JPS5934354B2 - 固定化耐熱性酢酸キナ−ゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な固定化耐熱性酢酸キナーゼおよびその製
造方法１こ係る。

アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）またはその誘導体もし
くはアデノシンジリン酸（ＡＤＰ）またはその誘導体（
以下これらを総称する場合、アデニンコファクター類と
いう）は酵素反応の補助基質として非常に重要である。

例えば、酵素へキソキナーゼ゛を使用してＤ−グリコー
スをグリコース６リン酸ｒこ転化する際には、補助反応
としてＰＴＰｌ）Ｓ必須であり、その他多くの酵素反応
ｔこおいてアデニンコファクター類／）５必須であるこ
とｂＳ良く知られている。

一方、これらアデニンコファクター類をエネルギー源と
して工業的に利用するため１こは、これらコファクター
類を、その活性を損うことなし］こ、相互変換すること
ｌ）５重要な課題であり、かつアデニンコファクターを
相互変換する方法が長期間安定１こ機能することも工業
的ｌこ重要である。

このよう１こ、酵素反応１こおけるエネルギー源として
重要なアデニンコファクター類の相互変換反応を触媒す
る酵素はホスホトランスフェラーゼとして知られ、中で
も酢酸キナーゼが特に有効であることが知られている。

酢酸キナーゼは多数の微生物ｆこより生産されている。

例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ−ｉ ｃｈ
１ａｃｏ ｌ ｉ） 、ベイロネラ・アルカレツセン
ス（Ｖｅｉ １ｌｏｎｅｌｌａ ａｌｃａｌｅｓｃｅｎ
ｓ）などが代表的な微生物の例であり、またバチルス°
ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｅ−
ａｒ□ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｊ−Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 。

８４．１９３（１９７８）、特開昭５２−２５０８８号
公報参照〕、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍ−ｏａｃＩｅｔｉ
ｃｕｍ）（Ａｒｃｈｉｖ 、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ 、
。

１００．１２１（１９７４））などにより耐熱性酢酸キ
ナーゼｔＪＳ生産されることが知られている。

これら酢酸キナーゼは以下のような反応を触媒する３Ａ
ＤＰ＋アセチルリン酸二ＡＴＰ十酢酸 −万、工業的合成反応に酵素を利用した場合、その特異
性に基き種々の利点のあることが知られている。

例えば、立体異性をも含めて副反応がなく、従って不要
な環境破壊性物質を幅生ずることがなく、高収率を達成
することｌ）′５でき、かつ反応条件も温和（常温、常
圧）であり、省エネルギーの課題を満足する。

しかし’ｅｂｂｓら、酵素反応は上記の如き利点を有す
る一方で、酵素が水溶性であるために、反応終了後膣酵
素を回保し再利用すること、および連続酵素反応を行う
ことが困難であるなどの欠点を有する。

更に、酵素は極めて高価であるから、これを工業的に利
用するため１こは上記の欠点を克服することが重要な課
題である。

このような酵素の有する欠点を改良、克服するｒコめ１
こ、当業界では既ｌこ数多くの研究がなされ、いくつか
の方法が提案されている。

その中で最も有力なものは酵素を水不溶性担体上に固定
する方法であり、これ１こついては、例えばオスカー等
（Ｏｓｋｅｒ ｅｔ ａｌ、）の［固定化酵素（１
ｍｍｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ）ＪＣＲＣ刊（１
９７３）および千畑一部編「固定化酵素、」講談社（１
９７５）ｒ、（どに詳しい記載ｂ５ある。

また、酢酸キナーゼについても工業的利用のためｉこは
該酵素を固定化すべきであることｌ）Ｓ提案されている
（酵素と工業」、３５巻、１号、３〜１０頁昭和５２年
）。

しかしながら、酵素は熱、酸、アルカリ等の固定化にお
ける諸条件１こ対して極めて不安定であり、かつ酵素の
性質は専ら酵素分子の微妙な高次構造に由来しており、
故に該高次構造が固定化により必然的に影響を受ける。

