JPH02282396A - 再生骨髄から同定された骨形成成長ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨髄切除後に原始骨（ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｏｎｅ）の小
柱が血餅に代わって髄腔を満たす骨形酸相があることは
よく知られている。この小柱は次に破骨細胞の吸収を受
けて正常な再生骨髄が生じる。髄腔に於て局在的に骨形
成反応があるだけでなく皮質骨で骨形成の刺激があり、
離れた骨格部位で骨及び軟骨形成が増大する。脛骨値の
切除後癒合の骨形酸相で下顎骨類についての観察は増大
した骨形成が骨芽細胞の数及び活性共シコ増加を生じる
ことを示唆した。血液循環に放出された後末梢骨形成応
答を仲介する因子が再生骨髄によって局在的に生産され
ることは提案されている。パブ（Ｂａｂ）　Ｉ　、等（
１９８８年）内分泌学第１２３巻、３４５頁、パブ、■
０等（１９８５年）Ｃａｌｃｉｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉｎ
ｔ第３７巻、５５１頁。

本発明は再生骨髄が骨形成細胞に作用する成長因子活性
を生じることを確立する。また本発明は、再生骨髄から
同定された（ｉ）骨芽細胞に刺激作用を有し、（ｎ）生
体内骨形成を促進する新規な骨形成成長ポリペプチドを
提供する。

本発明の新規な骨形成成長ポリペプチドはヒストンＨ４
，１０２個のアミノ酸タンパク質及びヒストンＨ４のフ
ラグメントと配列相同性を有する。カイネ（Ｋａｙｎｅ
）　Ｐ、　Ｓ。

等、（１，９８８年）細胞第５５巻、２７〜３９頁、カ
ルチェンホ（Ｋｈａｒｃｈｅｎｈｏ）　Ｅ、Ｐ。

等（１９８７年）　Ｂｉｕｌｌ、、　Ｅｋｓｐ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｍｅｄ。

第１０３巻（４）、４１８〜４２０頁。しかしながらこ
れらの文献には本発明の範囲内のポリペプチドを開示し
ておらず、本発明のポリペプチドの生物特性はいずれも
開示していない。

本発明は骨芽細胞に刺激作用を有しく］ｉ）生体内骨形
成を促進する新しく分離した生化学的に純粋なポリペプ
チド（又はポリペプチド群）を提供する。このポリペプ
チドは再生骨髄から同定された。本発明はまたポリペプ
チドを再生骨髄から分離する方法及び骨形成を増大させ
るためにポリペプチドを使用する方法を提供する。本発
明の新規なポリペプチドはスクリーニング手段として及
び骨欠損、骨喪失や骨形成低下を含む病気の予防（ｐｒ
ｅｖｅｎｔｉｏｎ、　ｐｒｏｐｈｙｌａｘｊ、ｓ）や治
療（ｔｈｅｒａｐｙ、　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）又は増大
した骨形成の恩恵を受ける他の症状に医薬組成物として
有用である。

骨形成成長ポリペプチド（○ａｐ’）は再生骨髄から同
定され骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形成する生化
学的に純粋なポリペプチドである。本明細書で用いられ
るＯＧＰは天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、全同
族体、イソ型タンパク質又は遺伝的変異体及び他の全変
異体を含むものとする。ＯＧＰの分子量は約５００〜２
６００好適には約１０００〜１６００更に好適には約１
５２５の範囲にある。

ＯＧＰは再生（又は癒合）骨髄調整培地（ＨＢＭＣＭ）
から異なる３段階で精製し、段階１及び２Ａは部分純粋
であり、段階２Ｂは明らかに均一であった。

本発明は骨形成の有効な促進剤として１４残基ポリペプ
チドを同定する。天然ＯＧＰを分離し、切除後骨髄再生
中のラット脛骨から得た骨形成組織によって調整した培
地（ＨＢＭＣＭ）から均一性に精製した。精製方法はサ
イズ排除クロマトグラフィー、ヘパリン−セファロース
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及
び逆相クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーか
らなリ、クロマＩ〜グラフィー選択画分は生物活性を示
した。

マイトジェン活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｊ
ｔｙ）の証明に従い、精製ポリペプチドＯＧＰをアミノ
酸配列の自動エドマン分解にかけた。同一配列の合成ポ
リペブチｊ〜は固相ペブチ１〜合成によって調製した。

合成ポリペプチドＯＧＰ　（ｓＯＧＰ）を試験し、骨芽
細胞に刺激作用を有することが判明した。約２００〜２
５０ｇの成体ラットに毎日静脈注射すると、５ＯＧＰは
約１ｐｇ／ラッ１−／日から約１μｇ／ラット／日まで
の用量で骨形成を促進した（鉱質付着率として測定）。

データはＯＧＰが同定された配列の１本のポリペプチド
であるがＯＧＰの同族体イソ型又は遺伝的変異体の可能
性がいかなる細胞条件にも存在することを示唆する。本
発明はＯＧＰのそのような同族体、イソ型又は遺伝的変
異体の全てを包含するが但し、各々は骨芽細胞に作用し
、生体内で骨形成する。詳細にはＯＧＰの同族体である
ポリペプチドは表Ａに示されるアミノ酸配列に関して少
なくとも約４０％好適には約６０％更に好適には少なく
とも約７５％保存されたアミノ酸配列を有するものを包
含する。

○ａｐの他の変異体が本発明の範囲内に包含されること
は当業者に理解されるであろう。

特にこれは保護性アミノ酸置換基でのみ分離又は合成Ｏ
ＧＦと異なるいかなる変異体をも包含する。このような
多くの保存性アミノ酸置換基はティラー（Ｔａｙｌｏｒ
）、　Ｗ、　Ｒ，Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、第１８８巻、２３３頁（１９８６
年）でセットとして述べられている。本出頭に於てＯＧ
Ｐ又はそのフラグメントは保存性アミノ酸置換、欠損あ
るいは他のプロセスによるいずれにせよアミノ酸配列の
そのような変異を包含するが、但し精製後のポリペプチ
ドは骨芽細胞に刺激作用及び生体内骨形成を示す。ＯＧ
Ｐのフラグメントはわずか６個以上のアミノ酸の配列を
有する／ｌ）さなペプチド＝７ ＝８− であり、該配列は表Ａに開示されるものである。

ＯＧＰより大きなポリペプチドも該ポリペプチドが骨芽
細胞に刺激作用を有し、生体内で骨形成するとき本発明
の範囲内に包含され、表Ａに示される一部アミノ酸配列
又はその保存性置換体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　５
ｕｂｓｔｉｔｕｔｊｏｎｓ）を含む。

ＯＧＰのアミノ酸配列は次の通りである。

表Ａ Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−ＬｅｕＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ多くの利用がＯＧＰのアミノ酸配列で作ること
ができることは当業者に容易に明らかになるであろう。

例えばオリゴヌクレオチドプローブはアミノ酸配列から
構成されＯＧＰをエンコードするｃＤＮＡクローンをふ
るい分けるために使用することができる。０ＧＰｃＤＮ
Ａ（ｓ）を含むこれらのクローンはｍＲＮＡを転写する
ためしこ使用することができ次に翻訳表現することがで
きる。ＯＧＰによるこの研究は遺伝子工学によって大量
のＯＧＰを生産するために又はＯＧＰの遺伝学を研究し
て骨形成に於ける細胞の役割を知るために使用すること
ができる。

また合成ポリペプチドはＯＧＰの薬理学的性質を改良す
るために生成することができる。これらの合成ペプチド
はメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）　（”固相
ペプチド合成”、酵素学の進歩、第３２巻、２２１〜２
９６頁、１９６９年）Ｇ、バーナイ（Ｂａｒｎａｙ）及
びＲ，Ｂ、メリフィールド１１固相ペプチド合成”ペプ
チド第２巻、Ｅ、グロス及びＪ、メレンホール（Ｍｅｒ
ｅｎｈｏｌｅ）編集（１９８０年）によって開発された
同相ペプチド合成手法によって生成することができる。

