JPH0219338A

JPH0219338A - 天燃源からポリ不飽和脂肪酸を抽出精製する方法

Info

Publication number: JPH0219338A
Application number: JP15918588A
Authority: JP
Inventors: Lubin David; デビット・ルウビン; J Lubin Eiriau; エイリアウ・ジェイ・ルウビン
Original assignee: Century Laboratories Inc
Current assignee: Century Laboratories Inc
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1988-06-29
Publication date: 1990-01-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】見逃Δ技先公界本発明は、天然のポリ不飽和脂肪酸源からポリ不飽和脂
肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　
ａｃｉｄ）を分離する方法に関するものであり、更に詳
細には、海水動物油といった天然起源のオイルから実質
的に純粋なＥＩ’Ａ及びＤ　ＨＡを分離する方法に関す
るものであり、そしてまた本発明は、一般的に安全と認
識されている材料のみを使用し温和な反応条件のみを用
いる方法に関するものであって、得られた物質は、シス
−トランス転位（ｃｉｓ−ｔｒａｎｓｃｏｖｅｒｓｉｏ
ｎ）のない実質的に１００％純粋なものであり、食品及
び薬品に使用できるものである。

主凱■漕景各種脂肪及び脂油は、脂肪酸のトリグリセリドから成る
ものである。多くの脂肪酸、特にポリ不飽和脂肪酸は１
合成することが難しく、したがってこれら脂肪酸が天然
的に存在するところの天然の脂肪又は脂油から抽出する
ことによってのみ得られている。これら不飽和脂肪酸の
内、多くのものは治療ポテンシャル（ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有することが知られて
いる。その他のものは好ましい作用効果を有するものと
考えられている。

また、治療ポテンシャルを有する脂肪酸は、特定のシス
−トランス異性体の形になければならない。

このような不飽和脂肪酸を、純粋な形で多量に且つシス
−トランス転化（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を生じること
なく、取得する方法が長い間求められていた。

治療効果を有し、そして純粋な形でしかもそれを多量に
取得するのが困難であった２つの特定のポリ不飽和脂肪
酸は５次のとおりである：　（すべての２の）　−５，
８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（（ａｌ
ｌ−ｚ）−５，８，１！、　１４．１７−ｅｉｃｏｓａ
ｐｅｎｔａ−ｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、以下これをＥＰ
Ａという、及び（すべてＺの）　−４，７，１，０，１
３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（（ａｌｌ−ｚ）
−４，７，１０，１３，１６，１９−ｄｏｃｏｓａｈａ
−ｘａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）　、以下これをＤＨＡと
いう。ＥＰＡ及びＤ　ＨＡは、いずれも、プロスタグラ
ンジンＰＧＥ、生合成におけるプレカーサーとして知ら
れているものである。

英国特許第１　、６０４　、５５４号及び第２，０３３
，７４５号は、血栓異常の治療及び予防におけるＥＰＡ
の効果について開示をしている。また、本発明者に係る
英国特許公報第２，１４８，７１３号は、血清コレステ
ロール及びトリグリセライドレベルを低下せしめるため
に、他の特定の脂肪酸とＥＰＡ及び／又はＤ　ＨＡとを
併用することについて開示をしている。

従来、純粋なＥＰＡ及びＤＨＡを得ることは非常に困難
であった。その理由は、これら脂肪酸の主たる起源が、
サバ、イワシまたはタラといった海産動物の油脂及び亜
麻仁油といった植物油それ自体、又は、トリグリセライ
ドといったこれら油脂類の誘導体だからである。運の悪
いことに、これら脂肪酸以外の脂肪酸が、常に大量に含
まれているのである。ＥＰＡ及びＤＨＡは医薬効果を有
するものとして知られているので、臨床研究を行うため
には、高度に純粋なＥＰＡ及びＤＨＡが大量に必要にな
ったのである。

ＥＰＡ、ＤＨＡ及びその他有用な高級不飽和脂肪酸をそ
れらのトリグリセライドから抽出するための従来法は、
高度に純粋な脂肪酸を製造するには満足できるものでは
なかった。ここで用いられるパ純粋（ｐｕｒｉｔｙ）”
という語は、鎖長が異なりそしてまた不飽和部分（ｕｎ
ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）の数及び位置が異なる他の脂肪
酸をすべて分離する意味で用いられるだけでなく、特定
のシス−トランス構造という面からも純粋であることを
意味するものである。従来法では、充分な純度が得られ
ないだけでなく、多くの場合従来法は、極端な物理的及
び化学的条件を必要とするので、脂肪酸の減成（ｄｅｇ
ｒａｄａｔｉｏｎ）、ペルオキシドの生成、及び／又は
少なくともいくつかのシス−結合のトランス−形への転
化（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が、ある程度、ひきおこさ
れることになる。更にまた、合衆国食品医薬品局（ＦＤ
Ａ）の一般的に安全として認識されているもの（Ｇｅｎ
ｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　Ａｓ　５ａｆｅ
）（ＧＲＡＳ）にはリストアツブされていない材料（１
ｍａｔｅｒｉａｌ）が１．数多くの従来法では用いられ
ている。最終生産物が食品や医薬品において使用される
ためには、最終生産物中に非−ＧＲＡＳ物質（ｓｕｂｓ
ｔａｎｃｅｓ）が存在しないことが重要なのである。

ＥＰＡを精製する従来法の１つは、米国特許第４．３７
７．５２６号に開示されている。この特許では、飽和脂
肪酸及び不飽和度が比較的低い脂肪酸を除去するために
、ＥＰＡを含む脂肪酸混合物を尿素で処理している。そ
の結果得た溶液は、次いで。

ＥＰＡの収率を更に高めるために、分別蒸留処理する。

しかしながら、分別蒸留を行うには、少なくとも１８０
℃の温度が少なくとも４０分間に亘って（ｏｖｅｒ　ａ
　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ）必要である。この特許のすべて
の実施例に示されており、この方法によって得ることの
できる最高の純度は、　９２．９％である。更にまた、
この方法によって製造された実質量のＥＰＡ、いくつか
の場合にはその量は２０％の高きに達するが、この実質
的量のＥＰＡにはある程度のシス−トランス転化が存す
ること、も発見された。

ＥＰＡのトランス一体は１食品又は医薬品に使用するに
はいかなる量でも完全に有害なのである。

Ａｂｕ−Ｎａｓｒ、　Ａ、　Ｎ、他、Ｊ、　Ａｍ、　Ｏ
ｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ。

Ｓｏｃ、、　３１．４１〜４５（１９４５）は、次のこ
とを開示している：尿素コンプレックス沈澱及びそれに
続いて行うクロマトグラフィ分離による予備濃縮処理を
行うことによって、タラの肝油酸を出発原料としてメチ
ル　エイコサペンタエノエート（ｍｅｔｈｙｌｅｉｃｏ
ｓａｐｅｎｔａｅｎｏａｔｅ）及びエチル　ドコサヘキ
サエノエート（ｅｔｈｙｌ　ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎ
ｏａｔｅ）を分離すること、を開示している。この技術
では充分に高い純度が得られないし、クロマト分離には
大量の溶媒が必要であって望ましくない。

