JP3439490B2

JP3439490B2 - 蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法

Info

Publication number: JP3439490B2
Application number: JP28113692A
Authority: JP
Inventors: 完三岩城; 恒孝太田; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1992-09-28
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 2003-08-25
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: EP0594311B1; JPH06107693A; KR940007056A; EP0594311A1; US5498697A; TW241268B; KR100294977B1; US5585474A; US5827691A; DE69331368D1; DE69331368T2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌転移抑制活性を有す
る新規蛋白質とその蛋白質をコードするＤＮＡ、さらに
は、その蛋白質の製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】現在、癌の治療は、主として外科的手
術、化学療法、放射線療法により行われている。多くの
癌はこれらの方法により治療できるが、万一、癌細胞の
一部が治療後も生き残るようなことがあると、その生き
残った一部の癌細胞が撒き散らされて一層重篤な癌転移
を促進し、患者の寿命を却って縮めてしまうことにな
る。癌転移が抑制できれば、癌患者の苦痛を和らげ、余
命を大幅に延ばすことが可能になると考えられ、現在、
有効な癌転移抑制剤の開発が強く望まれている。しかし
ながら、癌転移は一般に複雑な過程を経て成立すると考
えられており、それ故に、未だ有効な癌転移抑制剤を開
発できないでいるというのが実状である。

【０００３】なお、これまでにも、癌転移抑制活性を有
する様々な蛋白質が報告されているけれども、何れも本
発明の蛋白質とは相違するものである。例えば、インタ
ーフェロン、インターロイキン−２及び腫瘍壊死因子が
癌転移抑制活性を有するとの報告があるが、これらは何
れも分子量及びアミノ酸配列において本発明の蛋白質と
は明らかに異なり、且つ、何れも未だ有効な癌転移抑制
剤とはなり得ていない。一方、特開平２−３０８７９９
号公報には、ヒト造血器由来の細胞が産生する癌転移抑
制因子が開示されているけれども、例えば、分子量一つ
とってみても１０，０００乃至４５０，０００と極めて
曖昧であり、物質としての構造や性質・性状が明らかに
されているとは言い難い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このような状況に鑑
み、本発明の目的とするところは、癌転移を効果的に抑
制する新規な蛋白質を提供することにある。

【０００５】本発明の別の目的は、その蛋白質をコード
するＤＮＡを提供することにある。

【０００６】本発明のさらなる目的は、その蛋白質の製
造方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等が癌転移抑制
活性を有する新規物質を見出すべく鋭意研究したとこ
ろ、ヒトＴ細胞白血病由来の株化細胞であるＨＰＢ−Ｍ
ＬＴ細胞（微工研条寄第２４３０号）をカルメット・ゲ
ランウシ型結核菌（以下、「ＢＣＧ」と略記する。）及
びリポ多糖（以下、「ＬＰＳ」と略記する。）で刺激す
ると、その培養上清中に癌転移抑制活性が出現すること
を見出した。そして、その本体を解明すべく鋭意研究を
続けたところ、癌転移抑制活性の本体は蛋白質であり、
次のような理化学的性質を有するものであることが判明
した。

【０００８】（１）分子量４５，０００±５，０００

【０００９】（２）等電点ｐＩ＝５．７±０．５

【００１０】（３）部分アミノ酸配列 Asp Ser Glu Gly Tyr Ile Tyr Ala Arg Gly Ala Gln Asp Met Lys 1 5 10 15 及び Glu His Trp Ser His Asp Pro Phe Gluを有する 1 5

【００１１】（４）溶剤に対する溶解性水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶。

【００１２】（５）生物活性ヒト大腸癌由来の培養株化細胞であるＲＰＭＩ４７８８
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する

【００１３】（６）安定性水溶液中、ｐＨ７．２において１００℃で３０分間放置
すると失活する。水溶液中、ｐＨ７．２において４℃で１ヶ月間放置して
も安定。

【００１４】本発明者等が当該蛋白質を単離し、そのア
ミノ酸配列を分析したところ、化１に示すようなアミノ
酸配列を有することが判明した。なお、本発明で言う
「実質的に化１で表わされるアミノ酸配列を含有する」
とは、本発明の蛋白質は化１に示すアミノ酸配列を有す
るもののみに限定されず、その相同変異体をも包含する
ということを意味する。言い換えれば、前記理化学的性
質を有する限り、化１に示すアミノ酸配列の一部のみを
有する蛋白質も本発明に包含される。

