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JPH01206992A - 塩基性蛋白、その誘導体およびフラグメント、ならびにそれらの用途 - Google Patents

塩基性蛋白、その誘導体およびフラグメント、ならびにそれらの用途

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Publication number
JPH01206992A
JPH01206992A JP63293788A JP29378888A JPH01206992A JP H01206992 A JPH01206992 A JP H01206992A JP 63293788 A JP63293788 A JP 63293788A JP 29378888 A JP29378888 A JP 29378888A JP H01206992 A JPH01206992 A JP H01206992A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
naja
pla2
derivative
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP63293788A
Other languages
English (en)
Inventor
Andre Menez
メネ　アンドレ
Serge Chwetzoff
クベゾーフ　サージ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of JPH01206992A publication Critical patent/JPH01206992A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、エラピダエ科（Ｅｌａｐｉｄａｅ）の蛇特
にナジャ（Ｎａｊａ）蛇、より詳しくはナジャ・モサム
ビカ・バリダやナジャ・ニクリコリヌの毒から単離され
た塩基性蛋白（この蛋白をホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ
２）と称す）、そのフラグメントおよび誘導体；その製
法、ヒトおよび／または家畜用医薬として使用しうる治
療用組成物およびその蛋白、フラグメントおよび／また
は誘導体が存在する診断剤に関する。
（ロ）従来の技術 現在、有機物質または無機物質の何れかの多数の抗腫瘍
剤が存在している。これらの多くの抗腫瘍剤は、細胞核
、特に癌細胞の核に作用する。その作用損傷には色々あ
るが、核酸と蛋白の生合成を阻害するが、ＤＮＡの重複
を阻害または分裂スピンドルに作用するかである。多く
の著者がこれらの異なった作用損傷を報告している（　
Ｒ，に、Ｒａ１ｌ）ｈｅｔ　ａｌ、ＴｌＢ５．１９８３
．２１２〜２１４；Ｌｉｐｐａｒｄ、５ｉｃｅｎｃｅ、
１９８２０２１８　、４５７７　、１０７Ｆ＋−１０８
２；Ｆａｕｖａｕｄｏｎ、　Ｂｉｏｃｈ　１ｍ１ｅ、　
１９ｇ２０６４．４５７〜４７５）。
しかし、抗腫瘍剤は、癌細胞のみに特異的に作用しない
。癌細胞と同様に正常細胞の部分を阻害し、細胞自体が
急速に再生している全組織の毒となる。従って、多くの
抗腫瘍剤はヒトに対して大くの好ましからざる作用を有
するもである。
この所謂副作用が強いことから、既存抗腫瘍剤でみられ
るような薊作用を有さないかつ異なった作用様式と部位
を有する新しい抗腫瘍剤の開発研究がなされている。各
種の細胞、ことにＢリンパ球、′ｒリンパ球ならびにマ
クロファージによって分泌されたある種の物質が、ある
種の癌系の細胞を殺しうろことが最近報告されている（
Ｒｕｄｄｌｅ。
１ｍｍｕｎｏ１．Ｔｏｄａｙ、　１９ｇ７．８，５．１
