JPH02170050A - アンフェタミンおよび／またはｄ―メタンフェタミンの検出方法およびそれに用いる試薬 - Google Patents
アンフェタミンおよび／またはｄ―メタンフェタミンの検出方法およびそれに用いる試薬Info
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- JPH02170050A JPH02170050A JP1281627A JP28162789A JPH02170050A JP H02170050 A JPH02170050 A JP H02170050A JP 1281627 A JP1281627 A JP 1281627A JP 28162789 A JP28162789 A JP 28162789A JP H02170050 A JPH02170050 A JP H02170050A
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- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 title claims 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 35
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims 31
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- 229950007554 levmetamfetamine Drugs 0.000 claims 22
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 claims 22
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- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 18
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、一般に、アンフェタミンおよびｄメタンフェ
タミンのための蛍光偏光イムノアッセイ法およびそれに
用いる試薬に関する。本発明のアッセイ法は、β−ヒド
ロキノアミン類の交差反応性を除くために有効なプレイ
ンキュベーンヨンこれらの薬物は、肥満症、ナルコレプ
ンー、および低血圧の治療に用いられている。しかしな
がら、これらの薬物を過剰にまたは長期にわたって使用
することは、耐性および身体的な依存症を弓き起こす。
タミンのための蛍光偏光イムノアッセイ法およびそれに
用いる試薬に関する。本発明のアッセイ法は、β−ヒド
ロキノアミン類の交差反応性を除くために有効なプレイ
ンキュベーンヨンこれらの薬物は、肥満症、ナルコレプ
ンー、および低血圧の治療に用いられている。しかしな
がら、これらの薬物を過剰にまたは長期にわたって使用
することは、耐性および身体的な依存症を弓き起こす。
これらの薬物は興奮作用を有するために、一般に不法に
売られ濫用されている。非常に多量のアンフェタミンお
よびメタンフェタミンを摂取したときにしばしば伴う生
理学的な兆候としては、血圧の上昇、瞳孔の拡散、高熱
、痙牽、および急性のアンフェタミン精神病が挙げられ
る。
売られ濫用されている。非常に多量のアンフェタミンお
よびメタンフェタミンを摂取したときにしばしば伴う生
理学的な兆候としては、血圧の上昇、瞳孔の拡散、高熱
、痙牽、および急性のアンフェタミン精神病が挙げられ
る。
アンフェタミンおよびメタンフェタミンの濫用に対して
最もしばしば試験される生物学的流体は尿である。他の
生物学的流体は、アンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンの検出用アッセイに使用するものとしてはそれほど広
く研究されていない。
最もしばしば試験される生物学的流体は尿である。他の
生物学的流体は、アンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンの検出用アッセイに使用するものとしてはそれほど広
く研究されていない。
工程を提供する。加えて、本発明は、リボフラビンによ
る潜在的な蛍光妨害または内生チラミンによる潜在的な
妨害の除去に関する。さらに、本発明の蛍光偏光イムノ
アッセイに用いる新規な化学試薬を化学的に合成する方
法により、出発物質として「規制薬物」を利用する必要
性がなくなり、従って、米国薬物施行局（ＵＳＤＥＡ）
の要求に従うために必要な時間、労力、および経費が相
当節約される。
る潜在的な蛍光妨害または内生チラミンによる潜在的な
妨害の除去に関する。さらに、本発明の蛍光偏光イムノ
アッセイに用いる新規な化学試薬を化学的に合成する方
法により、出発物質として「規制薬物」を利用する必要
性がなくなり、従って、米国薬物施行局（ＵＳＤＥＡ）
の要求に従うために必要な時間、労力、および経費が相
当節約される。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）下記
に示す化学構造式を有するアンフェタミンおよびメタン
フェタミンは、中枢神経系興奮作用を有する交感神経興
奮性のフェネチルアミン誘導体である。
に示す化学構造式を有するアンフェタミンおよびメタン
フェタミンは、中枢神経系興奮作用を有する交感神経興
奮性のフェネチルアミン誘導体である。
アンフェタミン
＝２４
過去において、アンフェタミンは、薄層クロマトグラフ
ィー（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、お
よび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む多
くの方法によって検出されてきた。これらの方法は、一
般に該薬物の化学的抽出を含むものであるが、これは高
度の熟練者と長いアッセイ時間を要する込み入った手順
である。薄層クロマトグラフィーは非常な労力がかかり
、感度に劣る。ガスクロマトグラフィーおよび高速液体
クロマトグラフィーもまた、ともに非常な労力がかかり
、生物学的マトリックスから分析対象物の抽出を行うた
めに高度の熟練者を必要とする。
ィー（ＴＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、お
よび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む多
くの方法によって検出されてきた。これらの方法は、一
般に該薬物の化学的抽出を含むものであるが、これは高
度の熟練者と長いアッセイ時間を要する込み入った手順
である。薄層クロマトグラフィーは非常な労力がかかり
、感度に劣る。ガスクロマトグラフィーおよび高速液体
クロマトグラフィーもまた、ともに非常な労力がかかり
、生物学的マトリックスから分析対象物の抽出を行うた
めに高度の熟練者を必要とする。
加えて、ガスクロマトグラフィーは、通常、誘導体化の
工程を必要とする。
工程を必要とする。
一般に、競合結合イムノアッセイが、ガスクロマトグラ
フィーや高速液体クロマトグラフィーのような化学的方
法に代わる好ましい方法として提唱されてきている。
フィーや高速液体クロマトグラフィーのような化学的方
法に代わる好ましい方法として提唱されてきている。
蛍光偏光イムノアッセイ法は、均一競合結合アッセイに
おいて生成したトレーサー−抗体複合体の量を測定する
ための信頼性のある足指手段を提供するものである。
おいて生成したトレーサー−抗体複合体の量を測定する
ための信頼性のある足指手段を提供するものである。
一般に、競合結合イムノアッセイ法は、試験試料中のリ
ガンドを測定するために用いられる。
ガンドを測定するために用いられる。
般に「リガンド」とは、競合結合イムノアッセイ法によ
り定量的に決定すべき生物学的に興味のもたれる物質で
ある。このリガンドは、標識試薬、または「リガンド類
似体」、または「トレーサー」と、これらリガンドおよ
びリガント類似体に特異的な抗体上の限られた数のレセ
プター結合部位への結合について競合する。試料中のリ
ガンドの濃度は、抗体に結合するりガント類似体の量を
決定する。
り定量的に決定すべき生物学的に興味のもたれる物質で
ある。このリガンドは、標識試薬、または「リガンド類
似体」、または「トレーサー」と、これらリガンドおよ
びリガント類似体に特異的な抗体上の限られた数のレセ
プター結合部位への結合について競合する。試料中のリ
ガンドの濃度は、抗体に結合するりガント類似体の量を
決定する。
リガンドおよびリガンド類似体はそれぞれの濃度に比例
して抗体に結合するので、抗体に結合するリガンド類似
体の量は試料中のリガンドの濃度に反比例する。
して抗体に結合するので、抗体に結合するリガンド類似
体の量は試料中のリガンドの濃度に反比例する。
蛍光偏光法は、競合結合イムノアッセイにおいて生成し
たトレーサー−抗体結合体の量を測定するための定量的
および定性的手段を提供する。蛍光偏光法は、蛍光標識
化合物が平面偏光により励ガント以外の化合物の認識）
を最小にする必要がある。
たトレーサー−抗体結合体の量を測定するための定量的
および定性的手段を提供する。蛍光偏光法は、蛍光標識
化合物が平面偏光により励ガント以外の化合物の認識）
を最小にする必要がある。
特に、メタンフェタミンのｄ−および１−鏡像体の両方
ともＵＳＤＥＡ目録■規制物質であり、従って両者とも
に濫用の可能性があると考えられるが、ｌ−鏡像体は興
奮作用が弱く、また店頭の薬物には少量しか含まれてい
ない。それゆえ、薬物濫用を検出するために用いるアッ
セイが試料中の１鏡像体にのみ応答するのは望ましくな
いと考えられる。それゆえ、そのようなアッセイにおい
ては１−メタンフェタミンに対する交差反応性ができる
限り０に近くなる必要がある。本発明のイムノアッセイ
に用いる新規な抗血清とトレーサーとの組合わせは、１
−メタンフェタミンに対する交差反応性を５．１％未満
まで減少させる。
ともＵＳＤＥＡ目録■規制物質であり、従って両者とも
に濫用の可能性があると考えられるが、ｌ−鏡像体は興
奮作用が弱く、また店頭の薬物には少量しか含まれてい
ない。それゆえ、薬物濫用を検出するために用いるアッ
セイが試料中の１鏡像体にのみ応答するのは望ましくな
いと考えられる。それゆえ、そのようなアッセイにおい
ては１−メタンフェタミンに対する交差反応性ができる
限り０に近くなる必要がある。本発明のイムノアッセイ
に用いる新規な抗血清とトレーサーとの組合わせは、１
−メタンフェタミンに対する交差反応性を５．１％未満
まで減少させる。
アンフェタミンおよびメタンフェタミンのイムノアッセ
イにおいて、β−フェネチルアミンの誘導体、とりわけ
β−ヒドロキシフェネチルアミン化合物が強力な妨害物
であることも知られている。
イにおいて、β−フェネチルアミンの誘導体、とりわけ
β−ヒドロキシフェネチルアミン化合物が強力な妨害物
であることも知られている。
そのようなβ−ヒドロキンフェネチルアミンの起された
ときに、その回転度とは逆の関係にある偏光の度合を有
する蛍光を放射するという原理に基づいている。従って
、蛍光標識を有するトレーサー−抗体結合体を平面偏光
で励起させたときに、蛍光団は光の吸収と放射との間で
回転が抑えられるので、放射された光は高度に偏光した
ままである。これとは対照的に、未結合トレーサーが平
面偏光により励起されると、その回転は対応するトレー
サー−抗体結合体よりもはるかに速く、分子の励起集団
は一層速やかに無秩序化する。その結果、未結合トレー
サー分子から放射された光は脱偏光される。
ときに、その回転度とは逆の関係にある偏光の度合を有
する蛍光を放射するという原理に基づいている。従って
、蛍光標識を有するトレーサー−抗体結合体を平面偏光
で励起させたときに、蛍光団は光の吸収と放射との間で
回転が抑えられるので、放射された光は高度に偏光した
ままである。これとは対照的に、未結合トレーサーが平
面偏光により励起されると、その回転は対応するトレー
サー−抗体結合体よりもはるかに速く、分子の励起集団
は一層速やかに無秩序化する。その結果、未結合トレー
サー分子から放射された光は脱偏光される。
そのような蛍光偏光法は、ワンプ（Ｗａｎｇ）らの米国
特許第４，４２０，５６８号明細書において応用されて
おり、この方法は蛍光団としてトリアジニルアミノ−フ
ルオレセイン残基を使用することを含んでいる。
特許第４，４２０，５６８号明細書において応用されて
おり、この方法は蛍光団としてトリアジニルアミノ−フ
ルオレセイン残基を使用することを含んでいる。
アンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンの濫用に対
して正確で信頼性のおけるイムノアッセイを行うために
は、抗体の「交差反応性」（所望す種である薬物フェニ
ルプロバラノールアミンは、店頭で売られているうっ血
除去剤中にしばしば見出だされる。米国特許第３，８５
６．４６９号明細書には、アンフェタミンまたはメタン
フェタミンの分析用試料を水酸化アンモニウムの存在下
、ある量の過ヨウ素酸水溶液で８．０よりも大きなｐ）
（にて処理することにより、該試料からβ−ヒドロキシ
フェネチルアミン妨害物を除去することが開示されてい
る。試料を塩基性ｐＨで処理する必要に加えて、上記米
国特許第３，８５６，４６９号明細書に開示の水性前処
理は、薄層クロマトグラフィ、ラジオイムノアッセイに
よるイムノアッセイ、電子スピン共鳴法または酵素法に
より試料を評価するのに先立って用いる場合にのみ有用
であることを示唆している。
して正確で信頼性のおけるイムノアッセイを行うために
は、抗体の「交差反応性」（所望す種である薬物フェニ
ルプロバラノールアミンは、店頭で売られているうっ血
除去剤中にしばしば見出だされる。米国特許第３，８５
６．４６９号明細書には、アンフェタミンまたはメタン
フェタミンの分析用試料を水酸化アンモニウムの存在下
、ある量の過ヨウ素酸水溶液で８．０よりも大きなｐ）
（にて処理することにより、該試料からβ−ヒドロキシ
フェネチルアミン妨害物を除去することが開示されてい
る。試料を塩基性ｐＨで処理する必要に加えて、上記米
国特許第３，８５６，４６９号明細書に開示の水性前処
理は、薄層クロマトグラフィ、ラジオイムノアッセイに
よるイムノアッセイ、電子スピン共鳴法または酵素法に
より試料を評価するのに先立って用いる場合にのみ有用
であることを示唆している。
加えて、アンフェタミンおよび／またはメタンフェタミ
ンの分析用の生物学的試料中に天然に存在するチラミン
もまた、アンフェタミンおよびｄメタンフェタミンのイ
ムノアッセイにおける強力な妨害物である。チラミン妨
害物に付随する望ましくない結果は、偽陽性の結果が得
られることである。しかしながら、本発明のイムノアッ
セイに用いる新規な抗血清とトレーサーとの組合わせは
、チラミンに対するイムノアッセイの交差反応性を約０
．４％に維持するという点て、従来法に比べてチラミン
に対するアンフェタミンおよびｄメタンフェタミンのイ
ムノアッセイの選択性を顕著に改善するものである。
ンの分析用の生物学的試料中に天然に存在するチラミン
もまた、アンフェタミンおよびｄメタンフェタミンのイ
ムノアッセイにおける強力な妨害物である。チラミン妨
害物に付随する望ましくない結果は、偽陽性の結果が得
られることである。しかしながら、本発明のイムノアッ
セイに用いる新規な抗血清とトレーサーとの組合わせは
、チラミンに対するイムノアッセイの交差反応性を約０
．４％に維持するという点て、従来法に比べてチラミン
に対するアンフェタミンおよびｄメタンフェタミンのイ
ムノアッセイの選択性を顕著に改善するものである。
さらに、本発明の蛍光偏光イムノアッセイに用いる新規
な化学試薬を化学的に合成する方法により、出発物質と
して「規制薬物」を利用する必要がなくなり、従って、
連邦薬物施行径に要求を満たずために必要な時間、労力
および経費を著しく削減することができる。
な化学試薬を化学的に合成する方法により、出発物質と
して「規制薬物」を利用する必要がなくなり、従って、
連邦薬物施行径に要求を満たずために必要な時間、労力
および経費を著しく削減することができる。
最後に、本発明のイムノアッセイは分析の前に試料を処
理する必要がなく、また本発明のアッセインステムは１
−メタンフェタミンや他のアンフェタミン様化合物に対
する交差反応性が最小であるので、従来法に比べて迅速
で正確なアンフェタミン／ｄ−メタンフェタミンアッセ
イを行うことがめのラジオイムノアッセイ法） ； Ｃ
ｈｅｍ、 Ｐ ｈａｒｍ、 Ｂ ｕｌｌ、２５（４）、
８４０（１９７７Ｘメタンフエタミンのラジオイムノア
ッセイ）；Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ５ｃｉｅｎｃｅＩ ｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２７．４９（１９８５Ｘ尿アン
フエタミンのスクリーニングのためのラテックス凝集抑
制反応試験）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｎ
ｌｉｓｔｒｙ１６Ｌ １１７（＋９８７８生物分解性
カルボキシメチル−キチンを用いたメタンフェタミン特
異的抗体の誘導）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＳＶｏｌ、 ＋ ９、Ｎｏ、
＋ （＋ ９７６Ｘｄ−（Ｓ）−メタンフェタミンに
向けられた抗体の特異性の決定）ＣＩｉｎ、 Ｃｈｅｎ
、 ３２ ／ ９．１６７７（１９１１１６Ｘ尿中の
アンフェタミンの検出のための均一蛍光イムノアッセイ
）；Ｊｐｎ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ ３７（４）、
４１７（＋ ９８３Ｘメタンフエタミンのための固相マ
イクロエライサ）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒ Ｐｏｒｅｎ
ｓｉｃ ５ｃｉｅｎｃｅ、 Ｖｏｌ、３２、Ｎｏ、３．
６５８（１９８７Ｘ免疫細胞化学によるメタンフェタミ
ンの組織化学的呈示）；Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌ
ｌ、２５（４）、８３８（１９７７Ｘメタンフエタミン
に対する特異的抗体のできる。
理する必要がなく、また本発明のアッセインステムは１
−メタンフェタミンや他のアンフェタミン様化合物に対
する交差反応性が最小であるので、従来法に比べて迅速
で正確なアンフェタミン／ｄ−メタンフェタミンアッセ
イを行うことがめのラジオイムノアッセイ法） ； Ｃ
ｈｅｍ、 Ｐ ｈａｒｍ、 Ｂ ｕｌｌ、２５（４）、
８４０（１９７７Ｘメタンフエタミンのラジオイムノア
ッセイ）；Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ５ｃｉｅｎｃｅＩ ｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２７．４９（１９８５Ｘ尿アン
フエタミンのスクリーニングのためのラテックス凝集抑
制反応試験）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｎ
ｌｉｓｔｒｙ１６Ｌ １１７（＋９８７８生物分解性
カルボキシメチル−キチンを用いたメタンフェタミン特
異的抗体の誘導）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＳＶｏｌ、 ＋ ９、Ｎｏ、
＋ （＋ ９７６Ｘｄ−（Ｓ）−メタンフェタミンに
向けられた抗体の特異性の決定）ＣＩｉｎ、 Ｃｈｅｎ
、 ３２ ／ ９．１６７７（１９１１１６Ｘ尿中の
アンフェタミンの検出のための均一蛍光イムノアッセイ
）；Ｊｐｎ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ ３７（４）、
４１７（＋ ９８３Ｘメタンフエタミンのための固相マ
イクロエライサ）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒ Ｐｏｒｅｎ
ｓｉｃ ５ｃｉｅｎｃｅ、 Ｖｏｌ、３２、Ｎｏ、３．
６５８（１９８７Ｘ免疫細胞化学によるメタンフェタミ
ンの組織化学的呈示）；Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌ
ｌ、２５（４）、８３８（１９７７Ｘメタンフエタミン
に対する特異的抗体のできる。
生物学的試料中のアンフェタミンおよびメタンフェタミ
ンの検出に関連する技術については、米国特許第３，９
９６，３４４号明細書（フェネチルアミン抗原性結合体
、その調製、抗体および使用）：米国特許第４，０１６
，１４６号明細書（フェネチルアミン抗原性結合体、そ
の調製、抗体および使用）；米国特許第４．０４１，０
７６号明細書（薬理学的に活性なフェネチルアミン類の
イムノアッセイ）：米国特許第４，３２９．３８１号明
細書（アンフェタミンおよびメタンフェタミンに選択的
な抗体の産生に用いる免疫原の調製に用いるハプテン組
成物）：米国特許第３，９６６．７６４号明細書（レセ
プター置換−アンフェタミン類似体によるスピン標識化
合物のりガント決定）；米国特許第４，０６７．７７４
号明細書（酵素増幅アッセイ用化合物）：米国特許第３
，８７８，１８７号明細書（アンフェタミンのポリペプ
チド誘導体およびイムノアッセイ用類似体）：ＦＥＢＳ
ＬＥＴＴＥＲ８３６，３（１９７３）（尿中のアンフ
ェタミンを測定するた調製）；Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｔｏ
ｘｉｃｏｌｏｇｙ、 Ｉ ８（１）、９１（１９８１
Ｘ異なる濃度でのＥＭＴＩによるアンフェタミン関連ア
ミン類の分析）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ６０．５５１ （１９７４Ｘ３，４．
５−トリメトキシフェネチルアミン（メスカリン）およ
び２５−ジメトキシ−４−メチルフェニルイソプロピル
アミンのラジオイムノアッセイ）；およびＣ１１ｎｉｃ
ａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、 ｌ ８（３）、２９
９（１９８１ＸＲＩ Ａによるアンフェタミン関連アミ
ン類の分析）を参照されたい。
ンの検出に関連する技術については、米国特許第３，９
９６，３４４号明細書（フェネチルアミン抗原性結合体
、その調製、抗体および使用）：米国特許第４，０１６
，１４６号明細書（フェネチルアミン抗原性結合体、そ
の調製、抗体および使用）；米国特許第４．０４１，０
７６号明細書（薬理学的に活性なフェネチルアミン類の
イムノアッセイ）：米国特許第４，３２９．３８１号明
細書（アンフェタミンおよびメタンフェタミンに選択的
な抗体の産生に用いる免疫原の調製に用いるハプテン組
成物）：米国特許第３，９６６．７６４号明細書（レセ
プター置換−アンフェタミン類似体によるスピン標識化
合物のりガント決定）；米国特許第４，０６７．７７４
号明細書（酵素増幅アッセイ用化合物）：米国特許第３
，８７８，１８７号明細書（アンフェタミンのポリペプ
チド誘導体およびイムノアッセイ用類似体）：ＦＥＢＳ
ＬＥＴＴＥＲ８３６，３（１９７３）（尿中のアンフ
ェタミンを測定するた調製）；Ｃ１１ｎｉｃａｌ Ｔｏ
ｘｉｃｏｌｏｇｙ、 Ｉ ８（１）、９１（１９８１
Ｘ異なる濃度でのＥＭＴＩによるアンフェタミン関連ア
ミン類の分析）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂ ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ６０．５５１ （１９７４Ｘ３，４．
５−トリメトキシフェネチルアミン（メスカリン）およ
び２５−ジメトキシ−４−メチルフェニルイソプロピル
アミンのラジオイムノアッセイ）；およびＣ１１ｎｉｃ
ａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、 ｌ ８（３）、２９
９（１９８１ＸＲＩ Ａによるアンフェタミン関連アミ
ン類の分析）を参照されたい。
従って、尿などの生物学的流体中に存在するアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの両方のための信頼性
があって正確な蛍光偏光アッセイを行うだめの方法およ
び試薬を提供する必要性が存在する。本発明は、アンフ
ェタミンおよびｄメタンフェタミンの蛍光偏光イムノア
ッセイに特に有用な新規な試薬およびそのようなイムノ
アッセイにおけるそのような試薬の組合わせを提供する
という点て当該技術に進歩をもたらすものであス （課題を解決するための手段） すなわち、本発明は、 （ａ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式１： （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨｌ〉Ｃ−０または〉ＳＯ７、Ｒはへテロ
原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合計
０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレー
サーの塩、 （ｉｉ）式３６ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一で示される第一
トレーサーの塩、 （ｉｉ）式３ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーザー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、ついで （ｂ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定する ことを前処理する、生物学的流体の試験試料中の抗体、
および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、ついで （ｂ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーザーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定する ことを前処理する、生物学的流体の試験試料中のアンフ
ェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの存在を
検出し、またはその量を決定する方法： （ａ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式２ （式中、ＱＳＺおよびＲは前記と同じ）アンフェタミン
および／またはｄ−メタンフェタミンの存在を検出し、