【００１５】〈化１〉Met Thr Ser Lys Gly Pro Glu Glu Glu His Pro Ser Va1 Thr Leu Phe 1 5 10 15 Arg Gln Tyr Leu Arg Ile Arg Thr Val Gln Pro Lys Pro Asp Tyr Gly 20 25 30 Ala Ala Va1 Ala Phe Phe Glu Glu Thr Ala Arg Gln Leu Gly Leu Gly 35 40 45 Cys Gln Lys Va1 Glu Val Ala Pro Gly Tyr Val Va1 Thr Val Leu Thr 50 55 60 Trp Pro Gly Thr Asn Pro Thr Leu Ser Ser 11e Leu Leu Asn Ser His 65 70 75 80 Thr Asp Va1 Va1 Pro Val Phe Lys Glu His Trp Ser His Asp Pro Phe 85 90 95 Glu Ala Phe Lys Asp Ser Glu Gly Tyr Ile Tyr Ala Arg Gly Ala Gln 100 105 110 Asp Met Lys Cys Va1 Ser Ile Gln Tyr Leu Glu Ala Val Arg Arg Leu 115 120 125 Lys Val Glu Gly His Arg Phe Pro Arg Thr Ile His Met Thr Phe Val 130 135 140 Pro Asp Glu Glu Val Gly Gly His Gln Gly Met Glu Leu Phe Va1 Gln 145 150 155 160 Arg Pro Glu Phe His Ala Leu Arg Ala Gly Phe Ala Leu Asp Glu Gly 165 170 175 Ile Ala Asn Pro Thr Asp Ala Phe Thr Va1 Phe Tyr Ser Glu Arg Ser 180 185 190 Pro Trp Trp Val Arg Val Thr Ser Thr Gly Arg Pro Gly His Ala Ser 195 200 205 Arg Phe Met Glu Asp Thr Ala Ala Glu Lys Leu His Lys Val Val Asn 210 215 220 Ser Ile Leu Ala Phe Arg Glu Lys Glu Trp Gln Arg Leu Gln Ser Asn 225 230 235 240 Pro His Leu Lys Glu Gly Ser Val Thr Ser Val Asn Leu Thr Lys Leu 245 250 255 Glu Gly Gly Val Ala Tyr Asn Val Ile Pro A1a Thr Met Ser Ala Ser 260 265 270 Phe Asp Phe Arg Val Ala Pro Asp Val Asp Phe Lys Ala Phe Glu Glu 275 280 285 Gln Leu Gln Ser Trp Cys Gln Ala Ala Gly Glu Gly Val Thr Leu Glu 290 295 300 Phe Ala Gln Lys Trp Met His Pro Gln Val Thr Pro Thr Asp Asp Ser 305 310 315 320 Asn Pro Trp Trp Ala Ala Phe Ser Arg Val Cys Lys Asp Met Asn Leu 325 330 335 Thr Leu Glu Pro Glu I1e Met Pro Ala Ala Thr Asp Asn Arg Tyr Ile 340 345 350 Arg Ala Val Gly Val Pro A1a Leu Gly Phe Ser Pro Met Asn Arg Thr 355 360 365 Pro Val Leu Leu His Asp His Asp Glu Arg Leu His Glu Ala Val Phe 370 375 380 Leu Arg Gly Val Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ser 385 390 395 400 Val Pro Ala Leu Pro Ser Asp Ser 405

【００１６】このアミノ酸配列に基づき、ＨＰＢ−ＭＬ
Ｔ細胞から本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを検索し
たところ、化２に示す塩基配列を含むことが判明した。
本発明のＤＮＡも化２に示す塩基配列のもののみに限定
されず、本発明で言う「実質的に化２で表わされる塩基
配列を有する」とは、化２に示す塩基配列全体を含むも
のは言うに及ばず、その一部を含むものをも包含し得る
ことを意味する。例えば、遺伝子コードの縮重に基づ
き、化２に示す塩基配列における一以上の塩基が他の塩
基に置換されたもの、前記のような相同変異体を暗号指
定する塩基配列、さらには、化２に示す塩基配列と相補
的な塩基配列も本発明に包含される。なお、相補的な塩
基配列の場合、化２に示す塩基配列全体に相補的な配列
であっても良いし、その一部と相補的な配列であっても
良い。