２９〜１３０）。この物質をコードする遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）がクローンされた（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、１９８４，３１２，７１２〜？２４；Ｉ’ｅｎ
ｎｉｃａｅｔ　ａｔ、Ｎａｔｕｒｅ、１９ｇ４，３１２
．７２４〜７２７）。これらの物質は腫瘍え死因子（Ｔ
ＮＦ）およびリンホトキシン（ＬＴ）として知られてお
り、これらの物質の作用機序は現在のところ判明してい
ない。
蛇毒中の存在する物質で、非常に価値のある他のグルー
プの物質があるが、これらは、事実、多くの系の癌細胞
を殺す能力がある（　ＣｈａｉＩＩｌ−Ｍａｔｙａｓｅ
Ｌ　ａｌ、、Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、１９Ｂ？、
４０，１６，１６０１ｙ１６０７）。
この文献の著者は、蛇毒が生体内および生体外である種
の悪性肉腫と軟骨肉腫に細胞毒作用を示し、ナジャ・ニ
グリコリスの毒が高い細胞毒活性を有すると述べている
。
この細胞毒活性は、先行技術の抗腫瘍剤の作用機序と全
体的に異なり、問題の細胞の膜溶解をする機構に基づく
とみられる。エラピダエ科の蛇の大半の毒のように、東
アフリカのコブラ、ナシヤニグリコリスの毒は３つの群
の毒性蛋白、すなわち、クラーレ化トキシン類、カルジ
オトキシン類とホスホリパーゼ類を含んでいる。
毒の主成分であるカルジオトキシンは、特に細胞毒作用
を示すが、毒全体の細胞毒作用はカルジオトキシン単独
より大きい。蛇系の細胞毒作用は、カルジオトキシンの
細胞毒作用の阻害剤であるカルシウムが存在しても保持
される。従って、カルジオトキシン以外の１以上の細胞
毒因子がナジャ、特にナジャ・ニグリコリスの毒中に存
在する。
ホスホリパーゼ類はそれらの致死性によって異なるグル
ープに分離される。第１のグループは、酸性または中性
のホスホリパーゼ＾２’ｓで低毒性である。これらのＰ
ＬＡ２°Ｓはリン脂質性組織を消化する。第２のグルー
プは、非常に毒性であるＰＬ＾２°Ｓで、単量性の塩基
性分子または塩基性サブユニットを含む分子の何れかで
、これらは多数の蛇毒に見出されており、餌動物の急速
な完全麻酔をさせる。これらの化合物は、シナラプス前
神経末端でのアセチルコリン放出をブロックする能力と
、実質的な病毒性を含む他の効果で特徴付けられる。
第３のグループは強塩基性での毒性のＰＬＡ２°Ｓで、
これらは多くの蛇毒中に見出されているが、その作用機
序は今日までよく知られていない。ナジャ・ニグリコリ
スの塩基性ＰＬＡ２はこの群に属する。
（ハ）課題を解決するための手段 この発明は、ナジャ蛇の毒から単離されたヒトに価値あ
る治療効果を有する蛋白を提供することを目的とする。
その他の目的は、次のごときものである。
毒性がなくて抗腫瘍活性を有する前記蛋白のフラグメン
トを提供すること、 前記蛋白を適当な剤と処理して得られる誘導体で、毒性
がなくて抗腫瘍活性を有するものを提供すること、 前記蛋白を単離する方法を提供すること、前記蛋白の誘
導体またはフラグメントを製造する方法を提供すること
、 前記誘導体および／またはフラグメントを医薬組成物と
して使用すること、 前記誘導体および／またはフラグメントを癌細胞の選択
的検出剤として使用すること、癌細胞の選択的検出用の
簡易キットを提供すること。
この発明は、蛋白が１１８のアミノ酸からなり、Ｈ，３
２５ダルトンのオーダの分子量と、８．６のオーダの等
電点を有し、エラビダエ科の蛇、特にナジャ蛇、より詳
しくはナジャ・ニグリコリス（Ｎａｊａｎｉｇｒｉｃｏ
ｌｌｉｓ）またはナジャ・モサムビカ・バリダ（Ｎａｊ
ａ　ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ　ｐａｌｌｉｄａ）から得ら
れた、または適宜、合成もしくはクローニングによって