またはその量を決定する方法 （ａ）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ素酸水
溶液を用い、β−ヒドロキンフェネチルアミン交差反応
性を除くのに充分な時間該試料を前処理することにより
β−ヒドロキンフェネチルアミン交差反応性を除き、 （ｂ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式Ｉ： （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｉｉ）式３ （式中、ＱＳＺおよびＲは前記と同じ）て示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、 （ｃ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの二を決定し、ついで （ｄ）試薬分配手段を０４５％ＮａＣｌ中の５％プロピ
レンクリコール溶液で洗浄して該分配手段への試料の付
着を最小にする ことを前処理する、試料および試薬分配手段を有する自
動アッセイ装置を用いた蛍光偏光アッセイによる、生物
学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび／または
ｄ−メタンフェタミンを決定サーを特異的に認識し結合
することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、 （ｃ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定し、ついで （ｄ）試薬分配手段を０．４５％ＮａＣ１中の５％プロ
ピレングリコール溶液で洗浄して該分配手段への試料の
付着を最小にする ことを前処理する、試料および試薬分配手段を有する自
動アッセイ装置を用いた蛍光偏光アッセイによる、生物
学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび／または
ｄ−メタンフェタミンを決定する方法 する方法・ （ａ）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ素酸水
溶液を用い、β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応
性を除くのに充分な時間該試料を前処理することにより
β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応性を除き、 （ｂ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式２・ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｉｉ）式３ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレー（ａ）式
ｌ： （式中、ＱＳＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｂ）式３： （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｃ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特異的
に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｄ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサーを
特異的に認識し結合することのできる第二抗体 からなることを前処理する、生物学的試料中のアンフェ
タミンおよびｄ−メタンフェタミンを決定するのに有用
な試薬キット および （ａ）式２： （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｂ）式３ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｃ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特異的
に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｄ）ｄ−メタンフェタミンおよびその該第ニドレーサ
ーを特異的に認識し結合することのできる第二抗体 からなることを前処理する、生物学的試料中のア誘導体
トレーサー化合物、アンフェタミンおよび該第−トレー
サー化合物を特異的に認識し結合することのできる第一
抗体、ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー化
合物を特異的に認識し結合することのできる第二抗体か
らなる組成物と混合する。第一抗体および第二抗体にそ
れぞれ結合した第一トレーサー化合物および第ニドレー
サー化合物の■は蛍光偏光法によって決定され、生物学
的試料中のアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミン
の量を測定する。
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの両方のための信頼性
があって正確な蛍光偏光アッセイを行うだめの方法およ
び試薬を提供する必要性が存在する。本発明は、アンフ
ェタミンおよびｄメタンフェタミンの蛍光偏光イムノア
ッセイに特に有用な新規な試薬およびそのようなイムノ
アッセイにおけるそのような試薬の組合わせを提供する
という点て当該技術に進歩をもたらすものであス （課題を解決するための手段） すなわち、本発明は、 （ａ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式１： （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨｌ〉Ｃ−０または〉ＳＯ７、Ｒはへテロ
原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合計
０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレー
サーの塩、 （ｉｉ）式３６ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一で示される第一
トレーサーの塩、 （ｉｉ）式３ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーザー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、ついで （ｂ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定する ことを前処理する、生物学的流体の試験試料中の抗体、
および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、ついで （ｂ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーザーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定する ことを前処理する、生物学的流体の試験試料中のアンフ
ェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの存在を
検出し、またはその量を決定する方法： （ａ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式２ （式中、ＱＳＺおよびＲは前記と同じ）アンフェタミン
および／またはｄ−メタンフェタミンの存在を検出し、
またはその量を決定する方法 （ａ）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ素酸水
溶液を用い、β−ヒドロキンフェネチルアミン交差反応
性を除くのに充分な時間該試料を前処理することにより
β−ヒドロキンフェネチルアミン交差反応性を除き、 （ｂ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式Ｉ： （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｉｉ）式３ （式中、ＱＳＺおよびＲは前記と同じ）て示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、 （ｃ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの二を決定し、ついで （ｄ）試薬分配手段を０４５％ＮａＣｌ中の５％プロピ
レンクリコール溶液で洗浄して該分配手段への試料の付
着を最小にする ことを前処理する、試料および試薬分配手段を有する自
動アッセイ装置を用いた蛍光偏光アッセイによる、生物
学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび／または
ｄ−メタンフェタミンを決定サーを特異的に認識し結合
することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、 （ｃ）該第−抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第−トレーサーおよび該第ニドレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定し、ついで （ｄ）試薬分配手段を０．４５％ＮａＣ１中の５％プロ
ピレングリコール溶液で洗浄して該分配手段への試料の
付着を最小にする ことを前処理する、試料および試薬分配手段を有する自
動アッセイ装置を用いた蛍光偏光アッセイによる、生物
学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび／または
ｄ−メタンフェタミンを決定する方法 する方法・ （ａ）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ素酸水
溶液を用い、β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応
性を除くのに充分な時間該試料を前処理することにより
β−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応性を除き、 （ｂ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式２・ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｉｉ）式３ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第−トレー（ａ）式
ｌ： （式中、ＱＳＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｂ）式３： （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｃ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特異的
に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｄ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサーを
特異的に認識し結合することのできる第二抗体 からなることを前処理する、生物学的試料中のアンフェ
タミンおよびｄ−メタンフェタミンを決定するのに有用
な試薬キット および （ａ）式２： （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第一
トレーサーの塩、 （ｂ）式３ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ）で示される第ニ
ドレーサーの塩、 （ｃ）アンフェタミンおよび該第−トレーサーを特異的
に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｄ）ｄ−メタンフェタミンおよびその該第ニドレーサ
ーを特異的に認識し結合することのできる第二抗体 からなることを前処理する、生物学的試料中のア誘導体
トレーサー化合物、アンフェタミンおよび該第−トレー
サー化合物を特異的に認識し結合することのできる第一
抗体、ｄ−メタンフェタミンおよび該第ニドレーサー化
合物を特異的に認識し結合することのできる第二抗体か
らなる組成物と混合する。第一抗体および第二抗体にそ
れぞれ結合した第一トレーサー化合物および第ニドレー
サー化合物の■は蛍光偏光法によって決定され、生物学
的試料中のアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミン
の量を測定する。
さらに、本発明は、リボフラビン（ビタミンＢ２）によ
る潜在的な蛍光妨害の除去に関する。ヒトの必須栄養成
分であるリボフラビンは、ビタミンＢ複合体の熱安定性
成分、６．７−シメチルー９−［１゜Ｄ−リビチル］イ
ソアロキザジン、Ｃ，Ｈ２゜Ｎ４０６であり、乳、筋肉
、肝臓、腎臓、卵、草、麦芽、葉の多い新鮮な野菜、お
よび種々の藻類中に存在する。リボフラビン結合タンパ
ク質（ＲＢＰ）を各試料に直接加えるかまたはアッセイ
に用いた１種または２種以上の試薬に加えると、該タン
パンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンを決定する
のに有用な試薬キットを提供するものである。
る潜在的な蛍光妨害の除去に関する。ヒトの必須栄養成
分であるリボフラビンは、ビタミンＢ複合体の熱安定性
成分、６．７−シメチルー９−［１゜Ｄ−リビチル］イ
ソアロキザジン、Ｃ，Ｈ２゜Ｎ４０６であり、乳、筋肉
、肝臓、腎臓、卵、草、麦芽、葉の多い新鮮な野菜、お
よび種々の藻類中に存在する。リボフラビン結合タンパ
ク質（ＲＢＰ）を各試料に直接加えるかまたはアッセイ
に用いた１種または２種以上の試薬に加えると、該タン
パンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンを決定する
のに有用な試薬キットを提供するものである。
本発明は、蛍光偏光法を用い、生物学的試料中のアンフ
ェタミンおよびｄ−メタンフェタミンの両者の存在を検
出し、そのおよその量を決定するための方法に関する。
ェタミンおよびｄ−メタンフェタミンの両者の存在を検
出し、そのおよその量を決定するための方法に関する。
とりわけ、本発明の方法には、アンフェタミンおよび／
またはｄ−メタンフェタミンについて試験しようとする
尿試料のｐＨをアルカリ条件に調整することなく該試料
をブレインキュベーションすることが含まれる。特に、
ｐＨが約４．０〜７．５の過ヨウ素酸水溶液単独で試料
を処理して、アンフェタミンおよび／またはｄメタンフ
ェタミンおよびそれらのリガンドに特異的な抗体と交差
反応する望ましくない化合物を除去する。
またはｄ−メタンフェタミンについて試験しようとする
尿試料のｐＨをアルカリ条件に調整することなく該試料
をブレインキュベーションすることが含まれる。特に、
ｐＨが約４．０〜７．５の過ヨウ素酸水溶液単独で試料
を処理して、アンフェタミンおよび／またはｄメタンフ
ェタミンおよびそれらのリガンドに特異的な抗体と交差
反応する望ましくない化合物を除去する。
こうして処理した試料を、アンフェタミンのリガンド類
似体に結合した第一のフルオレセインもしくはフルオレ
セイン誘導体トレーサー化合物、ｄ−メタンフェタミン
のリガンド類似体に結合した第二のフルオレセインもし
くはフルオレセインり質は存在するすべてのリボフラビ
ンと結合してリボフラビン結合タンパク質−リポフラビ
ン複合体を生成し、かくして蛍光妨害物を除去すること
ができる。他の蛍光消滅（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）物質もまた、この目的のために
用いることができる。
似体に結合した第一のフルオレセインもしくはフルオレ
セイン誘導体トレーサー化合物、ｄ−メタンフェタミン
のリガンド類似体に結合した第二のフルオレセインもし
くはフルオレセインり質は存在するすべてのリボフラビ
ンと結合してリボフラビン結合タンパク質−リポフラビ
ン複合体を生成し、かくして蛍光妨害物を除去すること
ができる。他の蛍光消滅（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）物質もまた、この目的のために
用いることができる。
本発明はまた、内生チラミンによる潜在的な妨害の除去
にも関する。チロシンはたいていのタンパク質にみられ
るアミノ酸であり、フェニルアラニンから代謝的に合成
される。チラミンはチロシンの脱炭酸産物であり、排出
尿中にみとめられる。
にも関する。チロシンはたいていのタンパク質にみられ
るアミノ酸であり、フェニルアラニンから代謝的に合成
される。チラミンはチロシンの脱炭酸産物であり、排出
尿中にみとめられる。
チラミンはまた種々のヂーズのような食物の成分でもあ
り、細菌分解産物である。尿試料が実質的な量のチラミ
ンを含有しているときに、アンフェタミンおよびｄ−メ
タンフェタミンのイムノアッセイに用いる抗血清が生物
学的流体試料中に存在するチラミンとごくわずかでも交
差反応性（たとえば２％）があるとアンフェタミンおよ
び／またはｄ−メタンフェタミンについて偽陽性の結果
となるので、アンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミ
ンの正確で信頼性の置けるイムノアッセイのためには、
ヂラミン七の抗体交差反応性を最小にする必要がある。
り、細菌分解産物である。尿試料が実質的な量のチラミ
ンを含有しているときに、アンフェタミンおよびｄ−メ
タンフェタミンのイムノアッセイに用いる抗血清が生物
学的流体試料中に存在するチラミンとごくわずかでも交
差反応性（たとえば２％）があるとアンフェタミンおよ
び／またはｄ−メタンフェタミンについて偽陽性の結果
となるので、アンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミ
ンの正確で信頼性の置けるイムノアッセイのためには、
ヂラミン七の抗体交差反応性を最小にする必要がある。
本発明のイムノアッセイに用いる新規な抗血清とトレー
サーとの組合わせは、チラミンに対するイムノアッセイ
の交差反応性を約０４％に維持するという点で、従来法
に比べてチラミンに対するアンフェタミンおよびｄ−メ
タンフェタミンのイムノアッセイの選択性を著しく改善
するということが予期せずわかった。
サーとの組合わせは、チラミンに対するイムノアッセイ
の交差反応性を約０４％に維持するという点で、従来法
に比べてチラミンに対するアンフェタミンおよびｄ−メ
タンフェタミンのイムノアッセイの選択性を著しく改善
するということが予期せずわかった。
さらに、本発明は、本発明の方法において試薬として有
用な新規なトレーサーおよびその塩を含む、アンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンを単一アッセイで決定
するのに有用な安定化試薬キットにも関する。本発明に
よる試薬キットの他の成分は、リボフラヒン結合タンパ
ク質を含む溶液、β−ヒドロキシフェネチルアミン類に
対する望ましくない交差反応性を除去するのに有効な量
の過ヨウ素酸塩を含む前処理水溶液、およびアンフェタ
ミンを特異的に認識し結合することのできる第一抗体お
よびｄ−メタンフェタミンを特異的結合するように化学
的に修飾したりガントはハプテンと呼ばれる。一般にハ
プテンに対する抗体は、まず該ハプテンを担体に結合さ
せ、ついで該結合産物を動物に注射することによって産
生される。
用な新規なトレーサーおよびその塩を含む、アンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンを単一アッセイで決定
するのに有用な安定化試薬キットにも関する。本発明に
よる試薬キットの他の成分は、リボフラヒン結合タンパ
ク質を含む溶液、β−ヒドロキシフェネチルアミン類に
対する望ましくない交差反応性を除去するのに有効な量
の過ヨウ素酸塩を含む前処理水溶液、およびアンフェタ
ミンを特異的に認識し結合することのできる第一抗体お
よびｄ−メタンフェタミンを特異的結合するように化学
的に修飾したりガントはハプテンと呼ばれる。一般にハ
プテンに対する抗体は、まず該ハプテンを担体に結合さ
せ、ついで該結合産物を動物に注射することによって産
生される。
生成した抗体は、通常のよく知られた抗体単離法により
単離することができる。
単離することができる。
本明細書において「リガンド類似体」とは、実質部分が
リガンドと同じ空間的および極性的構成を有していて、
レセプターの結合部位に対してリガンドと競合し得る１
または２以上の決定基またはエピトープ部位を有してい
る一価または多価ラジカルをいう。そのようなりガント
類似体の特性は、該リガンドに対する抗体によって認識
されるほど該リガンドに対して充分な構造的類似性を有
しているということである。一般に、リガンド類似体は
、分子表面の有為部分に関してリガンド（本発明ではア
ンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミン）と同じかま
たは実質的に同じ構造および荷電分布（空間的および極
性的構成）を有している。抗体産生のための抗原の調製
におけるハプテンの結に認識し結合することのできる第
二抗体からなる組成の抗体試薬である。ピペットのよう
な自動分配手段を利用した自動化蛍光偏光アッセイの場
合には、本発明では、分配手段への付着のために試料か
ら試料へ薬物が残留していくのを最小にするために、混
合後にプロピレングリコールおよび食塩の水溶液で分配
手段を洗浄する。好ましい前処理水溶液は、約Ｏｌ〜０
．２５モルの過ヨウ素酸ナトリウムである。
リガンドと同じ空間的および極性的構成を有していて、
レセプターの結合部位に対してリガンドと競合し得る１
または２以上の決定基またはエピトープ部位を有してい
る一価または多価ラジカルをいう。そのようなりガント
類似体の特性は、該リガンドに対する抗体によって認識
されるほど該リガンドに対して充分な構造的類似性を有
しているということである。一般に、リガンド類似体は
、分子表面の有為部分に関してリガンド（本発明ではア
ンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミン）と同じかま
たは実質的に同じ構造および荷電分布（空間的および極
性的構成）を有している。抗体産生のための抗原の調製
におけるハプテンの結に認識し結合することのできる第
二抗体からなる組成の抗体試薬である。ピペットのよう
な自動分配手段を利用した自動化蛍光偏光アッセイの場
合には、本発明では、分配手段への付着のために試料か
ら試料へ薬物が残留していくのを最小にするために、混
合後にプロピレングリコールおよび食塩の水溶液で分配
手段を洗浄する。好ましい前処理水溶液は、約Ｏｌ〜０
．２５モルの過ヨウ素酸ナトリウムである。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
風致
本明細書において「リガンド」とは、それに対してレセ
プターまたは抗体のような結合タンパク質が得られるか
または生成することのできる分子をいう。本発明の対象
となるリガンドは、フェネチルアミン類、さらに詳しく
はアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンである。
プターまたは抗体のような結合タンパク質が得られるか
または生成することのできる分子をいう。本発明の対象
となるリガンドは、フェネチルアミン類、さらに詳しく
はアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンである。
これらリガンドはタンパク質不含の低分子量化合物であ
って、通常、動物内に注射したときに抗体を産生ずるこ
とはないが抗体と反応性である。担体タンパク質に合部
位は、リガンドへの結合のためのトレーサーに使用する
結合部位としばしば同じであり、抗体の鋳型を供するリ
ガンド類似体の同じ部分がトレーサー中でリガンド類似
体により暴露される。
って、通常、動物内に注射したときに抗体を産生ずるこ
とはないが抗体と反応性である。担体タンパク質に合部
位は、リガンドへの結合のためのトレーサーに使用する
結合部位としばしば同じであり、抗体の鋳型を供するリ
ガンド類似体の同じ部分がトレーサー中でリガンド類似
体により暴露される。
本発明は、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体
を使用することを含む。本発明においてトレーサー化合
物としての有用性に必要なフルオレセインおよびフルオ
レセイン誘導体の性質は、フルオレセインの蛍光性であ
る。フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）に依存し
て以下に示す２つの互変体のいずれかで存在する。
を使用することを含む。本発明においてトレーサー化合
物としての有用性に必要なフルオレセインおよびフルオ
レセイン誘導体の性質は、フルオレセインの蛍光性であ
る。フルオレセインは、環境の酸濃度（ｐＨ）に依存し
て以下に示す２つの互変体のいずれかで存在する。
ラクトン
開環（酸）形では数多くの共役二重結合が存在するため
、この形のフルオレセイン（およびフルオレセイン残基
を含む化合物）では約４ナノ秒の励起状態寿命の後に青
色の光を吸収し緑色の蛍光を放出することができる。開
環形および閉環形が共存する場合には、開環形および開
環形分子の相対濃度はｐＨレベルの調節により容易に変
えることができる。一般に、本発明のトレーサー化合物
は、溶液中でナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩などの塩として存在するため、本発明の分析法で用い
たときに開環の蛍光形で存在することができる。存在す
る特定の塩は、ｐＨレベルの調節に用いた緩衝液に依存
する。たとえば、リン酸ナトリウム緩衝液の存在下では
、本発明の化合物は子は、本発明の開示のためには「６
」の番号が付けられる。
、この形のフルオレセイン（およびフルオレセイン残基
を含む化合物）では約４ナノ秒の励起状態寿命の後に青
色の光を吸収し緑色の蛍光を放出することができる。開
環形および閉環形が共存する場合には、開環形および開
環形分子の相対濃度はｐＨレベルの調節により容易に変
えることができる。一般に、本発明のトレーサー化合物
は、溶液中でナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム
