JPH01212347A - 微量アナライト物質の測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微量アナライト物質の測定方法及び測定装置、
特に免疫反応（抗原−抗体反応）を利用して生体試料の
ような多成分系に微量台まれる特定の物質を定量的に測
定するために適した測定方法及び測定装置に関するもの
である。本発明は以下臨床検査におけ、る微量生体物質
の測定について説明するが、本発明の測定方法及び測定
装置は薬学、生物学、動物学、植物学、農学、化学、８
検査等を取り扱う広い分野への適用が可能である。

（従来の技術） 生体の生理活性に関与する物質は概して微量であり、し
かも生体に対して非常に重要な役割を演じるものが少な
くない。したがって、このような微量の生理活性物質を
定量的に測定することは医学、生化学等の生物関連分野
にとっては重要であり、そのための種々の方法が考案さ
れ、実用化されている。そのうち酵素、放射性同位元素
、化学発光物質、螢光物質などを標識として用いるアナ
ライト−レセプタ方式の測定は従来より広く普及してい
る。アナライト−レセプタ方式の測定においてはまず測
定対象物質たるアナライトと特異的に結合し得る第１の
レセプタを固定化した面相を試料溶液と標識第２レセプ
タもしくは標識アナライト（以下これらの標識体をコン
ジュゲートという）と同時、または逐次的に接触させて
アナライト−レセプタ反応を行なわせた後、洗浄し、し
かる後に該面相上に残存している標識物質の量を測定す
ることによって試料溶液中のアナライトの量を測定する
のである。ここで標識としてはラジオアイソトープや酵
素等の増感作用の大きい物質が用いられる。またレセプ
タとしてはアナライトが抗原やハプテンのときはそれに
対する特異抗体が、あるいはアナライトが抗体である時
はその抗体に対する抗原性物質か、アナライトがＤＮＡ
やＲＮＡである時にはそれらに相捕的なりＮＡ′ｐＨＮ
Ａが、アナライトがリガンドである時にはそれに対する
レセプタがそれぞれ用いられる。かかる測定方法の代表
例として不均一法Ｅ　Ｉ　Ａ、いわゆるＥｎｚｙ＠ｅ　
Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５
ａｙ　　（Ｅ　Ｌ　ｌ５Ａ）が知られている。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいては、試料溶液中の測定対象物質
を捕捉するために、測定対象アナライトと特異的に結合
し得るレセプタを試験管、マイクロプレート等に固定化
した固相が用いられ、増感用の標識として酵素が用いら
れる。例えば測定対象アナライトが抗原の場合、サンド
イツチ法ＥＬＩＳＡにおいては該抗原Ｉこ結合し得る第
２抗体（第２レセプタ）に酵素をｔｌ！識する。また鏡
台法ＥＬｆＳＡにおいては測定対象抗原と同一の抗原に
酵素を標識する。一方測定対象アナライトが抗体であり
、これを抗原サンドイツチ法で測定する場合には、レセ
プタとして抗原が用いられ、さらに酵素標識した抗原が
第２レセプタとして用いられろ。

また鏡台法によって抗体（アナライト）を測定する場合
には、レセプタとして抗原を用い、該抗原に対して測定
対象抗体と競合し得る抗体を選択しこれに酵素が標識さ
れる。上記標識として用いられた酵素に対する基質溶液
と、そしてさらに必要ならば発色試薬を固相と接触させ
る。すると基質溶液の分解反応に伴う基質溶液の光学的
性質が変化するので、その変化を観察するのである。

基質溶液の光学的性質の変化を観察するには、従来から
いくつかの方法が用いられている。そのうち機器を用い
る方法としては、吸光光度計、蛍光光度計、化学発光光
度計などで基質溶液の光学的性質の変化を光学的に測定
するものがある（例えば、石川、回合、宮井、酵素免疫
測定法、医学書院（１９ｇ２）参照）。

また、別の方法として基質溶液と対照基質溶液を対比さ
せ基質溶液の色の違いを肉眼で観察して微量アナライト
物質の存在を判定するものがある（例えば特開昭６０−
１２８３６９号参照）。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら機器を用いたこれらの光学的測定系は通常
安定な光源、高感度の光度計、精密な光学系増幅回路等
を要するために、高価で、大がかりで複雑な装置になら
ざるを得なかった。また測定するに当り、特殊な技術を
必要とするため取扱いのための専門の技術者を配置しな
ければならなかった。

一方肉眼で直接観察する方法は、定性的な測定方法であ
り、色の変化のバラツキや観察者の主観が入るので判定
に個人差が生じやすい。さらに、極く微量の物質の測定
の場合には色の変化が少な（判定が困難であった。

したがって、本発明の目的は、このような従来の測定方
法のもつ欠点を改良し、観察者の主観による判定基準の
曖昧さを除去して、基質溶液の分解反応を客観的に、し
かも高い検出精度で測定する微量アナライト物質の測定
方法及び測定装置を提供することにある。