この方法はカルボキシル末端を有するペプチドを固体支
持体に共有結合させる方法に基づく。望ましいペプチド
配列はカルボキシルからアミノ末端に向かって成長する
ペプチド鎖に１本のアミノ酸を逐次カップリングするこ
とによって調製される。カップリングは典型的には保護
した別の潜在的反応基を有してもよい樹脂に結合するア
ミノ酸のカルボキシル基を活性化することによって達成
される。成長ポリペプチド鎖にアミノ酸を付加した後、
また鎖を延長する前に保護基が典型的には除去される。

各アミノ酸がほとんど同じ一連の反応によって結合する
ために、合成に於て緻密な手順の必要性は最小限となる
。溶解度はペプチドが固体支持体に結合するため合成中
主要な問題ではない。この方法は迅速であり簡単に利用
することができる。１回の合成がアミノ末端付近で多方
向に枝分かれしてアミノ末端領域でのみ異なっている多
くの類似体を生成するのでアミノ末端置換基を有する多
くの類似体の合成には非常に便利である。

またアミノ酸配列は骨芽細胞に刺激作用を示し、生体内
で骨形成を示す非ペプチド分の確認のためにスクリーン
又は手段として使用することができるポリペプチドを生
成するために用いることができる。

本発明のポリペプチドはまた骨粗髭症 （又はあらゆる病因のオステオベニア（ｏｓｔｅ。

ｐｅｎｉａ）　）、骨折修復、骨欠損又は挫傷の癒合、
骨内インブラント及び骨補充又は骨形成の促進を必要と
する他の症状の場合に骨形成の促進に有用である。

本発明のポリペプチドは骨形成の整復並びに上で述べた
他の症状を含む病気の治療又は予防に医薬組成物中に含
めることができる。

本発明のポリペプチドの予防又は治療投与量の程度は勿
論患者の種類（年齢、性別等）治療される症状の種類又
は程度及び本発明の個々のポリペプチドとその投与経路
で異なる。一般に骨形成を促進する用途には日用量は哺
乳動物の体重１ｋｇ当り約４Ｐｇ〜５μｇの範囲にある
。

本発明のポリペプチドの有効な投薬量を哺乳動物特にヒ
トに与えるために適当ないかなる投与経路も使用するこ
とができる。例えば口、直腸、局所、非経口、眼、鼻、
舌下、バッカル、静脈内等からの投与を使用することが
できる。投薬形は錠剤、１−ローチ剤１分散液剤、懸濁
液剤、液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏、エアロゾ
ル剤等を含む。該投薬形はまた特にこの目的に設計され
た遅放出性充填器具又はこの方式で更に作用させるため
に改良した他の形のインブラン１−を含む。

本発明の医薬組成物は有効成分として本発明のポリペプ
チド又はその医薬的に使用し得る塩を包含し、また医薬
的に使用し得る担体及び任意に他の治療成分も含むこと
ができる。″医薬的に使用し得る塩″という用語は無機
塩基及び有機塩基を含む医薬的に使用し得る無毒性の塩
基から調製した塩を意味する。組成物は口、直腸、眼、
肺、鼻、舌下、皮膚、局所からの投与又は非経口（皮下
、粘膜下、筋肉内、静脈内及び動脈内を含む）投与に適
した組成物を含むが、いかなる場合でも最適な経路は治
療される症状の種類や程度及び有効成分の種類に依存す
る。これらは単位投薬形態として、製薬上よく知られた
いかなる方法によっても調製できることが便利である。

吸入法によって投与するには、本発明のポリペプチドを
エアロゾルの形体で圧力容器又は噴霧器から供給するか
あるいは適当な器具で粉体として吸入されるようなカー
トリッジとして供給するのが便利である。１回に一定量
を吸入（Ｍｒ）Ｉ）するエアロゾルの場合の吸入法に好
適な供給系は過フッ化炭化水素推進薬の懸濁液又は溶液
として処方することができる。

適当な局所処方は経皮手段、エアロゾル剤、クリーム剤
、軟膏、ローション剤、微粉末散剤等を含む。

実際の使用では本発明のポリペプチドを有効成分として
通常の医薬配合手法により医薬担体と緊密に混和して混
合することができる。担体は投与、例えば経口又は昇級
１１（静脈内、動脈内を含む）に望ましい調製形態によ
り種々の形を用いることができる。組成物を経口投薬形
に調製するために経口液状製剤例えば懸濁液剤、エリキ
シル剤、液剤の場合には水、グリコール類、油類、アル
コール類、香味剤、防腐剤、着色剤等、経口固形製剤、
例えば散剤カプセル剤、錠剤の場合にはデンプン、乳糖
、微品性セルロース、賦形剤、顆粒剤、滑沢剤、結合剤
、崩壊剤のような通常のいかなる医薬媒体も使用するこ
とができる。

投与が簡単なため、錠剤及びカプセル剤が最も都合の良
い経口投薬単位形であり、この場合、固形の医薬担体を
使用することは明らかである。所望により錠剤は常法に
より糖衣又は腸溶皮とすることができる。

」二で示した一般の投薬形のほかに本発明のポリペプチ
ドは制御された放出手段及び／又は供給器具によって投
与することができる。

経口投与に適した本発明の医薬組成物は分離している単
位、例えば各々所定量の有効成分を含むカプセル剤、オ
ブラー１〜包、又は錠剤として粉末又は顆粒剤として又
は水溶液、水分散液、非水媒体溶液又は分散液、水中油
型エマルジョン、油中水型エマルジョンとして供給され
る。このような組成物はいかなる製薬法によって調製し
てもよいが、必ず有効成分と１種以上の必要成分を構成
する担体とを混ぜる工程が含まれる。一般に本組成物は
、有効成分と液体担体又は微粉固体担体又は液体、固体
両担体とを均一に密接に混合し、必要に応じて混合物を
所望の形体に成形することによって調製される。例えば
錠剤は適宜１種以上の所要成分と共に圧縮又は型にはめ
て成形することによって調製することができる。

圧縮錠剤は粉体又は粒体等、自由流動性の有効成分を任
意の結合剤、滑沢剤、不活性賦形剤、表面活性剤又は分
散性薬剤と混合し、適当な機械で圧縮成形することによ
って調製される。型による錠剤は、粉状の本化合物を不
＝１５ 活性の液状賦形剤で湿らせた混合物を適当な機械で成型
することによって得られる。

以下実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例に限定されるものではない。

実施例１（段階１精製） 材料 アルカリ性ホスファターゼ活性のアッセイ用試薬、コラ
ゲナーゼ■型トリプシン、ダイズ１−リプシン阻害因子
−アガロース（ＳＴ工）、ＢＧＪ培地（フィットンージ
ャクソン修飾）ビタミンＣ、ウシ膵臓インシュリン及び
ヒ１〜血清アルブミンはシグマケミカル社から購入した
。（セントルイスＭＯ）、Ｆ−１０（Ｈａｍ）培地（栄
養素混合物）、ウシ胎児血清（ＦＣ８）、ダルベツコＰ
ＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液はギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）　（チャグリンフォールス、ＯＨ）から
入手した。

［メチル−”　Ｈ］チミジン（［３Ｈ］　ＴｄＲ）（５
ｍＣｉ／ｍＣ上ル）はヌクレア　リサーチセンター（ネ
ゲブ、イスラエル）から入手した。セファデックスＧ−
２５、セファデックスＧ−７５及びヘパリン−セファロ
ースＣＬ−６Ｂはファーマシア（７ツプサラ、スウェー
デン）から購入した。ミリポア膜はシュライチャーアン
ドシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ
）　（ダッセル、西独）から人手した。

血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）はバイオメディカルテ
クノロジーズ（ストロウトン（Ｓｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）
、ＭＡ）から、ヒト組換え体インターロイキンＩ−ａ（
ＩＬＬ）はシストロン（パインプルツク（Ｐｊｎｅ　Ｂ
ｒｏｏｋ、　ＮＪ）から購入した。他の薬品はすへて分
析用であり、メルクＡＧ（ダルムスタット（Ｄａｒｍｓ
ｔａｄｔ）、西独）から購入した。組織培養皿はヌンク
（ロスキルデ、デンマーク）から入手した。ＰＤＧＦに
対するウサギポリクローナル抗血清はＤｒ、Ｃ，Ｈ，ヘ
ルジン（アップサラ大学、スウェーデン）より提供され
た。