塩などの塩として存在するため、本発明の分析法で用い
たときに開環の蛍光形で存在することができる。存在す
る特定の塩は、ｐＨレベルの調節に用いた緩衝液に依存
する。たとえば、リン酸ナトリウム緩衝液の存在下では
、本発明の化合物は子は、本発明の開示のためには「６
」の番号が付けられる。
抗体と複合体を形成していない溶液中のトレーサーは、
吸収し蛍光を再放射するのに必要な時間よりも短い時間
自由に回転できる。その結果、再放射された光は相対的
に無秩序に配向しており、抗体と複合体を形成していな
いトレーサーの蛍光偏光は低く、０に近くなる。特異的
な抗体と複合体を形成すると、生成したトレーサー−抗
体複合体は抗体分子の回転度を示し、これは比較的小さ
なトレーサー分子の回転度よりも遅いため偏光の増加が
観察される。それゆえ、抗体部位への結合についてリガ
ントがトレーサーと競合するときには、得られた遊離ト
レーサーとトレーサー−抗体複合体との混合物の蛍光偏
光は、トレーサーの蛍光偏光とトレーサー−抗体複合体
の蛍光偏光との中間値を示すものとして観察される。試
料が高濃度のりガントを含んでいるときは、観察される
偏光値は遊離トレーサーの偏光値に近くなる、すなわち
低くなる。試料が低濃度のりガントを含んで一般にナト
リウム塩として開環形で存在する。
吸収し蛍光を再放射するのに必要な時間よりも短い時間
自由に回転できる。その結果、再放射された光は相対的
に無秩序に配向しており、抗体と複合体を形成していな
いトレーサーの蛍光偏光は低く、０に近くなる。特異的
な抗体と複合体を形成すると、生成したトレーサー−抗
体複合体は抗体分子の回転度を示し、これは比較的小さ
なトレーサー分子の回転度よりも遅いため偏光の増加が
観察される。それゆえ、抗体部位への結合についてリガ
ントがトレーサーと競合するときには、得られた遊離ト
レーサーとトレーサー−抗体複合体との混合物の蛍光偏
光は、トレーサーの蛍光偏光とトレーサー−抗体複合体
の蛍光偏光との中間値を示すものとして観察される。試
料が高濃度のりガントを含んでいるときは、観察される
偏光値は遊離トレーサーの偏光値に近くなる、すなわち
低くなる。試料が低濃度のりガントを含んで一般にナト
リウム塩として開環形で存在する。
本明細書において「フルオレセイン」なる語は、個々の
化合物としてかまたは大きな化合物の成分としてかにか
かわらず、開環形および閉環形の両者が特定の分子ため
に存在するならば、蛍光との関連以外ではこれら両者を
含めた意味である。蛍光を生じるためには開環形である
ことが必要である。
化合物としてかまたは大きな化合物の成分としてかにか
かわらず、開環形および閉環形の両者が特定の分子ため
に存在するならば、蛍光との関連以外ではこれら両者を
含めた意味である。蛍光を生じるためには開環形である
ことが必要である。
フルオレセイン分子の炭素原子の番号付けは、開環また
は閉環形の分子のいずれを考慮するかによって変わる。
は閉環形の分子のいずれを考慮するかによって変わる。
従って、炭素原子の番号付けに関しては、フルオレセイ
ンおよびその化合物についての文献は一様ではない。開
環形では、単離したフェニル環上のカルボキシル基に対
してパラの位置にある炭素原子は番号が５である。合成
に用いる原料物質は閉環システムで番号付けするのが最
も普通であるので、本発明の目的のためにはこの閉環形
の番号付けを採用することにする。それゆえ、カルボキ
シル基に対してパラの位置にあるフルオレセインおよび
フルオレセイン誘導体炭素原いるときは、偏光値は結合
トレーサーの偏光値に近くなる、すなわち高くなる。イ
ムノアッセイの反応混合物を垂直偏光および水平偏光で
順番に励起させ、ついで放射光のうち水平偏光のみを分
析することにより、反応混合物の蛍光偏光を正確に決定
することができる。決定しようとするリガンドの濃度と
偏光との正確な関係は、既知濃度の検量体の偏光値を測
定することにより確立する。リガンドの濃度は、この方
法で作成した標準曲線から外挿することができる。
ンおよびその化合物についての文献は一様ではない。開
環形では、単離したフェニル環上のカルボキシル基に対
してパラの位置にある炭素原子は番号が５である。合成
に用いる原料物質は閉環システムで番号付けするのが最
も普通であるので、本発明の目的のためにはこの閉環形
の番号付けを採用することにする。それゆえ、カルボキ
シル基に対してパラの位置にあるフルオレセインおよび
フルオレセイン誘導体炭素原いるときは、偏光値は結合
トレーサーの偏光値に近くなる、すなわち高くなる。イ
ムノアッセイの反応混合物を垂直偏光および水平偏光で
順番に励起させ、ついで放射光のうち水平偏光のみを分
析することにより、反応混合物の蛍光偏光を正確に決定
することができる。決定しようとするリガンドの濃度と
偏光との正確な関係は、既知濃度の検量体の偏光値を測
定することにより確立する。リガンドの濃度は、この方
法で作成した標準曲線から外挿することができる。
以下でも示すように、本発明に従って調製した特定のト
レーサーからは驚くほど素晴しいアッセイが得られるこ
とがわかった。
レーサーからは驚くほど素晴しいアッセイが得られるこ
とがわかった。
成栗
規制薬物法は、麻薬を含む精神活性薬物が濫用される可
能性があること、医学的な容認および依存性を生じ得る
ことに基づいた５つの目録に従って、これら薬物の処方
および投薬を規制する一連の連邦法である。この法律は
また、各目録における薬物の製造、貯蔵、および輸送の
規制システムをも確立する。この法律で扱われる薬物に
は、アヘンおよびその誘導体、アヘン製剤、幻覚発現薬
、抑制薬および興奮薬がある。規制薬物、またはアンフ
ェタミンおよびメタンフェクミンのように行動に影響を
与える可能性があり所持や使用に関して法律で規制され
ている物質を化合物の合成の出発物質として用いたり、
またはこの化学合成で中間体または最終産物として生成
されるときには、適当な書類を作成し連邦薬物施行局に
出願するためにかなりの時間と労力が費やされなければ
ならない。加えて、これら規制薬物は「規制された」ま
たは非常に制御された仕方で使用しなければならず、研
究室の運営および製造設備に非常な安全性が要求される
。従って、詳細な在庫目録を維持したり、すべての規制
薬物を施錠保管したりといった薬物施行局の種々の要請
を満たすのに必要な時間、労力および経費を削減するた
めに、化学反応を行い化合物を合成する場合に規制薬物
を使用したり製造したりすることは極力避けることが望
ましい。本発明の蛍光偏光イムノアッセイに用いる詳し
くいえば、過ヨウ素酸塩水溶液は、α−炭素原子に結合
する水酸基（−０Ｈ）が存在するときにα−炭素とβ−
炭素の間の側鎖を開裂させる。従って、開裂した化合物
はもはや結合部位について競合することはない。
能性があること、医学的な容認および依存性を生じ得る
ことに基づいた５つの目録に従って、これら薬物の処方
および投薬を規制する一連の連邦法である。この法律は
また、各目録における薬物の製造、貯蔵、および輸送の
規制システムをも確立する。この法律で扱われる薬物に
は、アヘンおよびその誘導体、アヘン製剤、幻覚発現薬
、抑制薬および興奮薬がある。規制薬物、またはアンフ
ェタミンおよびメタンフェクミンのように行動に影響を
与える可能性があり所持や使用に関して法律で規制され
ている物質を化合物の合成の出発物質として用いたり、
またはこの化学合成で中間体または最終産物として生成
されるときには、適当な書類を作成し連邦薬物施行局に
出願するためにかなりの時間と労力が費やされなければ
ならない。加えて、これら規制薬物は「規制された」ま
たは非常に制御された仕方で使用しなければならず、研
究室の運営および製造設備に非常な安全性が要求される
。従って、詳細な在庫目録を維持したり、すべての規制
薬物を施錠保管したりといった薬物施行局の種々の要請
を満たすのに必要な時間、労力および経費を削減するた
めに、化学反応を行い化合物を合成する場合に規制薬物
を使用したり製造したりすることは極力避けることが望
ましい。本発明の蛍光偏光イムノアッセイに用いる詳し
くいえば、過ヨウ素酸塩水溶液は、α−炭素原子に結合
する水酸基（−０Ｈ）が存在するときにα−炭素とβ−
炭素の間の側鎖を開裂させる。従って、開裂した化合物
はもはや結合部位について競合することはない。
本発明の試薬キットによる前処理試薬には、ｐＨ約４〜
７．５の過ヨウ素酸塩水溶液が含まれる。
７．５の過ヨウ素酸塩水溶液が含まれる。
この前処理溶液には、Ｉ）Ｈ範囲が約４，０〜５．０の
過ヨウ素酸ナトリウムが含まれることが好ましい。過ヨ
ウ素酸ナトリウム溶液には、ｐＨ約４．５の約０．２０
Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムが含まれることが最も好まし
い。驚くべきことに、水酸化物のような化合物で試験試
料をアルカリ条件にｐＨ８節する必要なく、試験試料の
前処理を行うことができることがわかった。
過ヨウ素酸ナトリウムが含まれることが好ましい。過ヨ
ウ素酸ナトリウム溶液には、ｐＨ約４．５の約０．２０
Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムが含まれることが最も好まし
い。驚くべきことに、水酸化物のような化合物で試験試
料をアルカリ条件にｐＨ８節する必要なく、試験試料の
前処理を行うことができることがわかった。
２、トレーサー
（ａ）トレーサーの構造
使用可能なトレーサーは、広範囲の種々のフェネチルア
ミン誘導体から製造することができる。
ミン誘導体から製造することができる。
本発明の第一の新規なアンフェタミントレーサー新規な
化学試薬を化学的に合成する方法は、出発物質として規
制薬物を利用する必要がなく、従って、連邦薬物施行局
の要請を満たすために必要な著しい時間、労力、および
経費を削減できるという点で有利である。
化学試薬を化学的に合成する方法は、出発物質として規
制薬物を利用する必要がなく、従って、連邦薬物施行局
の要請を満たすために必要な著しい時間、労力、および
経費を削減できるという点で有利である。
蛍光偏光イムノアッセイを設計する上での目的は、抗体
の結合部位に対し所望のフェネチルアミン類とトレーサ
ーとの間で競合させることである。
の結合部位に対し所望のフェネチルアミン類とトレーサ
ーとの間で競合させることである。
この目的を達成するために、ハプテンおよびトレーサー
には多様な構造が可能である。本発明の目的のためには
、「ハブテン」は、一般に置換フェネチルアミン誘導体
およびタンパク質担体またはフルオレセイン化合物への
結合基からなる、免疫原またはトレーサーの前駆体、ま
たはそれらの誘導体である。
には多様な構造が可能である。本発明の目的のためには
、「ハブテン」は、一般に置換フェネチルアミン誘導体
およびタンパク質担体またはフルオレセイン化合物への
結合基からなる、免疫原またはトレーサーの前駆体、ま
たはそれらの誘導体である。
１、前処理試薬
本発明の重要な側面は、有効量の過ヨウ素酸塩水溶液で
試験試料を前処理することにＪ二って、蛍光偏光アッセ
イにおけるβ−ヒドロキシフェネチルアミン類に対する
交差反応性を除くことにある。
試験試料を前処理することにＪ二って、蛍光偏光アッセ
イにおけるβ−ヒドロキシフェネチルアミン類に対する
交差反応性を除くことにある。
化合物は、下記式１：
で示される化合物であり、本発明の第二の新規なアンフ
ェタミントレーサー化合物は、下記式２で示される化合
物である。上記式ｌおよび２において、（１）Ｑは（ａ
）フルオレセイン：または（ｂ）フルオレセイン誘導体
、 （２）Ｚは＞ＮＨ，＞Ｃ＝Ｏまたは＞ Ｓ Ｏ２（３）
Ｒはへテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ
原子を合計０〜１５個有する結合基である。
ェタミントレーサー化合物は、下記式２で示される化合
物である。上記式ｌおよび２において、（１）Ｑは（ａ
）フルオレセイン：または（ｂ）フルオレセイン誘導体
、 （２）Ｚは＞ＮＨ，＞Ｃ＝Ｏまたは＞ Ｓ Ｏ２（３）
Ｒはへテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ
原子を合計０〜１５個有する結合基である。
本発明の新規なｄ−メタンフェタミントレーサー化合物
は、下記式３ で示される化合物である。上記式３において、（１）Ｑ
は（ａ）フルオレセイン；または（ｂ）フルオレセイン
誘導体、 （２）Ｚは＞ＮＨｌ＞Ｃ＝Ｏまたは＞ Ｓ Ｏ２（３）
Ｒはへテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびペテロ
原子を合計Ｏ〜１５個存する結合基である。
は、下記式３ で示される化合物である。上記式３において、（１）Ｑ
は（ａ）フルオレセイン；または（ｂ）フルオレセイン
誘導体、 （２）Ｚは＞ＮＨｌ＞Ｃ＝Ｏまたは＞ Ｓ Ｏ２（３）
Ｒはへテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびペテロ
原子を合計Ｏ〜１５個存する結合基である。
下記式ａ〜コは、本発明によるアンフェタミンおよびｄ
−メタンフェタミンの好ましいトレーサーの構造を示す
。
−メタンフェタミンの好ましいトレーサーの構造を示す
。
［以下余白］
式Ｃ
式ｄ。
式ｂ・
弐〇”
式ｆ：
弐ｇ・
本発明のトレーサーは、下記に示すように、たとえば、
アミド基、アミジノ基、トリアジニルアミノ基、カルバ
ミド基、チオカルバミド基、カルバモイル基、チオカル
バモイル基、またはスルホニルカルバモイル基によりフ
ルオレセイン誘導体に結合したフェネチルアミン誘導体
である。本発明のトレーサーは、下記合成法の記載およ
び実施例で説明するように、アミノ基、カルボン酸基、
イソシアネート基、クロロスルホニル基などを含有する
フェネチルアミン誘導体に適当なフルオレセイン誘導体
を結合することによって調製する。
アミド基、アミジノ基、トリアジニルアミノ基、カルバ
ミド基、チオカルバミド基、カルバモイル基、チオカル
バモイル基、またはスルホニルカルバモイル基によりフ
ルオレセイン誘導体に結合したフェネチルアミン誘導体
である。本発明のトレーサーは、下記合成法の記載およ
び実施例で説明するように、アミノ基、カルボン酸基、
イソシアネート基、クロロスルホニル基などを含有する
フェネチルアミン誘導体に適当なフルオレセイン誘導体
を結合することによって調製する。
例示的な目的のために、フルオレセイン残基をフェネチ
ルアミン誘導体に結合させるのに用いる種々の結合基の
幾つかを以下に列記する。なお「Ｆｌ」の記号はフルオ
レセイン残基を表す。
ルアミン誘導体に結合させるのに用いる種々の結合基の
幾つかを以下に列記する。なお「Ｆｌ」の記号はフルオ
レセイン残基を表す。
結合基
ＮＨ−、Ｃ０−ＦＩ
Ｃｏ−ＮＨ−ＰＩ
ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＦＩ
ＳＯ２−ＮＨ−Ｆｌ
式１：
または式ｊ：
一例として、本発明の新規なトレーサーを合成するのに
用いるフルオレセイン誘導体の幾つかを以下に列記する
。
用いるフルオレセイン誘導体の幾つかを以下に列記する
。
ＰＩ−ＮＨ２フルオレセインアミン
Ｆｌ−ＣＯ２ＨカルボキシフルオレセインＦｌ−ＮＨＣ
ＯＣＨ２Ｉ α−ヨードアセトアミドフルオレセイン アミノメチルフルオレセイン Ｆｌ ＣＨ２ＮＨ２ ２，４−ジクロロ−１，３，５−１リアジン−２イルア
ミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）４−クロロ−６ メトキンー１．３，５ トリア ジン−２−イルアミノフルオレセイン（メトキシＤＴＡ
Ｆ） Ｉ 本発明の新規なアンフェタミントレーサー前駆体化合物
は、下記式４ 本発明の新規なメタンフェタミントレーサー前駆体化合
物は、下記式６： で示される構造式であるのが好ましい。
ＯＣＨ２Ｉ α−ヨードアセトアミドフルオレセイン アミノメチルフルオレセイン Ｆｌ ＣＨ２ＮＨ２ ２，４−ジクロロ−１，３，５−１リアジン−２イルア
ミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）４−クロロ−６ メトキンー１．３，５ トリア ジン−２−イルアミノフルオレセイン（メトキシＤＴＡ
Ｆ） Ｉ 本発明の新規なアンフェタミントレーサー前駆体化合物
は、下記式４ 本発明の新規なメタンフェタミントレーサー前駆体化合
物は、下記式６： で示される構造式であるのが好ましい。
下記式６において、
（１）Ｑ’は水素原子、水酸基または離脱基（２）Ｚは
＞ Ｎ Ｈｌ＞Ｃ＝Ｏまたは＞５Ｏ２（３）Ｒはへテロ
原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合計
Ｏ〜１５個有する結合基である。
＞ Ｎ Ｈｌ＞Ｃ＝Ｏまたは＞５Ｏ２（３）Ｒはへテロ
原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合計
Ｏ〜１５個有する結合基である。
本発明に従って新規なトレーサーおよび免疫原化合物を
生成するのに用いることかできるハプテンの幾つかの構
造を例示して下記式に−ｐに挙げる。
生成するのに用いることかできるハプテンの幾つかの構
造を例示して下記式に−ｐに挙げる。
および式５
で示される構造式であるのか好ましい。
上記式４および５において、
（１）Ｑ’は水素原子、水酸基または離脱基［本発明の
目的のためには、「離脱基」とはハロゲン原子、アシロ
キン基（カルボン酸エステルを含む）、スクンンイミジ
ルオキシ基またはフタルイミジルオキシ基、アルコキシ
基またはフェノキシ基または置換フェノキシ基、イミダ
ゾリル基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、または当業者
によく知られた他のあらゆる同様の活性化基として定義
される］（２）Ｚは＞ＮＨ，＞Ｃ＝Ｏまたは〉Ｓ０２・
（３）Ｒはへテロ原子を５個まで含み、炭素原子および
ヘテロ原子を合計０〜１５個有する結合基である。
目的のためには、「離脱基」とはハロゲン原子、アシロ
キン基（カルボン酸エステルを含む）、スクンンイミジ
ルオキシ基またはフタルイミジルオキシ基、アルコキシ
基またはフェノキシ基または置換フェノキシ基、イミダ
ゾリル基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、または当業者
によく知られた他のあらゆる同様の活性化基として定義
される］（２）Ｚは＞ＮＨ，＞Ｃ＝Ｏまたは〉Ｓ０２・
（３）Ｒはへテロ原子を５個まで含み、炭素原子および
ヘテロ原子を合計０〜１５個有する結合基である。
弐に
式１：
：
式ｎ・
式Ｏ
戎上
本発明のトレーサーは、式４および式５の一般構造式に
フルオレセイン残基またはフルオレセイン誘導体を結合
させることによって調製する。
フルオレセイン残基またはフルオレセイン誘導体を結合
させることによって調製する。
上記のごとく、フルオレセイン残基は、アミド結合、ア
ミンン結合、尿素結合、チオ尿素結合、ｐ−ニトロフェ
ノール、ペンタフルオロフェノール、イミダゾールなど
の他の活性化試薬も脱水試薬とともに用いることができ
る。ジメチルホルムアミドやジメトキシエタンのような
他の溶媒を用いることもできる。これら反応物は、アミ
ド結合を生成する条件下で結合させるのが好ましい。酸
クロライドへの変換を含む手順を用いるのが最も好まし
い。ついで、メタノール水溶液中で炭酸カリウムで加水
分解することによって化合物を脱保護するのが好ましい
。この脱保護工程には、トリフルオロアセトアミドの加
水分解に適した他の試薬、たとえば第三級アミン塩基、
炭酸ナトリウムまたはアルカリ金属水酸化物などを用い
ることができる。
ミンン結合、尿素結合、チオ尿素結合、ｐ−ニトロフェ
ノール、ペンタフルオロフェノール、イミダゾールなど
の他の活性化試薬も脱水試薬とともに用いることができ
る。ジメチルホルムアミドやジメトキシエタンのような
他の溶媒を用いることもできる。これら反応物は、アミ
ド結合を生成する条件下で結合させるのが好ましい。酸
クロライドへの変換を含む手順を用いるのが最も好まし
い。ついで、メタノール水溶液中で炭酸カリウムで加水
分解することによって化合物を脱保護するのが好ましい
。この脱保護工程には、トリフルオロアセトアミドの加
水分解に適した他の試薬、たとえば第三級アミン塩基、
炭酸ナトリウムまたはアルカリ金属水酸化物などを用い
ることができる。
アンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミントレーサー
の好ましい態様を、それぞれ下記式ｑおよびｒに示す。
の好ましい態様を、それぞれ下記式ｑおよびｒに示す。
カルバメート結合、チオカルバメート結合、トリアジニ
ルアミノ結合、スルポンアミド結合、またはスルホニル
カルバメート結合によりアミノ基、カルボキシル基、ク
ロロスルホニル基、イミデート基またはアルコキシ官能
基に結合させることができる。アンフェタミンに関して
現在のところ好ましい態様においては、フルオレセイン
誘導体は６−アミノフルオレセインであり、これを下記
式で示されるトレーザー前駆体と結合させる。
ルアミノ結合、スルポンアミド結合、またはスルホニル
カルバメート結合によりアミノ基、カルボキシル基、ク
ロロスルホニル基、イミデート基またはアルコキシ官能
基に結合させることができる。アンフェタミンに関して
現在のところ好ましい態様においては、フルオレセイン
誘導体は６−アミノフルオレセインであり、これを下記
式で示されるトレーザー前駆体と結合させる。
上記３−カルボキシアンフェタミントリフルオロアセト
アミドを塩化オキサリルで処理して対応する酸クロライ
ドに変換し、これをアセトニトリル溶液中で６−アミノ
フルオレセインと結合させる。クロロホルメートまたは
酸クロライドまたは無水物（カルボン酸前駆体と混合無
水物を生成する）、または１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール、式ｑ： 式ｒ： ｄ−メタンフェタミンに対しては、フルオレセイン誘導
体は６−カルボキンフルオレセインである。これを下記
式Ｓで示す前駆体と結合させる。
アミドを塩化オキサリルで処理して対応する酸クロライ
ドに変換し、これをアセトニトリル溶液中で６−アミノ
フルオレセインと結合させる。クロロホルメートまたは
酸クロライドまたは無水物（カルボン酸前駆体と混合無
水物を生成する）、または１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール、式ｑ： 式ｒ： ｄ−メタンフェタミンに対しては、フルオレセイン誘導
体は６−カルボキンフルオレセインである。これを下記
式Ｓで示す前駆体と結合させる。
式５
６−カルボキシフルオレセインは、アセトニトリル溶液
中、第三級アミン塩基の存在下でビス（２オキソ−３−
オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライドで処理する
ことにより上記４−アミノｄ−メタンフェタミントリフ
ルオロアセトアミドと結合させるのが好ましい。クロロ
ホルメートまたは酸クロライドまたは無水物（カルボン
酸前駆体と混合無水物を生成する）、または１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール、ペン
クフルオロフェノール、イミダゾールなどの他の活性化
試薬も脱水試薬とともに用いることができる。これら反
応物は、アミド結合を生成する条件下で結合させるのが
好ましい。ビス（２オキソ−３−オキサゾリジニル）ホ
スフィン酸クロライドを含む手順を用いるのが最も好ま
しい。
中、第三級アミン塩基の存在下でビス（２オキソ−３−
オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライドで処理する
ことにより上記４−アミノｄ−メタンフェタミントリフ
ルオロアセトアミドと結合させるのが好ましい。クロロ
ホルメートまたは酸クロライドまたは無水物（カルボン
酸前駆体と混合無水物を生成する）、または１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール、ペン
クフルオロフェノール、イミダゾールなどの他の活性化
試薬も脱水試薬とともに用いることができる。これら反
応物は、アミド結合を生成する条件下で結合させるのが
好ましい。ビス（２オキソ−３−オキサゾリジニル）ホ
スフィン酸クロライドを含む手順を用いるのが最も好ま
しい。
末端クロロスルボニル基を有するすべてのフェネチルア
ミン誘導体は、溶液中で単純に混合し、生成した酸を塩
基を用いて除去することによって４“−アミノメチルフ
ルオレセインまたはフルオレセインアミンと結合させる
ことができる。
ミン誘導体は、溶液中で単純に混合し、生成した酸を塩
基を用いて除去することによって４“−アミノメチルフ
ルオレセインまたはフルオレセインアミンと結合させる
ことができる。
カルボン酸、（アミノヒドロキシ）アルキルカルボン酸
などの末端カルボン酸基を有するすべてのフェネチルア
ミン誘導体は、酸クロライドを生成させるか、混合酸無
水物を生成させるか、または活性エステル法により４°
−アミノメチルフルオレセインまたはアミノフルオレセ
インに結合させることができる。
などの末端カルボン酸基を有するすべてのフェネチルア
ミン誘導体は、酸クロライドを生成させるか、混合酸無
水物を生成させるか、または活性エステル法により４°
−アミノメチルフルオレセインまたはアミノフルオレセ
インに結合させることができる。
（ｃ）トレーサーの組合わせ
本発明において好ましいトレーサー試薬は、第一トレー
サーおよび第ニドレーサーの塩からなる組成物である。
サーおよび第ニドレーサーの塩からなる組成物である。
一般に、第一トレーサーはアンフェタミンのリガンド類
似体の塩であり、第ニドレーザーはｄ−メタンフェタミ
ンのリガンド類似体の塩である。アンフェタミンおよび
メタンフェタミンに対する個々のトレーサーを組合わせ
ることについで、メタノール水溶液中で炭酸カリウムで
加水分解することによって化合物を脱保護するのが好ま
しい。この脱保護工程には、トリフルオロアセトアミド
の加水分解に適した他の試薬、たとえば第三級アミン塩
基、炭酸ナトリウムまたはアルカリ金属水酸化物などを
用いることができる。
似体の塩であり、第ニドレーザーはｄ−メタンフェタミ
ンのリガンド類似体の塩である。アンフェタミンおよび
メタンフェタミンに対する個々のトレーサーを組合わせ
ることについで、メタノール水溶液中で炭酸カリウムで
加水分解することによって化合物を脱保護するのが好ま
しい。この脱保護工程には、トリフルオロアセトアミド
の加水分解に適した他の試薬、たとえば第三級アミン塩
基、炭酸ナトリウムまたはアルカリ金属水酸化物などを
用いることができる。
使用可能なトレーサーは、種々のフェネチルアミン誘導
体から調製することができる。
体から調製することができる。