このことは酵素の工業的利用を妨げる別の因子となって
いたのである。

即ち、固定化により酵素の触媒機能６１増大した例６ｉ
知られている一方で、逆の例も多数知られている。

また、酵素の固定化によりその固有の性質がまったく失
われた例、その特異性が変化した例なども報告されてい
る（「酵素と工業−１，３５巻、７頁、昭和５２年）。

加うる１こ、酵素はこれを生産する生物種によってそれ
ぞれ分子構造を幾にし、かつこの微妙な構造はその置か
れた環境条件によって容易に変化する。

酢酸キナーゼ１こついても同様であり、例えばＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌ ｉｂ５生産するものは分
子量約５０．．０００の１本のポリペプチド鎖からなり
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓの生産するものは分子量約１６０，０００で４
本のポリペプチド鎖からなり（Ｊ、Ｂｉｏｉ 、Ｃｈｅ
ｍ、、８土、１９３（１９７８））、Ｖｅｉｌｌｏｎｅ
ｌｌａ ａｌ−ｃａｌｅｓｃｅｎｓの生産するものは
分子量約４０．０００の２本のポリペプチド鎖からなる
（ Ｊ−Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、 ２５１ 、３１１７
（１９７６））ことが知られている。

また、例えばＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ の
先度する酵素分子中１こはＳＨ基ｔ）Ｓ存在すると考え
られるｔ’ｓ、 Ｂ。

ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生産するもの
ｔこはＳＨ基ｂ５存在しない（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ
、、８４．１９３（１９７８）、ｌなど、分子構造はそ
の起源によって異る。

結局、現時点に８いては、固定化方法と固定化酵素との
間ｆこはいかなる規則性も見出されておらず、固定化処
理前の酵素の性質、例えば耐熱性、から固定化処理後の
固定化酵素の触媒機能、特異′性、活性の長期安定性な
どの諸性質を予測することが不可能（例えば、前出「固
定化酵素」１０７頁参照）であるため１こ、固定化する
こと（こよって安定な固定化酵素が得られるか否かを、
各酵素について試行錯誤【こより検討しなければならな
かった。

事実、酢酸キナーゼの固定化の研究はほとんどなされて
おらず、数少ない例としてＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド基を含有するポリアクリルアミドゲル １酢酸キナーゼを固定化する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，４４、８ ８ ７ （ １９
７６）、１が知られているが、この方法では固定化の際
「こ高価な失活防止剤（ジチオスレイトール）を共存さ
せ、かつアクリルアミドが固相化する極短時間の間に該
酢酸キナーゼを非酸化性雰囲気中に添加するという、微
妙で熟練を要する操作を必要としていた。

更１こ、固定化されなかった酢酸キナーゼを回収し再利
用することも、失活が太きいためＦこ実賃上不可能であ
り、経済性の点からも不利であった。

また、上記の如き経済性、操作上の不利を押して固定化
を実施する場合には、０℃近辺の低温条件下で行わねば
ならないため１こ経済的１こ一層不利であった。

一層、本発明者は既１こＢＱＳｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ−
ｏｐｈｉｌｕｓの生産する耐熱性酢酸キナーゼ１こつい
て、上記諸欠点を克報しｆコ該キナーゼの固定化方法を
確立し、ている（特開昭５６−１５４９９２参照）。

本発明者等は、種々の固定化法を検討した結果、特に酢
酸キナーゼの場合１こは、一定の耐熱性の要件を満足す
る酢酸キナーゼを使用することでより、固定化後も長期
１こ亘り活性を維持しかつ安定な固定化酵素を得ること
が可能であることを見出し本発明を完成するに到った。

そこで 本発明の目的は耐用寿命の長い、経済性、活性
の憂れた新規な固定化酢酸キナーゼを提供することであ
る。

本発明の他の目的は前記諸欠点を改良かつ克服し、汎用
性、経済性、作業性の優れた酢酸キナーゼの固定化方法
を提供することである。

本発明の更に別の目的ならびに特徴は以下の記載から明
らかとなろう。

即ち、本発明はクロストリジウム・サーモアセチカム（
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔ −
ｉ ｃ ｕｍ ）またはシュードモナス・サーモアミノ
リティカスＶ−２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅ
ｒｍ−ｏａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓＶ ２）の１菌株
の生産する耐熱性酢酸キナーゼと水不溶性固定化用担体
とからなる、固定化耐熱性酢酸キナーゼに関する。