【００１７】〈化２〉ATGACCAGCA AGGGTCCCGA GGAGGAGCAC CCATCGGTGA CGCTCTTCCG CCAGTACCTG 60 CGTATCCGCA CTGTCCAGCC CAAGCCTGAC TATGGAGCTG CTGTGGCTTT CTTTGAGGAG 120 ACAGCCCGCC AGCTGGGCCT GGGCTGTCAG AAAGTAGAGG TGGCACCTGG CTATGTGGTG 180 ACCGTGTTGA CCTGGCCAGG CACCAACCCT ACACTCTCCT CCATCTTGCT CAACTCCCAC 240 ACGGATGTGG TGCCTGTCTT CAAGGAACAT TGGAGTCACG ACCCCTTTGA GGCCTTCAAG 300 GATTCTGAGG GCTACATCTA TGCCAGGGGT GCCCAGGACA TGAAGTGCGT CAGCATCCAG 360 TACCTGGAAG CTGTGAGGAG GCTGAAGGTG GAGGGCCACC GGTTCCCCAG AACCATCCAC 420 ATGACCTTTG TGCCTGATGA GGAGGTTGGG GGTCACCAAG GCATGGAGCT GTTCGTGCAG 480 CGGCCTGAGT TCCACGCCCT GAGGGCAGGC TTTGCCCTGG ATGAGGGCAT AGCCAATCCC 540 ACTGATGCCT TCACTGTCTT TTATAGTGAG CGGAGTCCCT GGTGGGTGCG GGTTACCAGC 600 ACTGGGAGGC CAGGCCATGC CTCACGCTTC ATGGAGGACA CAGCAGCAGA GAAGCTGCAC 660 AAGGTTGTAA ACTCCATCCT GGCATTCCGG GAGAAGGAAT GGCAGAGGCT GCAGTCAAAC 720 CCCCACCTGA AAGAGGGGTC CGTGACCTCC GTGAACCTGA CTAAGCTAGA GGGTGGCGTG 780 GCCTATAACG TGATACCTGC CACCATGAGC GCCAGCTTTG ACTTCCGTGT GGCACCGGAT 840 GTGGACTTCA AGGCTTTTGA GGAGCAGCTG CAGAGCTGGT GCCAGGCAGC TGGCGAGGGG 900 GTCACCCTAG AGTTTGCTCA GAAGTGGATG CACCCCCAAG TGACACCTAC TGATGACTCA 960 AACCCTTGGT GGGCAGCTTT TAGCCGGGTC TGCAAGGATA TGAACCTCAC TCTGGAGCCT 1020 GAGATCATGC CTGCTGCCAC TGACAACCGC TATATCCGCG CGGTGGGGGT CCCAGCTCTA 1080 GGCTTCTCAC CCATGAACCG CACACCTGTG CTGCTGCACG ACCACGATGA ACGGCTGCAT 1140 GAGGCTGTGT TCCTCCGTGG GGTGGACATA TATACACGCC TGCTGCCTGC CCTTGCCAGT 1200 GTGCCTGCCC TGCCCAGTGA CAGC 1224

【００１８】さらに、本発明は当該蛋白質の製造方法を
も提供するものであり、本発明の蛋白質は、その蛋白質
の産生能を有する細胞を培養し、その培養物から蛋白質
を採取することにより製造することができる。本製造方
法で使用する細胞としては、例えば、ＨＰＢ−ＭＬＴ細
胞やＭＯＬＴ−４細胞などのヒトＴ細胞白血病由来の株
化細胞などが挙げられるが、本発明はこれらヒト細胞を
用いる態様に限定されない。動物由来の細胞や微生物で
あっても、その細胞乃至微生物が本来的に当該蛋白質の
産生能を有するものであるか、或は、例えば、細胞融合
法や遺伝子組換法によって当該蛋白質をコードする本発
明のＤＮＡを導入したものであって、培養後、その培養
物中から本発明の蛋白質を採取することができる限り、
前記ヒト細胞と同様、本発明において有利に使用するこ
とができる。

【００１９】このように、本発明の製造方法で使用する
細胞は本明細書に具体的に開示した細胞のみに限定され
ず、本発明の蛋白質は、必要に応じて、これら細胞の何
れかをＢＣＧ及びＬＰＳなどの適当な刺激剤で刺激しな
がら培養し、その細胞若しくは培養上清から生成した癌
転移抑制活性を有する蛋白質を採取することにより製造
することができる。そして、その培養は動物細胞若しく
は微生物一般の培養に準じればよく、ビタミン、ミネラ
ル、炭水化物などを含んでなる公知の培養培地を使用す
ることができる。採取方法も蛋白性生理活性物質一般の
精製に用いられる一種若しくは二種以上の方法が採用で
き、例えば、塩析、透析、遠心分離、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳
動、等電点分画などの方法を適宜組合わせればよい。