Ｔｅ５ｈｉｎｉａ、　Ｓ、他、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ
　ｔｈｅ　Ｊａ　ａｎｅｓｅＳｏｃｉｅｔ　　ｏｆ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ、　４４（８
）、　９２７（１９７８）には、ヤリイカ肝油を原料と
し、これをエタノール性水酸化カリウムでケン化し、エ
ーテルで脂肪酸を抽出し、そしてメチル化することによ
って、ＥＰＡ及びＤＨＡを単離する方法が記載されてい
る。粗製の脂肪酸メチルエステルは、シリカゲル６０　
（Ｓｉｌｉｃａ　Ｇｅｌ　６０）上でのカラムクロマト
グラフィーによって精製し、次いで、硝酸銀とシリカゲ
ルとの混合物上でのカラムクロマトグラフィーによって
ＥＰＡをＤＨＡから分離する。この技術の問題点は、最
終製品中に痕跡量の銀がしばしば残存することであり、
これは、ヒトが消費する食品又は医薬品において極めて
有害なものなのである。更にまた、カラムクロマトグラ
フィーを行うためには、非常に大量の溶媒が必要である
。

ある程度までＥＰＡを分離、精製するためにカラムクロ
マトグラフィーを使用する点についての開示は、上記の
ほか、日本の時開５６−１１５７３６号、及びソ連特許
第９７３，１２８号において記述されている。

高純度ＥＰＡを得るための他の従来法は、英国特許公報
第２，１４８，７１３号に開示されている。この公報に
は次の方法が記載されている：脂肪酸混合物中における
不飽和脂肪酸の二重結合をヨウ素化し１次いでヨウ素化
されたオイルをケン化し、ケン化混合物から脂肪酸を抽
出し、ヨウ素化された脂肪酸をメチル化し、カラムクロ
マトグラフィーによって脂肪酸を分離し、次いで、希望
するフラクションを脱ヨウ素する方法が記載されている
。

この方法によれば最後に行う（ｅｖｅｎｔｕａｌ）カラ
ムクロマトグラフィーにおいて、脂肪酸の卓越したレゾ
リュージョン（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が可能となり、
そして、処理期間中に脂肪酸を酸化から保護することが
できるのである。タラ肝油のような天然のＥＰＡ源から
ＥＰＡを分離するためにこの方法を利用すれば、収率９
０％以上（ｏｖｅｒ　９０％）及び純度９６〜１００％
が得られる。しかしながら、この方法の工程中に実質量
のシス−トランス転化（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が生じ
ること、そしてその結果、得られた９６〜ｂＥＰＡとは
限らないこと、が判明した。更にまた、ヨウ素はＧＲＡ
Ｓ材料リストには載っていないのである。

脂肪酸一般に関して、各種の分離技術がもちいられてき
た。これら既知の技術には、尿素コンプレックスによる
分離及び低温分別結晶による分離がある。

尿素を用いる分離技術には、結晶包接化合物の形成が包
含される。これは、アダクツ（ａｄｄｕｃｔｓ）又はコ
ンプレックス（ｃｏＩｌρｌｅｘ　）とも呼ばれるもの
であって、尿素と各種の直鎖有機化合物との間で形成さ
れるものである。包接化合物は２以上の化合物が結合し
たものであって、該化合物の内の１方が、他方の化合物
の結晶骨格構造のなかに包含されているものである。包
接化合物の各成分は、それぞれ分離して存在しうるもの
であるが、化学的な結合方法ははっきりしていないもの
である。

これら各成分は、二次原子価力（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｖ
ａｌｅｎｃｅ　ｆｏｒｃｅ）と水素結合とによって相互
に保持されているのである。しかしながら、包接化合物
は、通常の水素−結合システムとは相違するものである
。その理由は、前者においては、″ホスト（ｈｏｓｔ）
”と“ゲスト（ｇｕｅｓｔ）”分子のサイズと形状とが
臨界的に重要であるのに対して、後者においてはそれら
はほとんどないし全く何の役割も果たすものではないか
らである。

長鎖脂肪酸の飽和度が高くなればなるほど、尿素コンプ
レックスの生成がより容易になることは既知である。し
たがって、尿素で処理することによって、飽和した化合
物及びほとんどの七ノー不飽和化合物をポリ不飽和化合
物から分離することができることになる。この尿素コン
プレックスによる分離技術は、次の文献に詳述されてい
る：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｓｅｓ　Ｊに１
ａｒｅ　Ｓ、　Ｍａｒｋｌｅｙ編、パート３．２３０９
〜２３５８ページ、インターサイエンスバブリッシャー
ズ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ
）。

ニューヨーク、１９６４、におけるＳｗｅｒｎ、　Ｄ、
　　“分離技術：Ｅ、尿素コンプレックス（Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ　ｏｆＳｅｐａｒａｔｉｏｎ　：　Ｅ、　Ｕ
ｒｅａ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）”の項Ｏここのおいては
、これらのページに記載されたすべての内容を参照文献
として扱うことにする。

低温分別蒸留は、脂肪酸とモノエステル類の分離のため
に使われてきたし、また同じく天然油脂のグリセライド
と他のリピッド物質の分離のためにも使われてきた。こ
の技術は、脂肪酸を溶媒中に溶解し次いで温度を低下せ
しめて各種脂肪酸を溶媒から結晶せしめる工程を包含す
るものである。

しばしば、零下（ｓｕｂ−ｚｅｒｏ）　（’Ｃ）の温度
が使用される。しかしながら、この技術には多くの制約
が存する。多数の脂肪酸の混合物を分離する際、高純度
のものを得ることが難しく、そしてまた各種酸の相互溶
解（ｍｕｔｕａｌ　５ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）の問題も存
する。

この技術及び低温結晶の制約については、上に引用した
Ｍａｒｋｌｅｙの本の２０８１〜２１２３ページにおけ
る。

Ｍａｒｋｌｅｙ、　Ｋ、　Ｓ、、　　”分離技術：Ａ、
蒸留、塩溶鮮度、低温結晶（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏ
ｆ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　：　Ａ。

Ｄｉｓｔｊｌｌａｔｉｏｎ、　Ｓａｌ、ｔ　５ｏｌｕｂ
ｉｌｉｔｙ、　Ｌｏｗ−Ｔｅｍｐｅｒａ−ｔｕｒｅ　Ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）”に詳しく記述されて
いる。

ここにおいては、これらの個所に記載されたすべての内
容を参照文献として扱うことにする。

Ｐｒ１ｖｅｔｔ、　０．５．他、Ｊ、　Ａｍ、　Ｏｉｌ
　Ｃｈｅｍｉｓｔ、　Ｓｏｃ、。

３６、４４３〜４４９（１９５９）には、低温結晶と尿
素コンプレックスとの結合を包含する技術が記載されて
いる。ブタ肝臓リピッドの分析では、先ずはじめに低温
分画を用いて２つのフラクションを得、そして、濾液を
尿素包接化合物を経てメタノールからの分画処理に付し
た。各フラクション及び濾液は、それぞれエステル化し
蒸留し、そして各種の留出物を分析した。Ｓｗｅｒｎ、
Ｄ、他、Ｊ、　Ａｍ、　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｏ＋ｉｓｔ。

鉢虹、　２９．６１４〜６１５（１９５２）は、オリー
ブ油から尿素コンプレックスを沈澱せしめて飽和化合物
と七ノー不飽和化合物を分離し、次いで、尿素コンプレ
ックスから単離した酸又はエステルを低温結晶処理し、
そして分別蒸留してオレイン酸を９７〜９９％の純度で
製造すること、が開示されている。

Ｓｗｅｒｎ、　Ｄ、他、Ｊ、　Ａｍ、　Ｏｉｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔ、　Ｓａｃ、、　２９゜４３１〜４３４（１９
５２）及び米国特許第２，８３８，４８０号では、先ず
はじめに０℃において９０％メタノールから結晶化する
ことによって飽和酸を分離し、次いで濾液に尿素を加え
てオレイン酸のアダクトを室温で沈澱せしめることによ
って、獣脂、脂（ｇｒｅａｓｅ）又はレッドオイル（ｒ
ｅｄ　ｏｉｌ）からオレイン酸を単離している。