得られ、かつ酵素活性と細胞毒活性をする蛇ことにエラ
ピダエ科の蛇の毒から単離されたホスホリパーゼ＾２（
ＰＬＡ２）タイプの塩基性蛋白を提供するものである。
上記の分子量は、ゲル濾過（ＰＡＧＥ−ＳＤＳ）でナジ
ャ・ニグリコリスのα−ノイロトキシン（Ｍ胃・６８０
Ｇ）　、チトクロムＣ（ＭＷ＝１２．５００）　、大豆
芽トリプシン（■・２１．５０Ｇ）　、ウシ直情アルブ
ミン（Ｍｖ・６８．０００）を参照して測定した。
この発明の蛋白は、有利な具体例によれば、次の式（Ｉ
）を有する。
Ａｓｎ　’−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−ＩＩ　ｉｓ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｈｉｓ　”−Ｃｙｓ
　−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　ｌ−Ｐｒ１−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａ
ｒ、ｏ−Ｖａ　Ｉ　−Ｖａ　ｌ　−Ｈｉｓ　”　−Ｐｈ
ｅ−＾１ａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ”−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ａｓｐ−＾５ｐ
−Ｌｅｕ”−Ａｓｐ−＾ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
−Ｖａｌ−１１ｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ”−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＭｅＬ
−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ”−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−！’ｈ
ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ”−３ｅｒ−Ｌｙｓ　−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−ＣｙｓＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ”−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ”−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−
＾１ａ１００−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−１１
ｅ−Ａｓｎ−＾１ａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ’　”−
１１ｅ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｎ’　”−０）１゜この発明の発明者は、前
記蛋白の致死毒作用は、細胞毒作用と酵素作用の２つの
作用の複合によることを例証した。
さらに、この発明者は、前記蛋白と同一または類似の細
胞毒活性を有する前記蛋白のフラグメントおよび誘導体
に関する。
これらの誘導体またはフラグメントは、ホスホリパーゼ
Ａ２と類似の細胞毒活性を有するが、ホスホリパーゼＡ
２の酵素活性を有さない。そのため、毒性ではなく、上
記の複合作用の一方を持たないが、選択的な抗腫瘍活性
を有する。
この発明のフラグメントの中には、特に次のものが含ま
れる。
ＰＬＡ２のフラグメントからなり、前記蛋白の１〜８位