【００２０】このように、本発明は前記目的を達成する
ものであって、癌転移抑制活性を有する新規蛋白質、そ
の蛋白質をコードするＤＮＡ、さらには、その蛋白質の
製造方法を包括するものである。

【００２１】次に、実験により本発明を説明する。

【００２２】

【実験１】癌転移抑制活性の測定癌転移抑制活性は、猶本等、『ジャーナル・オブ・キャ
ンサー・リサーチ・クリニカル・オンコロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣ
ｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ）』、第１１３巻、
第５４４〜５４９頁（１９８７年）に記載された方法に
準じ、ヌードマウスにＲＰＭＩ４７８８細胞（微工研条
寄第２４２９号）を移植して肺転移を起こさせるモデル
を用いて測定した。

【００２３】すなわち、被験群においては、細胞を移植
する２日前、１日前及び３時間前に、先ず、ＢＡＬＢ／
ｃヌードマウス（５匹以上）の尾静脈に被験標品を含む
燐酸緩衝液０．２ｍｌを計３回注射した。ヌードマウス
の尾静脈にＲＰＭＩ４７８８細胞２×１０⁶ 個を注射し
て移植した翌日から、被験標品を１日１回、７日間連続
して前記と同様に注射した。対照群に対しては、被験標
品を含まない燐酸緩衝液を用いた以外、試験群と同様に
処置した。細胞を移植してから２１日目にヌードマウス
を屠殺し、その肺表面の転移巣を肉眼で計数した。対照
群において５０個以上の平均転移巣数が認められ、且
つ、被験群においてこの平均転移巣数が半分以下に減少
し、その減少が統計学的に有意と判定されたときに、癌
転移抑制活性があると判断した。

【００２４】

【実験２】ＢＣＧ／ＬＰＳ刺激ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞培
養上清の調製新生仔ハムスターに予めウサギから公知の方法で調製し
た抗ハムスター胸腺血清を注射して免疫を弱めた後、そ
の皮下にＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を移植し、通常の方法で４
週間飼育した。皮下に生じた約２０ｇの腫瘍を摘出し、
細切して分散させた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ１６４
０培地で洗浄した後、同じ培地に５×１０⁶ 個／ｍｌの
濃度になるように再懸濁し、得られた懸濁液にＢＣＧを
１０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で１日培養した。次い
で、培養物にＬＰＳを１μｇ／ｍｌ添加し、さらに１日
培養した後、遠心分離して培養上清を採取した。

【００２５】

【実験３】本発明の蛋白質の精製と理化学的性質実験２で得た培養上清をメンブランモジュール『ＡＩＬ
３０１３（旭化成工業製造）』により約２０倍濃縮し、
２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に対
して透析した後、２５ｍＭイミダゾール−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化させたＰＢＥ−９４カラム（フ
ァルマシア・エル・ケー・ビー製造）に負荷した。次い
で、カラムにｐＨ４．０のポリバッファー７４（ファル
マシア・エル・ケー・ビー製造）を通液して培養上清を
溶出させ、各溶出画分をＰＢＳに対して透析した後、癌
転移抑制活性の有無を試験した。その結果、ｐＨ５．０
乃至６．５の間に溶出した画分に癌転移抑制活性のある
ことが判明した。活性画分を集め、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００カラム（ファルマシア・エル・ケー・ビー
製造）により再分画した後、各溶出画分の癌転移抑制活
性を試験したところ、溶出液体積／充填ゲル体積が０．
５乃至０．６５の間に溶出した画分に癌転移抑制活性が
認められた。その活性画分を１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７．４）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−５
ＰＷカラム（東ソー製造）に負荷し、次いで、１０ｍＭ
から５００ｍＭまでの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
４）による直線濃度勾配下で溶出させたところ、癌転移
抑制活性は、燐酸カリウム緩衝液の濃度が７０ｍＭ付近
に溶出された。このようにして得られた活性画分を１０
ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対して透析
した後、１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラム（東亜燃料
工業製造）に負荷し、カラムに１０ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６．８）を通液したところ、癌転移抑制活
性は非吸着画分に認められた。この非吸着画分を２５ｍ
Ｍビス・トリス−イミノ二酢酸緩衝液（ｐＨ７．１）で
平衡化させたＭｏｎｏ−Ｐカラム（ファルマシア・エル
・ケー・ビー製造）に負荷し、次いで、ポリバッファー
７４（ｐＨ４．０）で溶出させることにより、癌転移抑
制活性を有する本発明の蛋白質を単離した。