アミノ基、ヒドラジニル基、ヒドラジド基などの末端ア
ミノ基を有するすべてのフェネチルアミン誘導体を、活
性エステル法または混合酸無水物法によりカルボキシフ
ルオレセイン轟に結合し、また溶液中で単純に２つの物
質を混合することによってＤＴＡＦまたはアルコキシＤ
ＴＡＰに結合することができる。アミノ基は、ホスゲン
およびチオホスゲンと反応させることによって、それぞ
れイソシアネートおよびチオイソシアネートに変換する
ことができる。ついで、これらをフルオレセインアミン
または４゛−アミノメチルフルオレセインと縮合してト
レーサーを生成する。
ミノ基を有するすべてのフェネチルアミン誘導体を、活
性エステル法または混合酸無水物法によりカルボキシフ
ルオレセイン轟に結合し、また溶液中で単純に２つの物
質を混合することによってＤＴＡＦまたはアルコキシＤ
ＴＡＰに結合することができる。アミノ基は、ホスゲン
およびチオホスゲンと反応させることによって、それぞ
れイソシアネートおよびチオイソシアネートに変換する
ことができる。ついで、これらをフルオレセインアミン
または４゛−アミノメチルフルオレセインと縮合してト
レーサーを生成する。
より、高い特異性、低い交差反応性、高い感度および正
確さを保ったまま両方の薬物（アンフェタミン／ｄ−メ
タンフェタミン）を検出できるという利点が得られる。
確さを保ったまま両方の薬物（アンフェタミン／ｄ−メ
タンフェタミン）を検出できるという利点が得られる。
上記手順に従って生成したアンフェタミントレーサーお
よびｄ−メタンフェタミントレーサーの数多くの組合わ
せを用いることができる。第一および第ニドレーサーは
、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などの塩
であるのが好ましい。第一および第ニドレーザーが試薬
溶液中でナトリウム塩として存在し、第一トレーサーが
式ａで示されるアンフェタミンのリガンド類似体であり
、第ニドレーザーが弐ｇで示されるｄ−メタンフェタミ
ンのリガンド類似体であるのが最も好ましい。現在のと
ころ最も好ましいトレーサー調製物は、ｐＨ７、５のＯ
，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％アジ化ナトリ
ウム、および０．０１％ウシγグロブリン中の約９０ｎ
Ｍの混合トレーサーである。
よびｄ−メタンフェタミントレーサーの数多くの組合わ
せを用いることができる。第一および第ニドレーサーは
、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などの塩
であるのが好ましい。第一および第ニドレーザーが試薬
溶液中でナトリウム塩として存在し、第一トレーサーが
式ａで示されるアンフェタミンのリガンド類似体であり
、第ニドレーザーが弐ｇで示されるｄ−メタンフェタミ
ンのリガンド類似体であるのが最も好ましい。現在のと
ころ最も好ましいトレーサー調製物は、ｐＨ７、５のＯ
，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％アジ化ナトリ
ウム、および０．０１％ウシγグロブリン中の約９０ｎ
Ｍの混合トレーサーである。
３、抗体
本発明の抗体は、動物内で以下に述べる免疫原に対する
応答を引き起こすことにより調製する。
応答を引き起こすことにより調製する。
免疫原の投与は、当業者によく知られた仕方で一連の注
射によりウサギやヒツジのような動物に対して行う。
射によりウサギやヒツジのような動物に対して行う。
（ａ）免疫原の構造
使用可能な免疫原は、種々のフェネチルアミン誘導体か
ら製造することができる。パラ位で官能化したフェネヂ
ルアミン化合物から調製した免疫原は、動物で抗体を産
生ずることができる。そのような抗体は、適当なトレー
サーと組み合わせたときに本発明によるフェネヂルアミ
ンアッセイに有用である。
ら製造することができる。パラ位で官能化したフェネヂ
ルアミン化合物から調製した免疫原は、動物で抗体を産
生ずることができる。そのような抗体は、適当なトレー
サーと組み合わせたときに本発明によるフェネヂルアミ
ンアッセイに有用である。
本発明のアッセイに用いるアンフェタミンおよびｄ−メ
タンフェタミンに対する抗体は、タンパク質担体（免疫
原）、好ましくはウシ血清アルブミンまたはブタチログ
ロブリンに結合させたアンフェタミンおよびｄ−メタン
フェタミン誘導体に対する応答により産生される。本発
明による新規なアンフェタミン免疫原化合物は、下記式
７：で示される構造式であるのが好ましい。
タンフェタミンに対する抗体は、タンパク質担体（免疫
原）、好ましくはウシ血清アルブミンまたはブタチログ
ロブリンに結合させたアンフェタミンおよびｄ−メタン
フェタミン誘導体に対する応答により産生される。本発
明による新規なアンフェタミン免疫原化合物は、下記式
７：で示される構造式であるのが好ましい。
上記式９において、
（１）Ｑ’“は（ａ）ポリアミノ酸
（ｂ）ポリアミノ酸誘導体；または
（ｃ）他の免疫原担体
（２）Ｚは＞ＮＨ，＞Ｃ−○または＞５Ｏ２（３）Ｒは
へテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子
を合計０〜１５個有する結合基である。
へテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子
を合計０〜１５個有する結合基である。
下記式ｔおよびＵは、それぞれ本発明による好ましいメ
タンフェタミンおよびアンフェタミン免疫原化合物を示
す構造式である。
タンフェタミンおよびアンフェタミン免疫原化合物を示
す構造式である。
奥：
および下記式８：
で示される構造式であるのが好ましい。
上記式７および８において、
（１）Ｑ”は（ａ）ポリアミノ酸；
（ｂ）ポリアミノ酸誘導体；または
（Ｃ）他の免疫原担体；
（２）Ｚは＞ＮＨ，＞Ｃ＝Ｏまたは〉ＳＯ２；（３）Ｒ
はへテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原
子を合計Ｏ〜１５個有する結合基である。
はへテロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原
子を合計Ｏ〜１５個有する結合基である。
本発明による新規なメタンフェタミン免疫原化合物は、
下記式〇： 式Ｕ： 本発明の免疫原は、以下の合成法および実施例で述べる
ように、式４（アンフェタミン用）、式５（アンフェタ
ミン用）または弐６（メタンフェタミン用）で示される
フェネチルアミンハプテン前駆体化合物をタンパク質ま
たはタンパク質誘導体に結合することによって調製する
。
下記式〇： 式Ｕ： 本発明の免疫原は、以下の合成法および実施例で述べる
ように、式４（アンフェタミン用）、式５（アンフェタ
ミン用）または弐６（メタンフェタミン用）で示される
フェネチルアミンハプテン前駆体化合物をタンパク質ま
たはタンパク質誘導体に結合することによって調製する
。
本発明の好ましい態様においては、上記置換フェネチル
アミン化合物をウシチログロブリンに結合することによ
って免疫原を調製する。他の種々のタンパク質担体、た
とえば、キーポールリンペットヘモシアニン、卵白アル
ブミン、ウシブーグロブリン、血清アルブミンなども有
利に使用することができる。他の担体として、充分な数
の利用可能なアミノ基を有する合成ポリアミノ酸、およ
びアンフェタミンまたはｄ−メタンフェタミンハプテン
と反応性の官能基を有する合成または天然のポリマー性
物質を用いることができる。本発明による好ましい免疫
原前駆体化合物は、下記式■およびＷで示ず構造を有す
るものである。
アミン化合物をウシチログロブリンに結合することによ
って免疫原を調製する。他の種々のタンパク質担体、た
とえば、キーポールリンペットヘモシアニン、卵白アル
ブミン、ウシブーグロブリン、血清アルブミンなども有
利に使用することができる。他の担体として、充分な数
の利用可能なアミノ基を有する合成ポリアミノ酸、およ
びアンフェタミンまたはｄ−メタンフェタミンハプテン
と反応性の官能基を有する合成または天然のポリマー性
物質を用いることができる。本発明による好ましい免疫
原前駆体化合物は、下記式■およびＷで示ず構造を有す
るものである。
式ヱ
籾ｙ
（ｂ）免疫原の合成
本発明の免疫原は、アンフェタミンまたはｄ−メタンフ
ェタミン誘導体をポリアミノ酸に結合することによって
製造することができる。
ェタミン誘導体をポリアミノ酸に結合することによって
製造することができる。
好ましい態様においては、ポリアミノ酸はウシヂログロ
プリンであり、ハプテンは上記で例示した構造式から選
択することができる。これらの反応物は、アミド結合、
アゾ結合、スルホンアミドンアミド結合および尿素結合
またはカルバメート結合が生成する。これは該ハプテン
の該ポリアミノ酸への直接結合によって行う。
プリンであり、ハプテンは上記で例示した構造式から選
択することができる。これらの反応物は、アミド結合、
アゾ結合、スルホンアミドンアミド結合および尿素結合
またはカルバメート結合が生成する。これは該ハプテン
の該ポリアミノ酸への直接結合によって行う。
側鎖アミン保護ハプテンをタンパク質に結合させた後、
保護基を除去して遊離のアミンまたは塩の形のアミンを
生成する。用いた保護基がトリフルオロアセチル基であ
るときは、塩基水溶液で処理するか、水素化ホウ素ナト
リウム水溶液にさらすか、または当業者に知られた他の
条件によって該保護基を除去することができる。保護基
がＢＯＣ（ｔ−ブチルカルバメート）基であるときは、
酸水溶液か、酸の非水溶液か、または当業者に知られた
他の方法によって該保護基を除去することができる。
保護基を除去して遊離のアミンまたは塩の形のアミンを
生成する。用いた保護基がトリフルオロアセチル基であ
るときは、塩基水溶液で処理するか、水素化ホウ素ナト
リウム水溶液にさらすか、または当業者に知られた他の
条件によって該保護基を除去することができる。保護基
がＢＯＣ（ｔ−ブチルカルバメート）基であるときは、
酸水溶液か、酸の非水溶液か、または当業者に知られた
他の方法によって該保護基を除去することができる。
上記ハプテンの合成は、非常によく似た方法で行うこと
ができる。典型的な出発物質は、ノルエフェドリンやエ
フェドリンのようなフェネチルアミン、またはベンズア
ルデヒドやフェニルプロパツールのようなフェネチルア
ミンに変換され得る化合物である。側鎖アミン官能性が
もともと存在結合、尿素結合およびアルキルアミン結合
を生成するのに通常用いる条件下で結合させるのが好ま
しく、これら条件は当業者にはよく知られている。
ができる。典型的な出発物質は、ノルエフェドリンやエ
フェドリンのようなフェネチルアミン、またはベンズア
ルデヒドやフェニルプロパツールのようなフェネチルア
ミンに変換され得る化合物である。側鎖アミン官能性が
もともと存在結合、尿素結合およびアルキルアミン結合
を生成するのに通常用いる条件下で結合させるのが好ま
しく、これら条件は当業者にはよく知られている。
活性エステル法を用いた結合反応においてカルボキシル
基をパートナ−として用いるのが、この目的のために所
望のアミド結合を生成させる上で最も有効であるので最
も好ましい。
基をパートナ−として用いるのが、この目的のために所
望のアミド結合を生成させる上で最も有効であるので最
も好ましい。
ハプテンをポリアミノ酸に結合させる前に、側鎖にある
アミンを保護する。保護基、たとえば、トリフルオロア
セチル基またはＢＯＣ（ｔ−ブチルカルバメート）基を
当業者に知られた条件下で加える。
アミンを保護する。保護基、たとえば、トリフルオロア
セチル基またはＢＯＣ（ｔ−ブチルカルバメート）基を
当業者に知られた条件下で加える。
フェネチルアミノ基が保護され、アンフェタミン誘導体
の２位または３位、またはｄ〜メタンフェタミンの２位
、３位または４位に−ＮＨ２、−ＣＯｔ Ｈ、ＣＯＮ
ＨＮ Ｈｔ、−０ＮＯＲ，−ＣＨｏ。
の２位または３位、またはｄ〜メタンフェタミンの２位
、３位または４位に−ＮＨ２、−ＣＯｔ Ｈ、ＣＯＮ
ＨＮ Ｈｔ、−０ＮＯＲ，−ＣＨｏ。
−ＮＣＯまたは一８Ｏ，０１基を有するハプテンをポリ
アミノ酸に結合することによって免疫原を調製する。ス
ルホニルクロライド基およびイソシアネート（−ＮＧＯ
）基の場合には、それぞれスルホするかまたは後で導入
されているときは、保護基により非反応性にしておかな
ければならない。ニトロ基をアミノ基に接触還元した後
、ついで冷亜硝酸との反応により該アミノ基をジアゾ化
する。
アミノ酸に結合することによって免疫原を調製する。ス
ルホニルクロライド基およびイソシアネート（−ＮＧＯ
）基の場合には、それぞれスルホするかまたは後で導入
されているときは、保護基により非反応性にしておかな
ければならない。ニトロ基をアミノ基に接触還元した後
、ついで冷亜硝酸との反応により該アミノ基をジアゾ化
する。
カルボキシル含有ハプテンは、上記方法により活性化す
る。Ｚ−Ｑが５Ｏ３ＣＩである場合には、タンパク質の
結合は、タンパク質の水溶液または水−有機溶液をクロ
ロスルホニルフェネチルアミン誘導体にさらすことによ
って行う。結合後、保護基を当業者に知られた方法で除
去し、得られた免疫原をサイズ排除クロマトグラフィー
かまたは透析により精製する。
る。Ｚ−Ｑが５Ｏ３ＣＩである場合には、タンパク質の
結合は、タンパク質の水溶液または水−有機溶液をクロ
ロスルホニルフェネチルアミン誘導体にさらすことによ
って行う。結合後、保護基を当業者に知られた方法で除
去し、得られた免疫原をサイズ排除クロマトグラフィー
かまたは透析により精製する。
（ｃ）抗体の組合わせ
本発明において好ましい抗体試薬は、上記免疫原に対す
る応答により産生された、アンフェタミンを認識し結合
することのできる第一抗体、およびｄ−メタンフェタミ
ンを認識し結合することのできる第二抗体からなる組成
物である。抗体がアンフェタミンまたはｄ−メタンフェ
タミンに特異的であることを条件として、上記手順に従
ってアンフェタミンまたはｄ−メタンフェタミンに対す
る応答により産生じた抗体の数多くの組合わせを用いる
ことができる。最も好ましいのは、式ｔて示される免疫
原に対する応答により産生された所定量の抗体、および
式Ｕで示される免疫原に対する応答により産生された所
定量の抗体を含む抗体試薬である。
る応答により産生された、アンフェタミンを認識し結合
することのできる第一抗体、およびｄ−メタンフェタミ
ンを認識し結合することのできる第二抗体からなる組成
物である。抗体がアンフェタミンまたはｄ−メタンフェ
タミンに特異的であることを条件として、上記手順に従
ってアンフェタミンまたはｄ−メタンフェタミンに対す
る応答により産生じた抗体の数多くの組合わせを用いる
ことができる。最も好ましいのは、式ｔて示される免疫
原に対する応答により産生された所定量の抗体、および
式Ｕで示される免疫原に対する応答により産生された所
定量の抗体を含む抗体試薬である。
ウサギ、ヒツジまたは他の動物の血清を本発明の抗体試
薬の抗体源として用いることができる。
薬の抗体源として用いることができる。
好ましい抗血清調製物は、ｐＨ７、５の０，１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液で希釈したヒツジ血清、０．１％アジ
化ナトリウム、０．０１％ウンγ−グロブリン、２％プ
ロピレングリコール（Ｖ／Ｖ）および１５Ｒｙ／ｉＱリ
ホフラヒン結合タンパク質からなるものである。
ナトリウム緩衝液で希釈したヒツジ血清、０．１％アジ
化ナトリウム、０．０１％ウンγ−グロブリン、２％プ
ロピレングリコール（Ｖ／Ｖ）および１５Ｒｙ／ｉＱリ
ホフラヒン結合タンパク質からなるものである。
４、洗浄試薬
驚くへきことに、フェネチルアミン蛍光アッセイ試薬キ
ットに５％プロピレングリコールおよび０．４５％Ｎａ
Ｃｌ洗浄水溶液を用いることにより、アッセイの信頼性
と正確さが改善されることがわて優れた結果を生み出す
ことがわかっ１こ。すでに述べたように、驚くべきこと
にこれら新規なトレーサーと抗体との組合わせは、アン
フェタミンおよびｄ−メタンフェタミンのイムノアッセ
イにおいて内生チラミンによる潜在的な妨害を除き得る
ことがわかった。本発明のイムノアッセイに用いる抗血
清と新規トレーサーとの組合わせは、チラミンに対する
イムノアッセイの交差反応性を約０４％に、ｌ−メタン
フェタミンに対する交差反応性を５％未満に抑えるとい
う点で、このアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミ
ンのイムノアッセイの選択性を従来法に比べて著しく改
善するものである。
ットに５％プロピレングリコールおよび０．４５％Ｎａ
Ｃｌ洗浄水溶液を用いることにより、アッセイの信頼性
と正確さが改善されることがわて優れた結果を生み出す
ことがわかっ１こ。すでに述べたように、驚くべきこと
にこれら新規なトレーサーと抗体との組合わせは、アン
フェタミンおよびｄ−メタンフェタミンのイムノアッセ
イにおいて内生チラミンによる潜在的な妨害を除き得る
ことがわかった。本発明のイムノアッセイに用いる抗血
清と新規トレーサーとの組合わせは、チラミンに対する
イムノアッセイの交差反応性を約０４％に、ｌ−メタン
フェタミンに対する交差反応性を５％未満に抑えるとい
う点で、このアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミ
ンのイムノアッセイの選択性を従来法に比べて著しく改
善するものである。
リボフラビン（ヒタミンＢ２）による蛍光妨害は、アン
フェタミンおよび／またはメタンフェタミンについての
あらゆるアッセイの定量結果を不正確にする。従って、
本発明のアッセイの他の顕著な利点は、リボフラビンに
よる潜在的な蛍光妨害を除去するところにある。このこ
とは、下記第１表に示したデータを調へることにより明
らかである。
フェタミンおよび／またはメタンフェタミンについての
あらゆるアッセイの定量結果を不正確にする。従って、
本発明のアッセイの他の顕著な利点は、リボフラビンに
よる潜在的な蛍光妨害を除去するところにある。このこ
とは、下記第１表に示したデータを調へることにより明
らかである。
かった。すなわち、約５％プロピレングリコールと０．
４５％ＮａＣ］との洗浄溶液により探針、ピペットまた
はスポイトのような分配手段への尿の付着が減少するこ
とがわかった。この分配手段への尿の付着は試料の汚染
となり、フェネチルアミン含有試料の後に試験した試料
について偽陽性の結果が得られることを認識する必要が
ある。アボット・ラボラトリーズのＴＤＫクリニカル・
アナライザー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ）
や同じくアボット・ラボラトリーズのＡＤｘアビューズ
ド・ドラッグ・システム（Ａｂｕｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ）のような高度に自動化されたアッセイ装置
は多数の試料を連続的に試験することができるが、この
ような装置の場合には試料間での尿の「持ち越し」を除
くことが非常に望ましい。試薬キットには、約５％プロ
ピレングリコールおよび０．４５％ＮａＣ１を含む洗浄
溶液を供することが好ましい。
４５％ＮａＣ］との洗浄溶液により探針、ピペットまた
はスポイトのような分配手段への尿の付着が減少するこ
とがわかった。この分配手段への尿の付着は試料の汚染
となり、フェネチルアミン含有試料の後に試験した試料
について偽陽性の結果が得られることを認識する必要が
ある。アボット・ラボラトリーズのＴＤＫクリニカル・
アナライザー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ）
や同じくアボット・ラボラトリーズのＡＤｘアビューズ
ド・ドラッグ・システム（Ａｂｕｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｓ
ｙｓｔｅｍ）のような高度に自動化されたアッセイ装置
は多数の試料を連続的に試験することができるが、この
ような装置の場合には試料間での尿の「持ち越し」を除
くことが非常に望ましい。試薬キットには、約５％プロ
ピレングリコールおよび０．４５％ＮａＣ１を含む洗浄
溶液を供することが好ましい。
アッセイ
本発明の特別の新規トレーサーおよび抗体は、所望のフ
ェネチルアミン蛍光偏光アッセイにおい第１表において
、２番目と３番目の欄にはトレーサーを薬物不含尿試料
に加える前に得られたデータ（蛍光強度）を示している
が、４番目と５番目の欄にはそのような試料にトレーサ
ーを加えた後に得られたデータを示しである。
ェネチルアミン蛍光偏光アッセイにおい第１表において
、２番目と３番目の欄にはトレーサーを薬物不含尿試料
に加える前に得られたデータ（蛍光強度）を示している
が、４番目と５番目の欄にはそのような試料にトレーサ
ーを加えた後に得られたデータを示しである。
さらに、本発明のアッセイ法は分析前に試料を処理する
必要がないので、従来法に比べて迅速かつ正確なアンフ
ェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンアッセイ
法を提供するものである。
必要がないので、従来法に比べて迅速かつ正確なアンフ
ェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンアッセイ
法を提供するものである。
本発明に従って定量的および／または定性的に決定する
ことのできるフェネチルアミン類の一般構造式は、下記
式１０ および式１１ ％式％ 上記式１０および式１１において、 （１）Ｒ，およびＲ２は水素原子、塩素原子、メチル基
またはメトキン基、または−緒になってメチレンンオギ
シ橋を形成し、 （２）Ｒ３はメチル基またはエチル基である。
ことのできるフェネチルアミン類の一般構造式は、下記
式１０ および式１１ ％式％ 上記式１０および式１１において、 （１）Ｒ，およびＲ２は水素原子、塩素原子、メチル基
またはメトキン基、または−緒になってメチレンンオギ
シ橋を形成し、 （２）Ｒ３はメチル基またはエチル基である。
のアンフェタミン／メタンフェタミン子・ソセイ法にて
アッセイすることにより行った。交差反応性％は下記式
により決定した。
アッセイすることにより行った。交差反応性％は下記式
により決定した。
代表的なデータを下記第２表に示す。
［以下余白］
本発明のアッセイ法は、アンフェタミンおよびｄ−メタ
ンフェタミン、並びに３４−メチレンジオキシアンフェ
タミン、３．４−メチレンジオキシエチルアンフェタミ
ンおよび３４−メヂレンジオキシメタンフェタミンのよ
うなある種のＵＳＤＥＡ目録１の［設計薬物（ｄｅｓｉ
ｇｎｅｒ ｄｒｕｇ）Ｊ（Ｕ ５ＤＥＡによって以前に
規制されていた特定の薬物の部類に含まれないように化
学的に特別に設計した薬物）を検出するので、アンフェ
タミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンのアッセイ
に特に適している。加えて、本発明のアッセイ法は、（
１）アンフェタミン様の興奮性合法処方薬（偽陽性を引
き起こすと思イっれるＵＳＤＥＡで規制されていない薬
物）；および（２）非興奮性薬物を検出しない。
ンフェタミン、並びに３４−メチレンジオキシアンフェ
タミン、３．４−メチレンジオキシエチルアンフェタミ
ンおよび３４−メヂレンジオキシメタンフェタミンのよ
うなある種のＵＳＤＥＡ目録１の［設計薬物（ｄｅｓｉ
ｇｎｅｒ ｄｒｕｇ）Ｊ（Ｕ ５ＤＥＡによって以前に
規制されていた特定の薬物の部類に含まれないように化
学的に特別に設計した薬物）を検出するので、アンフェ
タミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンのアッセイ
に特に適している。加えて、本発明のアッセイ法は、（
１）アンフェタミン様の興奮性合法処方薬（偽陽性を引
き起こすと思イっれるＵＳＤＥＡで規制されていない薬
物）；および（２）非興奮性薬物を検出しない。
アンフェタミンおよびメタンフェタミンおよびそれらの
代謝産物について交差反応性を試験した。
代謝産物について交差反応性を試験した。
化合物のアッセイは、既知量の試験化合物を薬物不含正
常ヒト尿に加え、アボット・ラボラトリーズのＴＤｘク
リニカル・アナライザー上で本発明第３表に示したデー
タから明らかなように、本発明のアッセイシステムはあ
る種のアンフェタミン様化合物に対して最小の交差反応
性を示す。交差反応性試験は、アンフェタミンおよびｄ
−メタンフェタミンに対して類似の化学構造を有する化
合物について行った。天然の尿に存在する幾つかのアミ
ン類についても試験した。その代表的なデータを下記第
３表に示す。
常ヒト尿に加え、アボット・ラボラトリーズのＴＤｘク
リニカル・アナライザー上で本発明第３表に示したデー
タから明らかなように、本発明のアッセイシステムはあ
る種のアンフェタミン様化合物に対して最小の交差反応
性を示す。交差反応性試験は、アンフェタミンおよびｄ
−メタンフェタミンに対して類似の化学構造を有する化
合物について行った。天然の尿に存在する幾つかのアミ
ン類についても試験した。その代表的なデータを下記第
３表に示す。
［以下余白］
第４表に示した化合物を表記の濃度までの濃度で試験し
たところ、このアッセイの感度（ＯｌＯμｇ／ＩＩＩσ
）未満の結果が得られた。
たところ、このアッセイの感度（ＯｌＯμｇ／ＩＩＩσ
）未満の結果が得られた。
［以下余白］
第４表
第４表（続き）
第４表（続き）
第４表（続き）
１＋１４
＋０７
第４表（続き）
＝１０８
ＩＩＩ
塩水溶液で前処理することが含まれる。好ましくは、０
１〜０２５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液で約１〜９
分間、最も好ましくは４〜５分間、約３１０Ｃ〜約３６
℃の温度範囲にて試料を処理する。
１〜０２５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液で約１〜９
分間、最も好ましくは４〜５分間、約３１０Ｃ〜約３６
℃の温度範囲にて試料を処理する。
こうして前処理した試料を、ついでアンフェタミンおよ
びｄ−メタンフェタミンに特異的なトレーサーおよび抗
体試薬と混合する。アンフェタミンまたはｄ−メタンフ
ェタミンとトレーサーとは限られた抗体部位に対して競
合し、その結果、抗体−リガント複合体が生成する。ト
レーサーおよび抗体を一定濃度に保つことにより、イン
キュベーションで生成したトレーサー−抗体複合体に対
する抗体−リガント複合体の比は試料中のアンフェタミ
ンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの量に正比例す
る。それゆえ、この混合物を平面偏光で励起させ、トレ
ーサーおよびトレーサー−抗体複合体により放射される
蛍光の偏光度を測定すれば、試料中のアンフェタミンお
よび／またはｄメタンフェタミンの量を定量的または定