のアミノ酸に対応する次のアミノ酸類シーケンス； −Ａｓｎ’−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｍｅｔ”を有するペプチド、 ＰＬ＾２のフラグメントからなり、前記蛋白の５５〜５
９位のアミノ酸類が、 −ＧＬｙ”−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ”−であ
るアミノ酸シーケンスを有するペプチド、 およびＰＬ＾２のフラグメントからなり、前記ＰＬ＾２
の４４〜５０位のアミノ酸類に対応するアミノ酸シーケ
ンスが −Ｃｙｓ”−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
−Ｃｙｓ”−であるペプチド。
この発明は、前記蛋白中に存在するヒスチジン類の１つ
が修飾された誘導体であって、その誘導体は、酵素活性
を有さないが、前記蛋白と同一または類似の細胞毒活性
を有し、前記のヒスチジンは、式Ｒ−Ｃ１ｌｔ　Ｘ　Ｌ
ｘはハロゲン原子、好ましくは臭素原子、ＲはＣ＋−ｔ
ｏの脂肪族または芳香族基）のアルキル基が固定されて
修飾されている。
アルキル化剤は、この発明の蛋白の４７位のヒスチジン
に固定されるのが好ましく、またブロモフェナシルプロ
ミドで行うのが有利である。
この発明はさらに、蛋白、その７ラグメントおよび／ま
たは誘導体が、適当なターゲット特に癌細胞への選択的
運搬用の物質をカップリングされた接合体に関する。運
搬用の物質は、ホルモン類、ポリクロナール免疫グロブ
リン類、モノクロナール免疫グロブリン類からなる群よ
り選択される。
さらにこの発明は、この発明によるホスホリパーゼＡ２
　（ＰＬＡ２）を得る方法に関し、その蛋白は、エラビ
ダエ科の蛇、ことにナジャ蛇、より詳しくはナジャ・ニ
グリコリスまたはナノヤ・モスサムビカ・バリダの毒か
ら、イオン交換クロマトグラフィーに付し、弱有機酸の
アルカリ塩（特に酢酸アンモニウム）で溶出させ、酵素
活性を有する溶出液を第２のイオン交換クロマトグラフ
ィーに付し、これで単離された蛋白を精製用の高速液体
クロマトグラフィーに付すことからなる。
次に、この発明のＰＬＡ２の誘導体は、ＰＬＡ２を上記
の方法で単離し、これをアルキル化剤Ｒ−ＣＨ２−Ｘ（
Ｘはハロゲン原子、ＲはＣ３，！。の脂肪族または芳香
族基）と接触させ、ＰＬＡ２に存在するヒスチジンの１
つに前記アルキル化剤を固定して、ＰＬＡ２を改質する
ことによって得られる。
アルキル化剤は、ＰＬＡ２の４７位のヒスチジンに導入
されるのが好ましく、ブロモフェナシルプロミドが有利
に用いられる。
ホスホリパーゼＡ２の誘導体は、遺伝子工学法で得るこ
ともでき、前記蛋白をコードするｃ、Ｄ　Ｎ　Ａが上記
したフラグメント４４〜５０を遺伝子的に改質する。
この発明は、この発明によるフラグメントを得る方法に
も関し、そのフラグメントは、蛋白質分解酵素的切断、
特にトリプシンおよび／またはキモトリプシン切断によ
って得ることができる。
この発明は、活性物質として、ホスホリパーゼＡ２の少
なくとも１つの誘導体および／またはフラグメント（こ
れらは運搬分子カップリングしても、していなくてもよ
い）の活性量と、任意に投与用に適する賦形剤とからな
る。特に癌治療用の治療用組成物に関する。
また、この発明は、この発明によって得られるホスホリ
パーゼＡ２の誘導体および／またはフラグメントから本
質的になる腫瘍細胞検出剤に関する。
さらに、この発明は、上記のホスホリパーゼＡ２の誘導
体および／またはフラグメントの適当量（任意に単位投
与用）に分けられてもよい）と、任意に検出用に必要な
バッファー、希釈剤と試薬の適量からなる癌細胞検出用
簡易キットが提供される。
このキットには、ホスホリパーゼ＾２の４７位のヒスチ
ジンをブロモフェナシルプロミツドで改質させたＰＢｐ
−ＰＬＡ２を用いるのが好ましい。