【００２６】このようにして、ＢＣＧ及びＬＰＳで刺激
したＨＰＢ−ＭＬＴ細胞の培養上清５０リットルから本
発明の蛋白質約７０μｇを単離した。本品を用いて理化
学的性質を調べた。

【００２７】（１）分子量本品をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、『ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９
７０年）に記載された方法に準じてドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ」と略記する。）し、分子量マーカとの相対
易動度より分子量を測定したところ、４５，０００±
５，０００であった。

【００２８】（２）等電点Ｍｏｎｏ−Ｐカラムからの溶出ｐＨより、本品の等電点
は５．７±０．５と推定された。

【００２９】（３）部分アミノ酸配列本品をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルから分子量約４
５，０００に相当するバンドを切出した。切出したゲル
切片を０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む１００ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）溶液中、３７℃で
１時間処理した後、リジルエンドペプチダーゼ（和光純
薬製造）を５μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で一晩消化し
た。消化物の上清をＤＥＡＥプレカラム付きのＣ１８カ
ラム（バイダック製造）による逆相クロマトグラフィー
で分画し、ペプチド断片を分取した。得られたペプチド
断片の部分アミノ酸配列をアミノ酸シーケンサ『４７０
Ａ型（アプライッドバイオシステム社製造）』により分
析した結果を化３、化４、化５及び化６に示す。

【００３０】〈化３〉Asp Ser Glu Gly Tyr Ile Tyr Ala Arg Gly Ala Gln Asp Met Lys 1 5 10 15

【００３１】

【００３２】

【００３３】

【００３４】（４）溶剤に対する溶解性本品は水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶であった。

【００３５】（５）生物活性本品の癌転移抑制活性を実験１の方法で試験した。その
結果、対照群（ヌードマウス５匹使用）における転移巣
数が３１４±１６９個であったのに対して、本品を２５
０μｇ／ｍｌ含む溶液を投与した群（ヌードマウス５匹
使用）の転移巣数は１００±４３個であり、本品が顕著
な癌転移抑制活性を有することが明らかとなった。

【００３６】（６）安定性本品をｐＨ７．２の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を１００
℃で３０分間放置した後、実験１の方法で癌転移抑制活
性を試験したところ、活性は認められず、本発明の蛋白
質はこの条件下で失活することが判明した。一方、本品
をｐＨ７．２の燐酸緩衝液に溶解し、溶液を４℃で一ヶ
月間放置した後、同様に活性を試験したところ、活性の
低下は認められず、本発明の蛋白質はこの条件下で安定
であることが判明した。

【００３７】

【実験４】急性毒性試験７週齢のマウスを使用して、本品の急性毒性を試験した
ところ、静脈内に投与した場合、本品のＬＤ _５０は５０
ｍｇ／ｋｇ以上と、極めて毒性の低いことが判明した。

【００３８】

【実験５】本発明の蛋白質をコードする遺伝子の塩基
配列本実験では、ティー・マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等、『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラ
トリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）』、
第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年などに記載されている
一般的な方法を採用し、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子の塩基配列を決定した。

【００３９】

【実験５−１】ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡライブ
ラリーの作製実験２の方法で得たＨＰＢ−ＭＬＴ細胞を血清無添加の
ＲＰＭＩ１６４０培地に５×１０⁶ 個／ｍｌの濃度にな
るように懸濁した。次いで、懸濁液にＢＣＧを１０μｇ
／ｍｌ添加し、３７℃で１日培養した後、ＬＰＳを１μ
ｇ／ｍｌ添加してさらに４．５時間培養した。培養物を
遠心分離して回収した細胞を４Ｍグアニジウム・イソチ
オシアネートで可溶化し、ホモゲナイズした後、５．７
Ｍ塩化セシウム上に重層させ、２５，０００ｒｐｍでさ
らに１７時間遠心分離することによりトータルＲＮＡを
得た。次いで、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ精製用ビーズ『オリ
ゴテックス−ｄＴ３０・スーパ（第一化学薬品製造）』
を用いてポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを精製し、そのポリ（Ａ）
⁺ ＲＮＡにｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャム
製造）をそこに添加されている指示書にしたがって適用
することによりｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＤＮＡ
クローニングシステムλｇｔ１０（アマシャム製造）を
用いてその合成したｃＤＮＡとλｇｔ１０ファージＤＮ
Ａとをライゲーションさせ、ライゲーションにより得ら
れた組換ファージＤＮＡをラムダ・インビトロ・パッケ
ージング・キット（アマシャム製造）を使用してパッケ
ージングすることにより、組換ファージによるＨＰＢ−
ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００４０】