性的に決第４表（続き） 「持ち越し」の決定は、正常ヒト尿中のｄ−アンフェタ
ミン溶液（３５０μｇ／ｌ１ＩＱ）をアッセイし、つい
て薬物不含の正常ヒト尿の試料をアッセイすることによ
り行った。持ち越しく％）−１００ｘ（薬物不含尿中に
認められたアンフェタミンの濃度／ｄ−アンフェタミン
溶液の濃度）。本発明では持ち越し％は０．０２％に等
しいかまたはそれ未満であることが決定された。
びｄ−メタンフェタミンに特異的なトレーサーおよび抗
体試薬と混合する。アンフェタミンまたはｄ−メタンフ
ェタミンとトレーサーとは限られた抗体部位に対して競
合し、その結果、抗体−リガント複合体が生成する。ト
レーサーおよび抗体を一定濃度に保つことにより、イン
キュベーションで生成したトレーサー−抗体複合体に対
する抗体−リガント複合体の比は試料中のアンフェタミ
ンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの量に正比例す
る。それゆえ、この混合物を平面偏光で励起させ、トレ
ーサーおよびトレーサー−抗体複合体により放射される
蛍光の偏光度を測定すれば、試料中のアンフェタミンお
よび／またはｄメタンフェタミンの量を定量的または定
性的に決第４表（続き） 「持ち越し」の決定は、正常ヒト尿中のｄ−アンフェタ
ミン溶液（３５０μｇ／ｌ１ＩＱ）をアッセイし、つい
て薬物不含の正常ヒト尿の試料をアッセイすることによ
り行った。持ち越しく％）−１００ｘ（薬物不含尿中に
認められたアンフェタミンの濃度／ｄ−アンフェタミン
溶液の濃度）。本発明では持ち越し％は０．０２％に等
しいかまたはそれ未満であることが決定された。
本発明の好ましい態様の分析方法に従ったアンフェタミ
ン／メタンフェタミンアッセイには、アンフェタミンお
よび／またはｄ−メタンフェタミンを含んでいるかまた
は含んでいると思われる尿試料を、望ましくない交差反
応を除去するのに充分な時間、有効量のｐ）（約４〜７
５の過ヨウ素酸＋１２ 定することができる。
ン／メタンフェタミンアッセイには、アンフェタミンお
よび／またはｄ−メタンフェタミンを含んでいるかまた
は含んでいると思われる尿試料を、望ましくない交差反
応を除去するのに充分な時間、有効量のｐ）（約４〜７
５の過ヨウ素酸＋１２ 定することができる。
その結果は、正味のミリ偏光単位（ｎｅｔ ｍ１ｌｌｉ
ｐ。
ｐ。
１ａｒｉｚａｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ）、スパン（ｓｐａ
ｎ） （ミリ偏光単位にて）および相対強度により定量
化することができる。；り偏光単位を測定すると、アン
フェタミンまたはｄ−メタンフェタミン不在下で最大量
のトレーサーが抗体に結合したときの最大の偏光が示さ
れる。抗体に結合したトレーサーの量は、正味のミリ偏
光に正比例する。本発明の目的のためには、正味のミリ
偏光の値が１９０を越えるのが理想的であるが、約１５
０〜約２２０の範囲であれば許容できる。スパンは、抗
体に結合したトレーサーの量が最大のときと最小のとき
の正味のミリ偏光の差を示す。スパンが大きいほどデー
タの定量分析が良好になる。本発明の目的のためには、
少なくとも約６０ミリ偏光単位のスパンが好ましい。強
度は、バックグラウンド蛍光を越える蛍光シグナルの大
きさの測定手段である。従って、強度が高くなるほど正
確な測定結果が得られる。強度は、本発明の好ましいト
レーサーについて、垂直偏光強度と水平偏光強度を２倍
したものとを加えた合計として決定される。強度は、ト
レーサーおよび他のアッセイ変量の濃度に依存して、バ
ックグラウンドノイズの約３倍から約３０倍の範囲のシ
フナルであり得る。本発明の目的のためには、強度はバ
ックグラウンドノイズの少なくとも８倍から１０倍であ
るのが好ましい。
ｎ） （ミリ偏光単位にて）および相対強度により定量
化することができる。；り偏光単位を測定すると、アン
フェタミンまたはｄ−メタンフェタミン不在下で最大量
のトレーサーが抗体に結合したときの最大の偏光が示さ
れる。抗体に結合したトレーサーの量は、正味のミリ偏
光に正比例する。本発明の目的のためには、正味のミリ
偏光の値が１９０を越えるのが理想的であるが、約１５
０〜約２２０の範囲であれば許容できる。スパンは、抗
体に結合したトレーサーの量が最大のときと最小のとき
の正味のミリ偏光の差を示す。スパンが大きいほどデー
タの定量分析が良好になる。本発明の目的のためには、
少なくとも約６０ミリ偏光単位のスパンが好ましい。強
度は、バックグラウンド蛍光を越える蛍光シグナルの大
きさの測定手段である。従って、強度が高くなるほど正
確な測定結果が得られる。強度は、本発明の好ましいト
レーサーについて、垂直偏光強度と水平偏光強度を２倍
したものとを加えた合計として決定される。強度は、ト
レーサーおよび他のアッセイ変量の濃度に依存して、バ
ックグラウンドノイズの約３倍から約３０倍の範囲のシ
フナルであり得る。本発明の目的のためには、強度はバ
ックグラウンドノイズの少なくとも８倍から１０倍であ
るのが好ましい。
第５表は、本発明の免疫原に応答して産生された好まし
い抗体およびトレーサー化合物を用いて得られた結果を
、スパンおよびミリ偏光単位で示したものである。第５
表に示したデータから明らかなように、式ｔで示される
免疫原から産生された抗体を式ａで示されるトレーサー
と組み合わせて用いたアッセイからは、アンフェタミン
アッセイについて優れた結果が得られる。ｄ−メタンフ
ェタミンのアッセイについては、式Ｕで示される免疫原
から産生された抗体を弐ｇで示されるトレーサーと組み
合わせて用いると優れた結果が得られる。
い抗体およびトレーサー化合物を用いて得られた結果を
、スパンおよびミリ偏光単位で示したものである。第５
表に示したデータから明らかなように、式ｔで示される
免疫原から産生された抗体を式ａで示されるトレーサー
と組み合わせて用いたアッセイからは、アンフェタミン
アッセイについて優れた結果が得られる。ｄ−メタンフ
ェタミンのアッセイについては、式Ｕで示される免疫原
から産生された抗体を弐ｇで示されるトレーサーと組み
合わせて用いると優れた結果が得られる。
本発明のアッセイで優れている側面の一つは、ることか
できる。代表的な緩衝液としては、ホウ酸塩、リン酸塩
、炭酸塩、トリス、バルビツールなどが挙げられる。特
にどの緩衝液を用いたかは本発明にとって重要ではない
が、リン酸緩衝液が好ましい。一般に、緩衝液のカチオ
ン部分は溶液中のトレーサーのカチオン部分を決定する
。
できる。代表的な緩衝液としては、ホウ酸塩、リン酸塩
、炭酸塩、トリス、バルビツールなどが挙げられる。特
にどの緩衝液を用いたかは本発明にとって重要ではない
が、リン酸緩衝液が好ましい。一般に、緩衝液のカチオ
ン部分は溶液中のトレーサーのカチオン部分を決定する
。
本発明の改良アッセイの好ましい方法は、実施例５で詳
細に説明する。このアッセイは「均一アッセイ」であり
、均一アッセイとは、結合トレーサーを未結合トレーサ
ーから分離していない溶液から最終偏光読み取りを行う
ものをいう。これは、未結合トレーサーから結合トレー
サーを分離しなければならない不均一イムノアッセイ法
に比べて顕著な利点を有する。
細に説明する。このアッセイは「均一アッセイ」であり
、均一アッセイとは、結合トレーサーを未結合トレーサ
ーから分離していない溶液から最終偏光読み取りを行う
ものをいう。これは、未結合トレーサーから結合トレー
サーを分離しなければならない不均一イムノアッセイ法
に比べて顕著な利点を有する。
すでに述べたように、本発明の蛍光偏光アッセイのため
の試薬は、リボフラビン結合タンパク質、アンフェタミ
ンおよびｄ−メタンフェタミンのフルオレセイントレー
サー類似体を含有する溶液中のアンフェタミンおよびｄ
−メタンフェタミン特異的抗体および過ヨウ素酸塩前処
理溶液からなる。
の試薬は、リボフラビン結合タンパク質、アンフェタミ
ンおよびｄ−メタンフェタミンのフルオレセイントレー
サー類似体を含有する溶液中のアンフェタミンおよびｄ
−メタンフェタミン特異的抗体および過ヨウ素酸塩前処
理溶液からなる。
式ｔおよび式Ｕで示される免疫原から産生された抗血清
と式ａおよび弐ｇで示されるトレーサーとを組み合わせ
て用いることによって、アンフェタミンまたはメタンフ
ェタミンのいずれについても正味のミリ偏光が２１３ｍ
Ｆでありスパンが７３ｍＰ以上のアッセイが得られる点
である。これは、アッセイの最も好ましい態様である。
と式ａおよび弐ｇで示されるトレーサーとを組み合わせ
て用いることによって、アンフェタミンまたはメタンフ
ェタミンのいずれについても正味のミリ偏光が２１３ｍ
Ｆでありスパンが７３ｍＰ以上のアッセイが得られる点
である。これは、アッセイの最も好ましい態様である。
−サーのフルオレセイン残基が開環形で存在するのに充
分なものでなければならない。ｐ）ｌ範囲は約３〜１２
、より普通には約５〜１０、最も好ましくは約６〜８で
ある。アッセイ手順の間に上記１）Ｈを達成し維持する
ために種々の緩衝液を用い加えて、希釈緩衝液、ｄ−ア
ンフェタミンカリプレーターおよびｄ−アンフェタミン
コントロールを含む通常のアンフェタミン／ｄ−メタン
フェタミンアッセイ溶液を調製するのが好ましい。
分なものでなければならない。ｐ）ｌ範囲は約３〜１２
、より普通には約５〜１０、最も好ましくは約６〜８で
ある。アッセイ手順の間に上記１）Ｈを達成し維持する
ために種々の緩衝液を用い加えて、希釈緩衝液、ｄ−ア
ンフェタミンカリプレーターおよびｄ−アンフェタミン
コントロールを含む通常のアンフェタミン／ｄ−メタン
フェタミンアッセイ溶液を調製するのが好ましい。
本発明の好ましい手順は、アボット・ラボラトリーズの
ＴＤｘクリニカル・アナライザーおよびＡＤｘアビュー
ズド・ドラッグ・システム（両者ともにアボット・ラボ
ラトリーズ、アービング、テキサスから入手可）ととも
に用いるべく特別に設計される。アボット・ラボラトリ
ーズのＴＤＫクリニカル・アナライザーまたは同じくア
ボット・ラボラトリーズのＡＤｘアビューズド・ドラッ
グ・システムを用いた場合、前処理から最終の読み取り
に至るまでアッセイが完全に自動化されることが認識さ
れるべきである。しかしながら、手動アッセイを行うこ
ともできる。自動化および手動アッセイの場合には、試
料を希釈緩衝液中の前処理溶液と混合し、バックグラウ
ンド読み取りを行う。ついで、トレーサーをアッセイに
混合する。
ＴＤｘクリニカル・アナライザーおよびＡＤｘアビュー
ズド・ドラッグ・システム（両者ともにアボット・ラボ
ラトリーズ、アービング、テキサスから入手可）ととも
に用いるべく特別に設計される。アボット・ラボラトリ
ーズのＴＤＫクリニカル・アナライザーまたは同じくア
ボット・ラボラトリーズのＡＤｘアビューズド・ドラッ
グ・システムを用いた場合、前処理から最終の読み取り
に至るまでアッセイが完全に自動化されることが認識さ
れるべきである。しかしながら、手動アッセイを行うこ
ともできる。自動化および手動アッセイの場合には、試
料を希釈緩衝液中の前処理溶液と混合し、バックグラウ
ンド読み取りを行う。ついで、トレーサーをアッセイに
混合する。
ついで、最後に抗体を試験溶液中に混合する。インキュ
ベーノヨン後、蛍光偏光読み取りを行い加工処理する。
ベーノヨン後、蛍光偏光読み取りを行い加工処理する。
自動化および手動アッセイの両方において、本発明の方
法は試料のｐＨ調簡の必要がない。
法は試料のｐＨ調簡の必要がない。
つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
実施例１
拷（好ましいアンフェタミントレーザー）氷酢酸（１０
ｘＱ）中の３−カルボキシベンズアルデヒト（１，９０
２９，１２，６８ミリモル）の溶液に、＝）ロ、：ｃタ
ン（２，８４８ｉＬ ２．９７０１ｊ、３８．０４ミ
リモル）および酢酸アンモニウム（１，０８０ｇ、Ｉ３
．９５ミリモル）を加えた。ついで、この溶液を１１０
℃の油浴中、窒素雰囲気下で撹拌しながら加熱した。つ
いで、すべての固形分が６０℃近くで溶液中に溶解し、
混合物は濃い黄色となった。３時間後、薄層クロマトグ
ラフィー（３間に分配した。（泡立ちのため注意が必要
）有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、回転蒸発器で溶
媒を除いて粗製のエステル（２，４０１りを得た。この
粗製の生成物を４０Ｘ２．５ｃｘフラツシユシリカカラ
ム上で４：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、
標記化合物（１，０３６９，３７％）を薄黄色の結晶固
体として得た。
ｘＱ）中の３−カルボキシベンズアルデヒト（１，９０
２９，１２，６８ミリモル）の溶液に、＝）ロ、：ｃタ
ン（２，８４８ｉＬ ２．９７０１ｊ、３８．０４ミ
リモル）および酢酸アンモニウム（１，０８０ｇ、Ｉ３
．９５ミリモル）を加えた。ついで、この溶液を１１０
℃の油浴中、窒素雰囲気下で撹拌しながら加熱した。つ
いで、すべての固形分が６０℃近くで溶液中に溶解し、
混合物は濃い黄色となった。３時間後、薄層クロマトグ
ラフィー（３間に分配した。（泡立ちのため注意が必要
）有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、回転蒸発器で溶
媒を除いて粗製のエステル（２，４０１りを得た。この
粗製の生成物を４０Ｘ２．５ｃｘフラツシユシリカカラ
ム上で４：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して精製し、
標記化合物（１，０３６９，３７％）を薄黄色の結晶固
体として得た。
３−（２−アミノプロピル）ベンジルアルコールオーブ
ン乾燥した窒素雰囲気下のフラスコ中にＴＨＦ中の１．
０Ｍボラン（１２，１５１Ｒ１１２，１５ミリモル）を
置いた。これを水浴中で冷却した。
ン乾燥した窒素雰囲気下のフラスコ中にＴＨＦ中の１．
０Ｍボラン（１２，１５１Ｒ１１２，１５ミリモル）を
置いた。これを水浴中で冷却した。
乾燥ＴＨＦ（１０ｊ！Ｑ）中の３−（２−ニトロ−１＝
プロペニル）安息香酸メチルエステル（５９６１１＋＠
、２．７ミリモル）の溶液を撹拌溶液にスポイトで加え
た。ついで、水素化ホウ素ナトリウム（５１３Ｒ９，１
，３５ミリモル）を混合物にすばやく加えた。
プロペニル）安息香酸メチルエステル（５９６１１＋＠
、２．７ミリモル）の溶液を撹拌溶液にスポイトで加え
た。ついで、水素化ホウ素ナトリウム（５１３Ｒ９，１
，３５ミリモル）を混合物にすばやく加えた。
この混合物を水浴中でさらに５分間、ついで室温で１５
分間撹拌した。室温で約５分後に黄色が消えて無色にな
った。ついで、この溶液を窒素雰囲気下で穏やかに還流
しながら一夜加熱した。反応：１ ヘキサン／ＥｔＯＡ
Ｃ）により出発物質が全く残留していないことが示され
た。反応混合物を室温に冷却し、ついで６Ｍ ＨＣｌを
用いてｐＨ約２の酸性にして水とメチレンクロライドと
の間に分配した。有機層を６Ｍ ＨＣｌで洗浄し、つい
で硫酸マグネシウムで乾燥した。ついで回転蒸発器で溶
媒を除き、粗生成物（２，７６８ｇ、９８％）を得た。
分間撹拌した。室温で約５分後に黄色が消えて無色にな
った。ついで、この溶液を窒素雰囲気下で穏やかに還流
しながら一夜加熱した。反応：１ ヘキサン／ＥｔＯＡ
Ｃ）により出発物質が全く残留していないことが示され
た。反応混合物を室温に冷却し、ついで６Ｍ ＨＣｌを
用いてｐＨ約２の酸性にして水とメチレンクロライドと
の間に分配した。有機層を６Ｍ ＨＣｌで洗浄し、つい
で硫酸マグネシウムで乾燥した。ついで回転蒸発器で溶
媒を除き、粗生成物（２，７６８ｇ、９８％）を得た。
非常に極性の高いカルボン酸をクロマトグラフィーにか
けるのは困難であるので、この粗生成物をさらに精製す
ることなく用いた。
けるのは困難であるので、この粗生成物をさらに精製す
ることなく用いた。
３−（２−ニトロ−１−プロペニル）安息香酸メチルエ
ステル 三フッ化ホウ素−メタノール複合体（３０ＩｌＩＱ）中
の３−（２−ニトロ−１−プロペニル）安息香酸（２７
６８９）の溶液を窒素雰囲気下に撹拌しながら２時間加
熱還流し、ついで−夜撹拌して室温まで下げた。プレパ
ラティブ薄層クロマトグラフィー（３：１ ヘキサン／
ＥｔＯＡｃ）により出発物質が全く残留していないこと
が示された。この混合物をメチレンクロライドと５％重
炭酸ナトリウムとの混合物を室温に冷却し、水（５００
ｆｆ１２）を滴下して冷却し、ついで穏やかに還流して
２時間再び加熱した。この反応混合物を再び室温に冷却
し、濾過し、残渣を水で洗浄した。ついて、集めた濾液
および洗浄液をＫ ＯＨペレットを用いてｐ）（＋ ４
の塩基性にした。メチレンクロライドを用いて生成物を
抽出し、この抽出を３回（３ｚ５ｍｆ２）繰り返した。
ステル 三フッ化ホウ素−メタノール複合体（３０ＩｌＩＱ）中
の３−（２−ニトロ−１−プロペニル）安息香酸（２７
６８９）の溶液を窒素雰囲気下に撹拌しながら２時間加
熱還流し、ついで−夜撹拌して室温まで下げた。プレパ
ラティブ薄層クロマトグラフィー（３：１ ヘキサン／
ＥｔＯＡｃ）により出発物質が全く残留していないこと
が示された。この混合物をメチレンクロライドと５％重
炭酸ナトリウムとの混合物を室温に冷却し、水（５００
ｆｆ１２）を滴下して冷却し、ついで穏やかに還流して
２時間再び加熱した。この反応混合物を再び室温に冷却
し、濾過し、残渣を水で洗浄した。ついて、集めた濾液
および洗浄液をＫ ＯＨペレットを用いてｐ）（＋ ４
の塩基性にした。メチレンクロライドを用いて生成物を
抽出し、この抽出を３回（３ｚ５ｍｆ２）繰り返した。
この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、揮発性物質を回転
蒸発器で除いた。この粗製のアミンは重量が２７３ｚ９
（５７％）であった。これをさらに精製することなく用
いた。
蒸発器で除いた。この粗製のアミンは重量が２７３ｚ９
（５７％）であった。これをさらに精製することなく用
いた。
ＭｅＯＨ（４ｍＱ）中の３−（２−アミノプロピル）ベ
ンジルアルコール（２５４，ｍｇ、１．４４ミリモル）
の溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（２５４μｇ、３０
２１１ｇ、２．１３ミリモル）およびトリエチルアミン
（２２０ｇｇ、１．５７ミリモル、７．１７Ｍ）を加え
た。ついで、この溶液を周囲温度で一夜撹拌した。薄層
クロマトグラフィー（クロロホルム／ＭｅＯＨ）により
出発物質は全く存在しないことが示された。ついで、こ
の溶液を６Ｍ ＨＣＩとＥｔｏＡｃとの間に分配し、有
機層を乾燥しく硫酸ナトリウム）、回転蒸発器で濃縮し
て保護アミノアルコール（３２１肩？、８６％）を得た
。
ンジルアルコール（２５４，ｍｇ、１．４４ミリモル）
の溶液に、トリフルオロ酢酸エチル（２５４μｇ、３０
２１１ｇ、２．１３ミリモル）およびトリエチルアミン
（２２０ｇｇ、１．５７ミリモル、７．１７Ｍ）を加え
た。ついで、この溶液を周囲温度で一夜撹拌した。薄層
クロマトグラフィー（クロロホルム／ＭｅＯＨ）により
出発物質は全く存在しないことが示された。ついで、こ
の溶液を６Ｍ ＨＣＩとＥｔｏＡｃとの間に分配し、有
機層を乾燥しく硫酸ナトリウム）、回転蒸発器で濃縮し
て保護アミノアルコール（３２１肩？、８６％）を得た
。
１（２−）リフルオロアセトアミドプロピル）交尾」断
アセトン（４１１の中の３−（２−）リフルオロアセト
アミドプロピル）ベンジルアルコール（３２１ｍｇ、１
．２３ミリモル）の溶液に、ジョーンズ試薬（Ｊｏｎｅ
’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（２，７Ｍ、 ５５ μＱ、
１．４８ミリモル）を加えた。４５分後に薄層クロ
マトグラフィー（ヘキサジ／ＥｔＯＡｃ）で調へたとこ
ろ中間体のアルデヒドが幾らか残留していることが示さ
れたので、ジョーンズ試薬をさらに５５μｇ加えた。さ
らに３０分後の薄層クロマトグラフィーでは一つのスポ
ットが示された。反応混合物に３滴のイソプロパツール
を加えて過剰のクロム（Ｖｌ）を使い尽くし、さらに３
０分間撹拌した。ついで、等容量のメチレンクロライド
で反応混合物を希釈出発物質の酸とほぼ同じ色の固体を
残した。乾燥アセトニトリル（ｌｘρ）とともにフルオ
レセインアミン異性体Ｈ（３７ｒ１ｇ、０．１０７ミリ
モル、０゜８当量）を加え、室温にて一夜（１４時間）
、隔壁でキャップした。薄層クロマトグラフィー（クロ
ロポルム／ＭｅＯＨ）で調べたところ、はとんどのフル
オレセインアミンが消費されたことがわかった。この混
合物を少量のＭｅＯＨで希釈し、すべてを溶解させ、２
つのシリカプレート（２０Ｘ２０Ｃ′Ｒｘ１Ｉｌｌｆｆ
）」二にすし状にっけ、これをクロロホルム／ＭｅＯＨ
で２回展開した。溶媒を注意深く除いた後、主要生成物
バンドの溶出から赤い固体（４１ｏ）を得た。再びクロ
ロホルム／ＭｅＯＨ（代わりに１１・ｌ ベンゼン／Ｅ
ｔＯＡｃ／アセトンを用いてもよい）で展開した４つの
シリカブレー）（２０ｘ２０ｃｘｘ０．５闘）上の第二
のクロマトグラフィーにより、わずかに痕跡量の高Ｒｆ
物質を含有する３５Ｒ９を得た。上記４つのプレート（
２０Ｘ２０ｃｍｘＯ，５Ｉｌ！ＩＩ）上の第三のクロマ
トグラフィーにより、保護トレーサー（２８ｍｇ）を得
、これをし、少量のシリカゲルを通して濾過した。揮発
性物質を回転蒸発器で除去して標記安息香酸（２２４ｍ
ｇ、６６％）をオフホワイトの固体として得た。
アミドプロピル）ベンジルアルコール（３２１ｍｇ、１
．２３ミリモル）の溶液に、ジョーンズ試薬（Ｊｏｎｅ
’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（２，７Ｍ、 ５５ μＱ、
１．４８ミリモル）を加えた。４５分後に薄層クロ
マトグラフィー（ヘキサジ／ＥｔＯＡｃ）で調へたとこ
ろ中間体のアルデヒドが幾らか残留していることが示さ
れたので、ジョーンズ試薬をさらに５５μｇ加えた。さ
らに３０分後の薄層クロマトグラフィーでは一つのスポ
ットが示された。反応混合物に３滴のイソプロパツール
を加えて過剰のクロム（Ｖｌ）を使い尽くし、さらに３
０分間撹拌した。ついで、等容量のメチレンクロライド
で反応混合物を希釈出発物質の酸とほぼ同じ色の固体を
残した。乾燥アセトニトリル（ｌｘρ）とともにフルオ
レセインアミン異性体Ｈ（３７ｒ１ｇ、０．１０７ミリ
モル、０゜８当量）を加え、室温にて一夜（１４時間）
、隔壁でキャップした。薄層クロマトグラフィー（クロ
ロポルム／ＭｅＯＨ）で調べたところ、はとんどのフル
オレセインアミンが消費されたことがわかった。この混
合物を少量のＭｅＯＨで希釈し、すべてを溶解させ、２
つのシリカプレート（２０Ｘ２０Ｃ′Ｒｘ１Ｉｌｌｆｆ
）」二にすし状にっけ、これをクロロホルム／ＭｅＯＨ
で２回展開した。溶媒を注意深く除いた後、主要生成物
バンドの溶出から赤い固体（４１ｏ）を得た。再びクロ
ロホルム／ＭｅＯＨ（代わりに１１・ｌ ベンゼン／Ｅ
ｔＯＡｃ／アセトンを用いてもよい）で展開した４つの
シリカブレー）（２０ｘ２０ｃｘｘ０．５闘）上の第二
のクロマトグラフィーにより、わずかに痕跡量の高Ｒｆ
物質を含有する３５Ｒ９を得た。上記４つのプレート（
２０Ｘ２０ｃｍｘＯ，５Ｉｌ！ＩＩ）上の第三のクロマ
トグラフィーにより、保護トレーサー（２８ｍｇ）を得
、これをし、少量のシリカゲルを通して濾過した。揮発
性物質を回転蒸発器で除去して標記安息香酸（２２４ｍ
ｇ、６６％）をオフホワイトの固体として得た。
５１１Ｑ、容フラスコ中の３−（２−トリフルオロアセ
トアミドプロプ−１−イル）安息香酸（３７ｉｙ、０．
１３４．５ミリモル）にジクロロエタン（Ｉｕのを加え
た（それほど可溶性でない）。塩化オキサリル（１６５
μｇ、０．１８８ミリモル、１．４当量）を加え、つい
でＤＭＦ（０，５μρ）を加えた。このフラスコを隔壁
でシールし、注射針で連結したバブラーを用いて気体発
生をモニターした。この混合物を室温で撹拌し、側壁か
ら固体をはがずために時折フラスコを渦巻状に振った。
トアミドプロプ−１−イル）安息香酸（３７ｉｙ、０．
１３４．５ミリモル）にジクロロエタン（Ｉｕのを加え
た（それほど可溶性でない）。塩化オキサリル（１６５
μｇ、０．１８８ミリモル、１．４当量）を加え、つい
でＤＭＦ（０，５μρ）を加えた。このフラスコを隔壁
でシールし、注射針で連結したバブラーを用いて気体発
生をモニターした。この混合物を室温で撹拌し、側壁か
ら固体をはがずために時折フラスコを渦巻状に振った。
すべての出発物質が溶解する前で気体の発生が止まった
ときに、さらに塩化オキサリルの小塊２個を加えた。す
べての固体が最終的に溶解し気体の発生が止まったとき
に（約２〜３時間）、窒素下で溶媒を飛ばし、下記のよ
うにして脱保護した。
ときに、さらに塩化オキサリルの小塊２個を加えた。す
べての固体が最終的に溶解し気体の発生が止まったとき
に（約２〜３時間）、窒素下で溶媒を飛ばし、下記のよ
うにして脱保護した。
方法Ｂ：炭酸イソブチル混合無水物を使用３−（２−ト
リフルオロアセトアミドプロブｌ−イル）安息香酸（０
，０３５ミリモル）の９．６＋２試料を乾燥アセトニト
リル（アルドリッチ・ゴールド・ラベル（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ Ｇｏｌｄ Ｌａｂｅｌ）、０３０屑ρ）中に溶解し
、氷／水浴中で冷却し、トリエチルアミン（５，４μｆ
ｉ、０．０３８５ミリモル、１１当量）およびイソブチ
ルクロロホルメート（５０μｍ２，０．０３８５ミリモ
ル、１１当量）で処理した。この混合物を水浴中で１／
２時間、ついで室温で１／２時間栓をして撹拌した。固
体のフルオレセインアミン異性体ＩＩ（１０，４ｕ９．
０．０３ミリモル、０．８６当量）を加え、混合物を室
温で一夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーで調べたと
ころ、２３時間後よりも２時間後の方が所望の生成物の
収歯が良かったことがわかった。メタノール（１００μ
ｇ）、水（２５μＱ）および濃アンモニア水（２５μＱ
）を用いて加水分解を２時間３０分行い、シリカ上で３
回、このうち２回は５ Ｉ りロワホルム／メタノール
、１回は１１：Ｉ ヘンゼン／酢酸エチル／アセトンを
用いてクロマトグラフィーを行うことにより生成物を精
製した。
リフルオロアセトアミドプロブｌ−イル）安息香酸（０
，０３５ミリモル）の９．６＋２試料を乾燥アセトニト
リル（アルドリッチ・ゴールド・ラベル（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ Ｇｏｌｄ Ｌａｂｅｌ）、０３０屑ρ）中に溶解し
、氷／水浴中で冷却し、トリエチルアミン（５，４μｆ
ｉ、０．０３８５ミリモル、１１当量）およびイソブチ
ルクロロホルメート（５０μｍ２，０．０３８５ミリモ
ル、１１当量）で処理した。この混合物を水浴中で１／
２時間、ついで室温で１／２時間栓をして撹拌した。固
体のフルオレセインアミン異性体ＩＩ（１０，４ｕ９．