この発明は、以上の変形に加えてこの発明に含まれる他
の変形が次の記載からも明らかになるであろう。次の実
施例にはホスホリパーゼＡ２誘を体の製法、癌細胞に対
するこの発明の誘導体またはフラグメントの特殊な細胞
毒活性、ナジャ・ニグリコリスの毒からのホスホリパー
ゼ＾２との比較での、誘導体またはフラグメントの良好
耐性が示される。
しかし、これらの実施例や実験例はこの発明を例証する
ものでそれによって限定されるものではない。
（以下余白） （ニ）実施例 実施例Ａ　ｎ　ＰＬＡ２の抽出と精製 凍結前をパスツール研究所から入手する。３ｇの毒を１
５１の水に溶解し、遠心分離後、イオン交換樹脂（“バ
イオレックス”７０　（Ｂｉｏｒａｄ）　）に入れる。
これを酢酸アンモニウム０．１４ト１．４Ｍのりニヤー
グラジェントに付した。これで分離されたｌＯのフラク
ション中の４つが卵黄レシチンに対し加水分解活性を示
し、これは前記の方法（Ｅ、Ａ、Ｄｅｎｎｉｓ。
」几１ｐｉｄ　Ｒｅｓ、、１９８６．１４．１５２−１
５９）によるｐＨスタットを用いて行う実験で示された
。これらのフラクション中で最も塩基性のものは、ＰＬ
Ａ２と称するもので、再び“バイオレックス°７０樹脂
を用い、酢酸アンモニウム０．６０ト０．９５Ｍのりニ
ヤーグラジェントによるクロマトグラフィーに付した。
最後にＰＬＡ２は、大きな気孔（ｖｉｄｅ−ｐｏｒｅ）
のブチルカラム（ヌクレオシル）５μｍ上逆相高速液体
クロマトグラフィーに付した。酵素は、水／トリフルオ
ロ酢酸混液中のアセト、ニトリルのグラジェントで溶離
され−る。
溶離液のプロフィルは図１に示され、これは、“バイオ
レックス”７０イオン交換樹脂使用のクロマトグラフィ
ーによるナジャ、ニグリコリスの毒の溶離プロフィルを
示す。なお樹脂は、前もって、ｐＨ７，４の０．１．４
Ｍ酢酸アンモニウムバッファーで平衡化した。
次いで、毒をカラム（３０ｘ　ｌ　ａｍ）の上から導入
し、保持されないフラクションは直ちに溶出した。
これはマークを付したが、ホスホリパーゼＡ２である。
この区分の溶出後に、０．１４ト１．４Ｍの酢酸アンモ
ニウムのグラジェントを同じＰＨで用いた。同じくマー
クで示したが最も毒性のホスホリパーゼＡ２が、最後の
フラクション、すなわち図の１番右のものを溶出する。
このフラクションを再びバイオレックス脂でのクロマト
グラフィーに、次いで高速液体クロマトグラフィーに付
した。
実施例Ｂ　：　ＰＬＡ２−ｐＢｐの製法実施例Ａで得た
ＰＬＡ２をバラブロモクナシルブロミドと接触させろ。
このプロミドは、ホスホリパーゼの活性部位のヒスチジ
ンに優先的に反応することが知られているものである（
Ｖｏｌｗｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９７４．１３１４４６〜１４５４
）。
上記の実験条件は次の通りである。
１５０ミリ１モルのＰＬＡ２を、　ＮａｃＩを０．１モ
ル／リットルを含有するｐＨ６のカコジル酸ナトリウム
緩衝液２ｎ＋Ｉ２に溶解する。この溶液に、５０ｇｇの
アセトン中過剰のｐＢｐ（５モル）の液を加える。５時
間３０℃の暗所で撹拌後、反応混合物のｐＨを氷酢酸で
３に下げた。サンプルを凍結し、高速液体クロマトグラ
フィー（大きな気孔のブチルカラム）に付した。疎水性
を増加させたグラジェント（アセトニトリル）で製品を
溶出させる。
薬理テスト 実施例１　：　ＰＬＡ２とそのｐＢｐ誘導体のシーケン
スの比較 ＰＬＡ２のアミノ酸シーケンス ナジャ・ニクリコリスの毒からの塩基性ホスホリパーゼ
の完全アミノ酸シーケンスは、ブロムシアンによる分解
Ａ、リティカスのりジルエンドペプチダーゼ（Ａ、Ｌｙ
Ｌｉｅｕｓ　Ｉｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｔａｓｅ）
とＳ、オウレウスｖ８のプロテアーゼ（Ｓ、ａｕｒｅｕ
