ７からＣ１４のアルカリールまたはアラルキル；脂環式；複 素環式；レポーター分子；ＲＮＡ切断基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特 性を改良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた めの基であり；およびＲ′およびＲ′′はＨであり；またはＲ′はＨでありかつ Ｒ′′はＯ−Ｒであり；またはＲ′およびＲ′′は合わさって＝Ｏである）によ り連結された第１のヌクレオシドおよび第２のヌクレオシドを含む化合物。
40. ４０．Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４の少なくとも一つがＯまたはＳであり、およ びＬ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４の別の少なくとも一つがＮ−Ｒである請求項第３ ９項に記載の化合物。