本発明において使用する耐熱性酢酸キナーゼは至適生育
温度が約５０〜８５℃、好ましくは６０〜８５℃なる範
囲内である微生物ｆ３ｓ生産する酢酸キナーゼである。

本発明でいう「耐熱性」とは、精製した酢酸キナーゼを
ｐＨ６，５〜８．０の５０ ｍＭ緩衝液中で５０°Ｃｆ
こて１５分間処理した後、測定した活性〔測定法の詳細
はＪ 、Ｂｉ ｏｌ 、Ｃｈｅｍ、 、２４９ 、２５
６７（１９７４）を参照〕が処理前の活性の少なくとも
約９０％、好ましくは９５％以上、最適には１００％を
保持していることを意味するものとする。

かかる耐熱性の要件を満足する酢酸キナーゼとしては、
例えばＢ、ｓ ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ −
ｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔ
ｙｃｕｍ。

ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｌ
ｙｔｉｃ−ｕｓＶ２ｒ、（どにより生産されるものを挙
げることができ、グリコース、サッカロースまたはリン
ゴ酸などの炭素源および／またはペプトン、肉エキス、
アミノ酸などの窒素源、必要ｆこより無機塩類および／
またはビタミンなどを含む通常使用される培地（例えば
、特開昭５２−２５０８８号公報参照）で該微生物を培
養し、常法に従って精製すること１こより容易に得るこ
とができる。

また、本発明で使用する水不溶性担体としては、本質的
ｌこ水に不溶な化学物をいい、例えばセルロース、デキ
ストラン、アガ七−ス、デンプンなどの多糖類の誘導体
；ポリ酢酸セルロース、ポリビニルアルコールの誘導体
；ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ
ビニルクロリド、ポリ（メチルメタクリル酸）エステル
、ポリブデン、ポリペンテン、ポリビニルデ゛ンクロリ
ド、ポリ（メク）アクリロニトリル、ポリメタクリル酸
、ポリアクリル酸、ポリアミノスチレン、ポリブタジェ
ン、ポリイソプレン、ポリマレイン酸モノメチル、架橋
性ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリビニ
ルアミン、ポリ（ジアルキルアミノエチルメタクリル酸
エステル）、ポリ（ジアルキルアミノメチルスチレン）
、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルピロリドン）
、ポリアクリル酸無水物、ポリメタクリル酸無水物、ポ
リマレイン酸無水物、ポリ（トリフルオロエチレン）ポ
リ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（ジビニルベンゼ
ン）、ポリ（α−メチルスチレン）、ポリ（Ｎ−ビニル
アミン）、ポリ（テトラメチレンクリコールシヒニルエ
ーテル）、ポリビニルスルホン、ポリビニルスルホキシ
ド、ポリアクロレイン、ポリメチルビニルケトンなどの
不飽和炭素を含む単量体からなる重合体；ポリフェニレ
ンオキシド、ポリメチレンオキシＰ１ ポリエチレンオ
キシド、ポリテトラメチレンオキシドなどのポリエーテ
ル類；ポリアラニン、ポリフェニルアラニンなどのポリ
ペプチド類；ナイロン−３、ナイロン−４、ナイロン−
６、ナイロン−７、ナイロン−１１、ナイロン−１２、
ナイロン−６，６、ナイロン−６、ｔｏ、ポリ（ｍ−フ
ェニレンイソフタルアミド、ポリ（ｐ−フェニレン−テ
トラフタルアミド）などのポリアミド；テレフタル酸、
イソフタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、ト
リメリット酸などのポリカルボン酸と、エチレングリコ
ール、フロピレンゲリコール、フチレンクリコール、ペ
ンタエリスリトール、ビスフェノールＡ／、、Ｃどのポ
リオールとのポリエステル類；グリコール酸、乳酸、ヒ
ドロキシピバリン酸などから得られるポリエステル：ジ
メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン
、メチルビニルポリシロキサン、シアノアルキルメチル
シロキサン、フルオロアルキルメチルポリシロキザンな
どの７リコンゴム；トルエンジイソシアネート、キシレ
ンジイソシアネート、フェニレンジイソシアネート、エ
チレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシア
ネート、トルエントリイソシアネートなどのポリイソシ
アネートと、ポリエチレンクリコール、ポリプロピレン
グリコール、両末端にＯＨ基を有するポリエステルなど
のポリオールとのポリウレタン類；フェノール、ホルム
アルデヒド樹脂、キシレン・ホルムアルデヒド樹脂、尿
素°ホルムアルデヒト樹脂、メラミン・ホルムアルデヒ
ド樹脂などのホルムアルデヒド樹脂；ポリイミド、ポリ
ベンズイミダゾール、ポリチアゾールなどの４員環を含
むポリマー；ポリカーボネート、ポリスルフオンなどの
その他の合成ポリマー類；ガラス、アスベスト、クレー
、マイカ、ヒドロキシルアパタイト、活性炭、シリカゲ
ル、アルミナなどの無機物ならびｌこその誘導体；およ
びポリフォスフアゼンなどの合成無機ポリマー等を挙げ
ることができる。