０．０３ミリモル、０．８６当量）を加え、混合物を室
温で一夜撹拌した。薄層クロマトグラフィーで調べたと
ころ、２３時間後よりも２時間後の方が所望の生成物の
収歯が良かったことがわかった。メタノール（１００μ
ｇ）、水（２５μＱ）および濃アンモニア水（２５μＱ
）を用いて加水分解を２時間３０分行い、シリカ上で３
回、このうち２回は５ Ｉ りロワホルム／メタノール
、１回は１１：Ｉ ヘンゼン／酢酸エチル／アセトンを
用いてクロマトグラフィーを行うことにより生成物を精
製した。
方法Ｃ１：ＢＯＰ−ＣＩを使用
アセトニトリル（３，０ｘｆ７）中の３−（ｌ）リフル
オロアセトアミドプロブ−１−イル）安息香酸（Ｉ０４
ｍ？、０．３８ミリモル）の溶液を、トリエチルアミン
（７，１７Ｍ）、フルオレセインアミン異性体１１（１
１４１１ｙ、０．３８ミリモル）およびビス（２−オキ
ソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（
ＢＯＰ−ＣＩＸ９７ｙ’ｊ、０，３８ミリモル）ととも
に室温で一夜撹拌した。（Ｂ ＯＰ −Ｃ１は最後に添
加）プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（１：Ｉ：
Ｉ ベンゼン／ＥｔＯＡｃ／アセトン）により未反応
フルオレセインアミンが示されたが、ＢＯＰ−ＣＩをさ
らに加えても反応を促進するとは思われなかった。つい
で、０−アシル化フルオレセイン誘導体の加水分解のた
めにＭｅＯＨ（１，０１１Ｑ）、水（２５０μＱ）およ
びアンモニア（２５０μＱ）を加えた。１時間撹拌した
後、窒素流下法ＣＩと同様であり、適当に計量した。
オロアセトアミドプロブ−１−イル）安息香酸（Ｉ０４
ｍ？、０．３８ミリモル）の溶液を、トリエチルアミン
（７，１７Ｍ）、フルオレセインアミン異性体１１（１
１４１１ｙ、０．３８ミリモル）およびビス（２−オキ
ソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（
ＢＯＰ−ＣＩＸ９７ｙ’ｊ、０，３８ミリモル）ととも
に室温で一夜撹拌した。（Ｂ ＯＰ −Ｃ１は最後に添
加）プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（１：Ｉ：
Ｉ ベンゼン／ＥｔＯＡｃ／アセトン）により未反応
フルオレセインアミンが示されたが、ＢＯＰ−ＣＩをさ
らに加えても反応を促進するとは思われなかった。つい
で、０−アシル化フルオレセイン誘導体の加水分解のた
めにＭｅＯＨ（１，０１１Ｑ）、水（２５０μＱ）およ
びアンモニア（２５０μＱ）を加えた。１時間撹拌した
後、窒素流下法ＣＩと同様であり、適当に計量した。
６−［３−（２−アミノプロピル）ベンズアミド］フル
オレセイン 上記ＣＩで記載した実験から得られた保護トレーサーの
全試料をＭｅＯＨ（１６００μ（Ｄおよび炭酸カリウム
（１，０Ｍ水溶液、８００μｇ）とともに−夜撹拌する
ことに上り脱保護した。２４時間後、プレパラティブ薄
層クロマトグラフィーにより、保護トレーサーはほとん
ど残っていないことが示された。ついで、この反応混合
物を４つのシリカゲルプレート（２０Ｘ２０ｃＲｘＯ，
５ｉｘ）、ｈにすじ状につけ、１．１ クロロホルム／
ＭｅＯＨ＋２％アンモニアで２回展開した。このプレー
トにはすし状部分が若干残っていたので、クロマトグラ
フィー手順を繰り返した。
オレセイン 上記ＣＩで記載した実験から得られた保護トレーサーの
全試料をＭｅＯＨ（１６００μ（Ｄおよび炭酸カリウム
（１，０Ｍ水溶液、８００μｇ）とともに−夜撹拌する
ことに上り脱保護した。２４時間後、プレパラティブ薄
層クロマトグラフィーにより、保護トレーサーはほとん
ど残っていないことが示された。ついで、この反応混合
物を４つのシリカゲルプレート（２０Ｘ２０ｃＲｘＯ，
５ｉｘ）、ｈにすじ状につけ、１．１ クロロホルム／
ＭｅＯＨ＋２％アンモニアで２回展開した。このプレー
トにはすし状部分が若干残っていたので、クロマトグラ
フィー手順を繰り返した。
溶媒を除去することによりトレーサー（１７，８ｍｇ、
０．０３４３ミリモル）を得た。この物質をＭｅＯＨ（
４ｔｈＱ＞中に再溶解し、トリエチルアミン（１０μの
およびジーｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ８
９，３＋９．０．０４２８ミリモル）と室温てで揮発性
物質を除いた。ついで、残渣をＭｅＯＨ中に再溶解し、
窒素下で２回ストリッピングした。
０．０３４３ミリモル）を得た。この物質をＭｅＯＨ（
４ｔｈＱ＞中に再溶解し、トリエチルアミン（１０μの
およびジーｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ８
９，３＋９．０．０４２８ミリモル）と室温てで揮発性
物質を除いた。ついで、残渣をＭｅＯＨ中に再溶解し、
窒素下で２回ストリッピングした。
ついで、この物質を２つのシリカゲルプレート（２０Ｘ
２０ｃｌｌｌｘ ２ｘｍ）上にすし状につけ、Ｉ：Ｉ
：１ベンゼン／ＥｔＯＡｃ／アセトンで２回展開した。
２０ｃｌｌｌｘ ２ｘｍ）上にすし状につけ、Ｉ：Ｉ
：１ベンゼン／ＥｔＯＡｃ／アセトンで２回展開した。
（この物質は、もっと薄いプレート、すなわち０゜５龍
プレート上での別のクロマトグラフィーからはもっと良
い結果が得られるであろう。）方法Ｃ２：ＢＯＰ−ＣＩ
を使用 ３−（２−トリフルオロアセトアミドプロブ−１−イル
）安息香酸（０，１ミリモル）の２７．５１１１９試料
を乾燥アセトニトリル（アルドリッチ・ゴールド・ラベ
ルＸ１．０ｘ（ｉ）中に溶解しくすべては溶解しない）
、ピリジン（６９μｇ、０．０８５ミリモル、０．８５
当量）お上びＢＯＰ−Ｃ１（２５，５ｍｇ、０．１ミリ
モル、１．０当量）で処理し、室温で１５分間撹拌した
。フルオレセインアミン異性体１１（２９，５ｍｇ、０
．０８５ミリモル、０．８５当量）を加え、湿気を排除
して室温で一夜撹拌を続けた。
プレート上での別のクロマトグラフィーからはもっと良
い結果が得られるであろう。）方法Ｃ２：ＢＯＰ−ＣＩ
を使用 ３−（２−トリフルオロアセトアミドプロブ−１−イル
）安息香酸（０，１ミリモル）の２７．５１１１９試料
を乾燥アセトニトリル（アルドリッチ・ゴールド・ラベ
ルＸ１．０ｘ（ｉ）中に溶解しくすべては溶解しない）
、ピリジン（６９μｇ、０．０８５ミリモル、０．８５
当量）お上びＢＯＰ−Ｃ１（２５，５ｍｇ、０．１ミリ
モル、１．０当量）で処理し、室温で１５分間撹拌した
。フルオレセインアミン異性体１１（２９，５ｍｇ、０
．０８５ミリモル、０．８５当量）を加え、湿気を排除
して室温で一夜撹拌を続けた。
その後の手順およびクロマトグラフィーは上記力一夜反
応させた。プレパラティブ薄層クロマトグラフィーによ
り、極性物質は残留していないことが示された。窒素下
に溶媒を除去し、小容量のメタノール中に反応混合物を
再溶解し、２つのシリカゲルプレート（２０Ｘ２０ｃ肩
Ｘ ０ 、５ ｍｍ）上にすし状につけた。このプレー
トを５，１ クロロポルム／ＭｅＯＨで２回展開した。
応させた。プレパラティブ薄層クロマトグラフィーによ
り、極性物質は残留していないことが示された。窒素下
に溶媒を除去し、小容量のメタノール中に反応混合物を
再溶解し、２つのシリカゲルプレート（２０Ｘ２０ｃ肩
Ｘ ０ 、５ ｍｍ）上にすし状につけた。このプレー
トを５，１ クロロポルム／ＭｅＯＨで２回展開した。
このプレートの頂部からの第二の主要バンドをこすり、
メタノールで溶出した。この物質を濃縮乾固し、トリフ
ルオロ酢酸中（２，Ｏｍのに再溶解した。３５分後のプ
レパラティブ薄層クロマトグラフィー（５：Ｉ クロロ
ホルム／ＭｅＯＨ）により、出発物質は全く残留してい
ないことが示された。窒素下に溶媒／試薬を除き、残渣
をＭｅＯＨ中に再溶解し、窒素下に２回飛ばしてほとん
どの残渣するトリフルオロ酢酸を除去した。
メタノールで溶出した。この物質を濃縮乾固し、トリフ
ルオロ酢酸中（２，Ｏｍのに再溶解した。３５分後のプ
レパラティブ薄層クロマトグラフィー（５：Ｉ クロロ
ホルム／ＭｅＯＨ）により、出発物質は全く残留してい
ないことが示された。窒素下に溶媒／試薬を除き、残渣
をＭｅＯＨ中に再溶解し、窒素下に２回飛ばしてほとん
どの残渣するトリフルオロ酢酸を除去した。
ノー３−イルアミノカルボニル）］］フルオレセイン５
−カルボキンフルオレセイおよび６−カルボキシフルオ
レセインの混合物（９，４層ｇ）をジメチルポルムアミ
ド（０，１２５ｆｆＣ）中に溶解し、水浴中で冷却した
。トリエチルアミン（０，０１＋５ｍＱ）およびイソブ
チルクロロポルメート（０，０１０７１１１ρ）を加え
、水が解けるまで混合物を２時間撹拌した。別のジメチ
ルポルムアミド（０，１２５肩の中の（Ｒ，Ｓ）−３−
（２−トリフルオロアセトアミドプロブ−１−イル）ア
ミノベンゼン（６，６層ｇ）の溶液を加え、室温で一夜
撹拌を続けた。この混合物をメタノール（０、ｌ ２５
＋１１１２）および水（００２０１ρ）で希釈し、濃ア
ンモニア水（０，０２０ｘρ）で処理した。さらに３時
間撹拌した後、窒素流下に揮発性物質を除いた。残渣を
薄層プレート上のクロマトグラフィー（クロロホルム／
メタノール）で精製して（Ｒ，５）−５−［２−）リフ
ルオロアセチルアミド−１−プロピル（フェン−３−イ
ルアミノカルボニル）］フルオレセインおよび（Ｒ。
−カルボキンフルオレセイおよび６−カルボキシフルオ
レセインの混合物（９，４層ｇ）をジメチルポルムアミ
ド（０，１２５ｆｆＣ）中に溶解し、水浴中で冷却した
。トリエチルアミン（０，０１＋５ｍＱ）およびイソブ
チルクロロポルメート（０，０１０７１１１ρ）を加え
、水が解けるまで混合物を２時間撹拌した。別のジメチ
ルポルムアミド（０，１２５肩の中の（Ｒ，Ｓ）−３−
（２−トリフルオロアセトアミドプロブ−１−イル）ア
ミノベンゼン（６，６層ｇ）の溶液を加え、室温で一夜
撹拌を続けた。この混合物をメタノール（０、ｌ ２５
＋１１１２）および水（００２０１ρ）で希釈し、濃ア
ンモニア水（０，０２０ｘρ）で処理した。さらに３時
間撹拌した後、窒素流下に揮発性物質を除いた。残渣を
薄層プレート上のクロマトグラフィー（クロロホルム／
メタノール）で精製して（Ｒ，５）−５−［２−）リフ
ルオロアセチルアミド−１−プロピル（フェン−３−イ
ルアミノカルボニル）］フルオレセインおよび（Ｒ。
５）−６−［２−トリフルオロアセチルアミド−ｌロブ
−１−イル）アミノベンゼン 水冷トリフルオロ酢酸無水物（３５πのに高純度の（Ｒ
９Ｓ）−１−フェニル−２−プロパツール（６゜１８ｇ
、５０ミリモル）をゆっくりと滴下した。添加完了後、
水浴中でなおこの混合物を１５分間撹拌した。ついで、
濃硝酸（３，２１１１ｇ、５１ミリモル）を滴下し、水
冷しながら混合物をさらに４５分間撹拌した。回転蒸発
器で揮発性物質を除去し、残渣を重炭酸ナトリウムとジ
クロロメタンとの間に分配した。有機層を無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して薄黄色の油（１３
，２９ｇ）を得、これはほとんどが４−二トロフェニル
−２＝プロピルトリプルオロ酢酸で、幾らかが２−二ト
ロフェニル−２−プロビルトリフルオロ酢酸で、少量が
３−ニトロフェニル−２−プロビルトリフルオロ酢酸で
ある混合物に相当するＮＭＲシグナルを示した。
−１−イル）アミノベンゼン 水冷トリフルオロ酢酸無水物（３５πのに高純度の（Ｒ
９Ｓ）−１−フェニル−２−プロパツール（６゜１８ｇ
、５０ミリモル）をゆっくりと滴下した。添加完了後、
水浴中でなおこの混合物を１５分間撹拌した。ついで、
濃硝酸（３，２１１１ｇ、５１ミリモル）を滴下し、水
冷しながら混合物をさらに４５分間撹拌した。回転蒸発
器で揮発性物質を除去し、残渣を重炭酸ナトリウムとジ
クロロメタンとの間に分配した。有機層を無水硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して薄黄色の油（１３
，２９ｇ）を得、これはほとんどが４−二トロフェニル
−２＝プロピルトリプルオロ酢酸で、幾らかが２−二ト
ロフェニル−２−プロビルトリフルオロ酢酸で、少量が
３−ニトロフェニル−２−プロビルトリフルオロ酢酸で
ある混合物に相当するＮＭＲシグナルを示した。
上記反応で得たニトロ異性体の混合物の２．２ｇ試料を
、メタノール（１０ｙ＋ｆｉ）および１Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液（１０１１Ｑ）中に溶解することによりプロ
ピル（フェン−３−イルアミノカルボニル）］フルオレ
セインを２つの主要生成物として得た。
、メタノール（１０ｙ＋ｆｉ）および１Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液（１０１１Ｑ）中に溶解することによりプロ
ピル（フェン−３−イルアミノカルボニル）］フルオレ
セインを２つの主要生成物として得た。
上記で得た（Ｒ，５）−５−［２−）リフルオロアセチ
ルアミド−１−プロピル（フェン−３−イルアミノカル
ボニル）］フルオレセインをメタノール（０、５ｘ１７
）中に溶解し、炭酸カリウムの１．０Ｍ溶液（０，２ｚ
Ｑ）で処理した。この混合物を周囲温度で１５時間撹拌
した。薄層プレート上のクロマトグラフィー（クロロホ
ルム／メタノール／アンモニア）により純粋な標記化合
物を得た。
ルアミド−１−プロピル（フェン−３−イルアミノカル
ボニル）］フルオレセインをメタノール（０、５ｘ１７
）中に溶解し、炭酸カリウムの１．０Ｍ溶液（０，２ｚ
Ｑ）で処理した。この混合物を周囲温度で１５時間撹拌
した。薄層プレート上のクロマトグラフィー（クロロホ
ルム／メタノール／アンモニア）により純粋な標記化合
物を得た。
この化合物は、上記調製法と同様にして、（ＲＳ）−６
−［２−）リフルオロアセチルアミド−１プロピル（フ
ェン−３−イルアミノカルボニル）コフルオレセインを
加水分解することにより調製した。
−［２−）リフルオロアセチルアミド−１プロピル（フ
ェン−３−イルアミノカルボニル）コフルオレセインを
加水分解することにより調製した。
（Ｒ，Ｓ）−２−（２−トリフルオロアセトアミドブ加
水分解した。最初に２層であった混合物は、周囲温度で
一夜撹拌後に均一になった。３Ｍ塩酸水溶液で中性にす
ることにより１８時間後に反応を停止させ、はとんどの
メタノールを回転蒸発器で除去した。水性残渣をジクロ
ロメタンで抽出し、この有機層を水で１回洗浄した。無
水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を除いて黄
色の油（１，３ｇ、９６５％）を得た。この異性体をシ
リカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘ
キサン／酢酸エチル）で分離し、（Ｒ，５）−１（２−
ニトロフェニル）−２−プロパツールが先に溶出した。
水分解した。最初に２層であった混合物は、周囲温度で
一夜撹拌後に均一になった。３Ｍ塩酸水溶液で中性にす
ることにより１８時間後に反応を停止させ、はとんどの
メタノールを回転蒸発器で除去した。水性残渣をジクロ
ロメタンで抽出し、この有機層を水で１回洗浄した。無
水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を除いて黄
色の油（１，３ｇ、９６５％）を得た。この異性体をシ
リカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘ
キサン／酢酸エチル）で分離し、（Ｒ，５）−１（２−
ニトロフェニル）−２−プロパツールが先に溶出した。
ジクロロメタン（６靜）中の（Ｒ，５）−１−（２ニト
ロフエニル）−２−プロパツール（２６５ｍｇ、１．４
６ミリモル）の溶液を水浴中で冷却し、トリエチルアミ
ン（０，２８６＋１！、 ２．０５ミリモル）で、つ
いでメタンスルホニルクロライド（２１０ｚｙ、１．８
３ミリモル）で処理した。この混合物を室温に徐々に温
めながら２時間撹拌した。生成物を水で、ついで５％重
炭酸ナトリウムで抽出して単離し、無水硫酸マクネシウ
ムで乾燥し、濾過し、溶媒を除いて、極めて純粋な（Ｒ
，Ｓ）−１−（２−二トロフェニル）−２−プロピルメ
タンスルホネートを黄色がかった黄褐色の固体としてほ
ぼ定量的な収量で得た。
ロフエニル）−２−プロパツール（２６５ｍｇ、１．４
６ミリモル）の溶液を水浴中で冷却し、トリエチルアミ
ン（０，２８６＋１！、 ２．０５ミリモル）で、つ
いでメタンスルホニルクロライド（２１０ｚｙ、１．８
３ミリモル）で処理した。この混合物を室温に徐々に温
めながら２時間撹拌した。生成物を水で、ついで５％重
炭酸ナトリウムで抽出して単離し、無水硫酸マクネシウ
ムで乾燥し、濾過し、溶媒を除いて、極めて純粋な（Ｒ
，Ｓ）−１−（２−二トロフェニル）−２−プロピルメ
タンスルホネートを黄色がかった黄褐色の固体としてほ
ぼ定量的な収量で得た。
上記反応で調製したメタンスルホネートエステルの一部
（３４８Ｒｇ、１．３４ミリモル）をジメチルホルムア
ミド（４酎）中に溶解した。アジ化ナトリウム（１７５
ｒＩｇ、２．６８ミリモル）を加え、混合物を１１５℃
の油浴中で１〜１／２時間撹拌した。室温に冷却した後
、生成物をエーテルと水との間に分配することによって
単離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を
除去した。残留した透明な黄色い油（２６３ｆｆ９）は
ＮＭＲによると７５％が（Ｒ，５）−１−（２−ニトロ
フェニル）２−アジドプロパンであり、残りはほとんど
が副生物などの混合物からなっていた。これらの化合物
はクロマトグラフィーでもよく分離しないので、この混
合物をさらに精製することなく用いた。
（３４８Ｒｇ、１．３４ミリモル）をジメチルホルムア
ミド（４酎）中に溶解した。アジ化ナトリウム（１７５
ｒＩｇ、２．６８ミリモル）を加え、混合物を１１５℃
の油浴中で１〜１／２時間撹拌した。室温に冷却した後
、生成物をエーテルと水との間に分配することによって
単離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を
除去した。残留した透明な黄色い油（２６３ｆｆ９）は
ＮＭＲによると７５％が（Ｒ，５）−１−（２−ニトロ
フェニル）２−アジドプロパンであり、残りはほとんど
が副生物などの混合物からなっていた。これらの化合物
はクロマトグラフィーでもよく分離しないので、この混
合物をさらに精製することなく用いた。
上記反応で調製した不純なアジドの一部（２３１−プロ
ピル（フェン−３−イルアミノカルボ上記方法に従い、
（Ｒ，Ｓ）−２−（２−）リフルオロアセトアミドプロ
プ−１−イル）アミノベンゼン（６，６ｍｇ）から標記
化合物を調製した。
ピル（フェン−３−イルアミノカルボ上記方法に従い、
（Ｒ，Ｓ）−２−（２−）リフルオロアセトアミドプロ
プ−１−イル）アミノベンゼン（６，６ｍｇ）から標記
化合物を調製した。
上記方法に従い、（Ｒ，５）−５−［２−トリフルオロ
アセチルアミド−１−プロピル（フェン−２イルアミノ
カルボニル）］フルオレセインから標記化合物を調製し
た。
アセチルアミド−１−プロピル（フェン−２イルアミノ
カルボニル）］フルオレセインから標記化合物を調製し
た。
上記方法に従い、（Ｒ，Ｓ）−６−［２−）リフルオロ
アセチルアミド−１−プロピル（フェン−２イルアミノ
カルボニル）］フルオレセインから標記化合物を調製し
た。
アセチルアミド−１−プロピル（フェン−２イルアミノ
カルボニル）］フルオレセインから標記化合物を調製し
た。
０ ｍｇ）をテトラヒドロフラン（３ｕρ）中に溶解し
、トリフェニルホスフィン（３２２ｆｆｇ）で処理する
ことにより還元した。気体の発生が開始した後、中間体
を加水分解するために水（３ｏｚｇ）を加え、この混合
物を窒素雰囲気下に４５℃の油浴中で一夜加熱した。１
５時間後、室温に冷却し、揮発性物質を除去した。残渣
をジクロロメタン（１０ｘσ）中に溶解し、無水トリフ
ルオロ酢酸（０，３０＋ｔｆ２）を加えた。１時間後に
溶媒を除いて金色の油（７５０１１ｇ）を得、これをフ
ラッシュクロマトグラフィーにかけて（Ｒ，５）−１−
（２−二トロフェニル）２−トリフルオロアセトアミド
プロパン（１８４ｍ９）を白色結晶固体として得た。
、トリフェニルホスフィン（３２２ｆｆｇ）で処理する
ことにより還元した。気体の発生が開始した後、中間体
を加水分解するために水（３ｏｚｇ）を加え、この混合
物を窒素雰囲気下に４５℃の油浴中で一夜加熱した。１
５時間後、室温に冷却し、揮発性物質を除去した。残渣
をジクロロメタン（１０ｘσ）中に溶解し、無水トリフ
ルオロ酢酸（０，３０＋ｔｆ２）を加えた。１時間後に
溶媒を除いて金色の油（７５０１１ｇ）を得、これをフ
ラッシュクロマトグラフィーにかけて（Ｒ，５）−１−
（２−二トロフェニル）２−トリフルオロアセトアミド
プロパン（１８４ｍ９）を白色結晶固体として得た。
上記反応で調製したニトロ化合物の一部（１３１＋９）
を酢酸エチル（１５ｘＩ２）中に溶解し、バールシェー
カー上の１０％パラジウム炭素（２５１１ｙ）で水素化
して（Ｒ，５）−２，−（２−トリフルオロアセトアミ
ドプロプ−１−イル）アミノベンゼンを透明な無色油と
してほぼ定量的な収量で得た。
を酢酸エチル（１５ｘＩ２）中に溶解し、バールシェー
カー上の１０％パラジウム炭素（２５１１ｙ）で水素化
して（Ｒ，５）−２，−（２−トリフルオロアセトアミ
ドプロプ−１−イル）アミノベンゼンを透明な無色油と
してほぼ定量的な収量で得た。
（Ｒ，５）−５−［２−）リフルオロアセチルアミドミ
ドプロプ−１−イル）ベンズアミトコフルオレセイン 小さなガラスびん中の１（２−トリフルオロアセトアミ
ドプロプ−１−イル）安息香酸（１１゜０ｍｇ、０．０
４ミリモル）にジクロロエタン（０，４ＩＩＩρ）を加
え（最初はすべての固体は溶解しない）、よく撹拌しな
がら塩化オキサリル（７，１ｍｇ）を加えた。少量（約
ｏ、ｏｏｉπＱ）のジメチルホルムアミドを加えるまで
は変化はみられなかった。この添加により気体が激しく
発生した。室温で３時間撹拌した後、溶液を２つの等し
い部分に分け、方を窒素流下で飛ばして乾燥させた。固
体の５アミノフルオレセイン（５，６Ｈ１０，０１６ミ
リモル）を加え、ついでジメチルホルムアミド（０１ｘ
Ｑ）を加え、この混合物を周囲温度で１７時間撹拌した
。窒素流下に溶媒を除き、残渣をシリカゲル薄層プレー
ト上のクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール
）にかけて標記化合物を得た。
ドプロプ−１−イル）ベンズアミトコフルオレセイン 小さなガラスびん中の１（２−トリフルオロアセトアミ
ドプロプ−１−イル）安息香酸（１１゜０ｍｇ、０．０
４ミリモル）にジクロロエタン（０，４ＩＩＩρ）を加
え（最初はすべての固体は溶解しない）、よく撹拌しな
がら塩化オキサリル（７，１ｍｇ）を加えた。少量（約
ｏ、ｏｏｉπＱ）のジメチルホルムアミドを加えるまで
は変化はみられなかった。この添加により気体が激しく
発生した。室温で３時間撹拌した後、溶液を２つの等し
い部分に分け、方を窒素流下で飛ばして乾燥させた。固
体の５アミノフルオレセイン（５，６Ｈ１０，０１６ミ
リモル）を加え、ついでジメチルホルムアミド（０１ｘ
Ｑ）を加え、この混合物を周囲温度で１７時間撹拌した
。窒素流下に溶媒を除き、残渣をシリカゲル薄層プレー
ト上のクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール
）にかけて標記化合物を得た。
ル）ベンズアミド］フルオレセイン
上記方法で調製した（Ｒ，５）−５−［３−（２−トリ
フルオロアセトアミドプロブ−１−イル）ベンズアミド
］フルオレセインの試料の半分の一方をメタノール（０
，４１Ｎｇ）中に溶解し、周囲温度で一夜撹拌しながら
１Ｍ炭酸カリウム水溶液（ｏ、２Ｒρ）で処理すること
によって加水分解した。この生成物をシリカゲル薄層プ
レート上のクロマトグラフィー（クロロポルム／メタノ
ール／アンモニア）にかけて精製した。
フルオロアセトアミドプロブ−１−イル）ベンズアミド
］フルオレセインの試料の半分の一方をメタノール（０
，４１Ｎｇ）中に溶解し、周囲温度で一夜撹拌しながら
１Ｍ炭酸カリウム水溶液（ｏ、２Ｒρ）で処理すること
によって加水分解した。この生成物をシリカゲル薄層プ
レート上のクロマトグラフィー（クロロポルム／メタノ
ール／アンモニア）にかけて精製した。
実施例２
窒素下、水浴中で撹拌したメタノール（７５Ｎｆ２）中
の（＋ Ｒ，２Ｓ）−（−）−エフェドリン（１３５５
ｇ、８２．００ミリモル）の溶液に、トリフルオロ酢酸
ｘチルＣ１２，２３順、１４．５５９．１０２５ミリモ
ル）およびトリエチルアミン（Ｉｌ、７１１１し、回転
蒸発器で濃縮した。プレパラティブ薄層クロマトグラフ
ィー（３：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により、幾らか
の出発物質がなお残っていることが示された。ついで、
反応混合物をＴＨＦ（５５ｘＱ）中に再溶解し、さらに
７．３３ｆｆＣの無水トリフルオロ酢酸および１．４９
の１０％パラジウム炭素触媒とともにさらに２４時間振
盪した。圧力は２７ｐｓｉまで下がった。反応混合物を
再び濾過し、回転蒸発器で濃縮した。プレパラティブ薄
層クロマトグラフィーおよび’ＨＮＭＲにより出発物質
が全く存在しないことが示された。この反応によって標
記化合物（１０，９２８ｇ、８９％）が無色油として生
成し、これをさらに精製することなく用いた。
の（＋ Ｒ，２Ｓ）−（−）−エフェドリン（１３５５
ｇ、８２．００ミリモル）の溶液に、トリフルオロ酢酸
ｘチルＣ１２，２３順、１４．５５９．１０２５ミリモ
ル）およびトリエチルアミン（Ｉｌ、７１１１し、回転
蒸発器で濃縮した。プレパラティブ薄層クロマトグラフ
ィー（３：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により、幾らか
の出発物質がなお残っていることが示された。ついで、
反応混合物をＴＨＦ（５５ｘＱ）中に再溶解し、さらに
７．３３ｆｆＣの無水トリフルオロ酢酸および１．４９
の１０％パラジウム炭素触媒とともにさらに２４時間振
盪した。圧力は２７ｐｓｉまで下がった。反応混合物を
再び濾過し、回転蒸発器で濃縮した。プレパラティブ薄
層クロマトグラフィーおよび’ＨＮＭＲにより出発物質
が全く存在しないことが示された。この反応によって標
記化合物（１０，９２８ｇ、８９％）が無色油として生
成し、これをさらに精製することなく用いた。
Ｃ，９０，２，：リモル）を加えた。この溶液を水浴中
で２時間撹拌し、ついで室温で２時間撹拌した。
で２時間撹拌し、ついで室温で２時間撹拌した。
プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（５：１ヘキサ
ン／ＲｔＯＡｃ）により出発物質は全く残っていないこ
とが示された。反応混合物を６ＭＨＣｌと酢酸エチルと