方法 癒合骨髄調整培地（Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｍ　ＣＭ　）の調製前
述のヘブライ大学（サブラ、イスラエル）血統の各々４
００ｇの雄うッ１−の肢から脛骨髄を切除した。Ｂａｂ
、１．等（１，９８５年）、Ｃａ１ｃｉｆ　Ｔｉ５ｓｕ
ｅ　Ｉｎｔ第３７巻、５５１頁、簡単に言えば骨幹に直
径２ｍｍの穴を隣接面の増殖プレートの大きさ内であけ
た。次にその穴に挿入し、強力吸引装置に取り付けたポ
リエチレンカニユーレを用いて骨髄腔から組織を除去し
た。処理した骨を１０日後に切開し、骨幹を縦に分解し
て骨髄腔にさらした。次に癒合組織を皮質の骨内膜部か
ら除き、１％（容量／容量）ペニシリン−ストレプトマ
イシンで補足した血清を含まないＦ−１０培地の十分量
で洗浄し、同じ培地（１肢からの組織／培地１ｍＱ）で
５％ＣＯ□−空気中３７℃に於て２４４時間装置た。次
に培地を集め、２５．０００ｘｇで３０分間遠心分離し
、上清を０．４５ｍｍ　孔サイズミリボア膜によりミ濾
過した。この調製物を粗ＨＢ　Ｍ　ＣＭと呼びそのタン
パク質含有量は３〜８　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑであった。

コールドチミジン、組織培地の成分、及び他の低分子量
混入物を除去するために粗ＨＢ　Ｍ　ＣＭを５ｍＭ酢酸
アンモニウムで平衡にしたセファデックスＧ−２５カラ
ムでゲルミ濾過にかけた。標準実験ではタンパク質６ｍ
ｇ又は３５ｍｇを各々ＰＤ−１０又は２．６Ｘ７Ｏｃｍ
カラムに注いだ。画分を５ｍＭ酢酸アンモニウムで溶離
し、無効量のタンパク質を含むものをプールし、凍結乾
燥し。

７０℃で貯蔵した。以後の実験では試料を解凍し、ＰＢ
Ｓに溶解した。

骨芽細胞に対する成長促進活性の監視 骨芽細胞ラットの骨肉腫細胞（ＲＯ８ １７／２）の培養液でＤＮＡ合成についての作用を調べ
ることによって成長因子活性（ＧＦＡ）を監視した。Ｒ
Ｏ８−１，７／２の貯蔵培養液を１０％ＦＣ８を含むＦ
−１０培地に維持した。異なる調製物のマイトジェン作
用を研究するために融合培養液をトリプシン処理し、２
×１０４細胞をＦ−１０培地中２０ｍ２培養ウェル（１
６ｍ　ｍマルチウェル皿）に接種し。

ＣＯ□−空気中３７°Ｃで装置した。まず６時間の間に
培地を２％ＦＣ８で補足して細胞の足場を増加させた。

次にこれをＰＢＳ中タンパク質溶液として加えた試験調
製物を含む血清を含まない培地で１８８時間装置た。Ｄ
ＮＡ合成率を決定するために培養液に温置時間の最後の
２時間に［’　Ｈ］　Ｔ　ｄ　Ｒ１、５ｍ　Ｃｉ／ウェ
ルをパルスした。このパルスは水冷却１０％（重量／容
量）トリクロロ酢酸で２回エタノール−エーテル（３：
１、容量／容量）で洗浄して停止した。細胞層を乾燥し
た後、トリクロロ酢酸不溶物質を０．２ＭＮａＯＨに溶
解し、全放射能を液体シンチレーション分光測定で算出
した。データは成長因子単位（Ｇ　Ｆ　Ｕ）として表わ
した。ＲＯ３細胞の増殖が血清依存性であるため、ＩＵ
は一定の実験に於て１０％ＦＣ８の作用の１／２と定義
した。細胞数は試験調製物に４８時間さらに姉妹培養液
で求めた。これはトリプシン処理後、固定量血球計数器
を用いて行なわれた。データは１培養ウェル当りの細胞
数として表わした。

タンパク質０　、５〜１　、０　ｍ　ｇを含むＨＢＭＣ
Ｍの１　ｍ　Ｑアリコートを室温に放置するか又は５６
℃に３０〜６０分間加熱した。また同様の試料を１ｏ分
間煮沸に対するＧＦＡの安定性を試験した。ＧＦＡは煮
沸操作に安定であることがわかった（表１）ので煮沸工
程を変性及び２５．ＯｏＯｘｇで４５分間遠心分離して
外来性タンパク質を除去するために用いた。

アフイニティーグロマトグラフイー ヘパリンーセファロース力ラム（０，９Ｘ２５ｃｍ床容
量）を製造業者の指示書に従い調製しＰＢＳを充填し、
室温に於て流速０．６ｍＭ／分でポンプで送った。０．
１５ＭＮａＣＱ　（ＰＢＳ）で平衡状態にあることを示
したヘパリン−セファロースパッチ式を用いる予備実験
ではＧＦＡが不溶基質に非結合のままであった。従って
Ｉ）　Ｂ　Ｓ中煮沸ＨＢ　ＭＣＭ　３０　ｍ　ｇを含む
２ｍＱ試料をカラムに充填し、ＰＢＳ２４ｍＱで床を洗
浄して溶離した。溶出液を５ｍＭ酢酸アンモニウムに対
して２４時間透析し、タンパク質を算定し凍結乾燥した
。

ゲルシミ濾過 次にＨＢＭＣＭ由来因子を精製するために、ヘパリン−
セファロースカラムから回収したタンパク質０　、５−
６　、０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑを５ｍＭ酢酸アンモニウ
ム１　ｍ　Ｑに溶解し、同溶液で平衡にした１、２Ｘ５
４ｃｍセファデックスＧ−７５カラムに注いだ。タンパ
ク質試料を室温で５ｍＭ酢酸アンモニウムを用いて流速
０．６５ｍ１２／分で溶離した。画分１．　、３　ｍ　
Ｑをタンパク質に対して算出し、凍結乾燥した。

１−リプシン消化 ＨＢ　Ｍ　ＣＭ由来因子のタンパク質性を確認するため
にヘパリン−セファロース工程後のＨＢ　Ｍ　ＣＭの１
．　ｍ　Ｑアリコートをトリプシン（トリプシン／ＨＢ
ＭＣＭ比１：２０重量／重量）と２５℃で素置した。反
応を停止して３０分後にこの混合液をＳＴＩのカラム（
０，４Ｘ１ｃｍ）に注いだ。対照は反応混合液にトリプ
シンを存在させないで同様に処理した試料からなるもの
とした。

他の細胞及び器官培養液 ＨＢ　Ｍ　ＣＭ由来因子の骨形成細胞に対する特異性を
研究するために、活性調製物を骨芽細胞及び非骨芽細胞
胎児うット頭蓋冠細胞（ＦＲＣ細胞）及び非骨形成ラッ
ト骨肉腫細胞（ＲＯ８２５／１）についてマイトジェン
効果を試験した。培養液をＣＯ２−空気中３７℃で均一
に維持した。全ての実験に於て試験調製物をＰＢＳ中タ
ンパク質溶液として培養液に加えた。

ＲＯ８細胞 ＲＯ８２５／１細胞を上述したＲＯ８１，７／２細胞と
同じプロトコールを用いて培養試験した。

凡ＲＣ細胞 ２１日目のラット胎児の骨壁から得た細胞を一次培養で
使用した。５個の細胞集団をルベン（Ｌｕｂｅｎ）等（
１９７６年）内分泌学第９９巻、５２６頁に記載される
方法に従いコラゲナーゼとトリプシンで逐次消化して分
離した。集団１〜２及び３〜５からの細胞をプールし、
各々非骨芽細胞及び骨芽細胞を示した。１６ｍｍマルチ
ウェル皿に１ウェル当り３Ｘ１．Ｏ’細胞で細胞を接種
し、１０％ＦＣ８で補足したＦ−１０培地で２４時間増
殖させた。次に培地を１％ＦＣ８のものに置き換え、２
４時間後に調製物及び［３Ｈ］Ｔｃ１Ｒ１，５ｍＣ１／
ウェルを加えた。［３ＨコＴｄＲのＤＮＡへの取り込み
と細胞数を更に２４時間後」二連の通り算出した。