本発明の固定化用担体は種々の形状、例えば粒状、繊維
、中空体状、フィルム、シートであり得る。

従って、本発明の固定化耐熱性酢酸キナーゼは撹拌槽、
充填槽、流動槽、管状並びｆこ膜状反応器などとして、
アデニンコファクター類の相互変換に利用することがで
きる。

一方、本発明１こおいては、耐熱性酢酸キナーゼは以下
のような方法ｆこ従って固定化することができる。

即ち、クロストリジウム・サーモアセチカムまたはシュ
ードモナス・サーモアミノリティカスＶ−２の１菌株の
生産する耐熱性耐酢キナーゼと、予め活性化した水不溶
性固定化用担体とを反応させることを特徴とする。

耐熱性酢酸キナーゼの固定化方法。

一般に、酵素を固定化する方法として、共有結合法、イ
オン結合法、物理的吸着法および包括法等が知られてい
る（前出の「固定化酵素」参照）。

また、■−アルキルー２−ハロピリジニウム塩を使用す
る新規な共有結合法を採用することもできる。

まず、共有結合法としては、例えばカルボキシル基を有
する水不溶性担体を１−アルキル−２−ハロピリジニウ
ム塩によって処理し、該担体を対アミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基反応性とし、これと酢酸キナーゼとを結合
させる方法、芳香族アミン基を有する水不溶性担体をジ
アゾニウム塩とし、これと酢酸キナーゼとをジアゾカッ
プリングする方法、カルボキシル基を含む担体に適当な
処理を施してアジド、クロリド、カルボジイミド、イン
シアネート等の誘導体に転化し、これと酢酸キナーゼと
をペプチド結合させる方法、ハロゲンなどの活性脱離基
を有する担体に結合する方法、担体の水酸基をハロゲン
化シアンで処理した後結合する方法、少なくとも２官能
性の試薬、例えばグルタルアルデヒド、ｌ−アルキル−
２−ハロピリジニウム塩、エピクロルヒドリンなど、に
より担体と酢酸キナーゼとを結合する方法などが挙げら
れる。

更に、イオン結合法としては、例えばカルボキシメチル
セルローズ、ジエチルアミノエチルセファデックス〔フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ）社の商品〕、ダウ
エックス−５０〔ダウケミカル（１）ａｗ ｃｈｅｍ、
）社の商品〕などのイオン交換体にイオン結合させる方
法を挙げることができる。

また、物理的吸着法としては、例えば活性炭、アルミナ
、シリカゲルなどの吸着剤に吸着させる方法があり、包
括法としては、例えば架橋ポリアクリルアミドゲル、ポ
リビニルアルコ−ゲルなどの高分子ゲル格子中に、もし
くは例えばナイロン、ポリスチレン、コロジオンなどの
皮膜中１こ包括する方法が挙げられる。