の間に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、回
転蒸発器で濃縮して保護エフェドリン（１４，９４３ｇ
、７０％）を無色油として得た。この化合物は精製する
必要がなかった。
ン／ＲｔＯＡｃ）により出発物質は全く残っていないこ
とが示された。反応混合物を６ＭＨＣｌと酢酸エチルと
の間に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、回
転蒸発器で濃縮して保護エフェドリン（１４，９４３ｇ
、７０％）を無色油として得た。この化合物は精製する
必要がなかった。
ＴＨＦ（５５１１ｆり中の（ＩＲ，２Ｓ）−１−フェニ
ル−１−ヒドロキシ−２−［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミド］プロパン（１３，２８＠、５０１ミリモ
ル）の溶液を、無水トリフルオロ酢酸（７３３順、５１
．９ミリモル）とともに１０％パラジウム炭素（１，４
ｇ）を有するハイドロゲネレーター上で振盪した。３日
後、圧力は２３ｐｓｉまで下がった。ついで、この反応
混合物をケイソウ土で濾過＋４０ 水浴中で撹拌した無水トリフルオロ酢酸（８Ｍ）中の（
Ｓ）−１−フェニル−２−［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミド］プロパンＣ２，２９７９，９３８ミリモ
ル）の溶液に、７０％硝酸（１５，５５Ｍ、６１５μ＆
、９．５６ミリモル）を１０分間かけて加えた。ついで
、水浴中で３時間撹拌して反応を続けた。この反応混合
物を窒素流下に飛ばして乾燥させ、残渣を塩化メチレン
と５％重炭酸ナトリウムの間に分配した。（泡立ちのた
め注意が必要）ついで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、濃縮乾固して粗製の生成物（１，３９９）を得、こ
れを移動相としてヘキサン／酢酸エチル混合物を用いた
フラッシュシリカゲルカラム上で精製した。
ル−１−ヒドロキシ−２−［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミド］プロパン（１３，２８＠、５０１ミリモ
ル）の溶液を、無水トリフルオロ酢酸（７３３順、５１
．９ミリモル）とともに１０％パラジウム炭素（１，４
ｇ）を有するハイドロゲネレーター上で振盪した。３日
後、圧力は２３ｐｓｉまで下がった。ついで、この反応
混合物をケイソウ土で濾過＋４０ 水浴中で撹拌した無水トリフルオロ酢酸（８Ｍ）中の（
Ｓ）−１−フェニル−２−［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミド］プロパンＣ２，２９７９，９３８ミリモ
ル）の溶液に、７０％硝酸（１５，５５Ｍ、６１５μ＆
、９．５６ミリモル）を１０分間かけて加えた。ついで
、水浴中で３時間撹拌して反応を続けた。この反応混合
物を窒素流下に飛ばして乾燥させ、残渣を塩化メチレン
と５％重炭酸ナトリウムの間に分配した。（泡立ちのた
め注意が必要）ついで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥
し、濃縮乾固して粗製の生成物（１，３９９）を得、こ
れを移動相としてヘキサン／酢酸エチル混合物を用いた
フラッシュシリカゲルカラム上で精製した。
生成した３種の異性体のうち２−ニトロ化合物が最も移
動し易く、４−ニトロ化合物が最も移動しにくかった。
動し易く、４−ニトロ化合物が最も移動しにくかった。
クロマトグラフィーにより純粋な（Ｓ）−１−（２−ニ
トロフェニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル
）アミド］プロパン（２６０屑９）および純粋な（Ｓ）
−１−（４−ニトロフェニル）２−［トリフルオロアセ
チル（メチル）アミド］プロパン（５１２ｕｙ）が分離
され、条里の物質が混合画分中に遊離された。幾つかの
中間の画分を集めて純粋な（Ｓ）−１−（３−ニトロフ
ェニル）−２［トリフルオロアセチル（メチル）アミド
］プロパン（６０ｆｆｇ）を得、これを薄層プレート上
で再びクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）に
かけることによりさらに精製して純粋な生成物（３４ｆ
ｆ９）を得た。
トロフェニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル
）アミド］プロパン（２６０屑９）および純粋な（Ｓ）
−１−（４−ニトロフェニル）２−［トリフルオロアセ
チル（メチル）アミド］プロパン（５１２ｕｙ）が分離
され、条里の物質が混合画分中に遊離された。幾つかの
中間の画分を集めて純粋な（Ｓ）−１−（３−ニトロフ
ェニル）−２［トリフルオロアセチル（メチル）アミド
］プロパン（６０ｆｆｇ）を得、これを薄層プレート上
で再びクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）に
かけることによりさらに精製して純粋な生成物（３４ｆ
ｆ９）を得た。
ｘ’ｌ ／ −ル（１０Ｒｉり中）（Ｓ）−１−（４−
ニトロフェニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチ
ル）アミド］プロパン（Ｂ７ｘ９）の溶液を、１０％パ
ラジウム炭素（ｌ１ｍｇ）を有するハイドロゲネレータ
ー上で振盪した。１時間後、圧力は６ｐｓｉまで下がり
、反応混合物を移し、ケイソウ土で濾過した。ついて、
得られた溶液を濃縮乾固して標記化合物（７３ｆｆ９）
をほとんど無色の油として得た。
ニトロフェニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチ
ル）アミド］プロパン（Ｂ７ｘ９）の溶液を、１０％パ
ラジウム炭素（ｌ１ｍｇ）を有するハイドロゲネレータ
ー上で振盪した。１時間後、圧力は６ｐｓｉまで下がり
、反応混合物を移し、ケイソウ土で濾過した。ついて、
得られた溶液を濃縮乾固して標記化合物（７３ｆｆ９）
をほとんど無色の油として得た。
主要トレーザーバンドをこすりとり、メタノールで溶出
し、４つのシリカゲルプレート（２０ｘ２０ｃｍＸ０．
５５ｉＩＩ＋）上で再びクロマトグラフィーにかけ、５
：１ クロロホルム／メタノールで２回層ルオレセイン 上記実験で調製した保護トレーサーの全試料を１Ｍ炭酸
カリウム水溶液（１、Ｏｘｆ２）とともにメタノール（
２，０１１１１２）中で一夜撹拌することにより脱保護
した。２４時間後、分析薄層クロマトグラフィーにより
、保護トレーサーはほとんど全く残っていないことが示
された。この反応混合物を４つのシリカゲルプレート（
２０Ｘ２０ｃｘｘＯ，５ｉｉ）上に筋をっけ、１．１
クロロホルム／メタノール＋２％アンモニアで２回展開
した。メタノールで溶出することにより標記化合物の溶
液を得た。
し、４つのシリカゲルプレート（２０ｘ２０ｃｍＸ０．
５５ｉＩＩ＋）上で再びクロマトグラフィーにかけ、５
：１ クロロホルム／メタノールで２回層ルオレセイン 上記実験で調製した保護トレーサーの全試料を１Ｍ炭酸
カリウム水溶液（１、Ｏｘｆ２）とともにメタノール（
２，０１１１１２）中で一夜撹拌することにより脱保護
した。２４時間後、分析薄層クロマトグラフィーにより
、保護トレーサーはほとんど全く残っていないことが示
された。この反応混合物を４つのシリカゲルプレート（
２０Ｘ２０ｃｘｘＯ，５ｉｉ）上に筋をっけ、１．１
クロロホルム／メタノール＋２％アンモニアで２回展開
した。メタノールで溶出することにより標記化合物の溶
液を得た。
ルボニル）コフルオレセイン
乾燥アセトニトリル（２，０靜）中の（Ｓ：）−１−（
４アミノフエニル）−２−［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミド］プロパン（７３ｍＬｉ、 ０．２８０
ミリモル）の溶液を、６−カルボキシフルオレセイン（
８４ｖｒ９．０．２２４ミリモル）、トリエチルアミン
（３９μρ、０．２８０ミリモル）およびビス（２オキ
ソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（
ＢＯＣ−ＣＩＸｌ ０７ｍ９．０４２０ミリモル）とと
もに室温で３日間撹拌した。（ＢＯＣ−ＣＩは最後に添
加した。反応は、おそらく撹拌１６〜１８時間後に完了
した。）プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（５：
１ クロロポルム／メタノール）により、それほど高い
Ｒｉ値の物質が観察されなかったので保護トレーサーへ
の約４０％の変換が示され、加水分解は示されなかった
。
４アミノフエニル）−２−［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミド］プロパン（７３ｍＬｉ、 ０．２８０
ミリモル）の溶液を、６−カルボキシフルオレセイン（
８４ｖｒ９．０．２２４ミリモル）、トリエチルアミン
（３９μρ、０．２８０ミリモル）およびビス（２オキ
ソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロライド（
ＢＯＣ−ＣＩＸｌ ０７ｍ９．０４２０ミリモル）とと
もに室温で３日間撹拌した。（ＢＯＣ−ＣＩは最後に添
加した。反応は、おそらく撹拌１６〜１８時間後に完了
した。）プレパラティブ薄層クロマトグラフィー（５：
１ クロロポルム／メタノール）により、それほど高い
Ｒｉ値の物質が観察されなかったので保護トレーサーへ
の約４０％の変換が示され、加水分解は示されなかった
。
この反応混合物を等容量のメタノールで希釈し、２つの
シリカゲルプレート（２０ｘ ２０ｃｍ×２ｚｚ）上に
すし状につけ、５：ｌ クロロホルム／メタノールで５
回展開した。ついで、各プレートからの０アセチル（メ
チル）アミド］プロパン水浴中で撹拌した無水トリフル
オロ酢酸（８ｇｇ）中の（Ｓ）−１−フェニル−２−［
）リフルオロアセチル（メチル）アミド］プロパン（２
，２９７９，９３８ミリモル）の溶液に、７０％硝酸（
０，６１５ｕＣ，９，５６ミリモル）を１０分間かけて
加えた。
シリカゲルプレート（２０ｘ ２０ｃｍ×２ｚｚ）上に
すし状につけ、５：ｌ クロロホルム／メタノールで５
回展開した。ついで、各プレートからの０アセチル（メ
チル）アミド］プロパン水浴中で撹拌した無水トリフル
オロ酢酸（８ｇｇ）中の（Ｓ）−１−フェニル−２−［
）リフルオロアセチル（メチル）アミド］プロパン（２
，２９７９，９３８ミリモル）の溶液に、７０％硝酸（
０，６１５ｕＣ，９，５６ミリモル）を１０分間かけて
加えた。
ついで、水浴中で３時間撹拌しながら反応を続けた。こ
の反応混合物を窒素流下に飛ばして乾燥させ、残渣を塩
化メチレンと５％重炭酸ナトリウムの間に分配した。つ
いで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固して
粗製の生成物（１，３９ｇ）を得、これを移動相として
ヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたフラッシュシリカゲルカ
ラム上で精製した。生成した３種の異性体のうち２−ニ
トロ化合物が最も移動し易く、４−ニトロ化合物が最も
移動しにくかった。クロマトグラフィーにより純粋な（
Ｓ）−１−（２−二トロフェニル）−２−［トリフルオ
ロアセチル（メチル）アミド］プロパン（２６０ｍ９）
および純粋な（Ｓ）−１−（４−：ｌ−ロフェニル）−
１−［トリフルオロアセチル（メチル）アミド］プロパ
ン（５１２ｘｙ）が分離され、これら化合物はカラムか
らほとんど混合画分中に出てきた。
の反応混合物を窒素流下に飛ばして乾燥させ、残渣を塩
化メチレンと５％重炭酸ナトリウムの間に分配した。つ
いで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固して
粗製の生成物（１，３９ｇ）を得、これを移動相として
ヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたフラッシュシリカゲルカ
ラム上で精製した。生成した３種の異性体のうち２−ニ
トロ化合物が最も移動し易く、４−ニトロ化合物が最も
移動しにくかった。クロマトグラフィーにより純粋な（
Ｓ）−１−（２−二トロフェニル）−２−［トリフルオ
ロアセチル（メチル）アミド］プロパン（２６０ｍ９）
および純粋な（Ｓ）−１−（４−：ｌ−ロフェニル）−
１−［トリフルオロアセチル（メチル）アミド］プロパ
ン（５１２ｘｙ）が分離され、これら化合物はカラムか
らほとんど混合画分中に出てきた。
（Ｓ）−１−（２−ニトロフェニル）−２−［）リフル
オロアセチル（メチル）アミトコプロパン（２４７Ｒ９
）をエタノール（１０Ｒρ）中に溶解し、パールシェー
カー上の１０％パラジウム木炭（２５１１ｇ）で水素化
した。１〜１７２時間後、濾過し、溶媒を除いて無色の
ガラス（２２０＋＋＋９）を得た。
オロアセチル（メチル）アミトコプロパン（２４７Ｒ９
）をエタノール（１０Ｒρ）中に溶解し、パールシェー
カー上の１０％パラジウム木炭（２５１１ｇ）で水素化
した。１〜１７２時間後、濾過し、溶媒を除いて無色の
ガラス（２２０＋＋＋９）を得た。
ン
ジメチルホルムアミド（ｏ、＋３ｚＱ、）中のカルボギ
ノフルオレセイン（コダック（Ｋｏｄａｋ）、５−異性
体と６−異性体との混合物、１０．０ｚｇ）の溶液を氷
−水浴中で冷却し、イソブチルクロロホルメＲので処理
することにより加水分解した。薄層シリカゲルプレート
上でクロマトグラフィーを行い、クロロホルム／メタノ
ール／アンモニアで展開することにより純粋な生成物を
得た。
ノフルオレセイン（コダック（Ｋｏｄａｋ）、５−異性
体と６−異性体との混合物、１０．０ｚｇ）の溶液を氷
−水浴中で冷却し、イソブチルクロロホルメＲので処理
することにより加水分解した。薄層シリカゲルプレート
上でクロマトグラフィーを行い、クロロホルム／メタノ
ール／アンモニアで展開することにより純粋な生成物を
得た。
上記実験と全く同様にして、（Ｓ）−６−［２−（２ト
リフルオロアセチル（メチル）アミド−１−プロピル）
フェニルアミノカルボニル］フルオレセインから標記化
合物を調製した。
リフルオロアセチル（メチル）アミド−１−プロピル）
フェニルアミノカルボニル］フルオレセインから標記化
合物を調製した。
上記実験と全く同様にして、（Ｓ）−１−（４ニトロフ
エニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル）アミ
トコプロパン（１０ｆｆ９）から２工程を経て標記化合
物を調製した。
エニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル）アミ
トコプロパン（１０ｆｆ９）から２工程を経て標記化合
物を調製した。
実施例３
（好ましいアンフェタミン免疫原）
−ト（１２ｆｆ９）およびトリエチルアミン（０，０１
２２１１ので処理した。この溶液を室温にゆっくり温め
ながら１〜４７３時間撹拌した。（Ｓ）−１−（２ニト
ロフエニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル）
アミトコプロパン（７，６ｚｆＩ）を別のツメチルホル
ムアミド（０，１３ｆｆＣ）中の溶液として加え、混合
物を周囲温度で１７時間撹拌した。この混合物をメタノ
ール（０，１３ｆｆＣ）および水（０，０３ｆｆ１２）
で希釈し、室温で２時間撹拌しながら濃アンモニア水溶
液（０，０３１１Ｑ）で加水分解した。窒素流下で揮発
性物質を除き、生成物を薄層シリカゲルプレート上のク
ロマトグラフィーにより単離し、クロロホルム／メタノ
ールで展開した。
２２１１ので処理した。この溶液を室温にゆっくり温め
ながら１〜４７３時間撹拌した。（Ｓ）−１−（２ニト
ロフエニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル）
アミトコプロパン（７，６ｚｆＩ）を別のツメチルホル
ムアミド（０，１３ｆｆＣ）中の溶液として加え、混合
物を周囲温度で１７時間撹拌した。この混合物をメタノ
ール（０，１３ｆｆＣ）および水（０，０３ｆｆ１２）
で希釈し、室温で２時間撹拌しながら濃アンモニア水溶
液（０，０３１１Ｑ）で加水分解した。窒素流下で揮発
性物質を除き、生成物を薄層シリカゲルプレート上のク
ロマトグラフィーにより単離し、クロロホルム／メタノ
ールで展開した。
（Ｓ）−５−［１（２−トリフルオロアセチル（メチル
）アミド−１−プロピル）フェニルアミノカルボニル］
フルオレセインの試料の半分の一方をメタノール（０，
４１１ｇ）中に溶解し、周囲温度で１６時間撹拌しなが
ら１Ｍ炭酸カリウム水溶液（０，２３−ニトロベンズア
ルデヒド（７，５６９，５０ミリモル）、ニトロエタン
（１１，２５９，１５０ミリモル）および酢酸アンモニ
ウム（４，２４Ｌ ５５ミリモル）からなる混合物を１
１０℃の油浴中の酢酸（２酎）中で２時間半加熱した。
）アミド−１−プロピル）フェニルアミノカルボニル］
フルオレセインの試料の半分の一方をメタノール（０，
４１１ｇ）中に溶解し、周囲温度で１６時間撹拌しなが
ら１Ｍ炭酸カリウム水溶液（０，２３−ニトロベンズア
ルデヒド（７，５６９，５０ミリモル）、ニトロエタン
（１１，２５９，１５０ミリモル）および酢酸アンモニ
ウム（４，２４Ｌ ５５ミリモル）からなる混合物を１
１０℃の油浴中の酢酸（２酎）中で２時間半加熱した。
その後、この混合物をプレパラティブ薄層クロマトグラ
フィー（ヘキサン／酢酸エチル）で調べたところ、出発
物質はほとんど残っていなかった。揮発性物質を回転蒸
発器で除き、残渣をジクロロメタンと水との間に分配し
、有機層を１０％重炭酸ナトリウムで２回洗浄した。第
１回目の重炭酸塩洗浄のときに気体が発生するので注意
が必要であった。硫酸マグネシウムで乾燥を行った。濾
過し、溶媒を除去して粗製の生成物（９，１３９）を得
た。この生成物の半分をフラッシュシリカカラム（３ｘ
３５ｃｍ）上でクロマトグラフィーにかけ、ヘキサンを
充填し、７：１ ヘキサン／酢酸エチルで溶出して純粋
な標記化合物（１，６ｆＮＪ、３２％）を得た。
フィー（ヘキサン／酢酸エチル）で調べたところ、出発
物質はほとんど残っていなかった。揮発性物質を回転蒸
発器で除き、残渣をジクロロメタンと水との間に分配し
、有機層を１０％重炭酸ナトリウムで２回洗浄した。第
１回目の重炭酸塩洗浄のときに気体が発生するので注意
が必要であった。硫酸マグネシウムで乾燥を行った。濾
過し、溶媒を除去して粗製の生成物（９，１３９）を得
た。この生成物の半分をフラッシュシリカカラム（３ｘ
３５ｃｍ）上でクロマトグラフィーにかけ、ヘキサンを
充填し、７：１ ヘキサン／酢酸エチルで溶出して純粋
な標記化合物（１，６ｆＮＪ、３２％）を得た。
１．０Ｍポラン−ＴＨＦ（２４ｚ（！、１４ミリモル）
を、窒素雰囲気下に氷／水浴中で冷却した乾燥１００ｍ
Ｑ容フラスコ中へ移した。乾燥ＴＨＰ（２２＋Ｑ）中の
１（３−ニトロフェニル）−２−二トロプ口ペン（１，
６６ｇ）の溶液を加え、ついで固体の水素化ホウ素ナト
リウム（＋５１１Ａｇ、４ミリモル）を加えた。顕著な
量の気体発生が生じ、５分以内の溶液の黄色は消えた。
を、窒素雰囲気下に氷／水浴中で冷却した乾燥１００ｍ
Ｑ容フラスコ中へ移した。乾燥ＴＨＰ（２２＋Ｑ）中の
１（３−ニトロフェニル）−２−二トロプ口ペン（１，
６６ｇ）の溶液を加え、ついで固体の水素化ホウ素ナト
リウム（＋５１１Ａｇ、４ミリモル）を加えた。顕著な
量の気体発生が生じ、５分以内の溶液の黄色は消えた。
水浴を除き、１５分間でフラスコを室温にもってきた。
ついで、７０℃の油浴中で８時間加熱した。（最大収量
のためには、７０℃の油浴中で８時間以上加熱する必要
あり）水（１，４Ｍ１２）を注意深く滴下することによ
り反応を停止させた。ついて、７０℃の油浴中で撹拌し
ながら混合物をさらに１時間加熱した。混合物から溶媒
を回転蒸発器により除き、残渣を０．５Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液とノクロロメタンとの間に分配した。ついて
、残渣を硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過し、溶媒
を除いて粗製の（Ｒ，５）３−（２−アミノプロピル）
ニトロベンゼン（１゜４８９）を得、これを精製する前
に以下のようにし線、２Ｈ）にングナルを示した。
のためには、７０℃の油浴中で８時間以上加熱する必要
あり）水（１，４Ｍ１２）を注意深く滴下することによ
り反応を停止させた。ついて、７０℃の油浴中で撹拌し
ながら混合物をさらに１時間加熱した。混合物から溶媒
を回転蒸発器により除き、残渣を０．５Ｍ水酸化ナトリ
ウム水溶液とノクロロメタンとの間に分配した。ついて
、残渣を硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過し、溶媒
を除いて粗製の（Ｒ，５）３−（２−アミノプロピル）
ニトロベンゼン（１゜４８９）を得、これを精製する前
に以下のようにし線、２Ｈ）にングナルを示した。
酢酸エチル（１０ｍｇ）中の３−（２−）リフルオロア
セトアミドプロプ−１−イル）ニトロベンゼン（＋５２
ｏ）の溶液を、３５ｐｓｉの過圧下、室温にて１０％パ
ラジウム木炭（２ｏｕｇ）とともにパールシューカー上
で振盪した。３０分以内に５ｐｓｉの圧力低下が起こり
、１時間１５分後にシェーカーから反応物を除いた。ケ
イソウ土パッドによる濾過によって触媒を除去し、溶媒
を除去して、定量的収量の標記化合物を透明な無電池と
して得た。
セトアミドプロプ−１−イル）ニトロベンゼン（＋５２
ｏ）の溶液を、３５ｐｓｉの過圧下、室温にて１０％パ
ラジウム木炭（２ｏｕｇ）とともにパールシューカー上
で振盪した。３０分以内に５ｐｓｉの圧力低下が起こり
、１時間１５分後にシェーカーから反応物を除いた。ケ
イソウ土パッドによる濾過によって触媒を除去し、溶媒
を除去して、定量的収量の標記化合物を透明な無電池と
して得た。
このものは、重水素化クロロホルム中で２００Ｍ１−（
ｚにおいて１．２（二重線、３Ｈ）、２．８（複雑な多
重線、２Ｉ（）、４．２（複雑な多重線、ＩＨ）、６゜
２（ブロードな一重線、ＩＨ）、６．６（幾つかの多重
線、３Ｈ）および７ 、．１ ｐｐｍ（見掛けの三重線
、ＩＨ）にＮＭＲシグナルを示した。
ｚにおいて１．２（二重線、３Ｈ）、２．８（複雑な多
重線、２Ｉ（）、４．２（複雑な多重線、ＩＨ）、６゜
２（ブロードな一重線、ＩＨ）、６．６（幾つかの多重
線、３Ｈ）および７ 、．１ ｐｐｍ（見掛けの三重線
、ＩＨ）にＮＭＲシグナルを示した。
ｄ、１−アンフェタミン免疫原
亜硝酸ナトリウム（１４，８ｘｇ、０．２１４ミリて保
護した。
護した。
上記粗製の（Ｒ，５）−３−（２−アミノプロピル）ニ
トロベンゼンの全試料をメタノール（１５ＩｌＩＣ）中
に溶解し、トリエチルアミン（１，３９ｍＣ１１０ミリ
モル）およびトリフルオロ酢酸メチル（１，２８９，１
，０１ｘ（２，Ｉ Ｏミリモル、■、２５当量）で処理
し、室温で２日と１７２日（必要以上に長く）撹拌した
。溶媒と過剰の試薬を除去して残渣（２，７４９）を得
、これをヘキサンを充填したフラッシュシリカカラム上
でクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン／酢酸エチルで
溶出した。純粋な（Ｒ，５）３−（２−）リフルオロア
セトアミドプロプ−１イル）ニトロベンゼンの収量は１
．０２２９Ｃ４７％）であった。このものは、ヘキサン
／酢酸エチルから再結晶した後の融点は１４１〜１４２
℃であった。重水素化クロロホルムおよび重水素化メタ
ノール混合物中での２００ＭＨｚにおけるＮＭＲスペク
トルは、■、３（二重線、３Ｈ）、２．９５（複雑な多
重線、２Ｈ）、４．３（複雑な多重線、ｌＨ）、７，６
（多重線、２Ｉ４）および８ 、１ ｐｐｍ（多重モル
）および３Ｍ塩酸水溶液（０，１５８靜）で処理するこ
とにより、（Ｒ，Ｓ）−３−（２−トリフルオロアセト
アミドプロプ−１−イル）アミノベンゼン（４８ｍｇ、
０．１９５ミリモル）を０℃の水（３ＩＩ＋のおよびア
セトン（２ｍ１２）中でジアゾ化した。１５分間撹拌し
た後、この混合物を、充分撹拌し水浴中で冷却した２Ｍ
水酸化ナトリウム（１２ｉｅ）中のウシチログロブリン
（２ｏ０ｉｇ）の溶液に加えた。窒素雰囲気下で室温に
て撹拌を一夜続けることにより保護基の除去を行った。
トロベンゼンの全試料をメタノール（１５ＩｌＩＣ）中
に溶解し、トリエチルアミン（１，３９ｍＣ１１０ミリ
モル）およびトリフルオロ酢酸メチル（１，２８９，１
，０１ｘ（２，Ｉ Ｏミリモル、■、２５当量）で処理
し、室温で２日と１７２日（必要以上に長く）撹拌した
。溶媒と過剰の試薬を除去して残渣（２，７４９）を得
、これをヘキサンを充填したフラッシュシリカカラム上
でクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン／酢酸エチルで
溶出した。純粋な（Ｒ，５）３−（２−）リフルオロア
セトアミドプロプ−１イル）ニトロベンゼンの収量は１
．０２２９Ｃ４７％）であった。このものは、ヘキサン
／酢酸エチルから再結晶した後の融点は１４１〜１４２
℃であった。重水素化クロロホルムおよび重水素化メタ
ノール混合物中での２００ＭＨｚにおけるＮＭＲスペク
トルは、■、３（二重線、３Ｈ）、２．９５（複雑な多
重線、２Ｈ）、４．３（複雑な多重線、ｌＨ）、７，６
（多重線、２Ｉ４）および８ 、１ ｐｐｍ（多重モル
）および３Ｍ塩酸水溶液（０，１５８靜）で処理するこ
とにより、（Ｒ，Ｓ）−３−（２−トリフルオロアセト
アミドプロプ−１−イル）アミノベンゼン（４８ｍｇ、
０．１９５ミリモル）を０℃の水（３ＩＩ＋のおよびア
セトン（２ｍ１２）中でジアゾ化した。１５分間撹拌し
た後、この混合物を、充分撹拌し水浴中で冷却した２Ｍ
水酸化ナトリウム（１２ｉｅ）中のウシチログロブリン
（２ｏ０ｉｇ）の溶液に加えた。窒素雰囲気下で室温に
て撹拌を一夜続けることにより保護基の除去を行った。
ついで、この溶液を２〜８℃の０．１Ｍ塩化ナトリウム
に対して透析した。
に対して透析した。
実施例４
小さなフラスコ中の（Ｓ）−１−フェニル−２［トリフ
ルオロアセチル（メチル）アミトコプロパン（１６４Ｒ
１？）に正味のりｏロスルホン酸（１，５ｍＱ）を加え
た。この溶液を周囲温度で１５分間撹拌し、ついで４０
℃浴中で１５時間加熱した。これを室温に冷却し、ジク
ロロメタン（４０ｕＱ）で希釈し、分液漏斗中で氷と飽
和塩化ナトリウム水溶液との混合物に注いだ。有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、シリカゲルの小ベツド
で濾過した。溶媒を除去してほとんど無色のガラス（１
７５ｍｇ）を得、このものは、重水素化クロロホルム中
において１．３（二つの二重線、末端メチル基に対して
）、２．０（２つの一重線および多重線、Ｎ−メチル基
およびヘンシルのメヂレン基に対して）、４．３および