しかしながら、一般的に安全であるとして認められてお
り且つ工業的な方法に使用することのできる材料のみを
用いて、しかもシス−トランス転化をひき起すことなく
、海産動物油からＥＰＡ及びＤ１１Ａを実質的に１００
％の純度で分離するための方法について、これを示唆す
るような従来技術は全くない。また、天然源から他の特
定のポリ不飽和脂肪酸を非常に高い純度で分離する方法
も、当技術分野において長い間求められていたものであ
る。

ｌ肌殴叉斡したがって５本発明の目的は、先行技術の問題点を解決
することである。

更にまた本発明の目的は、ＥＰＡ、　ＤＨＡ及びそれら
のエステルといった希望するポリ不飽和脂肪酸を、減成
せしめること（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）なく、分離精
製する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、海産動物油又は他の天然源から、
ＥＰＡ及びＤＮＡの混合物又は他の希望するポリ不飽和
脂肪酸を抽出する方法であって、市販の環境のもとて容
易に得ることのできる温度で、減成ないしはシス−トラ
ンス転化を生じることなく、しかも高収車高純度で抽出
する方法を提供することである。

これらの目的及び他の目的は、本発明にしたがって以下
の操作を行うことによって達成される：先ずはじめに、
酵素リパーゼを用いるといった温和な条件下でオイル起
源のトリグリセライドを加水分解し；有機溶媒で洗うこ
とによって非ケン化物を分離し；尿素で処理することに
よって、飽和脂肪酸及びモノ−不飽和脂肪酸との尿素コ
ンプレックスを生成゛せしめ、以ってこれら飽和及びモ
ノ−不飽和脂肪酸を除去し：残渣をアセトンが好適であ
るが有機溶媒中に溶解し；ゆっくり冷却し；そして固体
化した物質を生成するにしたがって分画除去するりこと
により上記目的が達成されるのである。好適な実施例で
は、各々の沈澱を生成せしめそしてこれを除去した後、
溶媒部分を蒸発し次いで冷却する工程をくり返して、溶
液中における脂肪酸濃度を高めることによって、純粋な
脂肪酸を完全に沈澱せしめるために行う極低温処理が避
けられる。このようにして、工業的な方法としてはより
望ましくないところの極低温を用いることなく、実質的
にこれと同一の収率及び純度を得ることができるのであ
る。

更にまた、この技術は、例えば亜麻仁油からシス−リノ
ール酸及びα−リルン酸を分離するというように、天然
の起源から前記以外のポリ不飽和脂肪酸を分離精製する
のにもうまく利用することができる。

好　な　施　についての　　な　四本発明の好適な実施例は、実質的にシス−トランス転化
を生じることなく実質的に１００％純粋なＥＰＡ及びＤ
１１Ａを分離することに関するものであるけれども１本
発明の方法は、天然起源から他の高度に不飽和化された
脂肪酸を分離精製するのにも適用することができる。以
下に行う記述は多くは、海生動物油から純粋なＥＰＡ及
びＤ１１Ａを分離する点に向けられてはいるが、他の天
然起源から上記とは別の高度にポリ不飽和化された脂肪
酸の分離にも。

同じ技術が使用できることを、充分に理解しておくべき
である。

本発明の基本的特徴は、処理の全工程に亘って極端な条
件をすべて回避した点、及び、尿素処理と低温分別結晶
とを結合した点にあり、これによって、予期せざること
に、実質的にシス−トランス転化を生じることなく実質
的に純粋なＥＰＡ及びＤＮＡを製造するものである。

本発明によってＥＰＡ及びＤ１１Ａを分離するところの
オイルは、脂肪酸のいかなる実質的変成低下も生じる前
に分離を行うよう、出来る限り新鮮であることが好まし
い。ＥＰＡ及びＤ１１Ａを高レベルに含有し本発明にお
いて使用するのに適した天然の油脂には、例えば次のよ
うなものが含まれる：サバ、イワシ、カマス（ｎ＋ａｃ
ｋｅｒｅｌ　ｐｉｋｅ）、ニシン等青みの魚といった海
産動物の油脂；タラ肝油；及びオキアミや各種のエビ様
カイアシ類といった海産の動物性プランクトンの油脂。

しかしながら、本発明においてはその他いかなるＥＰＡ
及びＤＨＡＩも使用できることを理解すべきである。魚
類源は、できる限り冷たい環境から得るのが好ましい。

エイコサテ１−ラエン酸がＥＰＡに転化するのを触媒す
るところの酵素であるΔ５−デサチュラーゼ（ｄｅｓａ
ｔｕｒａｓｅ）は、最適のＭ未活性が９０℃で生じるの
である。したがって、冷たい環境からの魚は、暖氷魚よ
りもＥＰＡ含量が高いのである。

また、魚を制御された環境のもとて飼養すると、更にＥ
ＰＡ収率を高めることすら可能となる。α−リルン酸（
ａ　−１１ｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ）に富んだ餌料を
魚に与えそして塩水中に９℃に維持しておくと、最上の
ＥＰＡ量が得られよう。

天然油脂は、ケン化又はアルコール分解（ａｌｃｏｈｏ
ｌｙｓｉｓ）　　Ｌ／て、トリグリセライドを遊離の脂
肪酸又は脂肪酸のエステルに転換する。しかしながら、
高温及び強塩基性試薬は過酸化及びシス−トランス転化
（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を起し得るので、これらを回
避するように方法を選ばなければならない。

好適な加水分解法は、酵素リパーゼを温度３５〜４０℃
及びｐ１１６〜７で使用する酵素加水分解である。

リパーゼは、常法にしたがい、システィンまたはアスコ
ルビン酸を痕跡量用いて賦活しなければならない。ケン
化するのにリパーゼを用いることによる他の利点は、リ
パーゼ酵素は、立体特異性を有するために、トリグリセ
ライドから自然に生成しうるところのトランス−脂肪酸
を全熱分解する（ｃｌｓａｖｅ）ことがない点である。

したがって、出発物質中にたとえトランス−ＥＰＡ又は
ＤＩ！Ａがあったとしても、これらのものは、非ケン化
物と一緒に除去されて最終製品中に存在することはなく
なることになる。

天然油脂を加水分解するための代替法としては、リパー
ゼまたは強塩基を用いてこれらの油脂を部分的に加水分
解する方法がある。リパーゼを用いる場合には、通常の
ように加水分解を６時間行うよりはむしろ１１７２〜２
時間の加水分解によって、ＥＰＡ源を更に富化すること
ができる。その理由は、リパーゼが、処理されたトリグ
リセライドの第１の分枝部分（ｂｒａｎｃｈ）と第３の
分枝部分を優先して除去するからである。天然トリグリ
セライドにおいて、まん中の分枝部分に（らべて外側の
分枝部分の方がはるかに飽和鎖が多いことは、既に知ら
れていることである。したがって、加水分解の量を制限
すれば、更なる飽和酸の実質量を自動的に除去できるの
である。

天然油脂の部分加水分解には、水酸化カリウムも使用す
ることができる。オイル源を水酸化カリウムで約１５〜
２０分処理し、トリグリセライドを部分的に加水分解す
るのである。リパーゼの場合のように、この部分的加水
分解によって、トリグリセライドからより富化されたＥ
ＰＡ源が得られる。