胎児マウス長管 これをソスコルネ（Ｓｏｓｃｏｌ、ｎｅ）等（１９８６
年）前筒７巻、４１頁に記載される通り行なった。簡単
に言えば１６日目の胎児から撓骨及び尺骨を取り除き筋
肉及び軟質組織から分けた。次にこれをビタミンＣｌ５
０ｍｇ／ｍＱとヒ１−血清アルブミン４　ｍ　ｇ　／　
ｍ　Ｑで補足した化学的に規定された培地（Ｂ　Ｇ　Ｊ
　、フィットンージャクソン修飾）で培養した。リン酸
濃度を１ｍＭに調節した。個々の骨の原基痕跡の全骨及
び骨幹長を培養開始時に及び４８時間後に透過光を用い
た解剖顕微鏡下で直接測定した。全骨あるいは骨幹の延
長はこれらの測定値の差として計算し、結果は成長因子
で処理した骨と化学的に規定された培地のみで増殖させ
た対照間の比として表わした（Ｔ／Ｃ比） アルカリ性ホスファターゼ活性 このアッセイのためにＲＯ８１７／２細胞の培養液から
培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し蒸留水にかき染め
音波処理した。、　ｌｖ素活性をアシ１〜ン（Ａｓｈｔ
ｏｎ）等（１９８４年）Ｃａｌｃｉｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　
Ｉｎｔ第３６巻、８３頁に記載される通り基質としてリ
ン酸ｐ−ニトロフェニルを用いて検定した。結果は１分
／姉妹培養液で計数した１０６細胞当り放出されたｐニ
トロフェノールのミクロモルどして表わした。

タンパク含有量 ブラトフ：ｋ　−Ｆ　（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）　（１９７
６年）Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第７２巻、２４８
頁の方法に従い、タンパク質を定景した。

ＩＬＬ活性の算定 バラク（Ｂａｒａｋ）等（１９８６年）、Ｊ、　Ｂｊｏ
ｌ。

Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｊｆｊｅｓ第５巻、３６２頁
に記載される胸腺細胞増殖アッセイを用いてＩ　Ｌ　］
−活性を算定した。

ＰＤＧＦに対するアッセイ 抗−ＰＤＧＦ抗体中和実験をＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆに対してウ
サギで調製したポリクローナル抗血清を用いて行なった
。ＰＤＧＦ又はＨＢＭＣＭ由来調製物をＲＯＳ　１７／
２細胞に抗体を存在させであるいは存在させずに加えて
［３Ｈ］ＴｄＲ取り込みについて効果を試験した。

蟇−来 ＲＯＳ１．７／２の数及びアルカリ性ホスファターゼ活
性について粗ＨＢＭＣＭの作用を確立した。最高稀釈度
の粗ＨＢＭ、ＣＭ（１：２０ｏ）では細胞数が７５％減
少し、酵素活性が２倍以上増加した。低希釈度１：１０
０〜１：１０では細胞の数が未処理培養液に比べて約２
倍以上増加し、アルカリ性ホスファターゼ活性は用量依
存性低下を示した。

粗ＨＢＭＣＭをセファデックスＧ−２５カラムによるゲ
ルミ濾過にかけたとき約８０％の添加タンパク質が無効
量（ｖｏｊ−ｄ　ｖｏｌｕｍｅ）の両分に回収された。

マイトジェン活性のほとんど全て（９４％）を含むこれ
らの両分がカラムから溶離した。

ＧＦＡについて加熱効果 Ｈ　Ｂ　Ｍ　Ｃ　Ｍ由来ＧＦＡについての加熱効果を表
１−に要約する。ＧＦＵは成長因子単位である。ＩＵは
同じ実験で１０％ＦＣＳの効果の１／２として定義した
。

表　　１ 血清を含まないＲＤＳ　１７／２細胞培養液のＨＢＭＣ
Ｍマイトジェン活性（［３Ｈ］ＴｄＲのＤＮＡへの取り
込み）について加熱効果因子１ １４ＢＭＣＭ（６０分，ＲＴ） ）ＩＢＭＣＭ（３０分，５６℃） ＨＢＭＣＭ（６０分，６０℃） ＨＢＭＣＭ（１０分，煮沸） 数７分−　　　　ＧＦＵ− ２０３８±３０４　　　０．２９±０．０５２７９２±
１２５　　　０．５９±０．０７３２１３±　８９　　
　０．８２±０．０５５８２０±２４３　　　２．８２
±０．１８温度あるいは反応時間の上昇についてＲＯＳ
１７／２細胞のＤＮＡへ［３Ｈ］ＴｄＲの取り込みにつ
いてＨ　Ｂ　Ｍ　Ｃ　Ｍの促進効果が増加した。特に１
０分間煮沸した後のマイ１〜ジエン活性に著しい増加が
あり、煮沸及び遠心分離で得た上清のマイトジェン活性
はＦＣＳと同様であった。タンパク質の半分は煮沸及び
遠心分離により比活性が８倍増加して除去することがで
きた（表２）。ＲＯＳ　１’７／２細胞アツセイに於て
煮沸調製物の用量応答関係は０、５〜５ｍｇ／ウェルで
著しいＧＦＡを示し、より高い用量では低下した。また
煮沸調製物の活性はＦＲＣ細胞集団３〜５（骨芽細胞集
団）のプール培養液に０．５ｍｇを加えたとき認められ
た。

ＲＴ．室温 因子濃度は３　、　６　ｍ　ｇ　／　ｍ　＋２である。

ｂ　４回くり返した培養ウェルの平均±ＳＥ表　　２ 煮沸によるＨ　Ｂ　Ｍ　ＣＭ由来成長因子の部分精製及
びヘパリン−セファロースによるアフィニティークロマ
１−グラフィー 沸 ２．５ ２．２３０ ４粗ＨＢＭＣＭ　１ｒｒ＋Ｑから アフィニティークロマ１〜グラフイー ’ｔｌＨＢＭｃＭをヘパリン−セファロースカラムに充
填すると適用したタンパク質の２０％がＰＢＳによって
溶離され残りのタンパク質は結合したままであった。Ｐ
ＢＳによって溶離された両分に回収されたマイトジェン
活性は比活性が１３倍増加した（表２）。

またヘパリン−セファロース工程後ＧＦＡの促進は用量
応答関係で示されＲＯ３１７／２細胞の効果は５０　ｎ
ｇ／ウェルで明らがであった。ＤＮＡ合成率のピーク刺
激は０．５μに／ウェルであり、その後低下した。また
ヘパリン−セファロースを用いて得られた調製物は骨芽
細胞ＦＲＣに著しいマイトジェン効果があった。ヘパリ
ン−セファロースカラムがら回収した物質をトリプシン
消化にかけたとき、ＨＢＭＣＭ由来ＧＦＡが９５％以上
阻害された（表３）。

表　　３ ヘパリン−セファロースのクロマトグラフィー処理ＨＢ
　Ｍ　ＣＭによるＲＯ８１７／２細胞ＤＮＡ合成の刺激
しこついて１−リプシン消化の効果調製物の添加見　　
　　数７分−ＧＦＵＨＢ　Ｍ　Ｃ阿Ｃ７２４５±３５７
　３．５９±０．２８ＨＢＭＣＭ＋ＳＴＩ’　　　　　
　　　　　　　　６３０９＋６８３　　　２．８９＋０
．５２１１Ｂ）ｉｃＭ＋　トＩＪプシン＋ＳＴＩ　　１
５０２＋　６９　０．１３＋０．０５血清を含まない対
照　　１３３０±７５血清（１０％）対照　　　　３９
９８＋　６８ａ特にことわらない限り血清を含まないｂ
４回くり返した培養ウェルの平均±ＳＥＣヘパリンーセ
ファロースクロマトグラフィーで得られたＨＢＭＣＭ調
製物の培養液につき２μｇ ｄヘパリン−セファロース及びダイス１−リプシン阻害
因子（ＳＴＩ）−アガロースクロマトグラフィー処理後
に得られたＨ　Ｂ　Ｍ　ＣＭ調製物の培養液につき２μ
ｇ セファデックスＧ７５によるゲルシミ濾過ＲＯ８１７／
２細胞のＤＮＡへの［３Ｈ］ＴｄＲ取り込みの促進によ
って表わされたセファデックス０７５カラムからＧＦＡ
の溶離状況が確立された。はとんどのタンパク質及びい
くらかのマイ１〜ジエン活性がカラムの無効量近くまで
溶離した。３本の大きなピークの活性は両分１９〜３８
で溶創した。分子量マーカーの溶離位置に基づき、３本
のピークの分子量推定値は３５，０００．１９，０００
及び１０，０００以下であった。