【実験５−２】標識ＤＮＡプローブの作製実験３で得られた化３に示す部分アミノ酸配列に基づ
き、その部分アミノ酸配列における配列Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａから予想される塩基
配列をＤＮＡシンセサイザー（アプライッドバイオシス
テム製造）で合成した。合成した塩基１７個からなる９
６種類の配列を表１に示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】化５に示す部分アミノ酸配列については、
その配列Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓから
予想される塩基配列の相補鎖を上記と同様にして合成し
た。合成した塩基１４個からなる９６種類の配列を表２
に示す。なお、ＤＮＡは［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを使い、常法にしたがって標識
した。

【００４３】

【表２】

【００４４】

【実験５−３】標識ＤＮＡプローブを用いたスクリー
ニング実験５−１で調製したＨＰＢ−ＭＬＴ細胞のｃＤＮＡラ
イブラリーである組換λｇｔ１０ファージ液と大腸菌Ｎ
Ｍ５１４Ｔ株をＬ培地で一晩培養して得られた培養液と
を混合し、混合物を３７℃で１５分間インキュベートし
た後、ソフトアガーを混合し、ハードアガー上に重層
し、固化させた。次いで、重層したアガー上の大腸菌を
３７℃で８時間培養し、冷却した後、アガー上にメンブ
ランフィルタ『ＨｙｂｏｎｄＮフィルタ（アマシャ
ム製造）』を重ねてメンブランフィルタ上にファージを
移取り、ファージＤＮＡを固定した。次に、標識ＤＮＡ
プローブと目的とする相補ＤＮＡ以外のＤＮＡとの非特
異的結合を防止するために、メンブランフィルタをサケ
精子ＤＮＡ（シグマ製造）溶液に浸漬することによりプ
レハイブリダイゼーションさせた後、実験５−２で調製
した標識ＤＮＡプローブを用いてサザンハイブリダイゼ
ーション法によるスクリーニングを行った。表１に示す
プローブ１による一次スクリーニングと表２に示すプロ
ーブ２による二次スクリーニングを行った結果、約６０
万個のクローンから３個の陽性クローンが得られた。こ
れら陽性クローンから取出したファージＤＮＡを制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化してベクターＤＮＡから切離し、挿
入断片の長さをアガロース電気泳動で確認した後、最も
長い約１．５ｋｂｐの挿入断片を持つクローンについて
さらなる解析を行った。

【００４５】

【実験５−４】本発明の蛋白質をコードする遺伝子の
塩基配列実験５−３で得た陽性クローンからファージＤＮＡを取
り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、アクリルア
ミドゲル電気泳動で分離して約１．５ｋｂｐの挿入ＤＮ
Ａ断片を得た。このＤＮＡ断片をライゲーションキット
（アマシャム製造）を用いてｐＵＣ１８プラスミドにラ
イゲーションすることにより、組換プラスミドを得た。
この組換プラスミドを常法により大腸菌に導入して得ら
れた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、次い
で、そのプラスミドＤＮＡにジデオキシ法を適用するこ
とにより本発明の塩基配列を決定し、その塩基配列から
本発明による蛋白質のアミノ酸配列を推定した。その結
果、本発明のＤＮＡは１，２２４塩基からなり、アミノ
酸４０８個からなる蛋白質をコードしていることが判明
した。そして、ここで推定したアミノ酸配列は、実験３
で決定したアミノ酸配列化３、化４、化５及び化６を全
て包括していた。