その理由は、トリグリセライドの第１と第３の分枝部分
が該塩基によって優先的に作用を受けるからである。

部分加水分解後、硫酸、又は、硝酸若しくは塩酸といっ
た強鉱酸を氷解混合物に添加して、脂肪酸混合物を分離
する。脂肪酸混合物は上部に浮遊するので、下部の水相
は排棄する。

また、この加水分解工程は、トリグリセライド源の如何
にかかわらず、他のポリ不飽和体をそれらのトリグリセ
リドから分離するのを増進するのにも有用である。

遊離の脂肪酸は、また、エステル交換法によってもそれ
らの天然源から分離することができる。

脂肪酸含有材料（海産動物油、亜麻仁油、大豆油等）を
、乾燥エタノール又は乾燥メタノール及び痕跡量の金属
ナトリウムとともに還流する。これによって遊離脂肪酸
のメチルまたはエチルエステルがそれぞれ生成し、トリ
グリセリド分子から遊離してくる。この方法は、アルカ
リ加水分解よりもより温和な条件を実質的に包含するも
のであって、過酷な条件による反応混合物の黒化を防止
するものである。これらのエステルは、標準的加水分解
技術によって、抽出工程のいかなる過程においても自由
に遊離の脂肪酸に変換することができる。目的によって
は、遊離体の酸に転換することなく、これらのエステル
類を直接用いる方が好ましいこともある。

次の工程では、有機溶媒で洗浄することにより、コレス
テロール、ビタミンＡ、Ｄ及び炭化水素類といった非ケ
ン化物質を除去する。この目的のためには、石油エーテ
ル、メチレンクロライド、エチルエーテル等すべての有
機溶媒が使用できる。

有機相を除去した後、水相を酸性化する。この酸性化工
程のためにはすべての酸が使用できるが。

薬学的に許容できる酸の方が好ましい。この処理によっ
て遊離の脂肪酸が分離している有機相の方へ分離してい
くことになろう。そこで、水相を廃棄する。塩化ナトリ
ウムまたはその他の塩類を少量加えると、この分離が高
められる。

次に、飽和脂肪酸及びモノ−不飽和脂肪酸を除去するた
め、脂肪酸混合物を尿素処理する。この尿素処理におい
て、尿素と脂肪酸の双方をその中に容易に溶解すること
のできる極性有機溶媒に、尿素を添加する。実施可能な
溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロ
パノール、石油エーテル、ベンゼン、トリクロルエチレ
ン、及びメチルイソブチルケトンが包含される。母性の
問題が回避できるため、エタノールを用いるのが好適で
ある。必要あれば加熱しながら溶媒に尿素を溶かして、
通常は尿素を１０〜２０％含有する尿素溶液を得る。尿
素溶液と脂肪酸混合物とを混合する。脂肪酸混合物を尿
素溶液に添加する場合、はじめに脂肪酸混合物を別途有
機溶媒で希釈して、脂肪酸を尿素溶液の高温からある程
度保護するようにするのが好ましい。遊離脂肪酸は、石
油エーテル、または、アセトン、エタノールもしくはメ
タノールといった極性溶媒中に溶かしてもよい。

尿素溶液の量は、脂肪酸混合物１重量部当り、少なくと
も０．５重量部、好ましくは１〜４重量部に調節する。

尿素溶液は、脂肪酸と均一に混合する。

そこで、好ましくは尿素処理した溶液を冷却することに
よって、尿素を沈澱せしめる。この時点で、脂肪酸混合
物中の飽和脂肪酸及び非飽和脂肪酸が、尿素結晶とコン
プレックスを形成し、晶出することになろう。希望する
のであれば、該溶液を長い間装置することによって、冷
却処理を実施してもよい。また５例えばウォーターバス
を用いて強制的に該溶液を冷却してもよい。該溶液を高
々５０℃、好ましくは３０〜４０℃に冷却すると、良い
結果が得られるであろう。更に尿素の除去率を高めよう
とするのであれば、更に該溶液を冷蔵庫内で約−１０℃
に冷却すればよい。

そこで、尿素と飽和及びモノ−不飽和脂肪酸とのコンプ
レックスは、これを濾去ないしは他の方法で除去する。

このようにして得た濾液は、例えばエバポレータで濃縮
して、溶媒の大部分を除去し、次いで、５％塩酸を用い
て、残りの尿素のすべてを脂肪酸混合物から洗滌する。

また、溶媒１部に対して１０部の水を用いて水抽出を行
い、溶媒を除去してもよい。

このようにして残った脂肪酸混合物は、高度不飽和脂肪
酸の実質的に純粋な結合体である。次のことが発見され
た：はじめに脂肪酸をアセトン等の有機溶媒に溶かし２
次いで目的とする個々の脂肪酸が溶液から固体化してく
るまでゆっくりと冷却することによって、非常に簡単に
して正確な方法でこれら個々の脂肪酸を完全に分離でき
ることが判ったのである。溶液をゆっくりと冷却してい
くと、溶液中における個々の溶解度にしたがって、各種
の脂肪酸が沈澱してくるのである。これらの脂肪酸の各
々がそれぞれ沈澱してくるので、それを溶液から分離す
るのである。各種の脂肪酸には。

溶液中の脂肪酸濃度に応じてそれらが溶液から沈澱して
くる特定のポイン１−がそれぞれ存する。例えば、ＤＮ
Ａは、約−３８〜−４０℃で１０％アセトン溶液から沈
澱してくることが判った。ＥＰＡは約−６０℃で沈澱し
てくる。他の脂肪酸は、そのほとんどが−３０℃以上（
ａｂｏｖｅ）の温度で沈澱する。

該溶液は、アセトン中冷凍二酸化炭素（ドライアイス）
浴中で冷却する。−３８〜−４０℃で生成する沈澱は、
実質的に温度を上げることなく焼結ガラス（ｓｉｎｔｅ
ｒｅｄ　ｇｌａｓｓ）又はブフナー漏斗を通して濾過す
ることによって、これを分離する。得られた結晶を分析
したところ、実質的に純粋なＤＨＡであることが判った
；　ＮＭＲで検討したところ、シス−トランス転化（ｃ
ｏｎｖｅｒｓｏｉｎ）は認められなかった。

約−６０℃で沈澱してくる物質は、シス−トランス転化
がなく実質的に１００％純粋なＥＰＡであることが判っ
た。

ＥＰＡとＤＨＡとをそれぞれ別個に分離するのに必要な
極低温を避れるために、各々の結晶化が終った後、上澄
を少なくして脂肪酸類の溶解度を低下せしめ、実質的に
純粋なりＮＡ及びＥＰＡの混合物を得ることができる。

また、低温処理と溶媒の除去処理との結合も利用できる
。

次の表は、にｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、　ｌｊ、７エ１豆
狂（Ｅｎｃ　ｃｌｏ　ｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅ＋５ｉｃ
ａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　　、第３版、第４巻、８２７
ページ（１９７８）に掲載されているものであって、ア
セトン、トルエン及びｎ−へブタン中における各種温度
での各種脂肪酸の溶解度の差異を示したものである。

