JPH01222783A

JPH01222783A - 固定化生体触媒の製造方法

Info

Publication number: JPH01222783A
Application number: JP4912588A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Asakura; 哲郎朝倉
Original assignee: Japan Vilene Co Ltd
Current assignee: Japan Vilene Co Ltd
Priority date: 1988-03-01
Filing date: 1988-03-01
Publication date: 1989-09-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、繊維状蛋白質担体に酵素、補酵素、微生物な
どの生体触媒を化学的に結合した固定化生体触媒の製造
方法に関する。

［従来の技術及び問題点］近年、生体触媒、特に酵素を担体に固定化し、バイオセ
ンサーやバイオリアクターなどとして、医療分野や環境
工業分野あるいは食品工業分野に利用するために、種々
の開発が行われている。

これら開発の中では、繊維状担体に酵素を固定化するこ
とも試みられており、繊維に酵素の機能を付加する考え
に基づいたもの、例えば縫合糸や人工血管の材料に適し
た生体との適合性のある繊維や、酵素の機能を繊維の形
状で発現する考えに基づいたもの、例えば布状や紙状へ
の加工のしやすい固定化酵素の開発が行われている。

従来、この繊維状担体に酵素を固定化したものとしては
、シェービング屑、牛皮粉砕物、絹ブイプロインからな
る群から選択される繊維性蛋白質。

担体に酵素を固定化したもの（特公昭６０−９９０号）
が知られており、ここでは繊維性蛋白質担体中のカルボ
キシル基を用いてアジド誘導体を生成し、酵素と反応さ
せる、いわゆるアジド法により固定化酵素が製造されて
いる。

このアジド法は種々の生体触媒や微生物菌体を蛋白質担
体に固定化できる優れた方法であるが、このアジド誘導
体の生成及び、アジド誘導体と生体触媒の反応において
、反応できる温度範囲か狭い上に、通常水冷下で反応を
行うため、温度管理が難しかった。また、繊維性蛋白質
担体、とくに絹フィブロインでは反応サイトとなる官能
基の数が少ないという問題もあった。

これらの問題を解決するべく、本発明者が研究を重ねた
結果、繊維状蛋白質担体にジアゾ基を導入し、これと生
体触媒とを反応させる方法において、生゛体触媒をある
特定の条件下で反応させた場合、固定化された酵素の安
定性が非常によく、かつ室温付近の広い温度で反応が進
むという知見を得て本発明を完成するに至った。

［発明の構成］本発明は、芳香族系アミノ基を有する繊維状蛋白質担体
を無機酸と亜硝酸ナトリウムによりジアゾニウム化合物
とした活性化繊維状蛋白質担体を、フェノール基、アミ
ノ基、イミダゾール基の群から選択される官能基を有す
る生体触媒１〜３ｍｇ／ｌを含む緩衝液に浸漬し、約１
〜４時間室温で反応させることを特徴とする固定化生体
触媒の製造方法に関する。

本発明に使用される繊維状蛋白質担体には絹繊維（絹フ
ィブロイン、絹セリシン）、コラーゲン、ケラチンなど
があるが、これら繊維状蛋白質担体はその構造内に芳香
族系アミノ基を有するか、あるいはその構造内に芳香族
系アミノ基が誘導されたものでなければならない、この
芳香族系アミノ基の誘導は、例えば繊維状蛋白質担体内
のチロシン残基中にあるフェノール基のオルト位の水素
原子をニトロ基に置換し、更にこのニトロ基をアミノ基
に還元することにより行われる。ここで、フェノール基
のオルト位の水素原子をニトロ基に置、換するには、例
えば繊維状蛋白質担体に−ａ硫酸−湛硝酸の混酸を作用
させることにより行われ、ニトロ基のアミノ基への還元
は、例えば亜ニチオン酸ナトリウム、水素化リチウムア
ルミニウムなどの還元剤を用いることにより行われる。

とくに絹ブイプロインはその構造内にフェノール基を有
するチロシン残基を多く有するため、この方法は有効で
ある。

この芳香族系アミノ基を有する繊維状蛋白質担体は無機
酸、例えば希塩酸と亜硝酸ナトリウムと反応させられ、
ジアゾニウム化合物、すなわち活性化繊維状蛋白質担体
となる。

このようにして得られた活性化繊維状蛋白質担体は、フ
ェノール基、アミノ基、イミダゾール基の群から選択さ
れる官能基を有する生体触媒１〜３ｍｇ／＋ｗｌを含む
緩衝液に浸漬し、約１〜４時間室温で反応させられる。

ジアゾニウム化合物がカップリング反応によりジアゾ結
合を形成するためには、力・ンブリング成分にフェノー
ル基、アミノ基、イミダゾール基のうち何れか一つの官
能基があることが必要であるから、生体触媒にはフェノ
ール基、アミノ基、イミダゾール基の群から選択される
官能基を有するものが用いられる。この生体触媒として
は、アスパルターゼ、アミラーゼ、インベルターゼなど
の酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、アデ
ノシントリホスフェート、補酵素−Ａなどの補酵素が好
適に用いられるが、とくに固定化における安定性に優れ
たアルカリ性フォスファターゼが望ましい。