【００４６】次に、本発明による蛋白質の製造方法の実
施例を示す。

【００４７】

【実施例】実験２と同様にしてヒトＴ細胞白血病由来の
株化細胞であるＭＯＬＴ−４細胞（大日本製薬販売）を
ＢＣＧ及びＬＰＳで刺激しながら培養し、次いで、その
培養上清を実験３と同様に処理して癌転移抑制活性を有
する本発明の蛋白質を採取した。収量は、培養上清５０
リットル当たり約４０μｇであった。本品は、実験３で
調製した蛋白質と同一の理化学的性質を有していた。

【００４８】

【発明の効果】本発明の蛋白質は癌転移を効果的に抑制
するので、癌転移の予防剤、治療剤、診断剤として有用
である。本発明の蛋白質は毒性が低いことから、注射剤
や舌下剤などの適宜剤形にして全身投与することができ
る。

【００４９】斯くも有用な当該蛋白質は、本発明の製造
方法により、大量に製造することができる。

【００５０】また、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ
は、遺伝子組換法により本発明の蛋白質を製造する上で
有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 1/00 - 19/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】理化学的性質が（１）分子量４５，０００±５，０００（２）等電点ｐＩ＝５．７±０．５（３）部分アミノ酸配列 Asp Ser Glu Gly Tyr Ile Tyr Ala Arg Gly Ala Gln Asp Met Lys 1 5 10 15 及び Glu His Trp Ser His Asp Pro Phe Gluを有する 1 5 （４）溶剤に対する溶解性水、生理食塩水及び燐酸緩衝液に可溶（５）生物活性ヒト大腸癌由来の培養株化細胞であるＲＰＭＩ４７８８
細胞（微工研条寄第２４２９号）の転移を抑制する活性
を有する（６）安定性水溶液中、ｐＨ７．２にて１００℃で３０分間放置する
と失活する水溶液中、ｐＨ７．２にて４℃で１ヶ月間放置しても安
定である単離された蛋白質を含んでなる癌転移抑制剤。
【請求項２】蛋白質が、実質的に下記の化１で表わさ
れるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に
記載の癌転移抑制剤。〈化１〉Met Thr Ser Lys Gly Pro Glu Glu Glu His Pro Ser Va1 Thr Leu Phe 1 5 10 15 Arg Gln Tyr Leu Arg Ile Arg Thr Val Gln Pro Lys Pro Asp Tyr Gly 20 25 30 Ala Ala Va1 Ala Phe Phe Glu Glu Thr Ala Arg Gln Leu Gly Leu Gly 35 40 45 Cys Gln Lys Va1 Glu Val Ala Pro Gly Tyr Val Va1 Thr Val Leu Thr 50 55 60 Trp Pro Gly Thr Asn Pro Thr Leu Ser Ser 11e Leu Leu Asn Ser His 65 70 75 80 Thr Asp Va1 Va1 Pro Val Phe Lys Glu His Trp Ser His Asp Pro Phe 85 90 95 Glu Ala Phe Lys Asp Ser Glu Gly Tyr Ile Tyr Ala Arg Gly Ala Gln 100 105 110 Asp Met Lys Cys Va1 Ser Ile Gln Tyr Leu Glu Ala Val Arg Arg Leu 115 120 125 Lys Val Glu Gly His Arg Phe Pro Arg Thr Ile His Met Thr Phe Val 130 135 140 Pro Asp Glu Glu Val Gly Gly His Gln Gly Met Glu Leu Phe Va1 Gln 145 150 155 160 Arg Pro Glu Phe His Ala Leu Arg Ala Gly Phe Ala Leu Asp Glu Gly 165 170 175 Ile Ala Asn Pro Thr Asp Ala Phe Thr Va1 Phe Tyr Ser Glu Arg Ser 180 185 190 Pro Trp Trp Val Arg Val Thr Ser Thr Gly Arg Pro Gly His Ala Ser 195 200 205 Arg Phe Met Glu Asp Thr Ala Ala Glu Lys Leu His Lys Val Val Asn 210 215 220 Ser Ile Leu Ala Phe Arg Glu Lys Glu Trp Gln Arg Leu Gln Ser Asn 225 230 235 240 Pro His Leu Lys Glu Gly Ser Val Thr Ser Val Asn Leu Thr Lys Leu 245 250 255 Glu Gly Gly Val Ala Tyr Asn Val Ile Pro A1a