ｓ　Ｖ８Ｐｒｏｔｅａｓｅ）の蛋白分解によって得られ
たヘプチド類に基づいて認められ゛た。
蛋白は１１ｇのアミノ酸からなり、１４１／２のシスチ
ン残基を有する。
ブロムシアンで処理し、カルボキシメチル化したホスホ
リパーゼの区分は、８つのアミノ酸、４９のアミノ酸、
６１のアミノ酸からそれぞれなるペプチドを与える。
他のシーケンスは、他の区分から得ることができる。こ
れらの異なるシーケンスを重ねるとＰＬＡ　２のシーケ
ンスを確立する′ことができる。
ｐ［３ｐ誘導体 ｐＢｐ−ＰＬＡ２誘導体は１分子当たり１つのヒスデシ
ンを欠き、２７６．５ｍｍにおける分子吸光係数は４５
，５００である。
実施例２：ＰＬＡ２とその誘導体の比較毒性ＰＬＡ２と
その誘導体とを別々にマウス（Ｉ８〜２０ｇ。
Ｂａ１ｂｃ、メス）に静注する。ＰＬＡ２とその誘導体
はＯＪｍ１２の生理食塩水に溶解して用いる。ＰＬＡ２
の１０ｇｇの投与が各マウスを致死させ、一方ＰＬＡ２
−ｐＢｐ−の２．３ｍｇの投与で各マウスを致死させな
い。
表１ 表１は、ＰＬＡ２、誘導体ｐＢｐ−ＰＬＡ２とＣＮＢｒ
処理の誘導体のＬＤ、。値を示す。これは生理食塩水１
１．３ｍ（Ｊに溶解した上記の所定量をＢａ１ｂ　ｃマ
ウス（２０±Ｉｇ）の層の血管に注射し２４時間後に生
存率を観察することにより得られる。なお必要により、
少なくとも１週間毎日観察する。〉は、上記した量で注
射で死亡しなかったことを示す。
ＰＬＡ２は実質的な致死活性で特徴付けられ、これに対
して２つの誘導体は非毒性である。
実施例３　：　ＰＬＡ２とそのｐ１３ｐ誘導体の細胞毒
活性の測定 ホスホリパーゼＰＬＡ２とそのｐＢｐ誘導体の細胞毒活
性は次のようにして測定される。
カルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳ−ＤＵＬＢ
ＥＣＣＯ培地１ｍ１）当たり３．５Ｘ１０’セルを含有
する所定の均一種のセル懸濁液に各種の量のホスホリパ
ーゼまたはその誘導体をいれる。培養は３７℃で１時間
行う。トリパンブルー染料を培地に加える。
崩解したセルの数を測定することにより、化合物の細胞
毒活性を評価することができる。この細胞毒活性は、背
景を差引き、対象セルの５０％を殺す化合物の濃度で定
量化される（　Ａｃ５゜）。表■は、８つのセル系（内
３つは癌系で３つは正常細胞）についてのＰＬＡ２とｐ
Ｂｐ誘導体の細胞毒裏皮（Ａｃ１゜）を示す。
（以下余白） 表■ この表は、ＰＬＡ２またはｐＢｐ−ＰＬＡ２が、悪性ま
たは正常細胞を殺すのに必要な濃度を示す。＞Ｘ　（Ｘ
はモル／リフドルで表した濃度）は、問題の細胞がＰＬ
Ａ２またはその誘導体のその濃度では死なないことを示
す。
天然ＰＬＡ２は、テスト対象の細胞（悪性および正常に
関係なく）全てに細胞毒であることが分かる。
一方ｒ’ＬＡ２−ｐＢｐは悪性の癌細胞のみに選択的に
細胞毒であることにより特徴付けられる。５つの悪性転
換種の内４つはこの物質で分解され、３つの正常細胞は
影響されていない。
図２は、ナジャ・ニグリコリスの毒からのＰＬＡ２が異
なる濃度に存在する場合のＰＬ細胞の細胞溶解の速度を
示す。横座標に時間（時）と縦座標に細胞溶解速度をそ
れぞれプロットしている。
口はＰＬＡ２の２μｍｏ１２／１２に対応◇はＰＬＡ２
の１μｍｏ１２／ｉ２に対応＋はＰＬＡ２の０，５ｕ＋
ｏ１２／１２に対応ＸはＰＬＡ２の０．２５ｕｍ１２／
１２に対応間はＰＬ＾２のＯｕｍＱ／Ｑに対応 細胞の膜溶解は、トリパンブルー沈積テストで分かる。
この図から、塩基性ＰＬ＾２が非常に細胞毒で、ＰＬＡ
２の細胞毒効果は、培養時間と、ＰＬＡ２ａ度の双方に
依存することが分かる。
実施例４：ＰＬＡ２とその誘導体の酵素活性の測定酵素
活性は、０．１１ＭのトリトンＸ　１００の存在下、４
０’Ｃ，ｐＨ８で、ホスホチジルコリン（５，５Ｘ　１
０−”Ｍ濃度）について１分間当たり１　ｕｖａｏ（ｌ