さらに、本発明の目的は光学的測定系に比べて格段に簡
単な測定系を有する微量アナライト物質の測定方法及び
測定装置を提供することにある。

さらに、本発明の目的は、訓練されない人により使用で
きるか、または診断目的のために迅速に決定が必要であ
るときに該分野またはその他における医療従事者による
使用に適した簡便な微量アナライト物質の測定装置を提
供することにある。

本発明の他の目的は、中小規模の病院や検査センター、
さらにはベットサイドで使用できる小型で安価な微量ア
ナライト物質の測定装置を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の測定方法は、アナライト−レセプタ反応を終え
た固相と基質溶液を接触させて、基質溶液の分解反応に
伴う基質溶液のｐＨ変化を利用した微量アナライト物質
の測定方法であって、上記固相を基質溶液のｐＨ変化を
測定するｐｌ’！電極のｐＨ感応面との間隙が１ＩＩＩ
ａ以下となるように対面配置して、該間隙内における基
質溶液のｐＨ変化を測定することを特徴とする微量アナ
ライト物質の測定方法である。

さらに本発明の測定装置はアナライト−レセプタ反応を
終え几固相と基質溶液を接触させて、基質溶液の分解反
応に伴う基質溶液のｐＨ変化を利用した微量アナライト
物質の測定装置において、基質溶液の入口と出口を有す
るセルと、該セル内に収容されたｐＨｔ極と、該セル内
に基質溶液を供給するポンプ　及び測定対象物質たるア
ナライトと特異的に結合する第１のレセプタを固定した
固相に、試料溶液と標識第２レセプタ、または標識アナ
ライトを接触反応させ、洗浄した固相をセル内に収容す
る手段と、セル内に収容された固相の表面とｐＨ電極の
ｐＨ感応面をその間隙がｌａａ＋以下となるように対面
配置する固相位置決め手段よりなることを特徴とする微
量アナライト物質の測定装置である。

すなわち、本発明にかかる測定方法では東１図に原理図
で示すように、アナライト−レセプタ反応と洗浄を終え
表面にコンジュゲートを含むアナライト−レセプタ複合
体５が吸着された固相３をｐＨ電極１のｐａ感応面２と
の間隙ｄがｌ■以下となるように対面配置させ、上記狭
い間隙に実質的に封入された基質溶液４の分解反応に伴
うｐＨ変化を直接測定するのである。

従来、ｐＨ電極を検出手段として用いるアナライト−レ
セプタ方式の測定装置は、吸光光度計や蛍光光度計を検
出手段とするものに比べて検出限界が格段に劣るため実
用的でないと考えられていたが、本発明者らはｐＨ電極
のｐＨ感応面とアナライト−レセプタ反応を終えた固相
の間隙をｉｏｏｍ以下に設定することにより、意外にも
従来の検出手段を用いたものと同等の高い検出精度が得
られることを見出したのである。

かかる測定方法の基本的な操作は、まず（１）レセプタ
固定化表面を有する固相３を準備する。次に（２）該面
相をアナライト溶液およびコンジュゲート溶液と反応さ
せ、固相表面にアナライト−レセプタ複合体（コンジュ
ゲートを含む）５を形成させろ。その後（３）該固相を
洗浄して遊離のアナライトや遊離のコンジュゲートを除
去する。次に（４）該固相の表面をｐＨ電極１のｐＨ感
応面２より１ＩＩＩＩｎ以下の距離に配置する。（５）
この前もしくは後に少くともこの間隙に基質溶液を導入
して、（６）面相　・表面に吸着したコンジュゲート５
によって基質溶液を分解し、この時の基質溶液のＰＨ変
化をｐＨ電極で測定する。

このようにして固相表面上に吸着したコン、シュゲート
（従ってアナライト）の量に応じて基質溶液のｐＨ変化
が生じるので、ｐＨ変化からアナライトの濃度を定量的
もしくは定性的に測定するので２然的に検出限界が高く
、しかも信頼性の高い測定結果が得られる。また検出手
段としてｐＨ１を極を使用しているため迅速に、しかも
簡便に微量アナライト物質が測定できる。

次に本発明の測定装置の一実施例を図面にて説明する。

以下の説明では固相として円筒状Φ細径管を乳いた装置
について説明するが、本装置はアナライト−レセプタ反
応を利用した微量物質の測定に対して一般的に使用する
ことが出来て、以下に説明されたような装置に限定され
ると解釈すべきてないことも明白であろう。

第２図は本発明の測定装置の概略断面図であり、かかる
装置は基質溶液の入口１２と出口１３を有するセル１１
と、該セル１１内に収容されたｐＨ３ｉ極１４及び比較
電極１５と、セル内に基質溶液を供給するポンプ２０と
、内表面にレセプタを固定しん細径管６をセル１１内に
収納する手段９と、細径管の内表面とｐＦ！電極１４の
ｐＨ感応面１６との間隙を１＋ｍ以下に設定する位置決
め手段（図示せず）から構成されている。２１は基質溶
液の液溜めである。