これらの方法ｔこおいては、酢酸キナーゼ水浴液と担体
またはその先駆体とを必要ならば重合開始剤の存在下に
混合もしくは重合処理する公知の方法に従って実施でき
、ただし温度は常温を使用することが可能である。

常温条件下で固定化処理することができることは本発明
の特筆すべき利点である。

上記の如く、本発明の固定化耐熱性酢酸キナーゼは種々
の方法で製造し得るが、担体と酢酸キナーゼとの結合力
、活性、耐用寿命などの点で共有結合法が特に優れてい
る。

就中、酢酸キナーゼを失活させる危険性の少ない温和な
反応条件を選ぶことができ、かつ高い残存活性率を達成
することのできる点で、少なくとも２官能性の試薬、特
にｌ−アルキル−２−ハロピリジニウム塩、を使用する
共有結合法、とりわけ予めカルボキシル基を有する担体
を脱酸剤の存在下に１−アルキル−２−ハロピリジニウ
ム塩と反応させて得られる担体と耐熱性酢酸キナーゼと
を共有結合させる方法が好ましい。

■−アルキルー２−ハロピリジニウム塩を使用する共有
結合法は以下のようにして実施することができる。

即ち、カルボキシル基を有する水不溶性担体とカルボキ
シル基に対するモル比約１〜約ｔｏｏｏ、好ましくは２
〜２００、最適には２〜２０の脱酸剤とを、無水有機溶
剤中で混合する。

次いで該混合物に１−アルキル−２−ハロピリジニウム
塩を、カルボキシル基ｌこ対するモル比的１．２〜約１
２００、好ましくは２，４〜４８０、最適には２．４〜
２４の量で添加し反応させる。

反応温度は常温〜溶媒の沸点なる範囲であり、反応時間
は約１０分以上、好ましくは１時間以上である。

該脱水剤を溶解し得る無水溶媒で洗浄する。

これによって酵素結合能を有する水不溶性担体を得るこ
とができる。

かくして得た担体を０〜５０℃、好ましくは０〜３０℃
、最適には０〜２０℃なる範囲の温度にて、酢酸キナー
ゼ水溶液と、ｐＨ６〜ＩＯ１好ましくは７〜９、最適に
は７〜８なる条件下で反応させて目的とする固定化耐熱
性酢酸キナーゼを得る。

反応時間は少なくとも２分、好ましくは５分〜１０時間
、最適（こはＩＯ分〜２時間である。

前記固定化法は、また以下のよう１こ実施することもで
きる。

即ち、カルボキシル基を有する担体と、カルボキシル基
ｔこ対するモル比的１．２〜２４０、好ましくは２．４
〜１２０、最適には２．４〜４８の１−アルキル−２−
ハロピリジニウム塩と、カルボキシル基に対するモル比
的２．４〜４８０、好ましくは４．８〜２４０、最適に
は４．８〜９８の脱酸剤および酢酸キナーゼを水−有機
溶媒混合液に直接添加して固定することもできる。

この場合、該混合溶媒はｐＨ約６〜９、好ましくは６〜
８、最適には６．５〜７．５であり、水：有機溶媒の混
合比はｌ：０．６〜６、好ましくはｌ：０．８〜１．２
である。

−万、反応温度ならびに反応時間は、夫々０〜５０°Ｃ
１好ましくは０〜３０℃、最適１こは０〜２０℃および
少なくとも２分、好ましくは２分〜５時間、最適には５
分〜２時間である。

前記固定化法において使用するｌ−アルキル−２−ハロ
ピリジニウム塩において、アルキル基としては、例えば
メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ドデ
シルなどの直鎖アルキル基：ｉ−プロピル、ｔ−ブチル
、ネオペンチルなどの分岐鎖アルキル基；シクロペンチ
ル、シクロヘキシルなどの環状アルキル基；置換基とし
てフェニル、ナフチルなどの芳香族基および／またはシ
クロペンチル、シクロヘキシルなどの環状アルキル基お
よび／またはビニル、ブテニル、インブテニル基などの
不飽和アルキル基を有する上記アルキル基などを挙げる
ことができ、また２一位のハロゲンとしてはフッ素、臭
素、塩素、ヨウ素などを挙げることができる。