を加水分解する酵素量に相応する。Ｖｍａｘ値は、ＰＬ
Ａ２の１０−’ｍｏｆ２／Ｑを用い、同じ条件下で測定
される。
表■は塩基性ＰＬ＾２が卵黄レシチンに脂肪分解活性を
有することを示す。この脂肪分解活性はＳｎ”の存在下
よりＣａ″０の存在下でより認められ、ＥＤＴＡの存在
下ではＰＬＡ２が１０−’Ｍでも認められない。
（以下余白） 表■ この発明によるｐＢｐ−ＰＬＡ２には検出しうる酵素活
性が認められず、ＣＮＢｒ−ＰＬＡ２では弱いが明らか
な酵素活性が認められる。
図３は、ＰＬ細胞の溶解を示し、ＰＬＡ２　（◆は６ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ、■は２ｍＭ　Ｓｒ”、ムは２ｍＭ　Ｃａ
”°を共存）、ブロムシアンで化学的に処理した誘導体
（◇）およびバラブロモフェナシルプロミドで処理した
誘導体（ロ）を異なる濃度で存在させ、６０分培養した
際のものである。他の条件は図２のものと同じである。
横軸にμλ１の蛋白濃度、縦軸に溶解された細胞のパー
セントをプロットしている。
この図で示されるようにＰＬＡ２で得られた投与−レス
ポンス曲線は、カルシウム、ストロンチウムおよびＥＤ
ＴＡの存在、不存在に関係なく同じである。
高濃度の２価のカチオンまたはＥＤＴＡか存在しても培
養期間中細胞の安定性を変えないことが証明された。
細胞の膜溶解は、ＥＬ細胞で、３７℃または４℃で６０
分間行われたが、４℃でのカーブにみるべき差異が観察
されなかった。
２つのＰＬＡ　２誘導体、すなわちｐａｐ−ＰＬＡ２と
、ＰＬＡ２を酸性媒体のブロムシアンで分解された誘導
体についてもテストを行った。
図３はｐＢｐ−ＰＬＡ２がＰＬ細胞に細胞毒活性を有し
、ＣＮＢｒ処理の誘導体は細胞毒活性を有さないことを
示す。
上記の説明から明らかなように、この発明は、上記の具
体例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ナジャ・ニグリコリスの毒の溶離液の２８０
ｎｍにおける光学濃度プロフィルを示す。第２図は、こ
の発明によるＰＬＡ２についてのＰＬ細胞に対する細胞
溶解速度を示す。第３図はこの発明による蛋白による溶
解されたＦＬ細胞のパーセントと蛋白濃度との関係を示
す。 第１図 第２図 時閉（Ｈ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、蛋白が１１８のアミノ酸類からなり、１３．３２５
    ダルトンのオーダの分子量と、８．６のオーダの等電点
    を有し、エラピダエ科の蛇、特にナジャ蛇より詳しくは
    ナジャ・ニグリコリスまたはナジャ・モサムビカ・パリ
    ダの毒から得られ、または適宜合成らしくはクローニン
    グによって得られ、かつ酵素活性と細胞毒活性の両方を
    有するホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）タイプの塩基性
    蛋白。 ２、下記の式 I 【遺伝子配列があります】 を有する請求項１記載の蛋白。 ３、式（ I ）の１〜８位のアミノ酸に相当する次のア
    ミノ酸シーケンス： −Ａｓｎ＾１−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
    ｓ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ＾６−．を有するペプチドからなる
    請求項１または２記載による蛋白のフラグメント。 ４、式（ I ）の５５〜５９位のアミノ酸に相当する次
    のアミノ酸シーケンス： −Ｇｌｙ＾５＾５−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ＾
    ５＾９−．を有するペプチドからなる請求項１または２