セル１１は上下部に円筒状の太径部、中間部に細径部を
有し、かつ大径部の両端部は開口している。

そして下部太径部に基質溶液の入口１２、上部大径部に
基質溶液の出口１３が取り付けられている。セルの下端
開口は後述するｐＨ電極１４及び比較電極１５をセル内
に液密に収容するための電気絶縁樹脂からなるキャップ
体１０で閉塞されている。セルの材質としてはプラスチ
ック、無機ガラス金属などを用いることができる。１９
はｐＨ電極及び比較電極とｐＨ電題作動・読み取り回路
（図示せず）とを結ぶコネクタである。

上記セル１１内に収容されるｐＨ電極１４としては従来
から最ら多用されているいわゆるガラス電極の他に、ｐ
Ｈ感応性電界効果トランジスタ（以下ｐｌ−ＦＥＴとい
う）、酸化パラジウム／パラジウムワイヤ等の表面酸化
金属線タイプのｐＨ電極、プロトン受容体を含有するポ
リ塩化ビニルから成ろｐＨＧ応性高分子膜を金属線や炭
素線にコートした、コーチイドワイヤ型のｐＨ電極等、
各種の微小１）Ｈ電極を用いることができる。しかしな
がらガラス電極型のｐＨ電極は、細径化すると誘導ノイ
ズが増大する傾向がある。表面酸化金属線型ｐＨ電極は
細径化が容易であるが、長期の水中寿命等に難点がめる
。

コーチイドワイヤ型のｐｌ（電極も細径化が容易である
が、ｐＨ変化に対する直線応答域が狭い、水中寿命が短
いなどの難点がある。そのためこれ、らのｐＨ電極な使
用する場合には上記問題点を予め解消しておく必要があ
る。

それに対してｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔは（１）細径化が容易で
める。（２）細径化した時の誘導ノイズが少ない、（３
）ＩＣ技術で製造するので、電極間の特性のノくうつき
が小さくでき、かつｐＨ感応面（ゲート部）を微小化す
ることかできる。（４）ｐＨ変化に対する応答が極めて
速く、かつ応答曲線にヒステリシスが残らない、（５）
ｐＨ変化に対する直線応答域が広い、（６）水中の保存
寿命が半永久的で、かつｐＨ感度等の特性の経時変化が
少ない、等の優れた特徴を有しているので本発明装置に
用いるｐＨ１１極としては最適である。ｐＨ−Ｆ　Ｅ　
Ｔとしては（１）全周絶縁型（特公昭５７−４３８６３
号参照）　、（２）接合分離型（実公昭５８−５２４５
号参照）、（３）ＳＯＳ型（特開昭５９−４８６４６号
参照）等いくつかのタイプが知られている。本発明にお
いてはこれらのいずれのタイプのものを用いてもかまわ
ないが、その構造は基本的に第３図に示したように（１
）その先端近傍牛ヰ≠キ≠にｐＨ感応面（ゲート部）２
８を存し、（２）該ゲート部を含む素子先端部２９が、
レセプタ固定化細径管内に挿入可能な太さであり、（３
）素子先端部の長さは１〜ｌｏｍｍｓ好ましくは１〜３
１ｍｍであり、（４）素子先端部の上・下面、側面全て
の面か外部溶液との間で電気的に絶縁されていることが
必要である。一方該ｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔの素子足部３Ｉに
はリード線のポンディングパッド３０が設けられている
が、この素子足部の形状については特に制約はない。ま
た素子足部３１の外部溶液に対する電気的絶縁性につい
ても特に制約はない。なぜなら、素子足部は通常絶縁樹
脂の中に埋め込まれた形で使用されるからである。

素子先端部の太さとしては、内径２．０ｍｍ以下、通常
内径０．８■以下のレセプタ固相用：の細径管内に入る
ものであることが望ましい。例えば細径管の内径が０．
５３ｍｍ＋であれば、素子先端部の幅としては０．４５
１１１ｍ以下、厚みとしては０．２０ｍｌ１１以下であ
れば十分である。素子先端部の長さが１０ｍ＋ａ以上に
なると折れやすくなり、細径管のレセプタ固定化部分の
必要長が大きくなる、等の点で問題が生、じてくる。番
た長さが１ＩＩＩＩ１１以下になると素子先端部の細径
管内への挿入長が短かくなりすぎ、そのために細径管内
の酵素反応が細径管外の溶液の影響を受けやすくなるの
で好ましくない。素子先端部はそれ自身で外部溶液との
間で電気的に絶縁されていなければならない。上に記し
た全周絶縁型ｐＨ−ＦＥＴでは素子先端部の全周が酸化
ケイ素や窒化ケイ素等の層によって絶縁されている。ま
た接合分離型ではｐｎ接合によって電気的絶縁が達成さ
れている（提、センナ技術、１９８６年５月臨時増刊号
）。