４．９（小さな多重線および大きな多重線、メヂン基に
対して）、および７．４５（２つの多重線、パラ−２置
換芳香環に対して）および７ 、９５ ｐｐｍ（２つの
多重線、パラ−２置換芳香環に対して）でＮＭＲ共鳴を
示した。
ルオロアセチル（メチル）アミトコプロパン（１６４Ｒ
１？）に正味のりｏロスルホン酸（１，５ｍＱ）を加え
た。この溶液を周囲温度で１５分間撹拌し、ついで４０
℃浴中で１５時間加熱した。これを室温に冷却し、ジク
ロロメタン（４０ｕＱ）で希釈し、分液漏斗中で氷と飽
和塩化ナトリウム水溶液との混合物に注いだ。有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、シリカゲルの小ベツド
で濾過した。溶媒を除去してほとんど無色のガラス（１
７５ｍｇ）を得、このものは、重水素化クロロホルム中
において１．３（二つの二重線、末端メチル基に対して
）、２．０（２つの一重線および多重線、Ｎ−メチル基
およびヘンシルのメヂレン基に対して）、４．３および
４．９（小さな多重線および大きな多重線、メヂン基に
対して）、および７．４５（２つの多重線、パラ−２置
換芳香環に対して）および７ 、９５ ｐｐｍ（２つの
多重線、パラ−２置換芳香環に対して）でＮＭＲ共鳴を
示した。
ｄ−メタンフェタミンスルホンアミド免疫原ウシチログ
ロブリン（３９０１１ｇ）を０．１Ｍリン酸酸水素ナナ
トリウム１９．５Ｒの中に溶解し、ジメチルポルムアミ
ド（３９屑のを加えた。ついで、撹拌し、ついで、充分
撹拌し水浴中で冷却した水（２０酎）および１０Ｍ水酸
化ナトリウム水溶液（２１１１２）中のウシチログロブ
リン（２００ｘｙ）の溶液に滴下した。１５分間撹拌し
た後、この溶液を窒素雰囲気下に置き、キャップをし、
冷所にて一夜撹拌して保護基を完全に除去した。ｐ）（
を７に調節し、冷所にて０，１Ｍ食塩水に対して透析し
た。
ロブリン（３９０１１ｇ）を０．１Ｍリン酸酸水素ナナ
トリウム１９．５Ｒの中に溶解し、ジメチルポルムアミ
ド（３９屑のを加えた。ついで、撹拌し、ついで、充分
撹拌し水浴中で冷却した水（２０酎）および１０Ｍ水酸
化ナトリウム水溶液（２１１１２）中のウシチログロブ
リン（２００ｘｙ）の溶液に滴下した。１５分間撹拌し
た後、この溶液を窒素雰囲気下に置き、キャップをし、
冷所にて一夜撹拌して保護基を完全に除去した。ｐ）（
を７に調節し、冷所にて０，１Ｍ食塩水に対して透析し
た。
３位アゾ−ｄ−メタンフェタミン免疫原２位アゾ−ｄ−
メタンフェタミン免疫原に関する上記方法の前半部分と
同様にして、（Ｓ）ｉ（３−二トロフェニル）−２−［
）リフルオロアセデル（メチル）アミトコプロパン（３
４１１ｇ）から（Ｓ）１−（３−アミノフェニル）−２
−［トリフルオロアセチル（メチル）アミトコプロパン
の３０ｍｇ試料を調製した。同方法の後半部分と同様に
して、この物質（２９ｏ）とウシチログロブリン（１２
０ｘｇ）とから免疫原を調製した。
メタンフェタミン免疫原に関する上記方法の前半部分と
同様にして、（Ｓ）ｉ（３−二トロフェニル）−２−［
）リフルオロアセデル（メチル）アミトコプロパン（３
４１１ｇ）から（Ｓ）１−（３−アミノフェニル）−２
−［トリフルオロアセチル（メチル）アミトコプロパン
の３０ｍｇ試料を調製した。同方法の後半部分と同様に
して、この物質（２９ｏ）とウシチログロブリン（１２
０ｘｇ）とから免疫原を調製した。
４位アゾ−ｄ−メタンフェタミン免疫原３位アゾ−ｄ−
メタンフェタミン免疫原に関する」二層方法の後半部分
と同様にして、（Ｓ）−１ジメチルホルムアミド（３，
９＊ｆ２）中の（Ｓ）−１−（４クロロスルホニルフエ
ニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル）アミト
コプロパン（３９ｇ＠）の溶液を撹拌し、撹拌を周囲温
度にて一夜続けた。
メタンフェタミン免疫原に関する」二層方法の後半部分
と同様にして、（Ｓ）−１ジメチルホルムアミド（３，
９＊ｆ２）中の（Ｓ）−１−（４クロロスルホニルフエ
ニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル）アミト
コプロパン（３９ｇ＠）の溶液を撹拌し、撹拌を周囲温
度にて一夜続けた。
この溶液のｐＨを１０Ｍ水酸化ナトリウムで１３に調節
し、反応混合物をさらに１６時間撹拌してトリフルオロ
アセチル保護基を加水分解した。この物質を蒸留水に対
して透析した。
し、反応混合物をさらに１６時間撹拌してトリフルオロ
アセチル保護基を加水分解した。この物質を蒸留水に対
して透析した。
２位アゾ−ｄ−メタンフェタミン免疫原エタノール（１
０ｉＱ）中の（Ｓ）−１−（２−ニトロフェニル）−２
−［）リフルオロアセチル（メチル）アミトコプロパン
（２４７ｒ７）の溶液をバールシェーカー上にて１０％
パラジウム木炭（２５ｕ）で水素化し、（Ｓ）−１−（
２−アミノフェニル）−２［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミトコプロパン（２２０１１ｇ）を無色ガラス
として得た。
０ｉＱ）中の（Ｓ）−１−（２−ニトロフェニル）−２
−［）リフルオロアセチル（メチル）アミトコプロパン
（２４７ｒ７）の溶液をバールシェーカー上にて１０％
パラジウム木炭（２５ｕ）で水素化し、（Ｓ）−１−（
２−アミノフェニル）−２［トリフルオロアセチル（メ
チル）アミトコプロパン（２２０１１ｇ）を無色ガラス
として得た。
水（３酎）およびアセトン（０，５ｍＣ）中の上記アミ
ン（１０７ｇ９）および亜硝酸ナトリウム（３１ｏ）の
溶液を水浴中で冷却し、３Ｍ塩酸水溶液（０，３１１Ｑ
）で処理した。この混合物を冷所にて１５分間（４−ア
ミノフェニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル
）アミトコプロパン（９９，４ｍ９）とウシチログロブ
リン（２００η）とから表記免疫原を調製した。
ン（１０７ｇ９）および亜硝酸ナトリウム（３１ｏ）の
溶液を水浴中で冷却し、３Ｍ塩酸水溶液（０，３１１Ｑ
）で処理した。この混合物を冷所にて１５分間（４−ア
ミノフェニル）−２−［）リフルオロアセチル（メチル
）アミトコプロパン（９９，４ｍ９）とウシチログロブ
リン（２００η）とから表記免疫原を調製した。
実施例５
アンフェタミン／メタンフェタミンアッセイＡ、試薬
（１）全処理溶液−約０．２０過ヨウ素酸ナトリウム（
ｐＨ４，５）を含有する溶液 （２）トレーサー；実施例３で調製した好ましいトレー
サー（式ｑの化合物）および実施例４で調製した好まし
いトレーサー（式ｒの化合物）からなる。
ｐＨ４，５）を含有する溶液 （２）トレーサー；実施例３で調製した好ましいトレー
サー（式ｑの化合物）および実施例４で調製した好まし
いトレーサー（式ｒの化合物）からなる。
各化合物は、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシチログロブリン
を含有するｐＨ７，５の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、および０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中にあ
る。
を含有するｐＨ７，５の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、および０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中にあ
る。
（３）抗体：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０１％
アジ化ナトリウム、２％プロピレングリコールおよび１
５ｍｇ／ｍＱリボフラビン結合タンパク質中に適当に希
釈したアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンに対
して産生された抗血清からなるウサギまたはヒツジ抗血
清。
アジ化ナトリウム、２％プロピレングリコールおよび１
５ｍｇ／ｍＱリボフラビン結合タンパク質中に適当に希
釈したアンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミンに対
して産生された抗血清からなるウサギまたはヒツジ抗血
清。
（４）希釈緩衝液・０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７
，５，０，０１％ウシγ−グロブリンおよび０１％アジ
化ナトリウム。
，５，０，０１％ウシγ−グロブリンおよび０１％アジ
化ナトリウム。
（５）カリプレークー：０．１％アジ化ナトリウムとと
もに保存したｄ−アンフェタミンレベルが０゜００．０
１５．０３０．１．０，３．０および８０μｇ／ＩＮ夕
の正常ヒト尿プール （６）コントロール：０．５．１．５０または４．０μ
ｇ／ＩＩρのｄ−アンフェタミンを含有する、０１％ア
ジ化ナトリウムとともに保存した正常ヒト尿プール （７）洗浄液：０．４５％ＮａＣ１中に約５％のプロピ
レングリコールを含有する溶液 すべての偏光蛍光測定は、アボット・ラボラトリーズの
ＴＤｘクリニカル・アナライザーを用いて行った。
もに保存したｄ−アンフェタミンレベルが０゜００．０
１５．０３０．１．０，３．０および８０μｇ／ＩＮ夕
の正常ヒト尿プール （６）コントロール：０．５．１．５０または４．０μ
ｇ／ＩＩρのｄ−アンフェタミンを含有する、０１％ア
ジ化ナトリウムとともに保存した正常ヒト尿プール （７）洗浄液：０．４５％ＮａＣ１中に約５％のプロピ
レングリコールを含有する溶液 すべての偏光蛍光測定は、アボット・ラボラトリーズの
ＴＤｘクリニカル・アナライザーを用いて行った。
Ｂ、アッセイプロトコール
（１）等容量の未知試料および前処理溶液を前希する。
実施例６
過ヨウ素酸ナトリウム前処理
アボット・ラボラトリーズのＴＤｘクリニカル・アナラ
イザーを用い、上記実施例５Ｂに記載した前処理を行い
または行わずに、１００および１０００μｇ／１ｌＩＱ
のフェニルプロパツールアミンを含有する試料をアッセ
イした。このアッセイでは、式ａおよび弐ｇのアンフェ
タミン／ｄ−メタンフェタミントレーサーの組合わせ、
および式りおよび式Ｕで示される免疫原により産生され
た抗体を利用した。その結果を下記第６表に示す。
イザーを用い、上記実施例５Ｂに記載した前処理を行い
または行わずに、１００および１０００μｇ／１ｌＩＱ
のフェニルプロパツールアミンを含有する試料をアッセ
イした。このアッセイでは、式ａおよび弐ｇのアンフェ
タミン／ｄ−メタンフェタミントレーサーの組合わせ、
および式りおよび式Ｕで示される免疫原により産生され
た抗体を利用した。その結果を下記第６表に示す。
上記結果は、塩基のようなｌ）Ｈ上昇成分を加えること
なく試料を過ヨウ素酸ナトリウムで処理してもβ−ヒド
ロキンフェネチルアミン交差反応性を除去するのに有効
であり、アンフェタミン／メタンフェタミン蛍光偏光ア
ッセイなどの目的に有釈ウェル中にピペットで入れる。
なく試料を過ヨウ素酸ナトリウムで処理してもβ−ヒド
ロキンフェネチルアミン交差反応性を除去するのに有効
であり、アンフェタミン／メタンフェタミン蛍光偏光ア
ッセイなどの目的に有釈ウェル中にピペットで入れる。
充分な量の希釈緩衝液を加えて容量を５００μｇにもっ
ていく。
ていく。
この混合物を４〜６分インキュベートする。
（２）前希釈ウェルからの試料および抗体（２５μＱ）
をキュベツト中にピペットで入れる。バックグランドの
強度を読み取る。
をキュベツト中にピペットで入れる。バックグランドの
強度を読み取る。
（３）各２５μＱのトレーサーおよび抗体、および前希
釈ウェルからの試料をキュベツトに加える。
釈ウェルからの試料をキュベツトに加える。
充分な量の希釈緩衝液を加えて最終容量を２．０ｍＱに
もっていく。
もっていく。
（４）混合物の最終偏光蛍光強度からバックグランドの
偏光蛍光強度を差し引くことにより、抗体に結合したト
レーサーによるところの蛍光偏光を得る。
偏光蛍光強度を差し引くことにより、抗体に結合したト
レーサーによるところの蛍光偏光を得る。
（５）得られた偏光値は、各試料中のアンフェタミンお
よび／またはｄ−メタンフェタミン濃度に反比例する。
よび／またはｄ−メタンフェタミン濃度に反比例する。
（６）試料について得られた偏光値を、既知のアンフェ
タミンまたはｄ−メタンフェタミン含量のカリプレータ
ーを用いて作成した標準曲線と比較用であることを示し
ている。
タミンまたはｄ−メタンフェタミン含量のカリプレータ
ーを用いて作成した標準曲線と比較用であることを示し
ている。
以上、本発明を特定の具体例に基づいて記載してきたが
、当業者には本発明の範囲から逸脱しない限り数多くの
変更や変化を加え得ることが理解されるであろう。
、当業者には本発明の範囲から逸脱しない限り数多くの
変更や変化を加え得ることが理解されるであろう。
Claims (18)
- （１）（ａ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式１： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレ
ーサーの塩、 （ｉｉ）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される第二トレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第一トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第二トレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、ついで （ｂ）該第一抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第一トレーサーおよび該第二トレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定する ことを特徴とする、生物学的流体の試験試料中のアンフ
ェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの存在を
検出し、またはその量を決定する方法。 - （２）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量のヨウ素酸水溶
液を用い、アンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミン
に交差反応性のβ−ヒドロキシフェネチルアミンを除く
のに充分な時間該試料を前処理する請求項（１）記載の
方法。 - （３）リボフラビンによる蛍光妨害を減少させるのに有
効な量のリボフラビン結合タンパク質を該試料に加える
請求項（１）または（２）記載の方法。 - （４）（ａ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式２： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレ
ーサーの塩、 （ｉｉ）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される第二トレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第一トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第二トレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、ついで （ｂ）該第一抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第一トレーサーおよび該第二トレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定する ことを特徴とする、生物学的流体の試験試料中のアンフ
ェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの存在を
検出し、またはその量を決定する方法。 - （５）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ素酸水
溶液を用い、アンフェタミンおよびｄ−メタンフェタミ
ンに交差反応性のβ−ヒドロキシフェネチルアミンを除
くのに充分な時間該試料を前処理する請求項（４）記載
の方法。 - （６）リボフラビンによる蛍光妨害を減少させるのに有
効な量のリボフラビン結合タンパク質を該試料に加える
請求項（４）または（５）記載の方法。 - （７）（ａ）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ
素酸水溶液を用い、β−ヒドロキシフェネチルアミン交
差反応性を除くのに充分な時間該試料を前処理すること
によりβ−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応性を除
き、 （ｂ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式１： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレ
ーサーの塩、 （ｉｉ）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される第二トレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第一トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第二トレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、 （ｃ）該第一抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第一トレーサーおよび該第二トレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定し、ついで （ｄ）試薬分配手段を０．４５％ＮａＣｌ中の５％プロ
ピレングリコール溶液で洗浄して該分配手段への試料の
付着を最小にする ことを特徴とする、試料および試薬分配手段を有する自
動アッセイ装置を用いた蛍光偏光アッセイによる、生物
学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび／または
ｄ−メタンフェタミンを決定する方法。 - （８）（ａ）ｐＨ約４．０〜約７．５の有効量の過ヨウ
素酸水溶液を用い、β−ヒドロキシフェネチルアミン交
差反応性を除くのに充分な時間該試料を前処理すること
によりβ−ヒドロキシフェネチルアミン交差反応性を除
き、 （ｂ）生物学的流体の試験試料を （ｉ）式２： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレ
ーサーの塩、 （ｉｉ）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される第二トレーサーの塩、 （ｉｉｉ）アンフェタミンおよび該第一トレーサーを特
異的に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｉｖ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第二トレーサー
を特異的に認識し結合することのできる第二抗体 と混合し、 （ｃ）該第一抗体および該第二抗体にそれぞれ結合した
該第一トレーサーおよび該第二トレーサーの量を蛍光偏
光法により測定することによって該試料中のアンフェタ
ミンおよびｄ−メタンフェタミンの量を決定し、ついで （ｄ）試薬分配手段を０．４５％ＮａＣｌ中の５％プロ
ピレングリコール溶液で洗浄して該分配手段への試料の
付着を最小にする ことを特徴とする、試料および試薬分配手段を有する自
動アッセイ装置を用いた蛍光偏光アッセイによる、生物
学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび／または
ｄ−メタンフェタミンを決定する方法。 - （９）（ａ）式１： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレ
ーサーの塩、 （ｂ）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される第二トレーサーの塩、 （ｃ）アンフェタミンおよび該第一トレーサーを特異的
に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｄ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第二トレーサーを
特異的に認識し結合することのできる第二抗体 からなることを特徴とする、生物学的試料中のアンフェ
タミンおよびｄ−メタンフェタミンを決定するのに有用
な試薬キット。 - （１０）（ａ）式２： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される第一トレ
ーサーの塩、 （ｂ）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される第二トレーサーの塩、 （ｃ）アンフェタミンおよび該第一トレーサーを特異的
に認識し結合することのできる第一抗体、および （ｄ）ｄ−メタンフェタミンおよび該第二トレーサーを
特異的に認識し結合することのできる第二抗体 からなることを特徴とする、生物学的試料中のアンフェ
タミンおよびｄ−メタンフェタミンを決定するのに有用
な試薬キット。 - （１１）式１： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される構造を有
し、生物学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび
／またはｄ−メタンフェタミンの存在を検出し、または
その量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイに有用
なトレーサー試薬。 - （１２）式２： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される構造を有
し、生物学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび
／またはｄ−メタンフェタミンの存在を検出し、または
その量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイに有用
なトレーサー試薬。 - （１３）式３： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導
体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテ
ロ原子を５個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合
計０〜１５個有する結合基である）で示される構造を有
し、生物学的流体の試験試料中のアンフェタミンおよび
／またはｄ−メタンフェタミンの存在を検出し、または
その量を決定するための蛍光偏光イムノアッセイに有用
なトレーサー試薬。 - （１４）式ａ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｃ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｄ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｅ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｆ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｇ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｈ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼ または式ｊ： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される構造を有し、生物学的流体の試験試料中のア
ンフェタミンおよび／またはｄ−メタンフェタミンの存
在を検出し、またはその量を決定するための蛍光偏光イ
ムノアッセイに有用なトレーサー試薬。 - （１５）式４： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ’は水素原子、水酸基または離脱基、Ｚは＞
ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ＿２、Ｒはヘテロ原子を５
個まで含み、炭素原子およびヘテロ原子を合計０〜１５
個有する結合基である）、 式５： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ’、ＺおよびＲは前記と同じ） または式６： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ’、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される構造を有する、トレーサー前駆体化合物。 - （１６）式７： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ”はポリアミノ酸、ポリアミノ酸誘導体また
は他の免疫原担体、Ｚは＞ＮＨ、＞Ｃ＝Ｏまたは＞ＳＯ
＿２、Ｒはヘテロ原子を５個まで含み、炭素原子および
ヘテロ原子を合計０〜１５個有する結合基である） 式８： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ”、ＺおよびＲは前記と同じ） または式９： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｑ”、ＺおよびＲは前記と同じ） で示される構造を有する、免疫原化合物。 - （１７）式ｔ： ▲数式、化学式、表等があります▼ または式ｕ： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される構造を有する請求項（１６）記載の化合物。
- （１８）式ｖ： ▲数式、化学式、表等があります▼ または式ｗ： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される構造を有する免疫原前駆体化合物。
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