有機溶媒中における各種温度での脂肪酸の溶解度〇１８：２（９ｃ、　１２ｃ）　　−５０１６二〇１８：Ｏ１８：　１（９ｔ）１８　：　１（９ｃ）１．６００．６６０．２７０．２７０．５４０．１１０．０２３０．００５５．２１．６８０．５３０．１７０．２６０．０９２４．１０１．２００．３５１．４１０．３６０．０８６０．０１８０．３９００．０８０ｏ、ｏｉｓ０．００３３．１２０．０６０．２８０．８６０．２００．０５６０．３００．０８０．０２０．００５０．０８００．０１８０．００４２．２５０．６６０．１９０．０５０、１９０．０６０．０１９０．９８０．２００．０４２上記の表から、温度が１０％低下することによって、す
べての溶媒中ですべての脂肪酸の溶解度ファクターが約
３〜７低下することが判る。この溶解度ファクター（ｓ
ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒ）の故に、次の処理
によって希望する脂肪酸を抽出できることが判った：つ
まり、溶媒の量を減少せしめて溶液の１度をファクター
約２〜９　　（ｂｙ　ａ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆｆｒｏｍ
　ａｂｏｕｔ　２　ｔｏ　９）上げ（即ち、その溶植を
もとの容積１／２〜１／９に低下せしめ）１次いで溶媒
の容積を低下せしめることなく必要とされる温度よりも
実質的に高い温度に冷却せしめることによって、希望す
る脂肪酸を抽出できることが判ったのである。

この溶媒減少技術には、数多くの利点があり。

特に、必要な温度を多くの市販のフリーザーによって得
ることができ、また処理方法においても特別の技術ない
し特別の装置を必要とするものではないという利点があ
る。

この低温分別結晶の溶媒減少法は（ｓｏｌｖｅｎｔ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ
）、前述した尿素処理工程の結果得られるより高度の不
飽和脂肪酸の結合体（ｃｏａ＋ｂｉｎａｔｉｏｎ）を用
いることによって、完全なものとすることができる。尿
素処理工程によって得た高度不飽和脂肪酸の結合体を、
温度低下法に使用したのと同じタイプの有機溶媒中に溶
解する：例えば、これをアセトン又は石油エーテルの１
０％溶液中に置くことができるのである。約−２０℃に
一夜冷却すると、残留している飽和脂肪酸と不飽和度が
低い各種の脂肪酸が、溶液から固化してくる。そこで、
沈澱を分離しそして廃棄する。

次いで、もとの容積に対するある定められた量になるま
で（例えば、もとの容積の１／３）　、溶媒を蒸発又は
蒸留することによって、該溶液の容積を低下せしめてそ
の濃度を高める。このようにして得た容積が減少した溶
液を再度約−２０℃に冷却すると、モノ−不飽和脂肪酸
の新しい結晶が表われてくるので、この結晶を再度濾別
する。そこで再度、この濾液の容積をもとの容積の約１
／２〜１／９フアクター減少せしめ（ｂｅ　ｒｅｄｕｃ
ｅｄ　ｂｙ　ａ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆａｂｏｕｔ　ｏｎ
ｅ　ｈａｌｆ　ｔｏ　ｏｎｅ　ｎ１ｎｔｈ）、再度−２
０℃に一夜冷却する。ここで、ジー不飽和脂肪酸（ｄｉ
−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ）が
溶液から固化してくることになろう。これらの結晶を再
度濾別し廃棄する。ジー不飽和脂肪酸結晶が生成及び沈
澱するのに充分に低い温度が得られなかった場合には、
脂肪酸は分離した水相を形成するであろうから、これを
分液漏斗で除去することができる。

望ましくない脂肪酸をすべてしかも確実に溶液から結晶
化せしめるためには、濾液を更に一３０℃に冷却すれば
よい。分離相又は結晶が表われなかったら、そこで精製
工程は完結ということになる。

そこで、溶媒を蒸発せしめればよい。

残留した液体は、実質的に純粋なＥＰＡとＤ１１Ａの結
合体（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）から成っている。希望
するのであれば、−３８〜−４０℃に冷却してＤＨＡを
沈澱せしめることによって、これら２つの成分を分離し
てもよい。しかしながら、最も実用的には、ＥＰＡとＤ
ＨＡとの結合体は少なくとも個々独立の成分と同じであ
るから、これら２次分を分離する必要はない。

本発明法によってこのような高純度が得られるというこ
とは、まさに予期することができないことであり、とり
わけ、分別結晶法が最初に尿素処理を行わなければ実施
できないということからみると、上記のことは特に予測
を越えたものである。

加水分解した後、そして非ケン化物を溶解する有機溶媒
を除去した後、に得られる全脂肪酸混合物を冷却すると
、脂肪酸の混合物が混合物として溶液から沈澱してくる
。全く予期せざることに次のことが発見された：飽和及
びモノ−不飽和脂肪酸を尿素法によって先ずはじめに除
去した場合に限り、ＥＰＡとＤ１１Ａ相互間での沈澱点
の差、及び、最も沈澱点が近い脂肪酸との沈澱点の差が
、充分に大きなものとなって、脂肪酸の混合物として沈
澱するのではなく純粋なＥＰＡ又はＤＨＡとして沈澱す
るのである。海生動物油及び植物油中に見出される脂肪
酸は、その数も多く多様性も高いので、それから純粋な
ＥＰＡ及びＤＨＡを分離することは極めて困難であった
。この点については、上記した発明の背景の項で挙げた
各種文献で説明されているところである。尿素処理を行
い次いで低温結晶処理を行うという特定の処理の有機的
結合、しかもこの順序で処理を行うという処理順序の特
定によってのみ、シス−トランス転位を生じることなく
１００％純粋なＥＰＡ及びＤＨＡを得ることができるの
である。

このことは、従来技術での一般的知識から自明的になさ
れることではない。

有機溶媒、これから脂肪酸を、溶液の濃度を上昇せしめ
ながら冷却又はゆっくり冷却することによって、沈澱せ
しめるものであるが、この有機溶媒としてアセトンを用
いた場合について本発明方法を記述してきたけれども、
次の点について理解すべきである。すなわち、ＥＰＡ及
びＤＭＡの比沈澱点（ｒｅｌａｔｉｖｅｐｒｅｃｉｐｉ
ｔａｔｉｏｎ　ｐｏｉｎｔ）が、これら相互間でそして
また混合物中の他の脂肪酸との間で、純粋な沈澱が分離
し得る程度に布分離れている限りにおいて、アセトン以
外の他の有機溶媒も、上記目的のためすべて使用するこ
とができるのである。次のことが信じられている。すな
わち、溶液中における脂肪酸の濃度によるけれども、は
とんどの溶媒の場合、各種脂肪酸が沈澱する温度は。

使用する特定の溶媒とは無関係なのである。アセトン、
塩化メチレン、シクロヘキサン及び石油エーテルの１０
％溶液からのＤＮＡの沈澱点は、すべて、約−３８〜−
４０℃である。同様に、アセトン、シクロヘキサン及び
石油エーテルの１０％溶液からのＥＰＡの沈澱点は、こ
れらの溶液中でのＤＮＡ濃度によるが、約−６０℃〜約
−３０℃である。与えられた溶媒がこの目的のために実
施可能か実施不可能かという点については、常法にした
がって試験をすれば容易にわかることである。例えば、
トルエン及びヘプタンは実施可能ではあろうが、これら
は比較的毒性が強いので好ましくない、ということが判
る。最適な有機溶媒は、毒性が無く一般に安全であると
認識されているもの、又は、実質的な処理をすることな
く完全に除去できるもの、ということになろう。アセト
ン以外の好適な溶媒の例としては、シクロヘキサン、石
油エーテル及びメチレンクロライドが挙げられる。また
、溶質（ｓｏｌｕｔｅ）の濃度に応じて、溶媒が、沈澱
温度の全域に亘って１例えば少なくとも一７０℃の温度
においてまでも液体の状態のままで残っていること。