またＳＯ５型ｐ、ｎ−Ｆ　Ｅ　Ｔでは、素子の下面はサ
ファイヤ基板によって、また上面や側面は酸化ケイ素や
窒化ケイ素等の看によって電気的に絶縁されている。

本発明に用いられるｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔは、２５℃におい
テ４０なイＬ、　６０ａＶ／ｐＨ１さらニハ５０ないし
６０ａＶ／ｐＨ（７）ｐＨ感度を有することが望ましい
。またｐｔｔ感応膜としては窒化ケイ素、酸化アルミニ
ウム、酸化タンタル等の水中安定性のすぐれたものを採
用することが望ましい。特に酸化タンタルや酸化アルミ
ニウムは水中での安定性、ｐＨ応答特性等の点で優れて
いる。酸化タンタルをｐＨ感応膜とするｐＨ−Ｆ　ＥＴ
は本発明に用いるｐＨ電極として適している。

本発明の装置を用いて微壷物質の測定を行なうためには
、ｐＨ−ＦＥＴはノイズレベルの極めて低い（定ｐｉ下
で通常０．０５ｍＶ以下）ものを用いることが好ましい
。そのためには、相互コンダクタンスが５０μΦ、好ま
しくは１００μΦ、より好ましくは２００μΦ以上のも
のを用いることが望ましい。またｐＨ−ＦＥＴの素子先
端部と外部電極とを室温の生理食塩水中につけて、ｐＨ
−Ｆ　Ｅ　Ｔのソース電極と外部電極との間に３ｖの電
圧をかけた時のもれ電流が３０ｎＡ以下、好ましくは１
０ｎＡ以下であることが望ましい。相互コンダクタンス
が５０μΦ以下であったり、上記もれ電流が３０ｎＡ以
上であったりすると、測定時のノイズが大きくなる。

比較電極１５としては、飽和カンコラ電極や銀−塩化銀
電極等の尊格式比較電極、イオン不感応性膜をゲート膜
とする電界効果トランジスタ（特公昭５８−２５２２１
号参照）、あるいはイオン不感応性膜を灸属線や炭素線
にコートしたコーチイドワイヤ型の比較電極等を用いる
ことができる。本発明の装置にはいずれの方式の比較電
極を用いてもかまわないが、現時点では液絡式比較電極
が最も信頼性が高く好ましく用いられる。比較電極のセ
ル内への設置場所としては通常第２図に示したように、
セルの下部大径部で、かつｐＨ電極のｐＨ感応面１６と
液絡している場所に取り付けることが好ましい。また比
較電極をセルと液絡しているセル外の任意の場所に設置
することも可能である。

細径管６をセル内に収容する手段９としては、手で把持
してセル内に挿入してもよいが、例えば細径管６を先端
に把持した把持部材３０の他端部に螺子環３１を挿通し
、この螺子環３１をステッピングモータ（図示せず）の
回転力により回転させて自動的に上昇、下降させるよう
にしてもよい。３２は螺子環３１と離間して平行に装備
されたガイド部材である。把持部材３０を昇降させる機
構は上記機構の他の公知の種々の機構のものを採用する
ことができる。

細径管６の位置決め手段としては細径管の内表面とｐＨ
電極１４のｐｔｔ感応面１６との間隙を調整する公知の
Ｉｌ！溝を採用できる。例えば細径管６を直径方向に移
動可能としてもよいし、あるいは、セル１１の細径部の
内径を細径管の外径よりわずかに太くすることによって
、セルの細径部を細径管に対するガイドとすることもで
きる。上記細径管の位置決め手段によって、細径管６の
内表面とｐＨ電極のｐＨ感応面の距離を１．０ｍａ＋以
下、好ましくは０．５ａｍ以下に設定する。上記の細径
管の内表面とｐＨ感応面との距離がｌ　Ｏｓｍ以上にな
ると細径管の内表面とｐｉ感応面の間隙に封入された基
質溶液のＰＨ変化速度が急激に遅くなるために、高い検
出感度を達成することが事実上不可能となる。

細径管６は、少くともｐＨ電極のｐｉ感応面が十分にそ
の中に入り得る長さであることが必要である。

例えばｐＨ電極のｐＨ感応面の長さが１　、５ｍｍであ
れば、細径管のレセプタ固定化部の長さとしては通常３
−以上である。細径管のレセプタ固定化部が上記の条件
を満たすものであれば、細径管全体の形としては任意の
形を採用することができる。その−例を第４図に示す。

第４図に示した細径管２２はピペットチップの形状とし
たもので、細径管部２３と大径管部２４とから成る。大
径管部はピペッタの受口用のテーパとなる。この細径管
部２３の先端部分内表面　　’　　　２３−１にレセプ
タが固定化されている。第５図は細径管の他の例を示す
。この細径管２２はやはりピペットチップ塑であるが、
細径管部の内表面２５に凹凸を設けて、表面積を大きく
し、その先端中≠塙部２５−１にレセプタが固定化され
ている。大径部２６：よやはりピペッタ受口用のテーパ
となっている。このように細径管内表面の表面積を大き
くすることによって、検出感度を向上させたり、インキ
ュベーション時間を短縮することが可能となる。これら
細径管の材質としては、例えばポリスチレン、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリテトロフロロエチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、ポリビニル
アルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体等の
ポリオレフィン系ポリマー、ポリエチレンテレフタレー
トやポリブチレンテレフタレート等のポリエステル系ポ
リマー、ポリジメチルシロキサン等のポリシロキサン系
ポリマー、６ナイロン、６．６−ナイロン等のポリアミ
ド系ポリマー、ポリカーボネート、酢酸セルロースやニ
トロセルロースのようなセルロース系ポリマー、さらに
は各種無機ガラスを用いることができる。