非骨芽細胞ＲＯ８２５／１　細胞はＲＯＳエフ／２細胞
と同じ腫瘍から得たが後者と異なり、これらは骨芽細胞
表現型を示さなかった。特にヘパリン−セファロース工
程後に得られたものは、ＲＯ３１’７／２細胞に促進し
たと同じ濃度のＲＯ８２５／１細胞培養液でいくらかマ
イトジェン応答をもたらした。しかしながら、ＲＯ８２
５／Ｌ細胞応答の強さはＲＯ８１’７／２細胞に比較し
てかなり小さかった。またＨ　Ｂ　Ｍ　ＣＭ由来調製物
は、非骨芽細胞ＦＲＣ細胞（集団１〜２）のＤＮＡ合成
率について効果は明らかではなかった。

煮沸ＨＢ　Ｍ　ＣＭを胎児撓骨と尺骨の器官培養に加え
たとき、骨幹及び全骨の両延長の増加によって示される
増殖の著しい用量依存性促進があった。ピーク効果は８
μｇ　／　ｍ　Ｑタンパク質濃度で見られた。この濃度
に於て骨幹及び全骨の長さの増加は成長因子を含まない
対照の各々約２００％及び２５０％であった。骨幹と全
原基痕跡間の延長の大きさの差は軟骨性置端の増殖促進
から生じた。煮沸ＨＢＭＣＭのピーク効果は正のインシ
ュリン対照のほぼ２倍であった。

ＩＬＬ活性に対する胸腺細胞増殖アッセイ表４はＩＬＬ
調製物と異なり、煮沸ＨＢＭＣＭではなくヘパリン−セ
ファ０−ス工程後に得られた誘導体でもないＰＨＡを含
む培地中で［３Ｈ］　ＴｄＲの胸腺細胞ＤＮＡへの取り
込みを刺激したことを示し、ＨＢＭＣＭ由来成長因子が
ＩＬＬと似ていないことを示唆した。

表４ 分離したマウスの胸腺細胞のＤＮＡへの［”Ｈ］ＴｄＲ
取り込みについてＩＬＬとＨＢＭＣＭ調製物の効果 煮沸）ＩＢＭｃＭ　　　　　０．４　μｇ／ｍｌ　　　
　　１７７０±１３４．０μｇ／ｍｌ　　　　　　　１
６１３±１１Ｈ３−ＨＢＭＣＭ　ｃＯ、７１Ｌ　ｇ／ｍ
ｌ　　　　　　２６６７±　５１．１μｇ／ｍｌ　　　
　　　２２９０　＋　１７ＩＬＬ’　　　　　　　　　
５．ＯＵ　／ｍ１．　　　　　７６３４±３５ＩＬ１°
　　　　　　　　５．ＯＵ　／ｍｌ　　　　　　６５３
２±３０ＰＨＡ　　　　　　　　　　１０．ＯｔＬ　ｇ
／ｍｌ　　　　　　２５９０±２Ｏ−ＰＨＡ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４００　＋４６ａＨＢＭ
ＣＭとＩＬＬ調製物はＰＨＡｌ、（Ｃ０ｍ　ｇ　／　ｍ
　Ｑの存在下で試験した。

ｂ　８個の培養ミクロウェルの平均ｌ５ＥＣヘパリン−
セファロース工程後のＨＢＭＣＭ ｄ　ヒト単核細胞から ｅ　ヒト組換え体 一３５＝ ＰＤＧＦ含有量 ポリクローナル抗−Ｉ）　Ｄ　Ｇ　Ｆ抗体をＲＯ３１７
／２細胞に加えるとＰＤＧＦ−刺激複製を阻害したが煮
沸ＨＢ　Ｍ　ＣＭとヘパリン−セファロース工程後に得
られた調製物の中間用量で生じたマイトジェン効果を減
少しなかった。これらの条件下でＨＢＭＣＭ由来調製物
にＰＤＧＦの有為量を存在させると抗血清で試験したと
きＲＯ８細胞増殖の促進が低下するはずである。

実施例２（工程２Ａ精製） 材料及び方法 材料 Ｆ−１０（ＲＡＭ）培地（栄養素混合物）、ウシ胎児血
清（Ｆｅ２）、ダルベツコのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）及びペニシリン−ストレゾ１−マイシン溶液はギブコ
（チャグリンフォールス、ＯＨ）から入手した。［メチ
ル−３Ｈコチミジン（［Ｈ］　ＴｄＲ）（５μＣｉ　／
ミリモル）はヌクレアリサーチセンター（ネゲブ、イス
ラエル）から入手した。ヘパリン−セファロースＣＬ−
６Ｂはファーマシア（アップサラ、スウェーデン）から
購入した。

アルカリ性フォスファターゼアッセイに対する試薬はシ
グマ（セントルイス、ＭＯ）からＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ
、　Ｇ　Ｅに対する薬品はバイオ−ラド（リッチセント
、ＣＡ）から入手した。形質転換成長因子β１　（ＴＧ
Ｆβ１）及びβ２（ＴＧＦβ２）はＲ＆ｂシステムス（
ミネアポリス、ＭＮ）から入手した。インシュリン様成
長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）はメルク　シャープアンド　ド
ーム　リサーチラボラドリース、ラーウェイ、ＮＪから
入手した。他の全ての薬品は分析用であり、メルクＡＧ
（ダルムスタッ１〜、西独）から購入した。ラット骨肉
腫（ＲＯ８）細胞はＤｒｓ、Ｇ、Ａ及びＳ、Ｂ。

ロダン（メルク　シャープアンド　ドーム　Ｉ）。

サーチ　ラボラドリース、ウェストポイントＰＡ）から
入手した。組織培養皿はヌンク（ロスキルデ、デンマー
ク）から入手した。

癒合骨髄調整培地（ＨＢ　Ｍ　ＣＭ　）の調製前述のハ
ブ、■０等（１９８８年）内分泌学第１２３巻、３４５
頁により癒合骨髄から調整培地を調製した。簡単に言え
ば切除して１０日後にラット脛骨の１ｔｉｌｆｆｆ仝か
ら組織を分離し、１％（容ｆｋ／容ｆｆ１）ペニシリン
ースＩ−レプ１〜マイシンで補足した血清を含まないＦ
１０培地中で５％ＣＯ２−空気中３７℃で２４時間温装
置た。次に培地を集め、１０分間煮沸し、２５．○ＯＯ
ｘｇで３０分間遠心分離し、０．４５μｍ孔サイズミリ
ボア膜によりミ濾過した。

細胞培養液 骨形成ＲＯ３］、７／２細胞の培養液中でＤＮＡ合成の
効果を試験することによって成長因子活性（ＧＦＡ）を
監視した。要するにＨＢ　Ｍ　ＣＭ由来調製物及び他の
成長因子を血清を含まないＦ　−］−０培地中ＲＯ８細
胞を含む２ｃｍ２培養ウエル（１６ｍｍマルチウェル皿
）に加えた。２２時間後、培養液に［３Ｈ］Ｔ　ｄ　Ｒ
、２μＣｊ、　／　ｍ　Ｑをパルスした。２時間後、ト
リクロロ酢酸不溶物質の全放射能を液体シンチレーショ
ン分光測定で定量し、データを未処理培養液又は成長因
子単位（ＧＦＵ）の％として表わした。１単位は一定の
実験に於て１０％ウシ胎児血清効果の１／２として定義
した。ＨＢＭＣＭ誘導体の骨形成細胞に対する特異性を
算出するために上述のＲＯ８１７／２細胞と同じプロト
コールを用いて非骨形成ＲＯ８２５／１細胞の培養液中
で試験した。