該ピリジニウム塩を形成する対イオンとしては、例工ば
ハロゲン：トシレート、ブロシレートなどの有機陰イオ
ン：フルオロスルフェート、テトラフルオロボレートな
どの配位型陰イオンなどが挙げられる。

また、前記方法ｆこおいて使用する脱酸剤としては、活
性水素を有さない。

例えばトリエチルアミン、トリメチルアミン、メチルジ
エチルアミン、ピリジン、ルチジンなどの塩基：ｌ、８
−ジアザビシクロ（５，４，０）−７−ウンデセン、■
。

５−ジアザビシクロ（４，３，０）−５−ノネンなどの
超塩基、などを挙げることができる。

更に、有機溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン、シクロヘキサンなどの炭化水素：メチルアルコール
、エチルアルコール、アミルアルコール、シクロヘキサ
ノール、エチレングリコールクリセロール、エチレング
リコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールな
どのアルコール類ニジエチルエーテル、シアミルエーテ
ル、ベンジルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン、エチレングリコールジメチルエーテルなどのエーテ
ル類：アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノ
ンなどのケトン類：エチルアセテート、プロピルプロピ
オネート、ブチルホルメート、ブチルアセテートなどの
エステル類、クロロホルム、メチレンクロリド、四塩化
炭素、トリエチレンプロミドのようなハロゲン化炭化水
素：ニトロベンゼン、ニトロメタンなどのニトロ化合物
ニアセトニトリル、ベンゾニトリルなどのニトリル類ニ
ジエチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メ
チルピロリドンなどのアミド類を使用することができる
。

かくして、本発明によれば（１）個々の酢酸キナーゼに
ついて試行錯誤的に固定化方法を検討する必要がない、
（２）固定化する際に微妙かつ熟練を要する操作を必要
としない、（３）固定化の際に担体に固定されなかった
未固定酵素を回収し再利用することが可能である等の浸
れた利益を得ることができる。

本発明により得られた固定化耐熱性酢酸キナーゼは、長
期間安定に活性を維持するので、前記の如き反応器等の
形状でアデニンコファクター類を極めて効果的に相互変
換するプロモスを提供することが可能となる。

その結果、生体内における同様な生合成反応を生体外に
おいて工業的１こ実施する、いわゆるバイオリアクター
システムの稼業を可能とする。

例えば、有用な抗生物質であるグラミシジンＳを、酵素
を利用して工業的Ｉこ合成しようとする試み〔Ｅｎｚ−
Ｅｎｇ・、２１５３（１９７４）〕において、エネルギ
ー源として消費されるＡＴＰを効率良く再生産するプロ
セスを提供することができ、それによってかかる試みを
工業的に有効なプロセスとすることを可能とする。

これはほんの一例にすぎず、本発明の安定な固定化耐熱
性酢酸キナーゼは、アデニンコファクター類の相互変換
を必須の要件とする、他の工業的反応系においても広く
利用することが可能となる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。

尚、酵素活性の測定は公知の逆反応系しＴ＝Ｂｉｏ１．
ｃｈｅｍ−，２４９，２５６７（１９７４））に従って
、公知の方法 （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４
４゜３３５（１９７６））で実施した。

参考例１・比較例Ｉ ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ〔ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉｃ）社製〕５Ｓを、ガラスフィルター上に
て１ｍＭ塩酸１０００ｍｌで３回、洗浄、膨潤を繰返し
た後、ｐＨ８，３の５０ｍＭホウ酸緩衝液ｌｏｏｍ中に
懸濁し、公知の方法（特開昭５２−２５０８８号公報）
に従って培養、回収および精製したｓ Ｂ−ｓｔｅａｒ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの生産した酢酸キナーゼを上
記緩衝溶液に溶解した溶液・ １ｄ（５０００単位に相
当）を前記懸濁液に添加し、４０℃にてゆっくり振盪し
つつ、３０分間反応させた。

この反応混合物をガラスフィルターで濾過し、次いで得
られた固定化酢酸キナーゼを０、５ Ｍ ＫＣＡ を
含む、ｐＨ８，０の５０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液各２
００罰で３回洗浄した。