Thr Met Ser Ala Ser 260 265 270 Phe Asp Phe Arg Val Ala Pro Asp Val Asp Phe Lys Ala Phe Glu Glu 275 280 285 Gln Leu Gln Ser Trp Cys Gln Ala Ala Gly Glu Gly Val Thr Leu Glu 290 295 300 Phe Ala Gln Lys Trp Met His Pro Gln Val Thr Pro Thr Asp Asp Ser 305 310 315 320 Asn Pro Trp Trp Ala Ala Phe Ser Arg Val Cys Lys Asp Met Asn Leu 325 330 335 Thr Leu Glu Pro Glu I1e Met Pro Ala Ala Thr Asp Asn Arg Tyr Ile 340 345 350 Arg Ala Val Gly Val Pro A1a Leu Gly Phe Ser Pro Met Asn Arg Thr 355 360 365 Pro Val Leu Leu His Asp His Asp Glu Arg Leu His Glu Ala Val Phe 370 375 380 Leu Arg Gly Val Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ser 385 390 395 400 Val Pro Ala Leu Pro Ser Asp Ser 405
【請求項３】蛋白質が、実質的に下記の化２で表わさ
れる塩基配列を有するＤＮＡによりコードされているこ
とを特徴とする請求項１又は２に記載の癌転移抑制剤。〈化２〉ATGACCAGCA AGGGTCCCGA GGAGGAGCAC CCATCGGTGA CGCTCTTCCG CCAGTACCTG 60 CGTATCCGCA CTGTCCAGCC CAAGCCTGAC TATGGAGCTG CTGTGGCTTT CTTTGAGGAG 120 ACAGCCCGCC AGCTGGGCCT GGGCTGTCAG AAAGTAGAGG TGGCACCTGG CTATGTGGTG 180 ACCGTGTTGA CCTGGCCAGG CACCAACCCT ACACTCTCCT CCATCTTGCT CAACTCCCAC 240 ACGGATGTGG TGCCTGTCTT CAAGGAACAT TGGAGTCACG ACCCCTTTGA GGCCTTCAAG 300 GATTCTGAGG GCTACATCTA TGCCAGGGGT GCCCAGGACA TGAAGTGCGT CAGCATCCAG 360 TACCTGGAAG CTGTGAGGAG GCTGAAGGTG GAGGGCCACC GGTTCCCCAG AACCATCCAC 420 ATGACCTTTG TGCCTGATGA GGAGGTTGGG GGTCACCAAG GCATGGAGCT GTTCGTGCAG 480 CGGCCTGAGT TCCACGCCCT GAGGGCAGGC TTTGCCCTGG ATGAGGGCAT AGCCAATCCC 540 ACTGATGCCT TCACTGTCTT TTATAGTGAG CGGAGTCCCT GGTGGGTGCG GGTTACCAGC 600 ACTGGGAGGC CAGGCCATGC CTCACGCTTC ATGGAGGACA CAGCAGCAGA GAAGCTGCAC 660 AAGGTTGTAA ACTCCATCCT GGCATTCCGG GAGAAGGAAT GGCAGAGGCT GCAGTCAAAC 720 CCCCACCTGA AAGAGGGGTC CGTGACCTCC GTGAACCTGA CTAAGCTAGA GGGTGGCGTG 780 GCCTATAACG TGATACCTGC CACCATGAGC GCCAGCTTTG ACTTCCGTGT GGCACCGGAT 840 GTGGACTTCA AGGCTTTTGA GGAGCAGCTG CAGAGCTGGT GCCAGGCAGC TGGCGAGGGG 900 GTCACCCTAG AGTTTGCTCA GAAGTGGATG CACCCCCAAG TGACACCTAC TGATGACTCA 960 AACCCTTGGT GGGCAGCTTT TAGCCGGGTC TGCAAGGATA TGAACCTCAC TCTGGAGCCT 1020 GAGATCATGC CTGCTGCCAC TGACAACCGC TATATCCGCG CGGTGGGGGT CCCAGCTCTA 1080 GGCTTCTCAC CCATGAACCG CACACCTGTG CTGCTGCACG ACCACGATGA ACGGCTGCAT 1140 GAGGCTGTGT TCCTCCGTGG GGTGGACATA TATACACGCC TGCTGCCTGC CCTTGCCAGT 1200 GTGCCTGCCC TGCCCAGTGA CAGC 1224
【請求項４】蛋白質が、当該蛋白質の産生能を有する
細胞を培養し、得られる培養物から該蛋白質を採取して
得られたものであることを特徴とする請求項１、２又は
３に記載の癌転移抑制剤。