アフィニティークロマトグラフィー ヘパリン−セファロースカラム（０，９／２５ｃｍ床容
量）を製造業者の指示書に従い調製し、Ｉ’ＢＳで充填
し、室温に於て流速０．５ｍＱ／分でポンプで送った。

ＰＢＳ中煮沸ＨＢ　Ｍ　ＣＭ　２８　ｍ　ｇを含む２　
ｍ　Ｑ試料をカラムに充填し、２段階で溶離した。まず
ヘパリン−セファロース床をＰＢＳで２００分間インク
ラチカルに洗浄した。次にリン酸緩衝液ｐＨ７，２中０
．１５−１．３５Ｍ　ＮａＣ１１の２段階線状勾配をカ
ラムよりポンプで送った。勾配速度は段階工及び■中容
々０．０１５Ｍ／分及び０．００５Ｍ／分であった。両
分２ｍＱを集め５ｍＭ酢酸アンモニウムに対して２４時
間透析し、タンパク質を算出し、凍結乾燥した。

不活性化実験 約１０　Ｇ　Ｆ　Ｕを含むヘパリン−セファロースピー
ク活性画分の試料を水に溶解し、（ａ）５ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）（ｂ）０．１Ｍ　ＨＣ，Ｑ　（ｃ
）ＰＢＳ対照と３７°Ｃで９０分間反応させた。反応は
冷所で５ｍＭ酢酸アンモニウムを５時間透析して停止し
た。

ゲル電気泳動 ５ＤＳ−ＰＡＧＥはレムリ、ネイチュア第２２７巻、６
８０頁（１９７０年）に従って１．５ｍｍ厚さの１０〜
１８％勾配で行なった。

アルカリ性ホスファターゼ活性 このアッセイのために２％ＦＢＳで補足したＦ−１０培
地でＲＯ８１，７／２細胞を４８時間増殖させた。最後
の２４時間の間にこの細胞を煮沸あるいは非煮沸調整培
地１０μｇ／ｍΩ又はヘパリン−セファロースピーク活
性画分２μｇ　／　ｍ　Ｑで攻撃した。次に培地を培養
液から取り除き細胞をＰＢＳで洗浄し、蒸留水にかき集
め音波処理した。酵素活性を基質としてリン酸Ｐ−ニト
ロフェノールを用いて検定した。この結果は１分／姉妹
培養液で計数した１０６細胞当り放出されたＰ−ニトロ
フェニルのミクロモルとして表わした。

タンパク質含有量 タンパク質をプラトフォード、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｍ、第７２巻、２４８頁（１９７６年）の方法に従
い定量した。

結果 ＲＯ８１７／２細胞のＤＮＡへの［３Ｈ］ＴｄＲ取り込
みの促進によって表わされるヘパリン−セファロースカ
ラムからＧＦＡの溶離状況を得た。

米−−１ ヘバリン−セファロースクロマ１−グラフィーのＨＢ　
Ｍ　ＣＭ由来成長因子活性溶離時間１及び最大ピーク活
性２ 段階工：　０．１５阿ＮａＣ］　によるインクラチック
溶離ＡＨ５６，４，０，６２±０．０６　　　３．１２
１　　　１３０　　　　１、．５５±０．０５　　　０
．６１ＡＩＵ　　　１８４　　　　１．．０２±０．０
４　　　０．１３段段階　：０，１５−１．３５　Ｎａ
Ｃ１勾配による溶離ＢＴ　　　　　７゜３．　　　１．
００±０．０４　　　１．０６Ｂｌｌ　　　　３９　　
　　　］、、５９±０．０２　　　０．８０８ｍ　　　
１３０　　　　０．８４＋０．０４　　　０．０６１溶
離時間は各段階の始めから別々に示す。

２活性をアッセイした両分試料はタンパク質２ｍｇ／ｍ
Ｑを含有した。データは１条件につき３回くり返した培
養液の平均ＩＳＥである。

３つの大きなピーク、活性、ＡＩ、Ａｎ及びＡｍはカラ
ムをＰＢＳでイソクラチカルに洗浄したとき溶離した（
表５）。調製物Ａ−■及び特にＡ−ＩＴはＤＴＴによる
低下及びＨＣＱによる酸性化にかなり安定であった（表
６）。

表　　６ ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーによって分
離したＨ　Ｂ　Ｍ、　ＣＭ由来ＧＦＡピークの安定性 処理　　　　　Ａ−Ｉ　　　Ａ−ＩＩ　　　Ｂ−１１残
存する活性％ 煮沸（ＩＩＢＭｃ阿）　　　　１．００　　１００　　
　１００５　ｍＭ　ＤＴＴ　　　　　６８　　　９１．
　　　　５０．１ＭＩ＋Ｃ１６８７７７５ 次にＡ−工及びＡ−１１の両方が還元及び非還元ゲルに
ついて同様に見えた場合還元に対する耐性をゲル電気泳
動によって確認した。

Ａ−４はゲルの先端近くに移動する成分及び６０〜７５
ＫＤの　２．３の追加成分を含有した。カラムをＮａＣ
Ｑｆｉ度勾配を用いてポンプで送ったときＢ−１，Ｂ−
Ｈ及びＢ−ＩＩ＋を示す各ＧＦＡピークは各々０．３．
０．７５．１．２Ｍ塩で分割した。調製物Ｂ−１１は還
元により不活性化され（表６）、還元ゲルについて若干
５５〜８０ＫＤバンドを示した。また１３−Ｉ及びＢ−
ＩＩは各々１４及び３３ＫＤバンドを含有した。調製物
へ−■及びＢ−ＩＩ＋に回収されたタンパク質の量は不
活性化及び電気泳動実験の試験に不十分であった。

煮沸前の調整培地はＲＯ８細胞アルカリ性ホスファター
ゼに影響を及ぼさなかった。調整物Ａ−Ｈ１Ｉ３−Ｉｆ
及びＢ−ｍは酵素活性をほとんど２倍に刺激した。しか
しながら、ＨＢ　Ｍ　ＣＭを試験したとき最も高い促進
効果が見られた（３００％）。

非骨形成ＲＯ８２５／１細胞はＲＯ８ １７／　２と同じ腫瘍から得られているが後者と異なり
骨形成表現型を表わさない。調製物Ａ−１１はＲＯ８２
５／１細胞のＤＮＡに［”Ｈ］ＴｄＲの取り込みを刺激
しなかった。

八−■はいくらか刺激を示したがＲＯ８１７／２細胞の
効果の４０％だけであった。

１３−Ｉは両細胞の種類で同様の効果を示した。

討論 骨形酸相では再生骨髄は骨形成細胞に成長促進活性を生
じる。本結果はＨＢＭＣＭ中の活性がヘパリン−セファ
ロースアフィニティークロマトグラフィーによって分離
可能な少なくとも６種の独立した活性に分けられること
を示す。同様に脱石灰化した骨基質から得た成長因子活
性はヘパリン−セファロースにより分離可能でもあるい
くつかタンパク質性の種類からなることは証明されてい
る。ＨＢＭＣＭでの複数のピークは異なった″担体”タ
ンパク質を有する因子のタンパク質分解又は集合に理論
的には起因するが、これは（ａ）培地を調整次に処理し
ている間にプロテイナーゼ阻害因子の介在物がヘパリン
ーセファロ−スからの溶離状況を変えなかったこと、及
び（ｂ）安定性及び標的細胞作用に関して個々のＧＦＡ
ピークの特性が明らかに異なることのためありそうもな
い。