また、ここで、緩衝液が使用されるのは、生体触媒の活
性化繊維状蛋白質担体への固・電化に際し、この固定化
のための両者の合成反応及び生体触媒の安定性がｐＨの
影響を受けやすく、適正なｐＨ範囲以外では生体触媒の
活性が著しく低下するからである。例えば、生体触媒と
してアルカリ性フォスファターゼが用いられる場合、緩
衝液としては、ｐＨ７，５〜８．０に調製された０、０
５Ｍの硼酸ナトリウム−塩酸バッファー、０．０５Ｍの
硼酸−塩酸バッファーなどを使用するのが望ましい。

この緩衝液には生体触媒が予め溶解されるが、その生体
触媒濃度は１〜ｂる。これは、１ｍ３／ｍ１未満では生体触媒の固定化量
が少なくなるため、当然活性は低くなり、３ｎ＋ｇ／ｌ
を超えると生体触媒が過剰量となって、互いに反応を阻
害するため、やはり活性は低下するからである。

なお、上記緩衝溶液における活性化繊維状蛋白質担体と
生体触媒との反応時間は１〜４時間とする必要がある。

ここで、反応時間が４時間以下とされるのは、本発明の
活性化繊維状蛋白質担体のジアゾ基が非常に活性の高（
°１官能基、言い換えれば不安定な官能基であり、素早
く反応させる必要があり、また、生体触媒も余り長い時
間反応溶液中に存在することは好ましくないからである
。−方、反応時間が１時間以上とされるのは、これ未満
では固定化が十分に進まないからである。

この様にして得られた固定化生体触媒は活性が十分維持
されており、生体触媒の安定性に優れる利点を有する。

特に高温域における熱安定性には優れており、固定化さ
れていない生体触媒や、他の製法により固定化された生
体触媒が失活してしまう６５℃という高温であってもあ
る程度の活性を維持することができる。

また、上記の反応において、生体触媒の安定性は反応温
度が室温の比較的広い温和な条件範囲で保証され、アジ
ド法の場合のように水冷下で行う等の温度管理の難しさ
はない、なお、ここで室温とは１〜３５℃（ＪＩＳに−
００５０による）の範囲の温度をいう。

（実施例１）家蚕面を０．５％のクエン酸水溶液で、浴比５０ｆ＆に
て１００℃、３時間の精練を施した後、蒸留水でよく洗
浄、乾燥して絹フィブロインを得た。

この絹フィブロインを濃硫酸−濃硝酸−蒸留水（１：　
１　：２〜３）の混合液に数秒間浸漬して、絹ブイプロ
インのチロシン残基側鎖にニトロ基を導入した。

このニトロ化した絹フィブロインを、蒸留水でその洗液
が中性を示すようになるまでよく洗浄した後、絹フィブ
ロインのチロシン残基に対して２０倍モルの亜ニチオン
酸ナトリウムとｐＨ８〜１０のバッファー中で常温で約
１時間反応させ、ニトロ基を還元してアミノ基にした。

次いて、このアミノ化絹フィブロインを蒸留水でよく洗
浄、乾燥させた後、水冷下で１Ｍ塩酸中に浸漬し、これ
に攪拌しながら０．５Ｍ亜硝酸ナトリウム溶液を徐々に
滴下し、１時間反応させてジアゾ化合物を得た。

このジアゾ化合物、すなわち活性化した絹フィブロイン
を、蒸留水及びｐＨ７，５（７）　０．０５Ｍ　？ｊＩ
ｍ　ナトリウムバッファーで洗浄した後、アルカリ性フ
ォスファターゼ２ｍｇ／ｌを含むｐＨ７，５の０．０５
Ｍ硼酸ナトリウムバッファーに、浴比１ｔａｇ７ｃｃで
浸漬して、温度３０℃で１時間反応させ、アルカリ性フ
ォスファターゼを絹フィブロインに固定した。

この固定化アルカリ性フォスファターゼを、１Ｍ塩化カ
リウム水溶液中に４℃で３時間浸漬して塩類処理を行い
、更に、０．５Ｍグリシン溶液と４℃で１時間反応させ
１．フリーのジアゾ基をブロックした。

得られた固定化アルカリ性フォスファターゼの活性を、
基質としてｐ−ニトロフェニルフォスフェートを用いて
酵素反応を行い、ｐ−ニトロフェノールの生成量を分光
光度計を使用して４００ｎｍの吸収強度でモニターする
ことにより調べたところ、広範囲な使用温度及びｐ　Ｈ
にわたって、固定化されていないアルカリ性フォスファ
ターゼとほぼ変わらない活性を示し、その安定性が非常
に優れていた。とくに、使用温度６５℃においては、固
定化されていないアルカリ性フォスファターゼは失活し
てしまうのに、固定化アルカリ性フォスファターゼは約
２０〜２５％（２５℃での活性を１００とした場合の相
対活性）の活性を残しており、高温域における安定性に
優れていた。