なお、このような細径管にレセプタを固定化し、微鬼物
質の検出に利用することができると思われる物質と、そ
れらにより測定できると考えられる項目の一例を表−１
に示す。

以下余白 表　　　　　　　　　１ 本発明におけるコンジュゲート用標識酵素と基質溶液の
組み合わせとしては、酵素反応によって基質溶液のＰＨ
が大きく変化する標識酵素／基質溶液の組み合わせを用
いることが必要である。そのような組み合わせとしては
例えば、トリアジルグリセロールリパーゼ／トリアジル
グリセロール、アセチルエステラーゼ／酢酸エステル、
アセチルコリンエステラーゼ／アセチルコリン、グルコ
ノラクトナーゼ／グルコノラクトン、アルカリホスファ
ターゼ／ｐ−ニトロフェノールリン酸、アリルサルファ
ダーゼ／アリルサルフェート、ウレアーゼ／尿素、パル
ピッラーゼ／パルピッレート等の加水分解酵素／その基
質の組み合わせ、グルコースオキシダーゼ／グルコース
、コリンオキシダーゼ／コリン、カテコール１，２−ジ
オキシゲナーゼ／カテコール等の酸化還元酵素／その基
質溶液の組み合わせ等があげられる。中でもウレアーゼ
／尿素、トリアジルグリセロールリパーゼ／トリアジル
グリセロール、グルコースオキシダーゼ／グルコース等
の組み合わせは、安定で活性の高い′酵素が入手しやす
いこと、安価で純度の高い基質溶液が入手しやすいこと
等の理由により１．実用に適している。中でも特にウレ
アーゼ／尿素の組合せは、酵素反応に伴うｐｉ変化が大
きいので適している。

次に本発明装置を用いた測定方法をｌステップサンドイ
ツチ法による抗原の測定の場合について説明する。競合
法や２ステツプサンドイツチ法では操作が若干異なるが
装置の構成は変らないので説明を省略する。まず細径管
６の内表面にレセプタを固定する。かかるレセプタを固
定化する方法としては、従来のＥＬＩＳＡに用いられた
方法をそのま＼探用することができる。例えば物理吸着
によってレセプタを固定化する時には、まず細径管を十
分に洗浄した後、レセプタである第１抗体を溶解した緩
衝溶液を細径管の内部に導入し、０℃〜４０℃の温度で
一定時間静置する。この時レセプタ溶液の中に細径管の
先端部のみを浸漬してもかまわない。後者の方法では、
レセプタ溶液の中に浸漬された細径管の先端部の外壁と
内壁の両方にレセプタが吸着するが、その事が測定に悪
影響を及ぼすことはない。この後細径管を洗浄用緩衝液
で洗浄した後、ブロッキング処理を行なう。ブロッキン
グ処理は、該洗浄後の細径管を例えばウシ血清アルブミ
ン、ウシ胎児血清アルブミン、各種動物の血清、各種イ
ムノグロブリン、あるいは界面活性剤等で処理すること
によって行なわれる。

ブロッキング処理はレセプタ固定化部は勿論のことそれ
以外の試料溶液やコンジュゲト溶液との接触が予想され
ろ部分全体に行なうことか必要である。

次にブロッキング処理後の細径管の先端部を、所定量の
標識第２抗体を含育する試料溶液に含浸し、所定時間イ
ンキュベーションする。それにより細径管内壁上に第１
抗体−抗原−漂識第２抗体のサンドイッチ型抗原−抗体
複合体が形成される。

次いで洗浄操作によって、サンドイッチを形成していな
い遊離の測定対象抗原、遊離の標識第２抗体、あるいは
遊離の抗原−標識第２抗体複合体を細径管内表面より除
去する。これらインキュベーション及び洗浄操作によっ
て、細径管の内表面には試料溶液中の測定対象抗原の濃
度と相関を持った量のサンドイッチ型抗原−抗体複合体
、したがって標識酵素が結合した状態となる。

一方酵素反応をｐＨ電極で追跡するためのセルでは第６
図に示すように、基質溶液１７をポンプ２０によって液
溜め２１よりセル内に供給し、出口１３よりオーバーフ
ローさせてｐＨ電極１４のｐＨ感応面１６及び比較電極
１５を洗浄する。セル内の液面はＰＨ電極のｐＨｇ応面
０先端部より上にある。３３は排液容器である。

酵素反応を開始させるためには第７図のように、インキ
ュベーション、洗浄後の細径管６を細径管収納手段（図
示せず）によりセルの上端開口よりセル内に挿入して、
ｐＨ電極のｐＨ感応面を該細径管で完全に収りかこむよ
うにする。この時送液ポンプ２０は停止させておくこと
が望ましい。第８図に細径管６をセル１１内に収納した
ときのセルの細径部周辺の詳細を示す。その後、該細径
管内で基質の分解反応が進行するので、それに伴うＰＨ
変化を測定する。この時のｐＨの変化速度から標識第２
抗体の酵素活性、すなわち試料溶液中の測定対象抗原の
濃度を求める。