実施例３（段階２Ｂ：ＯＧＰの精製及びアミノ酸配列） 材料 Ｆ−１０（ＨＡ、Ｍ）培地（栄養素混合物）及びカナマ
イシンスルフニー１〜はグランドアイランドバイオロジ
カル（グランドアイランド、ＮＹ）から入手した。ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）はハゼルトン／ＫＣバイオロジカル
ス（レネタＫＳ）から入手した。［メチル−３■（］チ
ミジン（［３Ｈ］　ＴｄＲ）（６，７Ｃ５７５９モル）
はニューイングランドヌクレア（ボストン、Ｍ　ａ　）
から購入した。１−ランス−エポキシ−スクシニル−ロ
イシル−アミド（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ６４．）
、ロイペプチン及びペプスタチンはシグマケミカル社（
セントルイス、ＭＯ）から入手した。ヘパリン−セファ
ロースＣＬ−６Ｂ及びセファデックスＧ２５はファーマ
シア（アップサラ、スウェーデン）から人手した。組織
培養皿はコスタ−（ケンブリッジ、Ｍ　ａ　）の生成物
である。

友−辺。

ＨＴ３　Ｍ　ＣＭからＧＦＡの部分精製１−Ｔ　Ｂ　Ｍ
　ＣＭを」二連の通り（実施例１及び２）調製し、バブ
■０等（１９８８年）内分泌学第１２３巻、３４５頁で
報告されたプロトコールを変更して煮沸及びヘパリン−
セファロースクロマトグラフィーにより部分精製した。

ＨＢ　Ｍ　ＣＭ　ｒｅ　１０分間煮沸し、次に冷却した
遠心機で２５，０００ｘｇに於て４５分間遠心分離した
。上清を集め次のプロティナーゼ阻害因子２５μＭ　Ｅ
６４．２５μＭロイペプチン及び５μＭペプスタチンで
補足した。また同じプロティナーゼ阻害因子の混合液を
ヘパリン−セファロース、ゲルミ濾過及びイオン交換工
程（以下参照）から順次回収した調製物に加えた。

アフィニティークロマトグラフィー ヘパリン−セファロ−７、カラム（１．、６Ｘ２４　ｃ
ｍ床容量）を製造業者の指示書に従って調製し、リン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）で平衡にし、４℃に於て流速０．
５ｍｆｆ　７分でポンプで送った。タンパク質１００ｍ
ｇを含む煮沸１（　Ｂ　Ｍ　Ｃ　Ｍをカラムに通過させ
た。次にこのカラムをＰＢＳ５０ｍΩで洗浄した。次し
こ回収された調整培地及びＰＢＳをプールし、凍結乾燥
した。一部処理したＧＦＡを精製に十分な量で蓄積する
ためにヘパリン−セファロース工程を繰り返して行なっ
た。

骨形成細胞に於けるＧＦＡの監視 これはペニシリンース１ーレプトマイシンをカナマイシ
ン−スルフェートに置き換えたほかは上述した通り（実
施例工）、骨芽細胞ＲＯＳ　１７／２細胞で行なった。

この結果はＧＦＵ又はＰＢＳ対照の％として表わした。

イオン交換クロマトグラフィー 塩、コールドチミジン及び組織培地の他の成分を除去す
るために、ヘパリン−セファロースカラムから回収した
調製物を少量の水に溶解し、予め充填されたセファデッ
クスＧ２５カラム（ＦＤ−１０）に通過させた。酢酸ア
ンモニウム（　５　ｍ．　Ｍ　）をカラム平衡及び溶離
のために用いた。複数カラムからの無効量を集め、ＲＯ
Ｓ　１７／２細胞でＧＦＡを示す両分をプールし、凍結
乾燥した。

イオン交換グロマ１〜グラブイーのために５０ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液（ＳＡＢ）、ＰＨ＝５−０を凍結乾燥
物質１　ｍ　（Ｌ　／　１．　６　５ｍｇタンパク質に
加えた。この混合液を１　０、０００ｘｇで１５分間遠
心分離し、混合液中タンパク質約８５％を含む沈降物を
捨てた。タンパク質０．４〜７．０ｍｇを含む上清試料
をウォーターズ６５０　　アドバンストプロティン　ビ
ュリフイケーションシステム（ミリボア　コーポレーシ
ョン、ミルフォード、ＭＡ）を用いるモノ−ＳＨＲ５１
５ファース１〜プロティン液体クロマ１へグラフィー（
ＦＰＬＣ）カチオン交換カラム（ファーマシア、アップ
サラ、スウェーデン）によりクロマ１−グラフィー処理
した。このカラムは３段階でｉ開始ＳＡＢを用いてイソ
クラチカルに３分１ｉｓＡＢ中０　１．ＯＭ　ＮａＣＱ
を用いて３０分線状勾配装ｉｉ　Ｓ　Ａ　Ｂ中１．０Ｍ
ＮａＣＱを用いて７分、流速１ｍｆｌ／分でポンプで送
った。

画分１ｍＱを集め、タンパク質約３０ｎｇを含む試料を
ＧＦＡに対して検定した。各両分の結果はタンパク質を
充填せずに同じ操作でカラムから得られた対応する画分
からなるペアの対照試料の％として表わした。

逆　クロマトグラフィー ＧＦＡを示す複数のイオン交換実験からの両分をプール
し、推定全タンバク質含有量ｉ８μｇを含む３．２ｍＱ
をＣＩ　／　Ｃ８ＰｒｏＲＰＣＨＲ５／　２　Ｆ　Ｐ　
Ｌ　Ｃ逆相カラム（ファーマシア、アップサラ、スウェ
ーデン）に充填した。

この方ラムを０．１％トリフルオロアセテート（ＴＦＡ
）を含む０〜１００％アセトニトリル勾配を用いて流速
０．５ｍＱ／分で溶離した。

各々０．５ｍｆｌの両分を集め、スピードバク（Ｓｐｅ
ｅｄｖａｃ）コンセントレータ−（サノベント（Ｓａｖ
ａｎｔ）、ファーミングデイル（Ｆａｒｍｊｎｇｄａｌ
ｅ）ＮＹ）で乾燥した。これの前に各両分の１０μＱア
リコートを別々に乾燥しＰＢＳに再溶解し、ＧＦＡを検
定した。

ヱ主ス遺髪医抜定 ＧＦＡを示す逆相カラムから回収された両分をプールし
、タンパク質〜３０ｎｇを含む試料をオンラインＰ　Ｔ
　Ｈ分析計、モデル１２ＯＡ　を備えた気相プロティン
シークエンサーモデル４７０Ａでアミノ酸配列決定用の
自動エドマン分解にかけたくアプライドバイオシステム
入社、ホスターシティ−１ＣＡ）　、。

叉乞パ久ヌ１玉遣− 」二連の通りタンパク質を定量した（実施例１）。

結果 逆相クロマトグラフィー 逆相クロマトグラフィーの溶離を第１図に示す。タンパ
ク質を２本の小さなピーク（溶離時間２７分、３６分）
及び１本の大きなピーク（溶離時間４５分）で回収した
。〜２７％アセトニトリルに対応する溶離時間１９〜２
２分後にＧＦＡの大きなピークを回収した。

マイトジェン有効画分で回収したタンパク質のアミノ酸
配列（溶離時間１９〜２２分、第２図）は１４残基ペプ
チド、分子量１５２３を示した。この調製物中細の混入
ペプチドの存在は証明されなかった。配列は表Ａに示さ
れる。

実施例４ 合成ＯＧＰの生物活性 材料 ｔ−Ｂ　ｏ　ｃ−Ｇ　Ｑ　ｙ　　ＯＣＨ２−Ｐａｍ樹脂
、Ｎ−Ｂｏａ保護アミノ酸誘導体、Ｎ、Ｎジシクロへキ
シルカルボジイミド（ＤＤＣ）、１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジイソプロピルエチルアミ
ン（ＤＩＥＡ）、トリプルオロ酢酸（ＴＦＡ）　、Ｎ、
Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びジクロロメタン
（ＤＣＭ）はアプライドバイオシステム入社（ホスター
シティ−１ＣＡ）から入手した。