が必要である。

本発明の容量減少実施例を実施するに際して。

溶液を冷却する正確な温度及び正確な容量減少量は、結
合体中に存在する特定の脂肪酸に応じて違ってくること
になろう。これらのパラメーターは、当業者が並外れた
実験を行うことなく経験的に決定することができる。該
溶液は、沈澱開始温度よりも少し低い温度に冷却し、そ
して沈澱が完結するまで該温度に維持することができる
。そこで、容量減少工程を行う。大ざっばではあるが実
際に則した経験則にしたがって、各工程において、最初
の工程における容量の１７３に容量を減少させればよい
。しかしながら、結合体における特定の脂肪酸によるけ
れども、脂肪酸の結合体が一緒になって沈澱するようで
あれば、容量の減少が大きすぎるということが、判るで
あろう。他方、溶液の容量を低下せしめるのに適した温
度でも沈澱が生じない場合には、それは容量の減少が充
分ではないということが１判るであろう。通常の実験に
よって、希望する温度で次のフラクションの沈澱が生じ
るであろうところの容量の減少量がわかるであろう。

本発明を以下の実施例について説明するが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない：叉庭舅上５００ｃｃのタラ肝油を２Ｑの蒸留水中で激しく撹拌し
た。乳化剤として、ＥＰＡのナトリウム塩を５０ｇ加え
た。ホスフェートバッファーとアスコルビン酸とを用い
て１反応中のｐＨを７に維持した。ブタすい臓のリパー
ゼを該エマルジョンに対して１ｇ添加し、そしてこのエ
マルジョンを６時間撹拌しながら４０℃に維持した。

１００ｃｃの石油エーテルを加えて、コレステロール、
ビタミンＤ、ビタミンＡ及びその他の不純物といった非
ケン化物を除去した。充分に混合した後、水相から石油
エーテル相を分離し、この石油エーテル相を分液漏斗を
用いて除去した。

水相は、５％）１２Ｓｏ４溶液と塩化ナトリウム５０ｇ
を用いて酸性化し、有機相を塩析せしめた。水相から分
れた有機相は、遊離酸を含有しており、この有機相を分
液漏斗を用いて分離し、そして硫酸ナトリウムを用いて
乾燥せしめた。硫酸ナトリウムは濾去した。この時点で
、有機相は、約４５０ｃｃとなり遊離の脂肪酸を含有し
ていた。次いでこの有機相に絶対エタノールを２００ｃ
ｃ混合した。連続的に撹拌し７０℃に加熱しながら、絶
対エタノール２Ｑ中に８００ｇの尿素を溶解せしめた。

そこで遊離脂肪酸のエタノール溶液にこの尿素−アルコ
ール溶液を混合せしめた。直ちに、尿素と飽和及びモノ
−不飽和脂肪酸とのコンプレックスが、生成しそして沈
澱した。液相をデカントし、そしてエバポレーターを用
いてエタノールを除去し、これを再使用するために回収
した。液相中に残留している尿素を、５％塩酸溶液で洗
滌することによって除去し１次いで蒸留水で洗った。こ
のようにして得た有機相をガスクロマトグラフィーで分
析した。その分析結果は次のとおりであった：胤−版一筐　　　パーセント１６　：　１　　　　　　　　　　　４．８１８　：　
１　　　　　　　　　　　１．５１８　：　２　　　　
　　　　　　１．２２０　：　５　　　　　　　　　　
５７２２　：　６　　　　　　　　　　１８２２　：　
１　　　　　　　　　１７．５そこで、この有機相をア
セトンに溶かして、約１０％の溶液とした。この溶液を
市販のフリーザーに入れて、ゆっくりと溶液の温度を低
下せしめた。

約Ｏ〜−２℃で、最初の沈澱が生じた。この沈澱を濾去
し、実質的に純粋な２４：１脂肪酸であることがわかっ
た。次の沈澱は約−５〜−８℃で生じたのでこれを濾過
回収した。この沈澱は、１７：１及び１６：１脂肪酸の
混合物であることがわかった。

次の沈澱は約−１２℃で生じ、これは実質的に１８：２
脂肪酸であることがわかった。

残留溶液は、次にドライアイス−アセトン浴中に置いて
更に冷却した。−３８〜−４０℃で別の沈澱が生じた。

ブフナー漏斗を用いて実質的に温度を上げることなく、
この沈澱を除去し、これをガスクロマトグラフィーで分
析した。この生成物は１００％Ｄ１１Ａであることが判
った。用いたガスクロマ１−グラフィー装置は精度ｏ、
ｏｏｔ％であり、不純物は認められなかった。また、こ
のサンプルをＮＭＲでも分析したが、シス−トランス転
化が生じてないことも判った。この生成物は１００％す
べて−シスＤ１１Ａであった。　ＮＭＲ研究の結果、ト
ランス−立体配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に対
応するピークは認められなかった。

残留溶液の温度をひき続き低下せしめた６約＝６０℃で
、別の沈澱が生じた。上述したＤＨＡの場合と同じ方法
で分離したところ、この沈澱は１００％純粋な［ＥＰＡ
であることが判った。ＮＭＲ研究の結果。

それこそトランス−立体配置は一切認められなかった・ＥＰＡの収率は、出発原料であるタラ肝油に対し約１５
％であり、ＤＮＡの収率はもとのタラ肝油に対し約９％
であった。

実施１７− 比較のために、尿素処理を除き他は上記した処理と同じ
処理をくり返した。上記実施例１とすべて同じ方法によ
って、タラ肝油５００ｃｃをリパーゼで処理し、そして
非ケン化物（ｎｏｎ−ｓａｐｏｎｉｆｉａｂｌｅｍａｔ
ｅｒｉａｌ）を除去し、次に水相を酸性化して有機相を
塩析し、これを回収した。この有機相は遊離脂肪酸を含
有しているので、次いで有機相をアセトンに溶かして１
０％溶液を調製した。この溶液を市販のフリーザに入れ
て、溶液温をゆっくりと低下せしめた。約＋２０℃で沈
澱が始った。この沈澱は、温度が約−１５℃に低下する
まで連続して生じた。この沈澱を濾去し、そして脂肪酸
の混合物であることを認めた。濾液を更に冷却したが、
−７０℃までは更に沈澱が生じることはなかった。アセ
１〜ンを蒸発せしめた後でさえも、残渣は残らなかった
。このように、最初に尿素処理をしなければ、脂肪酸の
分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は不可能なのである。

この沈澱を尿素で処理すれば、実施例１で述べた最初に
尿素処理する方法と実質的に同じ結果が得られるはずで
あるが、純粋なＥＰＡ又はＤＨＡを分割する（ｒｅｓｏ
ｌｖｅ）のには役立たないであろう。これは、わずかに
、不飽和脂肪酸の残りから飽和脂肪酸とほとんどのモノ
−不飽和脂肪酸とを分離するだけであろう。

失意五主分別結晶処理においては、アセトンにかえて石油エーテ
ル、シクロヘキサン、又はメチレンクロライドを用い、
実施例１の方法をくり返した。石油エーテル及びシクロ
ヘキサンを用いた場合には。

アセトンを用いた場合と同じ結果が得られた。アセトン
を用いた場合と同じ温度で、ＥＰＡ又はＤＮＡの沈澱が
生じた。溶媒として塩化メチレンを用いた場合には、実
施例１と同様に−３８〜−４０℃で実質的に１００％純
粋なりＮＡが沈澱した。しかしながら、ＥＰＡが沈澱す
る以前に、塩化メチレンの同化が始まった；したがって
、塩化メチレンは好適な溶媒ではないことになる。