なお、上記固定化反応において反応温度を４〜３０℃の
範囲で変化させたところ、いずれの温度においても活性
は８０％以上に維持されており、安定性に問題はなく、
とくに３０℃に近ずくほどこの活性は高かった。

（実施例２〜３．比較例１〜２）実施例１で用いた緩衝液に代えて、第１表に示す緩衝液
を各々用いた事以外は、実施例１と全く同様にして固定
化アルカリ性フォスファターゼを製造した。

得られた固定化アルカリ性フォスファターゼの活性を実
施例１と同様にして調べ、実施例１の活性を１００とし
て、その相対活性を第１表に示した。

第１表から明らかな様に、緩衝液のｐＨが７．５〜８．
０の間では相対活性は８８％以上に維持されており、安
定しているが、これらの範囲からはずれると活性が２５
％以下と著しく低下し、不安定になることがわかる。

［以下余白］第１表本Ｔｒｉｓはｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙ　ｎ＋ｅｔｈｙ
ｌ）ａｍｉｎｏ　ｎ＋ｅｔｈａｎｅ（２−７ミノ２−ヒ
トー〇Ｎシメチト１．３）００ハ０ンシーオーｎ）　の
略（実施例４〜５．比較例３）実施例１でのアルカリ性フォスファターゼとジアゾ化絹
フィブロインとの反応時間を、第２表に示す各々の反応
時間に代えて反応させた事以外は、実施例１と全く同様
にして固定化生体触媒を製造した。

得られた固定化アルカリ性フォスファターゼの活性を実
施例１と同様にして調べ、実施例１の活性を１００とし
て、その相対活性を第２表に示した。

第２表から明らかな様に、反応時間が１〜４時間の間で
は活性は８２．５％以上に維持されており、安定してい
るが、（Ｌ５時間では活性が４０％以下と著しく低く、
不安定になることがわかる。

［以下余白］第２表（実施例６〜７）実施例１でのアルカリ性フォスファターゼの緩衝溶液中
での濃度を、第３表に示す各々の濃度に代えた事以外は
、実施例１と全く同様にして固定化生体触媒を製造した
。

得られた固定化アルカリ性フォスファターゼの活性を実
施例１と同様にして調べ、実施例１の活性を１００とし
て、その相対活性を第３表に示した。

第３表から明らかな様に、生体触媒濃度が１〜３ｍｇ／
＋ａｌの間では活性は５０．８％以上に維持されており
、使用可能な範囲と考えられる。

第３表［発明の効果］以上、説明したように、本発明の固定化生体触媒の製造
方法は、生体触媒を繊維状蛋白質担体に固定化するため
の新規な方法であり、反応温度が室温付近の、比較的広
い温和な条件Ｗ！囲で固定化が行え、しかも生体触媒の
活性が十分維持された、安定した状態で生体触媒を固定
化することができる。また、この方法によれば、高温域
における熱安定性に優れた固定化生体触媒を得ることが
できる。

とくに、繊維状蛋白質担体に絹フィブロインを用いる場
合、絹フィブロインにはチロシンが５〜６％と比較的多
く存在するので、ジアゾ基を導入するためのチロシン残
基側鎖のフェノール基が豊富にあり、特別な表面処理等
をしなくても、そのまま担体として使用することができ
、しかも、チロシン残基側鎖のみをジアゾ基が修飾する
ため、他のアミノ酸側鎖や末端゛に固定化されないから
、反応条件をコントロールすることによって、使用目的
に応じた活性が得られる。

また、化学修飾によって導入したジアゾ基は生体触媒の
固定化反応と同時に分子内架橋を起こすため、生体触媒
固定化後の担体の強度が向上する。

更には、Ｍ！繊維状蛋白質担体とくに絹フィブロインの
生体適合性などの利点は、そのまま維持されており、こ
れらの性質も有効に利用できる。

従って、本発明は、バイオセンサー、バイオリアクター
、生体適合材料などに適した固定化生体触媒を生産性良
く製造できる極めて有用な方法である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）芳香族系アミノ基を有する繊維状蛋白質担体を無
機酸と亜硝酸ナトリウムによりジアゾニウム化合物とし
た活性化繊維状蛋白質担体を、フェノール基、アミノ基
、イミダゾール基の群から選択される官能基を有する生
体触媒１〜３ｍｇ／ｍｌを含む緩衝液に浸漬し、約１〜
４時間室温で反応させることを特徴とする固定化生体触
媒の製造方法。
（２）繊維状蛋白質担体が絹フィブロインである請求項
１記載の固定化生体触媒の製造方法。
（３）生体触媒がアルカリ性フォスファターゼである請
求項１または２記載の固定化生体触媒の製造方法。