フッ化水素（ＨＦ）はマテソン（Ｍａｔｈｅｓｏｎ　）
（セカクス、ＮＪ）、ｐ−クレゾールはアルドリッヒケ
ミカル社（ミルウォーキー、ＷＩ）、セファデックスＧ
１５Ｆはファーマシア（アップサラ、スウェーデン）か
ら購入したｅＦ−１０（Ｉｉ　Ａ　Ｍ　）培地（栄養素
混合物）及びカナマイシンスルフェートはグランドアイ
ランドバイオロジカル（グランドアイランド、ＮＹ）か
ら入手し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はポリサイエンシズ
社（ウオーリントン、ＰＡ）から入手した。体重２４０
〜２６０ｇの雄のスプラグ−ダウレイラットはタコニッ
クファーム、ＮＹから入手した。アクロマイシン（テト
ラサイクリン塩酸塩）はレダリー（Ｌｅｄｅｒｌｅ）　
（パールリバー、ＮＹ）　、テラマイシン（オキシナ１
ヘラサイクリン）はローリノジーファイザー（Ｒｏｅｒ
ｊｇ−Ｐｆｉｚｅｒ）　にューヨーク、ＮＹ）から人手
した。メチルメタアクリレート包埋樹脂成分は　ノイッ
シャーサイエンティフィック（フェアローン、Ｎ　、７
　）の生成物である。

方法 合成ＯＧＰ　（ｓＯＧＰ）の調製 ５ＯＧＰはアプライドバイオシステムスモデル４３０Ａ
自動ペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステ
ム入社、ホスターシティ−ＣＡ）を用いてメリフィール
ド（１９６９年）Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、第３２巻
、２２】頁の固相法によって合成した。この合成は０．
５ミリモルのｔ−Ｂ　ｏ　ｃ　−Ｇ　Ｑ　ｙ　−ＯＣＨ
２−Ｐａｍ樹脂（１％架橋、０．７８ミリモル／ｇ）で
行なった。アミノ酸誘導体はｔ−ブチルオキシカルボニ
ル（Ｂｏｃ）基でα−アミノ官能基を保護した。側鎖の
保護はＡｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（２−ＣＱ−Ｚ）、Ｔ
ｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）及びＴｈ　ｒ　（０−Ｂ　ｚ　Ｑ
）とした。Ａ　ｒ　ｇ及びＧＱｎのＢｏｃ保護誘遵体の
カップリングはコニグ（Ｋｏｎｉｇ）　Ｗ、及びゲイガ
ー（Ｇｅｉｇｅｒ）Ｒ（１９’７０年）　、Ｃｈｅｍ、
　Ｂｅｒ、第１０３巻、７８８頁のＤＣＣ−ＨＯＢＴ法
による。他の全てのアミノ酸誘導体はハゲマイア（Ｈａ
ｇｅ−ｍａｉｅｒ）　Ｈ及びフランクＨ（１９７２年）
、ホップーセイラーのＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、第３５３巻、１９７３年のＤＣＣ仲介プレフォーム
シンメトリカルアンドヒドリド法により結合した。各ア
ミノ酸残基のカップリングは２回繰り返した。閉塞アミ
ノ末端はＤＣＭ中６０％ＴＦＡで処理して脱保護した。

側鎖を脱保護し、ペプチドはＨＦ方法を用いて樹脂（樹
脂結合ペプチド２．７ｇ）から分離し、この場合アニソ
ール４ＩＩｌΩと液体ＨＦ３６ｍＱの混合液を０℃で７
５分間用いた。粗合成ペプチドは５０％（容量／容量）
酢酸水溶液で溶離されるセファデックス０１５Ｆ３Ｘ３
５ｃｍカラムにより部分精製した。次にプレパり１００
０モジユール（ミリボア　コーポレーション、ミルホー
ド、ＭＡ）を備えたウォーターズデルタプレプ３０００
高圧液体クロマトグラフィー装置により精製を達成した
。

カートリッジは０゜１％ＴＦＡを含む　５〜３３．５％
アセトニトリル勾配を用いて流速１ｏＯｍＱ／分でポン
プで送った。

骨について５ＯＧＰの生体内効果 ＰＢＳ中ｓ　ＯＧ　Ｐ溶液を尾静脈より毎日、８日間で
１００μＱ／日／ラットをラットに投与した。対照動物
にはＰＢＳ単独又は逆配列５ＯＧＰを有するペプチドを
投与した。これらのラットにテトラサイクリンで２回、
２日と８日に６　ｍ　ｇアクロマイシン及びテラマイシ
ン（水中）を各々筋肉注射して標識した。

これらのラットの頚部を脱臼して犠牲にし、脛骨を分離
し、７０％エタノールで固定した。

次にこの標本を脱水し、メチルメタクリレートに包埋し
、脱石灰化されてなく染色されていない切片１０μｍを
蛍光顕微鏡にかけた。

マギスカン相互作用像アナライザー（ジョイスーレブル
（Ｊｏｙｃｅ−Ｌｏｅｂｌ）、ガテスヘッド（Ｇａｔｅ
ｓｈｅａｄ　）　Ｕ　Ｋ　）に接続したＳＩＴビデオカ
メラ（デージ−ＭＴＩ、ミシガンシティーＩＮ）を備え
たミクロホトエピフルオレッセント　ミクロスコープに
コン、日本）の４８０ｎｍフルオレセインフィルターを
用いて蛍光像を記録した。皮質−骨内膜面及び隣接骨幹
端出柱面の測定は×５５０倍のアナライザースクリーン
で行なった。二重標識の分離は１．０個の顕微鏡視野の
二重標識全ゾーン中ライン中央の間の複数測定値の平均
として測定した。鉱質付着率（ＭＡＲ）は標識間の時間
の１日当りのミクロメーターとして示した。

結果 ５ＯＧＰを８匹に静脈注射すると脛骨の皮質−骨内膜及
び骨幹端小柱両面はＭＡＲの増加を示した（第２図）。

有効用量範囲は０．１〜３０ｎｇ／ラッ１〜／日であっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は陽イオン交換クロマトグラフィーによって得ら
れたＧＦＡのＣ１／Ｃ８逆相クロマトグラフィーを示す
。実線はＲＯ８１７／２細胞培養液に於けるＤＮＡ合成
率を示す。データは３回の培養からの平均ｎＩ数／分で
ある。ピーク領域の全画分並びに他の全データ点は平均
のＳＤ＜１．０％であった。点線はタンパク質含有量を
示す。 第２図はラット脛骨の皮質骨内膜（ａ）及び骨幹端小柱
（ｂ）面の鉱質付着率（ＭＡＲ）について５ＯＧＰの効
果を示す。データは４匹（１，００ｐ　ｇと３００ｐｙ
群）又は５匹（他の群）のラットの１匹当り１脛骨の測
定値平均±ＳＤである。 ５ＯＧＰＶ：Ｖ埴（ｐ９／ラット／　］月ＦＩＧ、　２
ａ ｓＯＧＰン１Ｊ７ｉｔ　（ｐ９　／　　ラット／　　日
　）ＦＩＧ、　２ｂ 手続補正書 平成２年５月２２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量約５００〜２６００を有し、 骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形成する生化学的に
   純粋なポリペプチド（ＯＧＰ）。 ２、表Ａに示されるアミノ酸配列に関して少なくとも約
   ４０％保存されたアミノ酸配列を有する請求項１記載の
   ポリペプチド。 ３、表Ａに示されるものと実質的に同じアミノ酸配列を
   有する請求項２記載のポリペプチド。 ４、再生骨髄に見い出される請求項１記載のポリペプチ
   ド。 ５、各々が骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形成する 【アミノ酸配列があります】 又はその保存性置換体の一部アミノ酸配列を有する１種
   以上のポリペプチドを包含している骨形成成長ポリペプ
   チド。 ６、配列が請求項５記載のポリペプチドである６個以上
   のアミノ酸を有する小ペプチドを包含している請求項５
   記載の骨形成成長ポリペプチドフラグメント。 ７、再生骨髄から生化学デブリを含まないポリペプチド
   を分離することを特徴とする請求項１記載の骨形成成長
   ポリペプチドの製造方法。 ８、請求項１記載のポリペプチドの治療上有効な量を哺
   乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物の骨形成を
   増大させる方法。 ９、（ａ）分子を請求項１記載のポリペプチドと接触さ
   せ （ｂ）骨芽細胞についての作用及び生体内骨形成を分子
   を存在させないときの作用に比べて測定する ことを特徴とする骨芽細胞に刺激作用し、生体内で骨形
   成する分子の同定方法。 １０、請求項１記載のポリペプチドの治療上有効な量及
   び医薬的に使用し得る担体を包含している骨形成を増大
   させるための医薬組成物。