上記細径管６をセル内に挿入したときの重要な点は、第
８図に示しているように細径管６の下端とｐＨ電極の樹
脂部３５の先端の間隙を可能な限りせまくすることであ
る。酵素活性を測定する時には、細径管の内外の基質溶
液が互いに混り合わないことが望ましい。そのためｐＨ
電極の樹脂部３５の外径を細径管６の外径とぼり同程度
にして、セルの細径部１８の中に下方より挿入・固定し
ておき、酵素活性測定時には細径管６を、樹脂部３５に
その先端部が接触するまで上方より挿入する。こうする
ことによって細径管６の下端開口部がｐＨ電極１４の樹
脂部３５によって適度に閉塞され、細径管内の基質溶液
を隔離することができる。なおこの場合ｐＨ’を極のｐ
Ｈ感応面１６と比較電極１５との間はある程度液絡して
いることが必要である。この液絡は電気的な液絡である
から、通常樹脂部３５の上面や細径管６の先端部の凹凸
５にもとすく微小な間隙によって十分確保される。

（実施例） 以下本発明の測定方法の一例を実施例にて説明する。

［実施例１］ 手段 細径管を固相、ｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔを検出器とするＥＬ。

ＩＳＡ測定装置を組み立て、この装置を用いて、まずヒ
ト−ＩｇＧの定量を試みた。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡＡｌ１装　の組み１て まずセルとしては第２図哄キで示されたものを用いた。

ｐＨ１１極１４としては、特公昭５７−４３８６３に＼
、 記載の方法で製造された全周絶縁型のｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔ
のゲート部に、タンタル酸化物をＰＨ感応膜として蒸着
したものを用いた。このｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔの全体の寸法
は長さ５．５ｍｍ、幅Ｑ、４５ｍｍ、厚み０．１５ｍｍ
で、その先端０．８１１ＩＩ＋！の部分にゲート部（ｐ
Ｈ感応面）が設けられている。第８図に示すようにこの
ｐＨ−Ｆ　ＥＴをゲート部を含む先端１　、５ｍｍ程度
を突出させて樹脂３５で固定した。この樹脂部の外径は
０．６ｈｍである。この場合ｐＨ−Ｆ　Ｅ　ＴのｐＨｇ
応面０細径管の内表面との間隙の最大値ｄは（０，５３
−０，１５）／２＝０．１９＋ａｍであった。それに対
して、反応セルの細径部の内径を０．６５ｍａ＋、長さ
をｌ　５＋ａｍとした。比較電極１５としては銀／塩化
銀型の液絡式比較電極を用いた。ポンプ２０としてはペ
リスタポンプを用い、流速をｌ−／刊こ設定した。

使用しりｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔ　ノルＨ感度ハ３７℃ｉ？５
７．３＋＋Ｖ／ｐＨ１相互コンダクタンスは３８０μΦ
であった。ｐｌ（−ＦＥＴの作動は、ドレイン電圧４ボ
ルト、ドレイン電流ＬＯＱｇＡで定電流回路に接続して
行なった。

またｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔの出力信号としては液絡式比較電
極を基準とするソースの電位（以下これをソース電位と
略称する）を測定、記録した。

径　へのキャプチャの固定 レセプタとして抗ヒト−Ｉ　ｇＧ　（Ｓｈｅｅｐ）を選
び、細径管に次のようにして固定した。細径管としては
、第４図に示す細径部の内径が０，５３■のメデイキッ
ト株式会社製のポリテトラフロロエチレン製カニューラ
（商品名ハッピー、キャスＺ）を用いた。

このカニューラの細径部の長さは２５■、大径部の内径
、外径、長さは各々４■、６＋ａｍ、および２０ｍｍで
あった。５０μｇ／ｍＱの抗ヒト−ＩｇＧのＰ、ＢＳ溶
液（ｐＨ７゜０）を調製し、該溶液の中に上記カニュー
ラの先端１０Ｉｌｆｆｌの部分を４℃下２４時間浸漬し
て、この部分の内外壁に抗ヒトＩｇＧを物理吸着させた
。

次いで０．０５％の界面活性剤（商品名Ｔｗｅｅｎ　−
２０）を含むＰＢＳＢＳ溶液ｐＨ７，０）で該吸着後カ
ニューラの内外壁をよく洗浄した。その後該カニューラ
の細径部会体の内外壁を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）と０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液中
に室温下１時間浸漬し、いわゆるブロッキング処理を行
なった。