各段階で炉液を集め、これら炉液ならびに得られた固定
化酢酸キナーゼの活性をそれぞれ測定した。

更ｔこ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの生産す
る酢酸キナーゼ（ベーリンガー・マンハイム ’ （Ｂｏｅｌｉｎｇｅｒ＠Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製
〕を使用して同様の操作を繰返した。

結果は以下の通りであった。

実施例 ｌ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕ
ｍｓの生産する酢酸キナーゼを公知の方法 （Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ。

１００．１２１（１９７４）、ｌにより調製し、その５
００単位をガラスフィルター上ｌこて１ｍＭ塩酸３００
ｒｒＬｌで３回、洗浄・膨潤を繰返した後、２ｇの活性
化ｃＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を５０
ＴｆＬｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液中に分散させた懸濁液
に添加した。

これを３０°Ｃにてゆっくり振盪しながら１時間反応さ
せた。

以下、参考例１と同様に処理して固定化耐熱性酢酸キナ
ーゼを得た。

固定化酢酸キナーゼと炉液の活性を測定し、更に該固定
定化酢酸キナーゼをｐＨ７，３の５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝
液中に懸濁させ、３０°Ｃにて放置して活性の経時変化
を追跡した。

結果は以下の通りである。

上記結果から明らかな如く、本発明の酢酸キナーゼの固
定化法は固定化収率が高く、またＰ液から回収される未
固定酵素は再利用するのに十分高活性であることがわか
る。

更１こ本発明の方法ｔこより得られた固定化耐熱性キナ
ーゼの安定性が極めて浸れていることがわかる。

ちなみにＥｓｃｈｅ−ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの生産
する酢酸キナーゼの場合、固定化後１ケ月以内１こその
活性の殆ど全てが失われてしまうことが４つかつている
。

参考例 Ｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｌ
ｙｔｉ −ｃｕｓＶ−２の生産する酢酸キナーゼを常法
に従って培養、回収、および精製した。

次いで、ＣＨセファロース（ファルマシア社製）１０ｇ
を５００７ｒＬｌの１ｍＭ塩酸で、更に１０１００Ｏの
蒸留水で３回、洗浄・膨潤した。

該酢酸キナーゼ３０．０００単位と該ＣＨセファロース
ｌｏｇとを、５０ｍＭホウ酸緩衝液２５０ｍ１とアセト
ニトリル２５０ＴＬｌとの混合溶液中に懸濁し、次いで
これｌこトリーｔ−ブチルアミン２．４ ｍ Ｍおよび
ｌ−エチル−２−クロロピリジニウムプロミド１．２ｍ
Ｍを添加して、２０℃（こて振盪しつつ３０分間反応さ
せた。

この混合物をガラスフィルターで濾過し、次いで得られ
た固定化酢酸キナーゼを、ｐＨ８，０の５００ｍＭエタ
ノールアミノ−塩酸緩衝液１０１００Ｏで洗浄した後、
更にｐ）（ｓ、ｏの０．５ＭＫ（Ｊ’を含有する５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液各５００ｍ１で５回洗浄した。

最後にｐＨ７，３の５０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液各５００ｍ
１で３回洗浄した。

各段階の炉液を集め、炉液ならびに固定化酢酸キナーゼ
の活性を測定した。

また、かくして得た固定化酢酸キナーゼを、ｐＨ７，０
の５０ｍＭα−グリセロリン酸緩衝液中に分散させ、室
温１こて放置し、６ケ月後の活性を測定した。

以下に本参考例の結果を示す（数値は単位）この結果は
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏａ −ｍｉ
ｎｏｌｙｔｉｃｕｓＶ−２の生産する酢酸キナーゼから
得られた固定化酢酸キナーゼも極めて高い安定性を有し
ていることを示している。

また、回収された未固定化酢酸キナーゼは再利用可能で
あり、更に本発明の方法が高い固定化収率を有すること
もわかる。

実施例 ２ 内径０．２ ｍｍのナイロンチューブ内部１こ、７％テ
トラフルオロホウ酸トリエチルオキソニウム塩のジクロ
ロメタン溶液を、３００Ｃにて３時間、流速０．１５ｍ
１／分で循環された。