去】１１先生きたサケを０〜４℃で殺す。その内臓を除去し、肉を
スライスにカットする。直ちに、これらスライスの全体
に、γ−トコフェロールとアスコルビル　パルミテート
（ａｓｃｏｒｂｙｌ　ｐａｌｍｉｔａｔｅ）のｌ：１混
合物をスプレーする。

次いで、抗酸化剤をスプレーしたスライスはブレンダー
で１〜２分間混合し、そしてブレンドされた混合物は遠
心分離に移して７　、０００〜１０．ＯＯＯｒｐｍで１
０〜１５分間処理する。遠心分離後、油相を分離し、そ
してこれを１％塩酸水溶液と１；１の割合で混合する。

充分に混合した後、放置して各相を分離せしめ、そして
分液漏斗により油相を分離する。希塩酸との混合工程は
、すべてのメチルアミンを除去するために数回くり返し
、次いで、このオイルを蒸留水で洗滌しそれから分離す
るという工程を数回くり返して、残留している酸をすべ
て除去する。次いで、オイルの重量に対してγ−トコフ
ェロール０．０２％及びアスコルビル　パルミテート０
．０２％の量で、抗酸化剤を更に添加する。

このようにして得たオイルは、そこで、実施例１におけ
るタラ肝油の場合と全く同じに処理する。

実施例１におけると同様に、１００％すべてシスのＤ１
１Ａと同じ＜１００％すべてシスのＥＰＡが得られる。

失壽■且魚油１１０ｃｃを、９５％エタノール８０ｃｃ及び水２
０ｃｃと混合する。次いで、水酸化カリウム２３ｇを加
える。この混合物を、フラスコ内で連続的に撹拌しなが
ら、還流加熱する。この溶液全体に亘って窒素を泡状に
供給する。混合物の有機相及び水相の双方に痕跡量のア
スコルビン酸、アスコルビルパルミテート、及びγ−ト
コフェロールを添加することにより、オイルが酸化する
のを防止する。

還流６０〜９０分後に加水分解が完了する。混合物は冷
却しそして砕いた氷上に注ぎ１次いで水２００ｃｃを加
える。この混合物を水非混和性有機溶媒と共に振り混ぜ
て、コレステロール、ビタミンＡ、ビタミンＤ及び炭化
水素といった非ケン化物質を洗い去る。分液漏斗で有機
相を除去した後、４モルの硫酸又はその当価物を１２０
〜１４０ｗＲ用いて、水相を酸性化する。この遊離酸混
合物を１石油エーテルで抽出し、分離し、そして硫酸マ
グネシウムで乾燥する。

石油エーテルを完全に真空蒸発させ（ｅｖａｐｏｒａｔ
−ａｄ　ｏｖｅｒ　ｖａｃｕｕｍ）、遊離の脂肪酸をエ
タノール１００ｃｃに溶かし、そして、絶対エタノール
中７５ｇの尿素を添加する。これらの混合物をよく撹拌
しそして冷却する。尿素と飽和脂肪酸との包接結晶（ｉ
ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｒｙｓｔａｌ）が表われてくる。

これらを濾過し、そして新しい包接結晶が表われてくる
まで、上澄を蒸発せしめる。更に包接結晶が生成するま
で、上澄を更に冷却し、そしてこれらの結晶を濾出する
。残留上澄は、はとんどのポリ不飽和遊離脂肪酸を含有
しているので、これを蒸発せしめる。上澄からの残渣を
石油エーテルと５％ＨＣＩに溶かし、そして分離する。

次いで、有機相を水で洗う。

遊離の脂肪酸は、脂肪酸対石油エーテルの比率が１　：
　１０となるように、石油エーテルに溶解せしめ、そし
て−２０℃に一夜冷却する６次の日、該溶液を濾出しそ
して廃棄する。濾液はもとの容積の１／３に減少し、そ
して再び一２０℃に冷却する。モノ−不飽和脂肪酸から
なる新しい結晶が表われてくるので、これらの結晶を濾
出する。そこで濾液はもとの容積の１／９に減少し、そ
して−要冷却する。ジー不飽和脂肪酸からなる新しい結
晶又は新しい相のいずれかが表われてくる；分離してき
た脂肪酸相を分液漏斗で分離するか、又は、結晶を濾出
しそして廃棄する。濾液を再び一３０℃に冷却するが１
分離相又は結晶は表われてこない。そこで溶媒を蒸発せ
しめると、残った液体はＥＰＡ及びＤＨＡから成ってい
る。

失に孤立亜麻仁油１００ｇを実施例５と同様に処理して、沈澱し
てくる尿素コンプレックスとポリ不飽和遊離脂肪酸の混
合溶液とを生成せしめる。次いで実施例５に記載したの
と同様にして、冷却工程及び容量減少工程を実施する。

最初の容量減少工程（ｖｏｌｕｍｅ　ｒｅｄｕｃｔｊ、
ｏｎ　５ｔｅｐ）では、バルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉ
ｃ　ａｃｉｄ）の結晶が表われてくる。

第２の容量減少工程では、液状オレイン酸（ｏｌｅｉｃ
　ａｃｉｄ　１ｉｑｕｉｄ）の分離相又はオレイン酸の
結晶が表われてくる。

第３の容量減少工程では、液状シス−リノール酸（ｃｉ
ｓ−１ｉｎｏｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　１ｉｑｕｉｄ）の分
離相又はシス−リノール酸の結晶が表われてくる。

第３工程後の濾液中に見出される唯一の脂肪酸は、α−
リルン酸（ａｌｐｈａ−１ｉｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ
）である。

本発明の範囲から逸脱することなく各種の変形が実施可
能であり、そして１本発明が本明細書に記述されたこと
のみに限定して考えられるべきものではないことは、当
業者にとって明白なことであろう。