、　、７　　　　　の 標識酵素としてナタ豆から分離、精製したウレアーゼ（
シグマ社、タイプｃ−３）を用い、アビジン−ビオチン
法によって抗ヒト−Ｉ　ｇＧ　（Ｇｏａｔ）と以下のよ
うにして結合させた。まず１ｍｇ／ｌｌ１１２のウレア
ーゼ、ＩＩＩＩＭのＥＤＴＡを含むＯ，１Ｍ炭酸水素ナ
トリム緩衝溶液（ｐＨ８，３）を調製した。またＮ−ヒ
ドロキシサクシミド化ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社）のｌ
ｌ１ｇ／ｌｌＩ２のＤＭＳＯ溶液を調製した。次にこの
ウレアーゼ溶液１ｍＱとＮ−ヒドロキシサクシミド化ビ
オチン溶液５μＱとを室温で４時間反応させて、ウレア
ーゼをビオチン化した。この反応後溶液をＰＤ−１０カ
ラム（ファルマシア社）をカラムとするゲルクロコトグ
ラフイーにかけ、ビオチン化ウレアーゼの分画を分取し
た。この分画を、！％ＢＳＡ。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ　−２０，１ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ
　、　０．０１％Ｎ−Ｎ、ｌを含むＰＢＳＢＳ溶液ｐＨ
７，４Ｈ以下この溶液はよく使われるので“希釈バッフ
ァ゛と略記する）で希釈して、２５μｇ／ｌａＱの濃度
の溶液とした。

次にアビジン−Ｄ（ベクター社）を希釈バッファで７．
６μｇ／ｌａＱの、またビオチン化抗ヒト−ＩｇＧ（Ｔ
ＡＧＯ社）を同じ希釈バッファで６．９μｇ／ｌａＱの
溶液とした。このようにして得られたビオチン化ウレア
ーゼ、アビジン−０１ビオチン化抗ヒト−ＩｇＧの溶液
を容積比１：　１：　ｌで混合することによって目的と
するウレアーゼ標識化抗ヒト−ＩｇＧの溶液を調製した
。以下この溶液をコンジュゲート溶液と略記する。

ヒト−Ｉ　Ｇに対する検Ｉ［ｔａの作成次に本発明のＥ
ＬＩＳＡ測定装置の性能、を試験するためにヒト−１ｇ
Ｇに対する検量線を作成した。まず所定量のヒト−Ｉｇ
Ｇを上述の希釈バッファに溶かして所定濃度のヒトーＩ
ｇＧ溶液を調製した。次にこのヒトー１ｇＧ溶液と前述
のコンジュゲート溶液とを等容量ずつ混合した。一方抗
ヒト−１ｇＧを固定化した細径管体をブロッキング溶液
から引き上げ、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗
浄した。この細径管内に上述のヒトー１ｇＧ−コンジュ
ゲートの混合溶液を吸引し、室温下で３０分間インキュ
ベーションした後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ２０で洗
浄を行な？た。

基質溶液として０．１Ｍの尿素、１ｍＭの塩化アンモニ
ウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む溶液を調製し
、これを第２図に示された液溜め２１に仕込み、ポンプ
２０を作動させてセル１１の中に基質溶液を送り込み、
セル出口１８よりオーバーフローさせた。

この時点よりｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔのソース電位及びその変
化速度を記録させた。その−例を第９図に示した。

第９図において、ΔＶは反応前の基質溶液に対するソー
ス電位を基準にした時の、反応によるソース電位の変化
分であり実線で示されている。ｄＡＶ／ｄｔはその時間
微分であり、破線で示されている。

第９図の時刻Ａでポンプ２０を停止させた。時刻Ｂで上
記のインキュベーション−洗浄後細径管を第７図のよう
にセルの細径部に挿入した。この時点を時刻ゼロとする
。その直後より細径管内では尿素の（アンモニア−二酸
化炭素への）分解反応が進行し、それに伴って基質溶液
のｐＨがアルカリ側（ソース電位が低下する方向）に変
化する。この間ΔＶの変化速度は時刻Ｍで最大となる。

時刻Ｃで細径管体をセルより引き抜くと同時に送液ポン
プの運転を作動させると、ソース電位およびその時間微
分はすみやかに元に戻る。

このようにして各覆濃度のヒトーＩｇＧ溶液でインキュ
ベートした細径管に対するｐＨ応答曲線を測定し、その
結果から第１０図および第１１図に示した２種類の検量
線を作成した。第１０図は細径管挿入後５分後でのΔ、
■とヒト−１ｇＧの濃度との関係を示したもの、第１１
図はｄΔＶ／ｄ　ｔの極大値（第９図滅におけるｄΔＶ
／ｄｔ、いわゆるピークレート）・とヒト−１ｇＧの濃
度との関係を示したものである。

第１０図、第１１図のいずれの検量線でも検出下限濃度
はｌｎｇ／ｍＱ程度である。第１Ｏ図と第１１図を比べ
ると、第１０図では１１００ｎ／ｍ１２程度でΔＶがや
＼飽和しかけているのに対して、第１１図ではまだその
ような傾向が見られない。このことは細径管挿入後５分
後のΔＶを用いるよりは、いわゆるピークレートを用い
た方が１本の検量線での測定可能範囲が広くなることを
示唆している。