次いで、該ナイロンチューブにジクロロメタンを流速０
．２ｒｕｌ／分で１５分間流すことにより洗浄した。

更に、２５％へキサメチレンジアミン水溶液を流速０．
１５ｍ１／分で１時間３０°Ｃにて循環させた後、２５
ｒｎ Ｍホウ酸価培液（ｐＨ８，０）で洗浄した。

次いで、同緩衝液に５％（Ｗ／Ｖ）のスベリジン酸ジメ
チルを溶解した溶液を０．１５ｍ１／分なる流速で２０
分間、３０℃【こて循環させた後、メタノールを５分間
流して洗浄した。

かくして得たナイロンチューブに、５００単位のＣｌｏ
ｓｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅ −ｔｉｃｕｍ
起源の耐熱性酢酸キナーゼを含むホウ酸緩衝液（ｐＨ８
，０）を流速０． ｌ ５ ｒｕｌ／分で５時間、３０
℃にて循環させた。

次いで、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）にて十分洗浄して
、固定化耐熱性酢酸キナーゼを得た。

このものの活性は３００単位であった。

参考例 ３ ０、１２ ｉ ７ｍｌのアクリルアミドと６ｍｔ；）７
ｍｌのＮ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドとを含む２０ｍＭリ
ン酸液（ｐＨ７，５） ５ｍｌにＰｓｅｕｄｏｍｏｎ−
ａｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｌｙｔｃｕｓＶ−２起
源の耐熱性酢酸ナーゼ２０単位を加えた。

０℃にて撹拌混合し、５０１′ｖ／ｍｌの過硫酸カリウ
ム水溶液０．５１ｒＬｌを添加し、２０Ｗの蛍光灯の照
射の下で２時間反応させた。

生成したゲル状物を破砕した後、２０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５） Ｌ Ｏｍｌで３回洗浄した。

かくして得られた固定化耐熱性酢酸キナーゼの活性は１
５．２単位であり、洗液中に回収された耐熱性酢酸キナ
・−ゼは４．３単位であった。

また、該固定化耐熱性酢酸キナーゼを２０ｍＭ’Ｊン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）中に懸濁させ、３０℃にて６ケ月
放置した後、活性を測定したところ１５単位であり、極
めて安定化性に憂れていることがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔ
   ｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）の１
   菌株の生産する耐熱性酢酸キナーゼと水＠性固定化用担
   体とからなる、固定化耐熱性酢酸キナーゼ。 ２ 該耐熱性酢酸サナーゼが、５０℃の緩衝溶液中で１
   ５分間処理した後ｔこおいても、処理前の活性の９０％
   以上を保持している酢酸サナーゼである、特許請求の範
   囲第１項記載の固定化耐熱性酢酸キナーゼ。 ３ クロストリジウム・サーモアセチカムの１菌株の生
   産する耐熱性酢酸キナーゼと、予め活性化した水不溶性
   固定化用担体とを反応させることを特徴とする、耐熱性
   酢酸キナーゼの固定化方法。 ４ 該耐熱性酢酸キナーゼｌ）５．５０℃の緩衝溶液中
   で１５分間処理した後ｔこおいても、処理前の活性の９
   ０％以上を保持している酢酸キナーゼである、特許請求
   の範囲第３項記載の固定化方法。 ５ 少なくとも２官能性を有する試薬を用いて、水不溶
   性担体と反応させる。 特許請求の範囲第３項記載の固定化方法。 ６ 前記の少なくとも２官能性を有する該試薬ｂＳ１１
   −アルキルー２−ハロピリジウム塩である、特許請求の
   範囲第５項記載の固定化方法。 ７ カルボキシル基を予め有する水不溶性固定化担体を
   、脱酸剤の存在下に、■−アルキルー２−ハロピリジウ
   ム塩と反応させて得られる生成物と、耐熱性酢酸キナー
   ゼとを反応させる、特許請求の範囲第３項記載の固定化
   方法。