    記載による蛋白のフラグメント。 ５、式（ I ）の４４〜５０位のアミノ酸に相当する次
    のアミノ酸シーケンス： −Ｃｙｓ＾４＾４−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−
    Ａｓｎ−Ｃｙｓ＾５＾０−を有するペプチドからなる請
    求項１または２記載による蛋白のフラグメント。 ６、請求項１または２記載の蛋白のシーケンスに存在す
    るヒスチジン類の１つが、式Ｒ−ＣＨ＿２−Ｘ（式中Ｘ
    はハロゲン原子、好ましくは臭素原子、ＲはＣ＿１＿−
    ＿２＿０の脂肪族もしくは芳香族基）のアルキル基での
    固定によって修飾され、該蛋白と同一または類似の細胞
    毒活性を有するが該蛋白の酸素活性を有さない、請求項
    １または２記載による蛋白の誘導体。 ７、請求項１または２記載の蛋白、請求項３〜６記載の
    何れかのフラグメントまたは誘導体が、適切なターゲッ
    トことに癌細胞への選択的運搬用の物質と結合しており
    、その運搬用物質が、ことにホルモン類、ポリクロナー
    ル免疫グロブリン類およびモノクロナール免疫グロブリ
    ン類からなる群から選択されることからなる接合体。 ８、エラピダエ科の蛇、ことにナジャ蛇、よりくわしく
    はナジャ・ニグリコリスまたはナジャ・モスサムビカ・
    パリダの毒を弱有機酸の塩、ことに酢酸アンモニウムで
    溶出させるイオン交換クロマトグラフィーに付し、酵素
    活性を有する溶出液を第２のイオン交換クロマトグラフ
    ィーに付し、このようにして単離した蛋白を精製のため
    高速液体クロマトグラフィーに付することからなる、請
    求項１または２記載の蛋白を得る方法。 ９、請求項８記載の方法によりホスホリパーゼＡ２タイ
    プの蛋白を単離し、次いでこの蛋白を式Ｒ−ＣＨ＿２−
    Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ＲはＣ＿１＿−＿２＿０の脂肪
    族または芳香族基）のアルキル化剤と接触させ、蛋白中
    に存在するヒスチジン類の１つに前記アルキル化剤を固
    定することによって修飾することからなる請求項６記載
    の蛋白の誘導体を得る方法。 １０、請求項１または２記載の蛋白をコードするｃＤＮ
    Ａを、その蛋白のフラグメント４４〜５０で遺伝子工学
    的に修飾することからなる請求項６記載の蛋白の誘導体
    を得る方法。 １１、請求項３〜５記載の何れかのフラグメントを蛋白
    分解切断、ことにトリプシン切断および／またはキモト
    リプシン切断によって得ることからなる請求項３〜５記
    載のフラグメントを得る方法。 １２、活性物質として、請求項第３〜７記載の何れかの
    誘導体および／またはフラグメント（これらは適切なタ
    ーゲット、ことに癌細胞への選択的運搬用物質を結合し
    ていても、していなくてもよい）の少なくとも１種の活
    性量と、任意に投与用に適する賦形剤とからなる、こと
    に癌の治療に用いる治療用組成物。 １３、請求項３〜６記載の何れかの誘導体および／また
    はフラグメントから本質的になる腫瘍細胞検出剤。 １４、請求項３〜６記載の何れかの誘導体および／また
    はフラグメントの適量（任意に単位用量用に分けられて
    いてもよい）と、かつ、任意に緩衝剤、希釈剤および検
    出を行うのに必要な試薬の適量とからなる腫瘍細胞検出
    用の簡易キット。 １５、誘導体が請求項１または２記載の蛋白の４７位の
    ヒスチジンにプロモフェナシルブロシドを固定して得ら
    れるｐＢｐ−ＰＬＡ２である請求項１４記載のキット。
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