［実施例２〜８．比較例１〜３］ 次にレセプタ固定化細径管の内径を０．５３〜３．ＯＩ
の範囲で変えて実施例Ｉと同様の測定を行なった時のｐ
Ｈ応答曲線の変化について検討した。この目的のために
、セルの細径部の内径（これをＬとする）および樹脂部
３５の直径ａの異なるものを製作し、これに外径Ｑ１、
内径Ｉ２ｔのレセプタ固定化細径管を用いてＥＬＩＳＡ
の測定を行なった。この時Ｌ　−ａ　＝　０．０５＋ｓ
ｍ、ａ＝（！＋、Ｑ、−Ｑ＊＃　Ｏ，１６ｓ＋ｅの関係
が保持されるようにした。この場合ｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔの
ｐＨｇ応面０細径管内表面との間隙の最大値ｄはｄ　＝
　（１２，−０，１５）／２で表わされる。

このような反応セルおよび細径管を用い、実施例１と同
様にして、ＬＱｎｇ／ｍ１２のヒトーＩｇＧ溶液を測定
対象溶液としてｐＨ応答曲線を測定した。その結果から
、レセプタ固定化細径管の内径と、酵素反応開始５分後
におけるｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔの出力の関係を求め、表−２
及び第１２図に示した。表−２には上記のｐｎ−Ｆ　Ｅ
　Ｔ感応面と細径管内表面との間隙ｄの値も示した。第
１２図から明らかなように、細径管の内径が小さい；よ
ど同一のヒトーＩｇＧ濃度に対するｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔの
出力は大きくなる。細径管体の内径が２，２０１１１１
１１以上、すなわち間隙ｄか１．０ｍｍ以上では５分程
度の反応時間ではｐｉ変化はほとんど認められない。細
径管の内径が２．２ｍ＋ａ以下では１０Ｍｇ／＋ａｄと
いった微量のヒトＩｇＧに対して数Ｉｌｖから数十ｍＶ
といった十分検出可能な出力が得られる。

ざらに細径管の内径が０．８＋ａｍ以下、すなわち間隙
ｄ＃（０，２Ｇ＋ａｍ以下では４５＋＊Ｖ以上という大
きな出力が得られる。

以下余白 表　　　　　　　　　　２ （発明の効果） 本発明によれば、従来の光学的検出手段にくらべて格段
に簡単なｐＨ電極を用いたアナライト−レセプタ方式の
測定装置を提供することができる。

また、ｐＨ電極を用いるため小型、安価で、しかも使い
易く中小規模の病院や検査センター、さらにはベツドサ
イドで使用可能な微量アナライト物質測定装置を提供で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による測定原理を示す断面図であり、第
２図は本発明の測定装置の模式図であり、茅３図はｐＨ
−Ｆ　Ｅ　Ｔの斜視図であり、第４図及び第５図は細径
管の一例を示す断面図であり、第６図及び第７図は本発
明装置の測定方法を示す模式図であり、第８図はセルの
細径管部拡大断面図であり、第９図はｐＨ−Ｆ　Ｅ　Ｔ
のソース電位及びその変化速度の時間的変化、を示すグ
ラフであり、第１Ｏ図及び第１１図はｆ！に変とｐＨ応
答曲線の関係を示すグラフであり、第１２　歯５′Ｈ感
応面と細径管内表面とのキヨリとソース電位の関係を示
すグラフである。 １・・・ｐ）［電極　　　　　２・・・ｐＨ感応面３・
・・固　　相　　　　　４・・・基質溶液５・・・コン
ジュゲートを含むアナライト−レセプタ複合体６・・・
細径管 ２・・・細径管をセル内に収納する手段１１・・・セ　
ル　　　１４・・・ｐ■電極１５・・・比較電極 第８図 第９図 的句（介） 第１０図 ｈｌｇＱ　　ＣｏｎＣ，Ｉｎｇ／ｆｆ１ｌｌ第１を図 ｈｌｇＧ　Ｃａａｃ、（ｎｇ／ｍｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アナライト−レセプタ反応を終えた固相と基質溶液
   を接触させて、基質溶液の分解反応に伴う基質溶液のｐ
   Ｈ変化を利用した微量アナライト物質の測定方法であっ
   て、上記固相を基質溶液のｐＨ変化を測定するｐＨ電極
   のｐＨ感応面との間隙が１ｍｍ以下となるように対面配
   置して、該間隙内における基質溶液のｐＨ変化を測定す
   ることを特徴とする微量アナライト物質の測定方法。 ２、アナライト−レセプタ反応を終えた固相と基質溶液
   を接触させて、基質溶液の分解反応に伴う基質溶液のｐ
   Ｈ変化を利用した微量アナライト物質の測定装置であっ
   て、該測定装置は基質溶液の入口と出口を有するセルと
   、該セル内に収容されたｐＨ電極と、該セル内に基質溶
   液を供給するポンプと、測定対象物質たるアナライトと
   特異的に結合する第１のレセプタを固定化した固相に、
   試料溶液と標識第２レセプタ、または標識アナライトを
   接触反応させ、しかる後洗浄した固相をセル内に収納す
   る手段と、セル内に収納された固相の表面とｐＨ電極の
   ｐＨ感応面をその間隙が１ｍｍ以下となるように対面配
   置する固相位置決め手段よりなることを特徴とする微量
   アナライト物質の測定装置。