代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims

【特許請求の範囲】１、海産動物オイルから、（すべて−ｚ）−５，８，１
１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）と（
すべて−ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコ
サヘキサエン酸（ＤＨＡ）との実質的に純粋な混合物を
分離するための方法であって、次のことから成る方法：（１）オイルから、ポリ不飽和遊離脂肪酸、又はそれら
のメチル若しくはエチルエステルの混合物を抽出し；（２）該脂肪酸又はエステルを尿素及び極性有機溶媒と
混合するのであるが、該溶媒は尿素と脂肪酸又はエステ
ルを溶かすのに充分な量だけ存在せしめ、そして、該尿
素は、それとコンプレックス化しうる脂肪酸又はエステ
ルの実質的に全部と共に配位コンプレックス（ｃｏｏｒ
ｄｉｎａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘ）を形成するのに充分
な量だけ、存在せしめ；（３）該混合工程後に生成する沈澱を除去し、そして濾
液を回収し；（４）濾液から残留溶媒と尿素とを除去して純粋な脂肪
酸又はエステルを得；（５）純粋な脂肪酸又はエステルを有機溶媒に溶かして
溶液とし；（６）第１の沈澱が生成するまで該溶液をゆっくりと冷
却し、そしてこの第１の沈澱を除去し；（７）該溶液の容量を実質的に減少せしめそして溶液の
濃度を増加せしめるのに充分な量の溶媒を、沈澱除去後
に残留する濾液から、除去し；（８）第２の沈澱が生成するまで該溶液をゆっくりと冷
却し、そしてこの第２の沈澱を除去し；（９）該溶液の容量を実質的に減少せしめそしてその濃
度を増加せしめるのに充分な量の溶媒を、該第２の沈澱
除去後に残留する濾液から、除去し；（１０）分離液相又は固相が形成されるまで該濾液をゆ
っくりと冷却し、そして該分離相を除去し；そして（１１）実質的に純粋なＥＰＡとＤＨＡとの混合物を含
有する残留液相を保持する。２、特許請求の範囲第１項において、沈澱を得るために
該工程８及び１０において溶液を冷却する際の温度が、
該工程６において溶液を冷却する際の温度と実質的に同
一となるよう（ｓｕｃｈｔｈａｔ）、該工程７及び９に
おいて充分な溶媒を除去するものである、同項記載の方
法。３、該温度が約−１０〜３０℃である、特許請求の範囲
第２項に記載の方法。４、特許請求の範囲第１項において、その工程７及び９
でそれぞれ溶液から溶媒を除去するのであるが、その際
溶液の量をファクター約２〜９だけ減少せしめるもので
ある、同項記載の方法。５、該工程７及び９において、溶液の量をファクター約
３だけ（ｂｙａｆａｃｔｏｒｏｆａｂｏｕｔ３）減少せ
しめるものである、特許請求の範囲第４項に記載の方法
。６、海産動物オイルから実質的に純粋な（オール−ｚ）
−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（
ＥＰＡ）を分離するための方法であって、次のことから
成る方法：（１）オイルから、ポリ不飽和遊離脂肪酸、
又はそれらのメチル若しくはエチルエステルの混合物を
抽出し；（２）該脂肪酸又はエステルを尿素及び極性有機溶媒と
混合するのであるが、該溶媒は尿素と脂肪酸又はエステ
ルを溶かすのに充分な量だけ存在せしめ、そして、該尿
素は、それとコンプレックス化（ｂｅｉｎｇｃｏｍｐｌ
ｅｘｅｄ）しうる脂肪酸又はエステルの実質的に全部と
共に配位コンプレックスを形成するのに充分な量だけ、
存在せしめ；（３）該混合工程後に生成する沈澱を除去し、そして濾
液を回収し；（４）濾液から残留溶媒と尿素とを除去して純粋な脂肪
酸又はエステルを得；（５）純粋な脂肪酸又はエステルを有機溶媒に溶かして
溶液とし；（６）ゆっくりと冷却し、この冷却工程中に溶液から分
離してくる新しい固相又は液相は、これをすべて除去し
；そして（７）実質的に純粋なＥＰＡを含有する相を保持する。７、特許請求の範囲第６項における海生動物油から実質
的に純粋なＥＰＡを分離する方法に、更に、それから実
質的に純粋な（すべてＺの）−４，７，１０，１３，１
６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を分離する方
法を付加し、そして更に、該方法におけるゆっくりと冷
却した後に除去する工程の後に、実質的に純粋なＤＨＡ
を含む相を保持する工程を包含してなる、同項記載の方
法。８、海産動物オイルから実質的に純粋な（すべてＺの）
−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン
酸（ＤＨＡ）を分離するための方法であって、次のこと
からなる方法：（１）オイルから、ポリ不飽和遊離脂肪酸、又はそのメ
チル若しくはエチルエステルの混合物を抽出し；（２）該脂肪酸又はエステルを尿素及び極性有機溶媒と
混合するのであるが、該溶媒は尿素と脂肪酸又はエステ
ルを溶かすのに充分な量だけ存在せしめ、そして、該尿
素は、それとコンプレックス化しうる脂肪酸又はエステ
ルの実質的に全部と一緒になって配位コンプレックスを
生成せしめるのに充分な量だけ、存在せしめ；（３）該混合工程後に生成する沈澱を除去し、そして濾
液を回収し；（４）濾液から残留溶媒と尿素とを除去して純粋な脂肪
酸又はエステルを得；（５）純粋な脂肪酸又はエステルを有機溶媒に溶かして
溶液を生成せしめ；（６）ゆっくりと冷却し、この冷却工程中に溶液から分
離してくる新しい固相又は液相は、これをすべて除去し
；そして（７）実質的に純粋なＤＨＡを含有する相を保持する（
ｒｅｔａｉｎｉｎｇ）。９、特許請求の範囲第１項、第６項又は第８項のいずれ
か１項において、該溶解工程において使用する該有機溶
媒は、エタノール、メタノール、アセトン、シクロヘキ
サン、石油エーテルまたはエチレンクロライドからなる
群から選ばれるものである、同項記載の方法。１０、特許請求の範囲第１項、第６項又は第８項のいず
れか１項において、該工程（１）が次の工程から成る、
同項記載の方法：（ａ）過酸化及びシス−トランス転化（ｃｉｓ−ｔｒａ
ｎｓｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を回避するのに充分に温和
な条件のもとで、海産動物オイルを加水分解し；（ｂ）有機溶媒で洗うことによって加水分解生成物から
非ケン化物を除去し、そして水相を回収し；そして（ｃ）回収した水相を酸性化して有機相を放出せしめ（
ｒｅｌｅａｓｅ）、そして純粋な脂肪酸又はエステルを
含有する有機相を回収する。１１、特許請求の範囲第１０項において、該加水分解工
程に先立ち、アスコルビン酸、アスコルビルパルミテー
ト、ガンマートコフェロール及びそれらの混合物からな
る群から選択したものを添加することによって、酸化を
防止する、同項記載の方法。１２、該加水分解工程中ずっとオイル全体に対して窒素
をバブリングする、特許請求の範囲第１０項記載の方法
。１３、特許請求の範囲第１項、第６項又は第８項にいず
れか１項において、該尿素との混合工程において使用す
る極性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロ
パノール、石油エーテル、ベンゼン、トリクロルエチレ
ン及びメチルイソブチルケトンからなる群から選ばれる
ものである、同項記載の方法。１４、該尿素との混合工程で使用する該溶媒がエタノー
ルである、特許請求の範囲第１３項に記載の方法。１５、特許請求の範囲第１項、第６項又は第８項にいず
れか１項において、尿素と脂肪酸又はエステルとを使用
有機溶媒中に溶解せしめるのに充分な温度で、尿素混合
工程を行い、そして更に、沈澱を生ぜしめるために尿素
との混合工程後に行う混合物の冷却工程を包含する、同
項記載の方法。１６、特許請求の範囲第１項、第６項又は第８項にいず
れか１項において、オイルからポリ不飽和脂肪酸混合物
を抽出する該工程が、リパーゼ又は強塩基を用いてオイ
ル中のトリグリセライドを加水分解する工程を包含する
ものである、同項記載の方法。１７、特許請求の範囲第１６項において、加水分解剤が
、加水分解を受けるトリグリセライドの第１と第３の分
枝のみを分離して（ｄｅｔａｃｈ）まん中の分枝はグリ
セライド骨格上に実質的に元のままで残すだけの時間の
み加水分解することから、加水分解工程が構成されるも
のである、同項記載の方法。１８、特許請求の範囲第１項、第６項又は第８項にいず
れか１項において、該工程（１）が、エタノールまたは
メタノールを用いるエステル交換によってオイル中のト
リグリセライドを加水分解する工程を包含するものであ
る、同項記載の方法。１９、特許請求の範囲第１８項において、該エステル交
換工程が、痕跡量の金属ナトリウム、ナトリウムエトキ
サイドまたはナトリウムメトキサイドの存在下、無水エ
タノールまたはメタノールとともにオイルを還流せしる
ることから成るものである、同項記載の方法。